Abstract

Ο υποδοχέας ενεργοποιητή πλασμινογόνου ουροκινάσης (uPAR) παίζει ένα ρόλο στην πρόοδο του όγκου και έχει προταθεί ως στόχος για τη θεραπεία του καρκίνου. Εμείς περιγράφηκε πρόσφατα για την ανάπτυξη ενός νέου ανθρωποποιημένο μονοκλωνικό αντίσωμα που στοχεύει uPAR και έχει αντικαρκινική δραστικότητα σε πολλαπλές μοντέλα όγκων ξενομοσχεύματος σε ζώα. Αυτό το αντίσωμα, ATN-658, δεν αναστέλλει δέσμευση συνδέτη (δηλαδή υΡΑ και βιτρονεκτίνη) για uPAR και ο μηχανισμός δράσης της παραμένει ασαφής. Ως πρώτο βήμα για την κατανόηση της δραστικότητας κατά του όγκου του ΑΤΝ-658, στόχος μας ήταν να προσδιορίσει την επίτοπο σε uPAR στον οποίο ΑΤΝ-658 δεσμεύεται. Καθοδηγούμενη από συγκρίσεις μεταξύ πρωτευόντων και ανθρώπινων uPAR, μελέτες χαρτογράφησης επιτόπου διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας διάφορες ορθογώνιες τεχνικές. Συστηματική τοποκατευθυνόμενη και μεταλλαξιγένεση σάρωσης αλανίνης προσδιόρισε την περιοχή του αα 268-275 του υΡΑΚ ως επιτόπιο για ΑΤΝ-658. Δεν υπάρχουν γνωστές λειτουργία έχει προηγουμένως αποδοθεί σε αυτό τον επίτοπο διαρθρωτικά γνώσεις σχετικά με την αναγνώριση επίτοπο ελήφθησαν από δομικές μελέτες του θραύσματος Fab του ΑΤΝ-658 συνδέεται προς υΡΑΚ. Η δομή δείχνει ότι η ΑΤΝ-658 δεσμεύεται με την DIII τομέα του υΡΑΚ, κοντά στο C-τελικό άκρο του υποδοχέα, που πιστοποιεί τα αποτελέσματα χαρτογράφησης επιτόπου. Περιέργως, όταν δεσμεύεται σε uPAR, η περιοχή καθορισμού συμπληρωματικότητας (CDR) περιοχές του ΑΤΝ-658 μιμούνται στενά τις περιοχές πρόσδεσης του ιντεγκρίνης CD11b (αΜ), ένα προηγουμένως ταυτοποιηθεί συνδέτης uPAR πιστεύεται ότι εμπλέκονται σε λευκοκυττάρων κύλισης, η μετανάστευση και η σύνδεση του συμπληρώματος με κανένα γνωστό ρόλο στην πρόοδο του όγκου των στερεών όγκων. Αυτές οι μελέτες αποκαλύπτουν ένα νέο λειτουργικό επίτοπο στο uPAR που εμπλέκονται στην πρόοδο του όγκου και να επιδείξουν μία προηγουμένως μη αναγνωρισμένη στρατηγική για τη θεραπευτική στόχευση των uPAR

Παράθεση:. Xu Χ, Cai Υ, Wei Υ, Δωρεά F, Χουάρες J, Parry G, et al. (2014) Προσδιορισμός της Νέας επιτόπου σε uPAR ως στόχος για την Καρκίνο Θεραπευτικές μονοκλωνικό αντίσωμα ATN-658, ένα δομικό ομόλογο του uPAR Δεσμευτική Ενσωματίνης CD11b (αΜ). PLoS ONE 9 (1): e85349. doi: 10.1371 /journal.pone.0085349

Επιμέλεια: Francesco Bertolini, Ευρωπαϊκό Ινστιτούτο Ογκολογίας, Ιταλία

Ελήφθη: 10 Απρίλη του 2013? Αποδεκτές: 4 Δεκ 2013? Δημοσιεύθηκε: 21 Ιανουαρίου, 2014

Copyright: © 2014 Xu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από ΝΙΗ (HL086584) να ΜΗ, NCI (CA125564), για να Harold Chapman (YW) και (CA151461) έως (TVO και APM) και και το Ίδρυμα H και Ίδρυμα Καρκίνου του μαστού Lynn Sage (APM). Το ερευνητικό έργο χρηματοδοτήθηκε από τις υπηρεσίες του όγκου Βιολογίας πυρήνα (TBC) του Πανεπιστημίου Northwestern που ωφελείται από φιλανθρωπική υποστήριξη του Robert H. Lurie Κέντρο Καρκίνου και η χημεία της ζωής Διεργασιών Ινστιτούτο. δεδομένα ακτίνων Χ για τη μελέτη αυτή μετρήθηκαν σε beamline × 29 Εθνικό Synchrotron Light Source και σε APS SER-CAT beamline 22ID. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν τα ακόλουθα συμφέροντα. Fernando Δώρισε, Χοσέ Χουάρες, Graham Parry και Andrew P. Μαζάρ είχαν προσληφθεί από Attenuon κατά το χρόνο της μελέτης. Andrew Μαζάρ και Thomas O’Halloran έχουν συμφέρον των ιδίων κεφαλαίων και Andrew Μαζάρ λαμβάνει αμοιβές συμβούλων από την Τακτική Pharma, μια νεοσύστατη εταιρεία που κατέχει πλέον τα δικαιώματα για ATN-658. Andrew Μαζάρ είναι ένας εφευρέτης στην εκδοθεί δίπλωμα ευρεσιτεχνίας για ATN-658. Αρκετές ευρεσιτεχνίες ΗΠΑ εξέδωσε καλύπτουν ΑΤΝ-658, καθώς και το επιτόπιο. Αυτά τα διπλώματα ευρεσιτεχνίας είναι ΗΠΑ # 8.101.726 «δεσμεύουν συνδέτες το συγκρότημα ενεργοποιητή ουροκινάσης πλασμινογόνου τύπου (υΡΑ) και του υποδοχέα του (uPAR) που αναστέλλουν κατάντη αλληλεπιδράσεις uPAR: ταυτοποίηση και χρήση σε διάγνωση ή θεραπεία» (Parry και Mazar) και των ΗΠΑ # 8,105,602 «ουροκινάση τύπος επίτοπο υποδοχέα ενεργοποιητή πλασμινογόνου, μονοκλωνικά αντισώματα που προέρχονται από αυτά και μεθόδους χρήσης αυτών »(Parry και Mazar). Δεν υπάρχουν περαιτέρω διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα προϊόντα για την ανάπτυξη ή την εμπορία προϊόντων που να δηλώνουν. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών, όπως περιγράφεται λεπτομερώς σε απευθείας σύνδεση στον οδηγό για τους συγγραφείς.

Εισαγωγή

Μετάσταση και το μερίδιο της αγγειογένεσης πολλά κοινά χαρακτηριστικά φαινοτυπικά που οδηγούν στην εισβολή και τη μετανάστευση των καρκινικών και ενδοθηλιακών κυττάρων. Αυτές περιλαμβάνουν την αυξητική ρύθμιση της πρωτεάσης και ιντεγκρίνης έκφραση, η απώλεια της κυττάρου-κυττάρου και κυττάρου-μήτρας επαφές, μια αύξηση στην ανταπόκριση σε παράγοντες ανάπτυξης και διαφοροποίησης, και την αναδιαμόρφωση εξωκυτταρικής μήτρας (ECM) και βασικής μεμβράνης (ΒΜ) [ ,,,0],1], [2]. Το σύστημα ενεργοποιητή πλασμινογόνου ουροκινάσης (υΡΑ), που αποτελείται από υΡΑ, έναν ειδικό υποδοχέα επιφάνειας κυττάρου για υΡΑ (uPAR), και σερπίνης αναστολείς υΡΑ όπως αναστολέα ενεργοποιητή πλασμινογόνου-1 (ΡΑΙ-1), παίζει έναν κεντρικό ρόλο σε πολλές από αυτές δραστηριότητες [3] – [6]. Η δραστηριότητα αυτού του συστήματος είναι υπεύθυνος για την έναρξη καταρρακτών που έχουν ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση του πλασμινογόνου και διάφορες προ-μεταλλοπρωτεάσες (προΜΜΡ) [7], [8], η απελευθέρωση και επεξεργασία των λανθανόντων παραγόντων ανάπτυξης κατατεθεί στην ECM όπως FGF-2, VEGF, HGF, και ΤΟΡ-β [9] – [12] και την αναδιαμόρφωση συστατικά του ECM όπως βιτρονεκτίνη και ινονεκτίνη [13], [14]. Οι δραστηριότητες αυτές γενικά διαμεσολαβείται από την πρωτεολυτική λειτουργία του υΡΑ όταν δεσμεύεται με uPAR, μπορεί να ρυθμίζεται με την αναστολή της υΡΑ με ΡΑΙ-1, και εμφανίζονται στο εξωκυτταρικό περιβάλλον. Επιπλέον, uPAR αλληλεπιδρά επίσης με πολλούς άλλους συνδέτες εκτός από υΡΑ συμπεριλαμβανομένων αρκετών ιντεγκρίνες όπως α5β

1, α3β

1, και α5β

3 [15] – [17], καθώς και άλλες κυτταρικές συνδέτες επιφανείας και ECM συμπεριλαμβανομένων vitronectin και G υποδοχέων συζευγμένων με πρωτεΐνη [6]. Αρκετές από αυτές τις αλληλεπιδράσεις έχουν αποδειχθεί ότι είναι σημαντικά για την επιβίωση των κυττάρων του όγκου, εισβολή, και την αγγειογένεση [6], και εμπλέκουν uPAR εξαρτώμενη σηματοδότηση.

Για τους λόγους αυτούς, uPAR έχει προταθεί ως θεραπευτικός στόχος για την θεραπεία του καρκίνου. Ωστόσο, παρά την πληθώρα των βιβλιογραφικών στοιχείων που αποδεικνύουν τη σημασία του uPAR στην εξέλιξη των περισσότερων συμπαγών καρκίνων, συμπεριλαμβανομένου του μαστού [18], του παχέος εντέρου [19], του προστάτη [20], παγκρεατικό [21], των ωοθηκών [22], του πνεύμονα [23] , και του εγκεφάλου [24] καθώς και αρκετές αιματολογικές κακοήθειες όπως η οξεία λευχαιμία και το μυέλωμα [25], δεν uPAR στοχευμένη θεραπευτικός παράγων έχει αναπτυχθεί ή αξιολογηθεί σε καρκινικά κλινικές δοκιμές μέχρι σήμερα. Ένας αριθμός των αντισωμάτων που αναστέλλουν άμεσα τη δέσμευση του υΡΑ να uPAR έχουν προταθεί και δοκιμαστεί σε προ-κλινικές μελέτες, αλλά οι περισσότερες από αυτές έχουν καταδείξει μόνο μέτρια δραστικότητα κατά του όγκου και ως εκ τούτου δεν προχωρήσει σε κλινικό επίπεδο.

Πρόσφατα, αναγνωρίσαμε και ανέπτυξε μία νέα uPAR στοχευμένη μονοκλωνικού αντισώματος που παρουσιάζει ισχυρή αντικαρκινική δράση σε έναν αριθμό διαφορετικών μοντέλων όγκων σε ζώα, αλλά δεν αποκλείει τη σύνδεση του υΡΑ να uPAR [22], [26] – [28]. Αυτό το αντίσωμα, ATN-658, έχει πολλά μοναδικά χαρακτηριστικά που το διαφοροποιούν από τις προηγούμενες uPAR στοχευμένες προσεγγίσεις. Ένα βασικό χαρακτηριστικό είναι ότι ΑΤΝ-658 είναι ότι δεν μπλοκάρει δέσμευση uPAR υΡΑ και είναι σε θέση να συνδέεται με uPAR ακόμα και όταν καταλαμβάνεται από υΡΑ, αλλά παρ ‘όλα αυτά αναστέλλει τη μετανάστευση και την εισβολή

in vitro

[22] , [27]. ATN-658 δεν έχει καμία επίδραση στην υΡΑ ενεργοποίηση με τη μεσολάβηση του πλασμινογόνου αλλά έχει ορισμένες συνέπειες σχετικά με τις οδούς σηματοδότησης και την έκφραση διαφόρων γονιδίων που εμπλέκονται στην πρόοδο του όγκου, όταν αξιολογείται σε μοντέλα του προστάτη και των ωοθηκών

in vitro

και

in vivo

[22], [27]. Ένα από τα πιο εντυπωσιακά παρατηρήσεων με ΑΤΝ-658 είναι ότι η φαρμακολογική στόχευση του υΡΑΚ από αυτό το αντίσωμα οδηγεί σε ισχυρή αντικαρκινική δράση σε ένα ευρύ φάσμα των μοντέλων στερεού ξενομοσχεύματος όγκου [22], [26] – [28]. Οι επιδράσεις κατά του όγκου έχουν παρατηρηθεί ανεξάρτητα από ιστολογία του όγκου σε αυτά τα μοντέλα και επιπλέον με την αναστολή της μετάστασης

in vivo

, όπως θα μπορούσε να προβλεφθεί για uPAR παράγοντα στόχο, ATN-658 είναι επίσης σε θέση να αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των όγκων και επάγει απόπτωση [22], [26], [28]. Ωστόσο, η δομική και μηχανιστική βάση για αυτές τις επιδράσεις κατά του όγκου παραμένουν ασαφείς.

Για να αντιμετωπιστεί αυτό το ζήτημα, χαρακτηρίσαμε το επιτόπιο για uPAR στον οποίο ATN-658 δεσμεύει. Το επιτόπιο για ATN-658 αρχικά χαρτογραφήθηκε χρησιμοποιώντας τοπο-κατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεση και επιβεβαιώνεται από μια νέα τεχνική φασματομετρίας μάζας ανταλλαγής δευτερίου (φασματομετρία μάζας H /D-ανταλλαγής, ExSAR). Αυτός ο επίτοπος προσδιορίστηκε ότι είναι ένα επίτοπο για το οποίο έχει περιγραφεί προηγουμένως καμία λειτουργία σε υΡΑΚ. Επιπλέον, προσδιορίσαμε τις κρυσταλλικές δομές μόνο και σε σύμπλοκο με uPAR, το αμινο τερματικό (περιοχή δέσμευσης uPAR) του υΡΑ (ATF) το θραύσμα ΑΤΝ-658 Fab, και τον τομέα σωματομεδίνη Β (SMB) της βιτρονεκτίνης. Το ATN-658 Fab δεσμεύεται με τον DIII του υΡΑΚ, σύμφωνα με τα αποτελέσματα χαρτογράφησης επιτόπου. Το επίτοπο επί uPAR για ΑΤΝ-658 είναι κοντά στο Ο-τελικό άκρο, και δεν έχει επικάλυψη με την ουροκινάση και θέσεις πρόσδεσης βιτρονεκτίνης. Αυτή η μελέτη αποκάλυψε επίσης δομική ομολογία μεταξύ του ATN-658 βρόχων CDR και η uPAR περιοχή δέσμευσης της ιντεγκρίνης αΜ. Επιπλέον, δείξαμε ότι η δέσμευση ΑΤΝ-658 δεσμεύει την ένωση του άλλου ιντεγρίνης, α5β1, για uPAR και έτσι εξασθενίζει ιντεγρίνη α5β1-μεσολαβούμενη προσκόλληση σε εξωκυτταρική μήτρα. Τα αποτελέσματα αυτά υποδηλώνουν μια προηγουμένως άγνωστο μηχανισμό με τον οποίο uPAR μπορεί να λειτουργήσει στην εξέλιξη του όγκου και ένα μυθιστόρημα επιτόπου για τη θεραπευτική στόχευση αυτού του υποδοχέα.

Υλικά και Μέθοδοι

τηλέφωνα Γραμμές

σειρές ανθρώπινου όγκου PC-3 (αδενοκαρκίνωμα του προστάτη), HeLa (τραχηλικό καρκίνωμα), και το ανθρώπινο καρκίνο του πνεύμονα κυτταρική γραμμή Η1299 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA). Αμφότερες οι κυτταρικές γραμμές καλλιεργήθηκαν σε τροποποιημένο ελάχιστο μέσο Dulbecco Eagle συμπληρωμένο με 10% βόειο εμβρυϊκό ορό και πενικιλίνη-στρεπτομυκίνη. Mouse κυτταρική σειρά όγκου Β-16 (μελάνωμα), οστεοσάρκωμα σκύλος (D-17) και αθανατοποιημένα πράσινου Αφρικανικού πιθήκου (AGM) κύτταρα νεφρού ελέγχθηκαν (COS-1) για να εκφράσει uPAR με RT-PCR και κηλίδος western χρησιμοποιώντας ένα κουνελιού πολυκλωνικό uPAR αντιορό (rD2D3) είναι γνωστό ότι αντιδρούν εγκάρσια με uPAR από πολλαπλά είδη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [29]. uPAR κύτταρα που εκφράζουν στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκαν για να αξιολογηθεί η ικανότητα του ΑΤΝ-658 διασταυρούμενη αντίδραση με διάφορα μη-ανθρώπινα υΡΑΚ. Τόσο ανασυνδυασμένο διαλυτό uPAR (suPAR, κατάλοιπα 1-277) και (υπολείμματα αμινοξέων 1-143 του υΡΑ) ATF παρήχθησαν σε κύτταρα Drosophila S2 ως εκκρινόμενες πρωτεΐνες

E.Coli

[31].

Χαρακτηρισμός του μονοκλωνικού αντισώματος ΑΤΝ-658

ATN-658 εγέρθηκε έναντι ενός χυμοτρυπτική θραύσμα του διαλυτού uPAR (suPAR) που περιλαμβάνει DIIDIII (αα 88-283 της ώριμης uPAR) εκφράζεται σε

Drosophila

κύτταρα S2, χρησιμοποιώντας πρότυπες τεχνικές. Εν συντομία, ποντικοί Balb /c ανοσοποιήθηκαν με θραύσματα suPARDIIDIII συζευγμένο με KLH και το μέγεθος της ανοσολογικής απόκρισης παρακολουθήθηκε με ELISA. Με βάση αυτά τα δεδομένα, τα υβριδώματα παρήχθησαν με σύντηξη κυττάρων σπλήνας με την κυτταρική γραμμή μυελώματος P3x63Ag8.653. Κατεψυγμένα αποθέματα 10 γονικών υβριδωμάτων έγιναν και πέντε και καθαρίστηκαν όπως περιγράφεται [30]. Η πρωτεΐνη τομέας SMB (υπολείμματα αμινοξέων 1-50 της ανθρώπινης βιτρονεκτίνης) ήταν ένα είδος δώρο του Dr. Aiwu Zhou, εκφρασμένη σε των υβριδωμάτων υποβλήθηκαν σε περιοριστική αραίωση. υπερκείμενα καλλιέργειας ιστών από αυτά τα μονοκλωνικά αντισώματα στη συνέχεια εξετάστηκαν για δραστικότητα σε προσδιορισμούς ELISA και ο ισότυπος του κάθε αντισώματος προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας IsoStrips (Roche) .ATN-658, ισότυπο IgG1κ, δεσμεύεται suPAR ακινητοποιημένο σε πλαστικό με Κ

D του ~ 1 ηΜ και ιωδιωμένα ΑΤΝ-658 δεσμεύεται ειδικά uPAR στην επιφάνεια των κυττάρων HeLa με Κ

Δ ~ 5 ηΜ. Η Kd του ATN-658 για suPAR επιβεβαιώθηκε επίσης με τη χρήση συντονισμού επιφανειακών πλασμονίων (BIAcore). Η ανάλυση στυπώματος Western κατέδειξε ότι ΑΤΝ-658 ήταν ειδικά για τον ανθρώπινο uPAR και έκανε δεν αντιδρούν εγκάρσια με uPAR ποντίκι. ATN-658 καθαρίστηκε από υπερκείμενο ιστοκαλλιέργειας με χρωματογραφία στήλης χρησιμοποιώντας πρωτεΐνη-Α Sepharose, τυπικές αποδόσεις κυμαίνονταν από 60-120 mg /L του υπερκειμένου καλλιέργειας ιστού και την καθαρότητα του τελικού υλικού ήταν B. Η ειδικότητα της ΑΤΝ-658 μετρήθηκε με δοκιμασίες άμεσης σύνδεσης χρησιμοποιώντας uPAR μελανώματος που εκφράζουν ποντικού (Β16), καρκίνωμα ανθρώπινου προστάτη (PC-3) και πράσινου Αφρικανικού πιθήκου κύτταρα (COS-1) και επισημασμένα με βιοτίνη ΑΤΝ-658. ανάλυση FACS Β εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας κύτταρα HeLa (που εκφράζουν ανθρώπινο uPAR), D-17 κύτταρα καρκινώματος του πνεύμονα (που εκφράζει κυνικός uPAR και COS-1 κύτταρα. Κάθε κυτταρική γραμμή επωάστηκε με φυσιολογικό ορό κουνελιού (NRS), ένα πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού που εγείρεται έναντι ένα θραύσμα της ανθρώπινης uPAR (rDIIDIII), ποντικού IgG (mIgG) ή ATN-658 και το κατάλληλο FITC επισημασμένο δευτερογενές αντίσωμα.

η

Προσδιορισμός του επιτόπου για ΑΤΝ-658 σε ανθρώπινα suPAR με τοποκατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση

ευθυγράμμιση αλληλουχίας των πρωτευόντων αλληλουχιών DIIDIII uPAR αποκάλυψε ότι η ανθρώπινη και AGM uPAR διέφεραν μόνο σε εννέα θέσεις αμινοξέων (Πίνακας 2). Αυτές οι διαφορές αμινοξέων εννέα ήταν επαρκείς για να καταργήσει πλήρως την δέσμευση του ΑΤΝ-658 έως AGM uPAR. Έτσι, κλωνοποιήθηκε και εκφράστηκε AGM suPAR σε κύτταρα S2 και έκανε εννέα διαφορετικές μεταλλάξεις που αντικατέστησε διαδοχικά ένα αμινοξύ από το AGM αλληλουχία σε κάθε μεταλλάκτη με την αντίστοιχη ανθρώπινη αμινοξέων (Σχ. 2Α). Η αρχική αξιολόγηση αυτών των μεταλλάξεων ήταν ποιοτική όπου αξιολογήθηκε η ικανότητα του ΑΤΝ-658 να ανοσοκαθιζάνει (ΙΡ) ένα συγκεκριμένο μετάλλαγμα από το υπερκείμενο της καλλιέργειας (CS) από κύτταρα που εκφράζουν αυτό το μεταλλαγμένο. ATN-615, το οποίο είναι επίσης ανθρώπινη uPAR ειδικές αλλά για την οποία είχαμε ήδη εντοπίσει τον επίτοπο [33], [34], χρησιμοποιήθηκε για να επιβεβαιώσει την χρησιμότητα αυτής της προσέγγισης. ATN-615 ήταν μόνο σε θέση να την ΠΕ, η μεταλλαγμένη H192R suPAR (κλώνος 2? Εικ. 2Α). Αυτό είναι σύμφωνο με την περιγραφόμενη επίτοπο για ΑΤΝ-615, το οποίο αποτελείται από αα 187-192 (Εικ. 2Α). Στην πραγματικότητα, η μόνη διαφορά αμινοξέων μεταξύ Ετήσιας Γενικής Συνέλευσης και της ανθρώπινης uPAR σε αυτό το επιτόπιο είναι σε αα 192. Ομοίως, ATN-658 ήταν μόνο σε θέση να την ΠΕ, η E268K (κλώνος 8) suPAR μεταλλαγμένο εμπλέκουν αυτό το υπόλειμμα, ως μέρος του επιτόπιου ATN-658 . Αλανίνης μεταλλαξιγένεση σάρωσης γύρω από αυτό το αμινοξύ χαρτογραφεί την αλληλουχία από αο 268-275 ως το επιτόπιο για ΑΤΝ-658 (S1). Από το IP είναι μια ποιοτική εκτίμηση της δέσμευσης, να συλλάβει δοκιμασίες ELISA στήθηκαν για να μετρηθεί η πραγματική συγγένεια ATN-658 για τις διάφορες μεταλλάξεις Γενική Συνέλευση δυΡΑΚ όπως ήταν πιθανό ότι ίσως περισσότερο από aa 268 απαιτούνταν προκειμένου να αποκατασταθεί η πλήρης δραστικότητα δέσμευσης για ATN-658 όταν η αλληλουχία AGM suPAR μεταλλάχθηκε με την ανθρώπινη ακολουθία. Δεδομένου ότι οι μεταλλάξεις AGM δΐιΡΑΚ εκφράστηκαν με ενσωματωμένο σημαία V5, ένα αντίσωμα σημαία αντι-V5 χρησιμοποιήθηκε για να συλλάβει Ετήσια Γενική Συνέλευση του suPAR σε στερεή φάση. Η συγγένεια δέσμευσης μπορεί στη συνέχεια να προσδιορίζεται για κάθε AGM μεταλλαγμένο χρησιμοποιώντας μελέτες πρόσδεσης κορεσμού όπως περιγράφηκε προηγουμένως για ΑΤΝ-658 [27]. Χρησιμοποιώντας αυτή την προσέγγιση, η πρόσδεση του ΑΤΝ-658 παρατηρήθηκε μόνο για να κλωνοποιήσει 8 με Κ

d

~ 2 ηΜ, παρόμοια με την Κ

d

του ATN- 658 για την ανθρώπινη suPAR και για ανθρώπινη κύτταρα που εκφράζουν uPAR υποδεικνύοντας ότι αυτή η αλλαγή ενός μόνο αμινοξέος ήταν υπεύθυνη για την πλήρη κατάργηση της ΑΤΝ-658 σύνδεση προς AGM suPAR (Εικ. 2Β). Αυτή η αλλαγή μόνο αμινοξύ δεν καταργεί δεσμευτικός ΑΤΝ-658 μέσω μιας παγκόσμιας επίδραση επί suPAR διαμόρφωση από την δέσμευση της ΑΤΝ-617, η οποία συνδέεται με DIIDIII και δεν αντιδρούν εγκάρσια με AGM suPAR, δεν μεταβλήθηκε (Σχ. 2C).

Α. μεταλλάκτες ενός σημείου εισήχθησαν μέσα AGM suPAR έτσι ώστε ένα μόνο αμινοξύ άλλαξε από το AGM αλληλουχίας με την αλληλουχία ανθρώπινης uPAR και οι πρωτεΐνες που εκφράζονται και καθαρίζονται όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι. Κάθε κλώνος ταυτοποιείται με τον αριθμό (1-9) με την μετάλλαξη σημείου που προσδιορίζονται παρακάτω τον αριθμό χρησιμοποιώντας τον κώδικα ενός γράμματος των αμινοξέων. Εκτός από το σημείο μετάλλαξης και μόνο, το υπόλοιπο της αλληλουχίας suPAR είναι αυτή του AGM. suPAR μεταλλάγματα εκφράστηκαν σε κύτταρα S2 και τα υπερκείμενα επωάστηκαν είτε με ΑΤΝ-615 ή ΑΤΝ-658 που ακολουθείται από ανοσοκαταβύθιση όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. suPAR στη συνέχεια ανιχνεύθηκε με western blot χρησιμοποιώντας ένα πολυκλωνικό κουνελιού αντιορό που εγείρεται κατά της ανθρώπινης suPAR. B. Capture δοκιμασίες ELISA χρησιμοποιήθηκαν για να μετρηθεί η συγγένεια πρόσδεσης του ΑΤΝ-658 για τις διάφορες suPAR κλώνους που περιγράφονται στο (Α). Σύλληψη στην πλάκα ELISA ήταν μέσω της ετικέτας V5 και ανίχνευσης που χρησιμοποιείται βιοτίνη-ATN-658. Γ Βιοτίνη-ATN-617 χρησιμοποιήθηκε σε μια παρόμοια μορφή ELISA όπως περιγράφεται στο (Β) για να επιβεβαιώσει ότι η εισαγωγή του σημείου μετάλλαξης και μόνο δεν έχουμε μια παγκόσμια επίδραση στην suPAR conformation.ATN-617 cross-αντιδρά με μαϊμού suPAR και όλα κλώνοι εμφανίστηκαν να διατηρούν αυτή την αντιδραστικότητα μετά την εισαγωγή της μετάλλαξης.

η

Ευθυγράμμιση αυτού του επιτόπου σε πολλαπλά είδη uPAR εξηγεί το είδος ιδιαιτερότητα του ATN-658 δεσμευτική (3). Τα παλιά παγκόσμια πρωτεύοντα (πίθηκοι, οι χιμπατζήδες) είναι εξελικτικά πιο κοντά στον άνθρωπο και να έχουν ομόλογα uPAR σε άνθρωπο με το επιτόπιο για ATN-658. ATN-658 σύνδεση έχει παρατηρηθεί με ανοσοϊστοχημεία σε χιμπατζή ιστούς συνεπής με αυτή την παρατήρηση. Αντίθετα, νέο κόσμο πρωτευόντων (μακάκων, AGM) uPAR διαφέρει στις περισσότερες περιπτώσεις σε ένα μόνο κατάλοιπο, ΑΑ 268, και αυτό αρκεί για να καταργήσει πλήρως την δέσμευση του ΑΤΝ-658. Το uPAR κατώτερων θηλαστικών προκειμένου διαφέρει επίσης σε αυτή τη θέση καθώς και άλλοι συνεπής με την έλλειψη δέσμευσης της ΑΤΝ-658 για uPAR ή κύτταρα που εκφράζουν uPAR από τα εν λόγω είδη, καθώς και (Πίνακας 3).

Η

επιβεβαίωση της ATN-658 επιτόπου από υδρογόνο /δευτέριο Exchange Φασματομετρίας μάζας (H /D-Ex)

υδρογόνου-δευτερίου (

1-D) ανταλλαγή είναι ένα χρήσιμο εργαλείο για τον εντοπισμό των χώρων ή των διασυνδέσεων σύνδεση με τις πρωτεΐνες. Μετά τη μετάταξη από το νερό σε ένα σύστημα διαλύτη δευτερίου-based (βαρύ ύδωρ) μια πρωτεΐνη που θα παρουσιάσουν αύξηση της μάζας, όπως τα άτομα υδρογόνου πρωτεΐνη σταδιακά αντικαθίστανται με deuterons. Η πιθανότητα να λάβει χώρα ανταλλαγή υδρογόνου-δευτερίου καθορίζεται σε μεγάλο βαθμό από τη δομή της πρωτεΐνης και την προσβασιμότητα διαλύτη. Διαφορές στην τιμή του αμιδίου ανταλλαγή υδρογόνου προσδιορισμό της θέσης ενός επιτόπου.