Αφηρημένο

LIN28B εμπλέκεται σε «βλαστική ικανότητα» και ογκογένεσης ρυθμίζοντας αρνητικά την ωρίμανση των

7 ας-

μέλη της οικογένειας microRNA. Σε αυτή τη μελέτη, δείξαμε ότι η έκφραση LIN28B προωθεί τη μετανάστευση και την υποτροπή του καρκίνου του παχέος εντέρου. Ανοσοϊστοχημεία και ανάστροφης μεταγραφής αντιδράσεις αλυσίδας πολυμεράσης εκτελέστηκαν για την ανίχνευση της έκφρασης LIN28B σε μικροσυστοιχίες ιστό καρκίνου του κόλου, εγκλεισμένοι σε παραφίνη χειρουργική εκτομή ιστούς και καρκινικά κύτταρα. Απώλειας λειτουργίας, αναλύσεις μετανάστευση και πολλαπλασιασμό διεξήχθησαν για να οριοθετηθούν τα δυνητικά ρόλους των LIN28B στον καρκίνο του παχέος εντέρου. LIN28B ρυθμίζεται αυξητικά σε ιστό καρκίνου του κόλου σε σύγκριση με φυσιολογικό βλεννογόνο, και η υπερέκφραση του συσχετίζεται με μειωμένη επιβίωση του ασθενούς και την αύξηση της επανεμφάνισης του όγκου. καταστολή LIN28B ανέστειλε τη μετανάστευση των SW480 κυττάρων καρκίνου του κόλου και διευκόλυνε την κυτταροτοξικότητα που προκαλείται από οξαλιπλατίνη σε SW480 και HCT116 του κόλου. Εν κατακλείδι, LIN28B υπερέκφραση συμβάλλει στην ογκογένεση του παχέος εντέρου, και LIN28B μπορεί να χρησιμεύσει ως ένα διαγνωστικό εργαλείο και θεραπευτικό στόχο για τον καρκίνο του παχέος εντέρου

Παράθεση:. Pang Μ, Wu G, Χου Χ, Χου Ν, Liang L, Jia G , et al. (2014) LIN28B Προωθεί καρκίνου του παχέος εντέρου Μετανάστευση και την επανάληψη. PLoS ONE 9 (10): e109169. doi: 10.1371 /journal.pone.0109169

Επιμέλεια: Yuan-Σύντομα Ho, Ταϊπέι Ιατρικό Πανεπιστήμιο, την Ταϊβάν

Ελήφθη: 6 Ιούλη του 2014? Αποδεκτές: 28 Αυγ, 2014? Δημοσιεύθηκε: 31 Οκτωβρίου, 2014

Copyright: © 2014 Pang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Τμήμα Δημόσιας Υγείας της επαρχίας Sichuan (110.167). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

LIN28

αρχικά προσδιορίζονται στο

C. elegans

και δείχθηκε να είναι υπεύθυνη για τη χρονική στιγμή της ανάπτυξης [1]. LIN28 προκαλεί πλειοδυναμία όταν εκφράζεται σε σωματικά ινοβλάστες μαζί με

Oct4

,

SOX2

και

KLF4

.

LIN28B

, ως ομόλογο του

LIN28

, κλωνοποιήθηκε αρχικά από και φαίνεται να υπερεκφράζεται σε κύτταρα ανθρώπινου ηπατοκυτταρικού καρκινώματος και κλινικά δείγματα, το 2006 [2]. LIN28B είναι μία αναπτυξιακά ρυθμιζόμενη πρωτεΐνη δέσμευσης RNA που προωθεί την ογκογένεση μπλοκάροντας τη μετα-μεταγραφική επεξεργασία του όγκου-κατασταλτικό ιδιωτικού /προ

ας-7

microRNA [3], [4]. Η ικανότητα των LIN28B για τη ρύθμιση

ας-7

, ένα

καλόπιστους

όγκου-καταστολέα, είναι συνεπής με αναπτυξιακό της ρόλο στη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού και της κυτταρικής διαφοροποίησης. Είναι ενδιαφέρον, αρκετές μελέτες έδειξαν ότι το

LIN28B

η ίδια είναι επίσης ένας στόχος της

ας-7

μέλη της οικογένειας, συμπεριλαμβανομένων των miR-125b [5]. Εκτός

ας-7

, LIN28B μπορεί επίσης να δεσμεύουν το mRNA της εντερικής δείκτες βλαστικών κυττάρων, όπως

LGR5

και

PROM1

[6]. Εν ολίγοις, LIN28B προωθεί μετασχηματισμού κατά κύριο λόγο από την καταστολή

ας-7

. Ο ανταγωνισμός μεταξύ LIN28B και

ας-7

μπορεί να είναι κρίσιμη για τη φυσιολογική κυτταρική βιολογία και μπορεί να επιταχύνει την ανάπτυξη των όγκων φορά διαταράσσεται αυτή η ισορροπία.

LIN28B

είναι υπερμεθυλίωση σε σωματικούς ιστούς [ ,,,0],7], και παρεκκλίνουσα επανενεργοποίηση του μπορεί να προωθήσει ογκογένεση [8]. LIN28B συχνά υπερεκφράζεται σε πολλούς καρκίνους, ιδιαίτερα προηγμένες μορφές όπως προοδευτική ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [2], [9], επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών [10], όγκους του όγκου και των γεννητικών κυττάρων του Wilm [9]. Εκτός από το ότι στόχαστρο προγενέστερες microRNAs, LIN28B ενεργοποιείται από διάφορα ογκογόνο οδούς. C- /N-Μγο επάγουν έκφραση LIN28B σε πολλαπλά μοντέλα ανθρώπινων και όγκου ποντικού, με αποτέλεσμα

ας-7

καταστολή και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων [11], [12].

MYCN

ενίσχυση οδηγεί επίσης σε LIN28B υπερέκφραση [10], και έχει αναφερθεί ότι το c-Myc σχετίζεται με σποραδικές μεγάλο καρκίνο του εντέρου και οικογενή πολυποδίαση coli [13], υποδηλώνοντας έναν ρόλο για LIN28B σε καρκίνο του παχέος εντέρου.

Παρά τις μεγάλες επιτυχίες σε χειρουργική επέμβαση, χημειοθεραπεία και την ανάπτυξη νέων μοριακών στόχευση φαρμάκων, όπως η bevacizumab (Avastin), η συχνότητα εμφάνισης του καρκίνου του παχέος εντέρου συνεχίζει να αυξάνεται [14]. Κάθε χρόνο, οι όγκοι του παχέος εντέρου είναι υπεύθυνοι για 655, 000 θανάτους σε παγκόσμιο επίπεδο. Επειδή

Let-7

λειτουργεί σαν ένας δυνητικός καταστολέας ανάπτυξης σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου [15], εξετάσαμε την έκφραση LIN28B στο παχύ έντερο καρκινικούς ιστούς για να προσδιοριστεί η ισορροπία μεταξύ LIN28B και

ας-7

έκφραση . Εξετάσαμε έκφραση LIN28B σε ανθρώπινους όγκους καρκίνου του παχέος εντέρου μέσω μικροσυστοιχίας ιστών και βρέθηκε ότι ήταν σημαντικά LIN28B ρυθμίζεται αυξητικά σε καρκινικό ιστό σε σύγκριση με φυσιολογικό βλεννογόνο του κόλου. Να αναλύσει περαιτέρω την επιβίωση των ασθενών με καρκίνο του παχέος εντέρου, επιλέξαμε μια πρόσθετη ομάδα των μετεγχειρητικών ασθενών με λεπτομερή αρχεία παθολογία και τα δεδομένα παρακολούθησης από το 2004 έως το 2009. Όπως αναμενόταν, LIN28B υπερέκφραση συσχετίζεται με μειωμένη επιβίωση του ασθενούς και μια αυξημένη πιθανότητα υποτροπής του όγκου . Επιπλέον, βρήκαμε ότι φίμωση LIN28B ανέστειλε τη μετανάστευση των κυττάρων SW480 και SW480 ευαισθητοποιημένα και HCT116 κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου σε οξαλιπλατίνη επαγόμενη κυτταροτοξικότητα.

Ασθενείς και Μέθοδοι

ανάλυση ιστού όγκου

δείγματα ανθρώπινων καρκινωμάτων κόλου και φυσιολογικό κόλον ελήφθησαν από μία συστοιχία καρκινώματος ανθρώπινου κόλον ιστού (CO2161? US Biomax), το οποίο περιείχε 204 αδενοκαρκινώματα, 4 καρκίνοι σφραγιστικό δαχτυλίδι και 8 δείγματα φυσιολογικού βλεννογόνου του παχέος εντέρου. Λεπτομερείς κλινικές πληροφορίες, συμπεριλαμβανομένου του καθεστώτος της διαφοροποίησης και της ταξινόμησης ΤΝΜ, επίσης παρέχονται για κάθε δείγμα. Μια πρόσθετη ομάδα των δειγμάτων καρκινώματος του παχέος εντέρου 149 συλλέχθηκε από δείγματα που είχαν χειρουργικά το 2004 από συναινούντων ασθενείς σε Nanfang Νοσοκομείο (Ιατρικό Πανεπιστήμιο της Νότιας, Guangzhou, Κίνα), σύμφωνα με μια Institutional Review Board-εγκεκριμένο πρωτόκολλο. Κάθε μία από αυτές τις περιπτώσεις ακολουθήθηκε, με λεπτομέρεια, μέχρι και τον Ιούνιο του 2009. Εμείς επιβεβαίωσε το βαθμό ΤΝΜ για τα δείγματα και από τις δύο ομάδες. Συνολικά, 357 καρκίνο του παχέος εντέρου όγκοι και 8 κανονικά δείγματα κόλου χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση IHC. Οι λεπτομερείς πληροφορίες για όλους τους όγκους και τους ασθενείς παρέχεται στον Πίνακα 1. Το πρωτόκολλο της μελέτης εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας ηθική της Nanfang Νοσοκομείο. Έχουμε λάβει γραπτή συγκατάθεση από όλους τους συμμετέχοντες στη μελέτη. Όλες οι διαδικασίες έγιναν σύμφωνα με τη Διακήρυξη του Ελσίνκι και τις σχετικές πολιτικές στην Κίνα

Η

Δύο παθολόγους σκόραρε το LIN28B ένταση χρώσης σύμφωνα με την ακόλουθη κλίμακα: α. Βαθμολογία 0/1 χρησιμοποιήθηκε για να σημαίνει αδύναμος /χαμηλής έντασης LIN28B (0-25% θετικό ρυθμό)? ένα σκορ 2 εκπροσωπούνται ενδιάμεσο έντασης (25-50% θετικό ρυθμό)? και ένα σκορ 3 χρησιμοποιήθηκε για χρώση υψηλής έντασης (& gt? 50% θετικό ρυθμό). Όγκοι των βαθμών 1, 2 και 3 είναι ισοδύναμα με όγκους που ταξινομούνται καθώς και διαφοροποιημένες, μετρίως διαφοροποιημένων ή κακώς διαφοροποιημένο, αντίστοιχα, με τη χρήση μικροσκοπίου.

Σύνδεση δοκιμές κατάταξης (Mantel-Cox και Breslow) διεξήχθησαν για τη σύγκριση της επιβίωσης και διανομές επανεμφάνιση των διαφόρων ομάδων ένταση (0-2 έναντι 3). Η συσχέτιση μεταξύ της έντασης χρώσης και την επιβίωση ή την επανάληψη προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ανάλυση chi-square, και ένα διάστημα εμπιστοσύνης 95% υπολογίζεται για τον προσδιορισμό στατιστική σημαντικότητα.

καλλιέργειας κυττάρων

Η SW480, Caco2 και κυτταρικές σειρές HCT116 καρκίνου του παχέος εντέρου αγοράσθηκαν από την ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA) και καλλιεργήθηκαν σε τροποποίηση του Dulbecco του μέσου Eagle (ϋΜΕΜ? Gibco, Carlsbad, CA, USA) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS? HyClone, Logan South, UT, USA). Όλες οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν σε ένα 5% CO

2, υγροποιημένη ατμόσφαιρα.

ολιγοριβονουκλεοτίδια

Α LIN28B ειδικό siRNA και ένας αρνητικός μάρτυρας μικρό RNA (NC) κατασκευάστηκαν με Genepharma ( Σαγκάη, Κίνα). LIN28B- και GAPDH-ειδικών εκκινητών συντέθηκαν από την Takara (Takara Biotechnology, Dalian, Κίνα).

διαμόλυνσης κυττάρων

RNA ολιγοριβονουκλεοτίδια επιμολύνθηκαν χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή . Μεταξύ 50 και 100 ηΜ των ολιγοριβονουκλεοτίδια RNA χρησιμοποιήθηκαν για κάθε επιμόλυνση.

ημι-ποσοτική ανάστροφης μεταγραφής αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (RT-PCR) και ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης αντίστροφης μεταγραφής (qRT-PCR)

Το συνολικό RNA εξήχθη χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen) και κατόπιν υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ϋΝάση Ι (Tiangen Biotech, Beijing, Κίνα). Το cDNA για την qRT-PCR συντέθηκε με το κιτ αντιδραστηρίου PrimeScript RT και το gDNA γόμα (Takara). Η διαδικασία PCR ενίσχυση για GAPDH ήταν ως ακολούθως: 94 ° C για 3 λεπτά? 30 κύκλοι των 94 ° C για 30 s, 60 ° C για 30 s και 72 ° C για 30 s? και ένα τερματικό επιμήκυνση στους 72 ° C για 5 λεπτά. Η ενίσχυση του LIN28B διεξήχθη ως εξής: 95 ° C για 2 λεπτά? 30 κύκλοι των 95 ° C για 30 s, 58 ° C για 30 s και 72 ° C για 30 s? και ένα τελικό στάδιο στους 72 ° C για 5 λεπτά. Οι δοκιμασίες qRT-PCR διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας το SYBR PrimeScript RT-PCR κιτ (Takara) για GAPDH και LIN28B.

ανοσοστυπώματα

πρωτεϊνικά κλάσματα κυτοσολίου παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό RIPA (Beyotime Biotechnology, Haimen, Κίνα). Τα αντισώματα που χρησιμοποιούνται για τα ανοσοστυπώματα ήταν ειδικά για LIN28B (1:10, ab71415? Abcam, Cambridge, MA, USA) και GAPDH (G9295? Sigma-Aldrich, USA). Western blots και IHC διεξήχθησαν σύμφωνα με πρότυπες διαδικασίες.

Μετανάστευση ανάλυση

κύτταρα SW480 (1 × 10

4 κύτταρα σε 100 μΐ μέσου άνευ ορού), τα οποία είχαν επιμολυνθεί με το NC ή si-LIN28B, είχαν τοποθετηθεί στην κορυφή του θαλάμου του δίσκους καλλιέργειας Transwell (8 μm? BD Biosciences, San Jose, CA). Η κάτω θάλαμος γέμισε με 600 μι ρυθμισμένου μέσου. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα που δεν είχαν μεταναστεύσει στον κάτω θάλαμο απομακρύνθηκαν από την άνω επιφάνεια της μεμβράνης Transwell με μια μπατονέτα. Κύτταρα που μετανάστευσαν στην κάτω επιφάνεια της μεμβράνης μονιμοποιήθηκαν, χρωματίσθηκαν με 0,1% κρυσταλλικό ιώδες και απεικονιστεί.

Κυτταρική βιωσιμότητα ανάλυση

SW480 ή HCT116 κύτταρα, τα οποία είχαν επιμολυνθεί είτε με τον NC ή Si- LIN28B, σπάρθηκαν εις τριπλούν σε πλάκες 96 φρεατίων σε συγκέντρωση 1 × 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο. Αφού τα κύτταρα είχαν προσκολληθεί στις πλάκες, αυτά επωάστηκαν με διαφορετικές συγκεντρώσεις οξαλιπλατίνη (π.χ., 100, 10, 1, 0.1, 0.01 και 0.001 μg /mL? Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd., Jiangsu, Κίνα) για 4 ώρα και στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε πλήρες μέσο για επιπλέον 20 ώρες. Στο υποδεικνυόμενο χρονικό σημείο, 10 μL του CCK-8 διαλύματος (Dojindo, Kumamoto, Japan) προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο, και τα κύτταρα επωάστηκαν για 3 h στους 37 ° C. Η απορρόφηση (Α) καταγράφηκε στα 450 nm χρησιμοποιώντας αναγνώστη πλακός. Το πείραμα πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν, και ο λόγος της αναστολής των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας την ακόλουθη εξίσωση: (1 – ομάδα δοκιμής ομάδας Α /ελέγχου Α) χ 100%. Το IC

50 (50% ανασταλτική συγκέντρωση) αξία υπολογίστηκε με τη χρήση ειδικού λογισμικού (μέθοδος logit).

Η στατιστική ανάλυση

Μια δοκιμή log rank διεξήχθη για να συγκρίνει τις κατανομές επιβίωσης και υποτροπής για τις διάφορες ομάδες ένταση (0-2 έναντι 3). Η συσχέτιση μεταξύ της έντασης χρώσης και επιβίωση ή την επανάληψη προσδιορίστηκε σύμφωνα με μια ανάλυση Chi-square, όπου τιμές ρ μικρότερες του 0,05 θεωρήθηκαν ότι είναι στατιστικά σημαντική. Ένα διάστημα εμπιστοσύνης 95% υπολογίστηκε για την επιβεβαίωση της στατιστικής σημαντικότητας.

Αποτελέσματα

LIN28B ρυθμίζεται αυξητικά σε καρκινώματα του παχέος εντέρου

Για την εξέταση των πιθανών ρόλων για LIN28B στον καρκίνο του παχέος εντέρου, εμείς πρώτα σε σύγκριση έκφραση πρωτεΐνης LIN28B μεταξύ 208 δείγματα όγκου και 8 μη συμφωνημένα φυσιολογικά δείγματα βλεννογόνου από ένα μικροσυστοιχία ιστού χρησιμοποιώντας IHC. Η ένταση χρώσης των LIN28B βαθμολογήθηκε από δύο παθολόγους που είχαν τυφλωθεί με τη κλινικές πληροφορίες. Σε συμφωνία με προηγούμενες αναφορές [6], [16], LIN28B ήταν σημαντικά υπερεκφράζεται σε ιστούς όγκου σε σύγκριση με τους φυσιολογικούς ιστούς (Σχήμα 1, ρ & lt?. 0.001).

IHC έδειξε ότι LIN28B ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω σε ιστούς του όγκου σε σύγκριση με την κανονική βλεννογόνο, η οποία αποδεικνύεται πολύ λίγη έκφραση LIN28B. Αντιπροσωπευτικά γραφήματα παρουσιάζονται.

Η

LIN28B υπερέκφραση συσχετίζεται με μειωμένη επιβίωση των ασθενών και υψηλό κίνδυνο υποτροπής

Δεδομένα από ασθενείς που υποβλήθηκαν σε χειρουργική επέμβαση (ΤΝΜ Ι-ΙΙΙ, παραφίνη-ενσωματωμένες χειρουργική εκτομή ιστούς) αναλύθηκαν περαιτέρω μέσω δοκιμών log rank να διερευνηθεί η επίδραση της LIN28B υπερέκφραση για την επιβίωση και την επανεμφάνιση του ασθενούς. Αυτή η ανάλυση αποκάλυψε μια συσχέτιση μεταξύ χρώση LIN28B χαμηλής έντασης από δείγματα βαθμού TNM Ι και όγκων II και αυξημένη επιβίωση των ασθενών (Mantel-Cox ρ & lt? 0,01? Breslow, ρ & lt? 0,01) και μια κατώτερη πιθανότητα υποτροπής του όγκου (Mantel-Cox ρ & lt ? 0,01? Breslow p & lt?.. 0,01) (Σχήμα 2)

(Α) Ανώτατη LIN28B ένταση χρώσης από το στάδιο Ι, ΙΙ και ΙΙΙ του παχέος εντέρου συσχετίζεται με μειωμένη επιβίωση του ασθενούς. (Β) Υψηλή έκφραση LIN28B είχε σχέση με μια μεγαλύτερη πιθανότητα υποτροπής του όγκου (p & lt? 0,01? Συνδεθείτε τεστ rank).

Η

Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματά μας αποκαλύπτουν ότι η έκφραση LIN28B είναι στενά συνδεδεμένη με τη συνολική επιβίωση των ασθενών και υποτροπή του καρκίνου του παχέος εντέρου.

LIN28B απώλεια-του-λειτουργία ευαισθητοποιημένων SW480 και HCT116 κύτταρα να οξαλιπλατίνη κυτταροτοξικότητα

Οι

ας-7

όγκου μέλη καταστολέα microRNA οικογένειας είναι γνωστό ότι ρυθμίζουν χημειοευαισθησία [17], ενώ LIN28B προωθεί κακοήθεια κυρίως αναστέλλοντας

ας-7

βιογένεση. Έτσι, φρόντισε να διαπιστώσει αν LIN28B θα μπορούσε να επηρεάσει χημειοευαισθησία με οξαλιπλατίνη. Εξετάσαμε έκφραση LIN28B σε τρεις κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου με τη χρήση RT-PCR και κηλίδωση Western (Εικ. 3Α). HCT116 και SW480 κύτταρα επελέγησαν για χρήση σε αυτά τα πειράματα λόγω της χαμηλής και το υψηλό επίπεδο έκφρασής τους Lin28, αντίστοιχα. Η οξαλιπλατίνη επαγόμενη εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση κυτταροτοξικότητα σε αυτά τα κύτταρα (Σχ. 3Β). Το IC

50 τιμή για οξαλιπλατίνη ήταν 6.23 ± 0.75 μg /mL για τα κύτταρα HCT116, και αυτό αυξήθηκε κατά 30% σε 10,7 ± 2,26 μg /mL στα κύτταρα SW480. Αυτό το εύρημα πρότεινε ότι οι διαφορές στην έκφραση LIN28B μπορεί να χρησιμεύσει για να διαμορφώσουν χημειοευαισθησία σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου. Για να επαληθευτεί αυτή η υπόθεση, κατασκευάσαμε LIN28B ειδικά siRNA και τον έλεγχο των μικρών RNA. Η αποτελεσματικότητα του si-LIN28B προσδιορίστηκε σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές (Σχ. 4Α-Δ), και στη συνέχεια μια ανάλυση CCK-8 διεξήχθη για να διερευνήσει τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ του si-LIN28B και οξαλιπλατίνη σε HCT116 και SW480 κυττάρων. Τα αποτελέσματα έδειξαν μία συνεργική δράση μεταξύ si-LIN28B και οξαλιπλατίνη (Σχ. 3C-D), γεγονός που υποδηλώνει ότι η στόχευση των LIN28B μπορεί να είναι ικανό να ευαισθητοποιήσει κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου σε θεραπεία οξαλιπλατίνη.

(Α) RT- PCR και κηλίδας Western αναλύσεις αξιολογήθηκαν τα επίπεδα έκφρασης LIN28B σε Caco2, SW480 και κύτταρα HCT116. (Β) SW480 και HCT116 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων και επωάστηκαν με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις οξαλιπλατίνη. Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ δοκιμασίας CCK-8 μετά από 72 ώρες έκθεσης στο φάρμακο ελέγχου ή διαλύτη. IC

50 τιμές υπολογίστηκαν μετά καμπύλης προσαρμογής με τη χρήση του λογισμικού XLfit. (C-D) HCT116 και SW480 κύτταρα επιμολύνθηκαν με NC ή si-LIN28B 24 ώρες πριν την οξαλιπλατίνη (IC

50 τιμή) θεραπεία. Η ανασταλτική ποσοστό που έχει κανονικοποιηθεί σε NC, υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας CCK-8 απορρόφηση στα ενδεικνυόμενα χρονικά σημεία. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± φορές μεταβολής SE (η = 3? t-test του Student).

Η

(Α-Β) RT-PCR και στυπώματος Western αναλύσεις επιβεβαίωσαν την αποτελεσματικότητα των SH-LIN28B νοκ ντάουν σε HCT116 και SW480 κυττάρων. (C-D) Μία ανάλυση qRT-PCR επιβεβαίωσε επίσης την προς τα κάτω ρύθμιση των LIN28B mRNA στα κύτταρα αυτά. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SE. (n = 3? Φοιτητών

t-test

)

Η

Ελάττωση της LIN28B κατασταλεί τη μετανάστευση των κυττάρων SW480

Όπως LIN28B υπερέκφραση συσχετίστηκε με υποτροπή του όγκου και της επιβίωσης ασθενών, έχουμε δίπλα επιδίωξε να διερευνήσει κατά πόσον η έκφραση LIN28B επηρεάζει τη μετανάστευση των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου. Εμείς χτύπησε κάτω έκφραση LIN28B χρησιμοποιώντας siRNA, και η ανάλυση Transwell έδειξε ότι η καταστολή της LIN28B ανέστειλε σημαντικά τη μετανάστευση των κυττάρων SW480 (Εικ. 5).

Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 50 ηΜ NC ή SI-LIN28B και ήταν επιτρέπεται να μεταναστεύσουν μέσω ενός θαλάμου Transwell. Αντιπροσωπευτικά γραφήματα παρουσιάζονται.

Η

Συζήτηση

Πολλά βλαστική ικανότητα που σχετίζονται με τα γονίδια, τα οποία αναφέρονται ως oncofoetal γονίδια, πιστεύεται ότι για την προώθηση της ογκογένεσης με την επανα-έκφραση σε σωματικά κύτταρα. Η παρουσία του CD133

+ καρκινικά βλαστικά κύτταρα ή καρκινικά κύτταρα μπορεί να εξηγήσει την κίνηση της μετάστασης, επανάληψη και χημειο-αντίσταση του καρκίνου του παχέος εντέρου [18], [19].

Ας-7

εμπλέκεται στη ρύθμιση της αυτο ανανέωση και το ογκογόνο των κυττάρων του μαστού καρκίνο κίνηση [20] και είναι επίσης καταστέλλεται σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου [15]. LIN28B υπερέκφραση είναι γνωστό ότι συμβάλλουν στην καρκινογένεση αναστέλλοντας τη βιογένεση των

ας-7

, που μας ώθησε να αξιολογηθεί κατά πόσον η ισορροπία μεταξύ του όγκου προώθηση LIN28B και όγκου-κατασταλτικό

ας-7

ήταν μεταβάλλεται σε καρκίνο του παχέος εντέρου [21]. Βρήκαμε ότι η έκφραση LIN28B ρυθμίζεται αυξητικά σε ιστούς όγκων του παχέος εντέρου, και αυτή η έκφραση συσχετίζεται με μειωμένη επιβίωση του ασθενούς, και μεγαλύτερη πιθανότητα υποτροπής. Επιπλέον, η αποσιώπηση των LIN28B ευαισθητοποιημένα κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου σε κυτταροτοξικότητα που προκαλείται από οξαλιπλατίνη και ανέστειλε τη μετανάστευση τους

in vitro

.

Lin28

εκφράζεται σε διάφορους πληθυσμούς βλαστικών κυττάρων, αν και έκφραση της σε τελικά διαφοροποιημένα σωματικούς ιστούς είναι σπάνιο. Πρόσφατα, όταν εκφράζεται σε συνδυασμό με

Oct4

,

Nanog

και

SOX2, Lin28

φάνηκε να λειτουργεί ως υποκατάστατο για

c-Myc

να επαναπρογραμματίσει ανθρώπινα σωματικά ινοβλάστες να πλειοδυναμία [22]. Ως ομόλογο του Lin28,

LIN28B

έχει πρωτίστως κλωνοποιηθεί από ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα, και η υπερέκφραση του έχει δειχθεί ότι προάγει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων [2]. Η ενεργοποίηση των αποτελεσμάτων LIN28B σε μειωμένη καταστολή

ας-7

στόχους, όπως

HMGA2

,

Dicer1

[10],

KRAS

[23 ] και

c-Myc

, και η ενεργοποίηση των αντίστοιχων ογκογόνο μονοπατιών σηματοδότησης. Είναι ενδιαφέρον,

LIN28B

και ανάντη ρυθμιστή της

c-Myc

[12] αποτελούν επίσης στόχους της

ας-7

? Κατά συνέπεια, ένας

c-Myc-LIN28B-ας-7 άξονα

, ή βρόχος ανάδρασης, το οποίο μπορεί να χρησιμεύσει για να καταστείλει την ανάπτυξη του όγκου, μπορεί να υπάρχουν. Έτσι, η απώλεια του ελέγχου επί αυτού του άξονα μπορεί να επιταχύνει την ανάπτυξη του όγκου

Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως,

LIN28B

ρυθμίζεται από διάφορους ογκογόνους παράγοντες.? μέλη του

MYC

οικογένεια, συμπεριλαμβανομένων των

c-myc

,

N-Myc

και

MYCN

, μπορεί να ενεργοποιήσει LIN28B, γεγονός που υποδηλώνει ότι

LIN28B

είναι ένας σημαντικός στόχος της

MYC

και μπορεί να εξηγήσει γιατί

LIN28B

μπορεί να αντικαταστήσει

c-Myc

για τον επαναπρογραμματισμό των σωματικών κυττάρων σε πλειοδυναμίας. Η

c-Myc

παράγοντα μεταγραφής μπορεί να ενεργοποιηθεί από το

Wnt /APC

μονοπάτι, το οποίο είναι απορρυθμισμένη σε καρκίνο του παχέος εντέρου [24].

APC

γονίδιο αλλαγές, αν δεν είναι κληρονομική, αντιπροσωπεύουν τις πρώτες μοριακές αλλαγές κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του καρκίνου του παχέος εντέρου, ενώ δομικές αλλαγές του

myc, ras, p53

,

MCC

και

οι DCC

γονίδια θεωρείται ότι αντιπροσωπεύει αργά γεγονότα [25]. Εν ολίγοις, τα ευρήματά μας αποκαλύπτουν την ύπαρξη μιας προκαταρκτικής

Wnt /APC

–

Myc

–

LIN28B

–

ας-7

μονοπάτι στην καρκινογένεση του παχέος εντέρου . Υποθέτουμε ότι

Wnt /APC

–

Myc

ενεργοποίηση της οδού είναι το αρχικό συμβάν και ότι το

LIN28B-ας-7-c-Myc /LIN28B

βρόχος ανάδρασης επιταχύνει παχέος εντέρου καρκινογένεση. Ωστόσο, απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για να εξακριβωθεί ο ρόλος αυτού του βρόχου ανάδρασης στην καρκινογένεση.

Η μετάσταση και η επανάληψη είναι οι κύριοι λόγοι για τη μείωση στη συνολική επιβίωση μεταξύ των ασθενών με κακοήθεις όγκους. Έτσι, έχει μεγάλο ενδιαφέρον να είναι σε θέση να προβλέψει τη μετάσταση του όγκου και υποτροπή σε πρώιμο στάδιο. Επιπλέον, η πρόβλεψη υποτροπής του όγκου στο στάδιο ΙΙ /ΙΙΙ, οι ασθενείς μπορεί να καθοδηγήσει επικουρική χημειοθεραπεία. Βελτιωμένες μέθοδοι για την ταυτοποίηση στάδιο ασθενείς II σε υψηλό κίνδυνο υποτροπής [26], οι οποίες βασίζονται στα μοναδικά χαρακτηριστικά του κάθε μεμονωμένο όγκο, μπορεί να οδηγήσει σε χιλιάδες ζωές κάθε χρόνο. Επιπλέον, οι τεχνικές για τον προσδιορισμό σταδίου III ασθενείς που βρίσκονται σε χαμηλό κίνδυνο για υποτροπή της νόσου μετά από χειρουργική επέμβαση μπορεί να διαθέσει αυτά τα άτομα από το κόστος, το χρόνο και την τοξικότητα που σχετίζεται με τη χημειοθεραπεία [27]. Στη μελέτη μας, LIN28B ένταση χρώσης (& gt? 50%) συσχετίστηκε με μειωμένη επιβίωση του ασθενούς. Είναι σημαντικό, η έκφραση LIN28B θα μπορούσε να προβλέψει την επανάληψη των ΤΝΜ βαθμού II /III όγκων μετά από χειρουργική εκτομή.

Αν και αυτό το χειρόγραφο ήταν στο πλαίσιο της προετοιμασίας, μια μελέτη από το King et al. ανέφερε ότι LIN28B προωθεί την εξέλιξη του καρκίνου του παχέος εντέρου και μετάσταση τόσο

in vivo

[16] και

in vitro

μέσω

ας-7

εξαρτώμενη και ανεξάρτητη από μηχανισμούς [6]. Τα δεδομένα μας συνάδουν με αυτά τα ευρήματα, και σας προτείνουμε επίσης ότι η ανίχνευση της έκφρασης LIN28B θα μπορούσε να βοηθήσει στον καθορισμό του κατάλληλου συστήματος επικουρική χημειοθεραπεία σε ασθενείς με TNM βαθμού ΙΙ και ΙΙΙ καρκινώματα του παχέος εντέρου.

Εν κατακλείδι, τα δεδομένα μας υποδηλώνουν ένα σημαντικό ρόλο για

LIN28B

στην καρκινογένεση του παχέος εντέρου. έκφραση LIN28B φάνηκε να προβλέψει την επιβίωση του ασθενούς, πράγμα που σημαίνει ότι

LIN28B

μπορεί να είναι ένας χρήσιμος στόχος για νέες μοριακές θεραπευτική.