Αφηρημένο

Ο καρκίνος του προστάτη είναι ο κορυφαίος της αιτίας του καρκίνου που σχετίζονται με το θάνατο στους άνδρες. Παρά τις εντατικές επενδύσεις στη βελτίωση της έγκαιρης διάγνωσης, συχνά διαφεύγει έγκαιρη διάγνωση. Η θνησιμότητα παραμένει σε υψηλά επίπεδα σε καρκίνο του προστάτη σε προχωρημένο στάδιο, όπου παρηγορητική φροντίδα παραμένει η μόνη επιλογή. Κατά συνέπεια, οι αποτελεσματικές στρατηγικές για την πρόληψη της εμφάνισης και εξέλιξης της νόσου. Φυτικής προέλευσης ενώσεων έχουν μια σημαντική πηγή αρκετών κλινικά χρήσιμες αντι-καρκινικοί παράγοντες και προσφέρουν μία ελκυστική προσέγγιση κατά του καρκίνου του προστάτη. Έχουμε προηγουμένως έδειξαν ότι το εκχύλισμα μεθανόλης του Maytenus royleanus (ΜΕΜ) αφήνει και τα κλάσματα του έχουν σημαντική αντιοξειδωτική δράση με θεραπευτικό δυναμικό έναντι ελευθέρων ριζών συνδεδεμένων ζημιές. Η παρούσα μελέτη αξιολόγησε την αντι-πολλαπλασιαστική δράση του ΜΕΜ στο σύστημα μοντέλο καρκίνου του προστάτη. Ανάλυση των ΜΕΜ και διαφόρων κλασμάτων του αποκάλυψε την παρουσία τριτερπενοειδή, φλαβονοειδή και ταννίνες, συζευγμένο με μία ή περισσότερες πολικές ομάδες και τμήματα υδατανθράκων. Περαιτέρω μελέτες κατά τα γνωστά πρότυπα αποδείξει την ύπαρξη καφεϊκό οξύ και η κερκετίνη 3-ραμνοζίδιο σε διάφορες συγκέντρωση σε διαφορετικά κλάσματα ΜΕΜ. ανάλυση πορεία Χρόνος ΜΕΜ θεραπεία του καρκίνου του προστάτη κύτταρα έδειξαν μία σημαντική μείωση στη βιωσιμότητα των κυττάρων, η οποία αξιολογείται από ΜΤΤ και προσδιορισμούς κλωνογονική επιβίωση. Αυτό συνοδεύτηκε από G2 διακοπή φάση του κυτταρικού κύκλου, προς τα κάτω ρύθμιση της κυκλίνης /cdk δικτύου και αύξηση των αναστολέων οάκ. κύτταρα κατεργασμένα ΜΕΜ εμφάνισαν διάσπαση της κασπάσης-3 και PARP, και διαμόρφωση των αποπτωτικών πρωτεϊνών, για την ίδρυση απόπτωση ως κύριος μηχανισμός του κυτταρικού θανάτου. Αξίζει να σημειωθεί ότι ΜΕΜ κατέστειλε AR /PSA σηματοδότηση τόσο σε καλλιέργειες καρκινικών κυττάρων προστάτη και στο μοντέλο in vivo. Ενδοπεριτοναϊκή ένεση του ΜΕΜ (1.25 και 2.5 mg /ζώο) σε αθυμικούς γυμνούς ποντικούς εμφυτεύθηκαν με ευαίσθητα κύτταρα ανδρογόνων CWR22Rν1 έδειξαν σημαντική αναστολή στην ανάπτυξη του όγκου και μειωμένα επίπεδα PSA ορού παλινδρομική in vitro ευρήματα. Στο σύνολό τους, τα στοιχεία μας δείχνουν ότι η ΜΕΜ μπορούν να διερευνηθούν περαιτέρω για πιθανές θεραπευτικές δράσεις της έναντι της εξέλιξης του καρκίνου του προστάτη σε ανθρώπους

Παράθεση:. Shabbir Μ, Syed DN, Lall RK, Khan MR, Μουχτάρ Η (2015) Ισχυροί αντι-πολλαπλασιαστική, προ-αποπτωτική δραστηριότητα της Maytenus Royleanus Απόσπασμα από κύτταρα του καρκίνου του προστάτη: Αποδεικτικά στοιχεία σε

In-Vitro

και

In-Vivo

μοντέλα. PLoS ONE 10 (3): e0119859. doi: 10.1371 /journal.pone.0119859

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Ying-Jan Wang, Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Cheng Kung, Ταϊβάν

Ελήφθη: 12 Σεπτεμβρίου, 2014? Αποδεκτές: 17, Ιανουαρίου 2015? Δημοσιεύθηκε: 23 Μαρτίου, 2015

Copyright: © 2015 Shabbir et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Υποστήριξη παρέχεται από το Εθνικό Ινστιτούτο υγείας /National Cancer Institute RO1CA160867. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

παρά την πρόοδο στη διάγνωση και τη θεραπεία, ο καρκίνος του προστάτη παραμένει ένα από τα πιο κοινά προβλήματα υγείας που επηρεάζουν τους άνδρες κατά τη διάρκεια της ζωής τους. Πράγματι, ο καρκίνος του προστάτη είναι η δεύτερη κύρια αιτία θανάτου μεταξύ των ανδρών στις Ηνωμένες Πολιτείες και σε πολλές δυτικές χώρες [1]. Πρόσφατα έργου δεδομένα που του προστάτη, των πνευμόνων και του καρκίνου του παχέος εντέρου θα αντιπροσωπεύουν περίπου το ήμισυ του συνόλου των νεοδιαγνωσθέντων κρουσμάτων καρκίνου στους άνδρες το 2014, με καρκίνο του προστάτη και μόνο ευθύνεται για περίπου 1 στις 4 περιπτώσεις [2].

Ο υποδοχέας ανδρογόνων (AR) που ανήκει στην υπερ οικογένεια των πυρηνικών υποδοχέων παίζει ζωτικό ρόλο στην ανάπτυξη, λειτουργία και την ομοιόσταση του προστάτη [3]. Παρουσία ενός συνδέτη, όπως διυδροτεστοστερόνη (DHT) επάγει φωσφορυλίωση και διαμορφωτική αλλαγή στο AR, με αποτέλεσμα την πυρηνική μετατόπιση του, όπου συνδέεται με στοιχεία απόκρισης ανδρογόνων σε γονίδια-στόχους και ρυθμίζει την μεταγραφή. Υπερ-έκφραση του AR και προς τα πάνω ρύθμιση μεταγραφικής δραστηριότητας του είναι συχνά παρατηρείται σε προχωρημένο καρκίνο του προστάτη [4, 5]. Θεραπεία στέρησης ανδρογόνων παραμένει το πρότυπο φροντίδας για τη θεραπεία της νόσου σε προχωρημένο στάδιο. Παρά την αρχική θετική απάντηση, σχεδόν όλοι οι ασθενείς πάντοτε να εξελιχθεί σε μια πιο επιθετική, ευνουχίζεται ανθεκτικό φαινότυπο. Μελέτες σε δείγματα ασθενών δείχνουν ότι το AR εκφράζεται σε σχεδόν όλους τους καρκίνους του προστάτη, τόσο πριν όσο και μετά τη θεραπεία ανδρογόνων [6]. Στην πραγματικότητα, ειδικού προστατικού αντιγόνου (PSA), η οποία κωδικοποιείται από ένα γονίδιο που αποκρίνονται στο ανδρογόνο, έχει ανιχνευθεί στην πλειονότητα των καρκίνων ορμονικά ανθεκτικών, υποδεικνύοντας ότι η οδός σηματοδότησης AR είναι ακόμη λειτουργικό σε αυτούς τους καρκίνους [7].

Έλεγχος για PSA, σε συνδυασμό με δακτυλική εξέταση και βιοψία με βελόνα, έχουν βελτιώσει την επιβίωση των ασθενών με τη διευκόλυνση ανίχνευση των πρώιμων και εντοπισμένη νόσο. Ωστόσο, θεραπεία για τον προχωρημένο και μεταστατική νόσο είναι ακόμα άπιαστο [8]. Οι τρέχουσες προσεγγίσεις ιατρικής θεραπείας περιλαμβάνουν χειρουργική επέμβαση, ακτινοθεραπεία και χημειοθεραπεία, είτε ως μονοθεραπεία ή σε πολυτροπική προσέγγιση [8]. Ο ρόλος της διατροφής στον καρκίνο του ανθρώπου έχει αποκτήσει ιδιαίτερη προσοχή κατά τις τελευταίες δεκαετίες και έχει οδηγήσει σε μια παραδειγματική στροφή στην κατανόηση της πρόληψης και της θεραπείας του καρκίνου. Υπάρχουν αναδυόμενες αποδείξεις ότι η διατροφή, η σωματική δραστηριότητα και σωματικό βάρος συχνά ονομάζονται παράγοντες του ενεργειακού ισοζυγίου είναι σημαντικοί παράγοντες για την τροποποίηση της εξέλιξης του καρκίνου και μπορεί να συνδέεται με αυξημένο κίνδυνο υποτροπής του καρκίνου [9]. Προς το παρόν, οι μελέτες διεξάγονται για να αυξηθεί η κατανόηση της σχέσης μεταξύ διατροφής και του καρκίνου του προστάτη. Βέλτιστη διατροφή μπορεί να μειώσει τη συχνότητα εμφάνισης του καρκίνου του προστάτη και μπορεί να βοηθήσει στη μείωση του κινδύνου εξέλιξης της. Συμπεριλαμβανομένων πολύχρωμο, φυτικής προέλευσης τρόφιμα και τη διατήρηση ενός υγιούς βάρους έχουν προταθεί ως σημαντικές στρατηγικές διατροφής για τους επιζώντες του καρκίνου του προστάτη [10]. Μια πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι η χαμηλή συγκέντρωση του προστάτη του λυκοπενίου συνδέεται με την ανάπτυξη του καρκίνου του προστάτη σε ασθενείς με υψηλού βαθμού προστατική ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία [11]. Η προσκόλληση στη μεσογειακή διατροφή που αποτελείται από άφθονα φρούτα, λαχανικά, όσπρια, ξηρούς καρπούς, δημητριακά ανεπεξέργαστα, το ελαιόλαδο και μέτριες ποσότητες ψαριών συσχετίστηκε με χαμηλή συνολική θνησιμότητα μετά τη διάγνωση του καρκίνου του μη μεταστατικό προστάτη [12].

Maytenus royleanus ανήκει στην οικογένεια Celastraceae, μια μεγάλη οικογένεια που αποτελείται από περίπου 100 γένη και 1300 είδη, διανέμονται ευρέως στον κόσμο. Αρκετές είδη Maytenus έχουν χρησιμοποιηθεί στην παραδοσιακή ιατρική, για τη θεραπεία των γαστρεντερικών διαταραχών, πυρετός, αρθρίτιδα κ.λπ. [13, 14]. Οι βιολογικές δραστηριότητες των ειδών Maytenus αποδίδεται στην παρουσία των διαφόρων κατηγοριών των δευτερογενών μεταβολιτών όπως φαινολικές γλυκοσίδες, φλαβονοειδή και τριτερπένια [15]. Σε προηγούμενες μελέτες μας, έδειξαν ότι το εκχύλισμα μεθανόλης του Maytenus royleanus (ΜΕΜ) αφήνει και τα παράγωγα κλάσματα του κατείχε σημαντική αντιοξειδωτική δράση με θεραπευτικές δυνατότητες ενάντια στις ελεύθερες ρίζες οι ζημίες [15]. Εδώ, μελετήσαμε την επίδραση της ΜΕΜ επί του πολλαπλασιασμού κυττάρων καρκίνου του προστάτη και αποδεικνύουν ότι ΜΕΜ αναστέλλει την ανάπτυξη και τη βιωσιμότητα τόσο των ανδρογόνων ευαίσθητες και ανδρογόνο-ανεξάρτητου καρκίνου του προστάτη κύτταρα και εξασκεί ισχυρή ανασταλτική επίδραση επί AR /PSA σηματοδότηση και τα δύο σε in vitro καλλιέργειες κυττάρων και σε vivo ξενομοσχεύματα όγκου.

Υλικά και Μέθοδοι

Υλικά |

Τα αντισώματα έναντι cdk2, cdk4, CDK6, κυκλίνη Β1, κυκλίνη D1, κυκλίνη D2, κυκλίνη Ε, p27, p21, PSA, πολυ (ADP-ριβόζη) πολυμεράσης (PARP), Bcl-2, Βαχ, Bak, Bcl-XL και AR ελήφθησαν από την Cell Signaling Technology (Beverly, ΜΑ). Αντι-ποντικού και αντι-κουνελιού δευτερογενές αντίσωμα ραφανιδικής ανά-οξειδάση ελήφθη από την Amersham Pharmacia Βιοεπιστημών. Η Protein Assay Bio-Rad DC Kit αγοράστηκε από την Bio-Rad, CA. Novex προκατασκευασμένα πηκτώματα Τπδ-γλυκίνης λήφθηκαν από την Invitrogen. Η αννεξίνη-V-FLUOS Χρώση Kit αγοράστηκε από την Roche.

Παρασκευή φυτικό εκχύλισμα

Αποξηραμένα φύλλα ΜΕΜ πρώτα κονιορτοποιημένου που ακολουθείται από δύο εκχυλίσεις με 95% μεθανόλη. Φιλτραρισμένο ΜΕΜ ξηραίνεται με ψεκασμό και αιωρήθηκε σε 50 ml απεσταγμένο νερό και τα κλάσματα παρασκευάστηκαν σε 200 ml των διαλυτών με αυξανόμενης πολικότητας δηλαδή, η-εξάνιο, οξικό αιθυλεστέρα και η-βουτανόλη. Κάθε στρώση διαχωρίστηκε με έντονη ανάδευση και το διαλυτό απομείνει χρησιμοποιήθηκε ως υπολειμματικό υδατικό κλάσμα.

φυτοχημικές διαλογής

[Α] Υγρό ανάλυση χρωματογραφίας φασματομετρίας μάζας.

ΜΕΜ αναλύθηκε με LC-MS για να δημιουργήσει ένα δακτυλικό αποτύπωμα των φυτοχημικών που υπάρχουν στο φυτό. Αποξηραμένα δείγμα ΜΕΜ και διαφόρων κλασμάτων του διαλύθηκαν σε 15 mg /ml μεθανόλης. Αδιάλυτα σωματίδια απομακρύνθηκαν και 10 μΙ του δείγματος υποβλήθηκε σε χρωματογραφία HILIC σε αρνητικό ιονισμό και ανάστροφης φάσης (RP) και οι δύο σε θετικές και αρνητικές καταστάσεις ιονισμού να στοχεύσουν φλαβονοειδή και φαινολικά οξέα. Για HILIC διαχωρισμό, τα δείγματα χρωματογραφικά επιλυθεί με Phenomenex Luna HILIC, 3μm, στήλη 2x150mm επί Agilent 1200 HPLC (Agilent, CA) με ένα αυτόματο δειγματολήπτη διατηρήθηκε στους 5 ° C, χρησιμοποιώντας γραμμική βαθμίδα 10 mM μυρμηκικού αμμωνίου (ρΗ = 4,5) σε νερό και 1 mM μυρμηκικού αμμωνίου (ρΗ = 4,5) σε 99% ακετονιτρίλιο για 45 λεπτά. Για θετικό διαχωρισμό RP, τα δείγματα χρωματογραφικά επιλυθεί με Agilent ZORBAX 300SB-C18, 1.8μm, στήλη 2.1x50mm σε Agilent 1200 HPLC (Agilent, ΡβΙο Alto, CA) με ένα αυτόματο δειγματολήπτη διατηρήθηκε στους 5 ° C, χρησιμοποιώντας γραμμικό βαθμιαίο διαλύτη από 0,1% μυρμηκικό οξύ σε νερό και 0,1% μυρμηκικό οξύ σε ακετονιτρίλιο επί 60 λεπτά. Για αρνητικούς διαχωρισμού RP, παρόμοια ρύθμιση του οργάνου για τη θετική λειτουργία χρησιμοποιήθηκε ως ανωτέρω κατά την αλλαγή της κινητής φάσης σε μία γραμμική βαθμίδα 10 mM μυρμηκικού αμμωνίου (ρΗ 6.5) σε νερό και 1 mM μυρμηκικού αμμωνίου (ρΗ 6.5) σε 99% ακετονιτρίλιο για 45 λεπτά. Ο ρυθμός ροής, τόσο για τους τρόπους διαχωρισμού ήταν 250 μλ /λεπτό.

[B] Υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC) του εκχυλίσματος φυτών.

250 mg σκόνης φυτό εκχυλίζεται με 10 ml 25% HCl και 25 ml χλωροφορμίου. Το εκχύλισμα διηθήθηκε και αραιώθηκε στα 100 ml. 10μl του φιλτραρισμένου δείγματα εγχύθηκαν στο σύστημα HPLC Agilent 1200. Διαχωρισμός πραγματοποιήθηκε μέσω μιας στήλης C18 εξοπλισμένο με UV-VIS ανιχνευτή Spectra-Focus, μπεκ και αυτόματη δειγματολήπτη). Τριφθοροοξικό οξύ και ακετονιτρίλιο χρησιμοποιήθηκαν ως κινητές φάσεις με ταχύτητα ροής 1 ml /min. Καφεϊκό οξύ και η κερκετίνη 3-ραμνοζίδιο χρησιμοποιήθηκαν ως εσωτερικά πρότυπα για συγκριτική ανίχνευσης εντός των κλασμάτων ΜΕΜ. Οι καμπύλες βαθμονόμησης παράχθηκαν για τις δύο πρότυπες ενώσεις στην κλίμακα ποσότητας δείγματος (0.02-0.5 μg). Όλα τα πειράματα έγιναν εις τριπλούν.

Η επεξεργασία των κυττάρων

C

4-2 και τα κύτταρα ανθρώπινου καρκινώματος του προστάτη CWR22Rν1 αγοράστηκαν από την ATCC (American συλλογή καλλιεργειών τύπου). Αμφότερες οι κυτταρικές γραμμές αναπτύχθηκαν σε RPMI 1640 (Life Technologies, ΝΥ) συμπληρωμένο με 10% FBS και 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη, με 5% CO

2, στους 37 ° C. ΜΕΜ διαλύθηκαν σε DMSO χρησιμοποιήθηκε για την θεραπεία των κυττάρων. Τα κύτταρα σε συρροή ~ 70% έλαβαν θεραπεία με ΜΕΜ κατά 10-100 /ml για 24 ώρες σε πλήρες μέσο κελί όπου η τελική συγκέντρωση του DMSO που χρησιμοποιείται για κάθε επεξεργασία ήταν μικρότερη από 0,1% (ν /ν).

Κυτταρική βιωσιμότητα δοκιμασία

3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλ tetrazoliumbromide (ΜΤΤ) χρησιμοποιήθηκε για να μελετηθεί η επίδραση της ΜΕΜ επί της βιωσιμότητας των C

4-2, PC3, DU145 και CWR22Rν1cell γραμμές. Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν (1 × 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο) σε 1 ml πλήρους μέσου καλλιέργειας που περιέχει 10-200 /συγκεντρώσεις ΜΕΜ ml σε πλάκες μικροτιτλοδότησης 24 φρεατίων. Μετά από επώαση σε υγρό επωαστήρα για 24 ώρες στους 37 ° C, 200 μΐ ΜΤΤ (5 mg /ml: 1XPBS) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και επωάστηκαν για δύο ώρες, μετά το οποίο προστέθηκαν 200 μΐ DMSO. Οι πλάκες στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν (1800 χ g για 5 λεπτά στους 4 ° C). Η απορρόφηση στα 540nm καταγράφηκε σε ένα αναγνώστη μικροπλάκας. Η επίδραση της ΜΕΜ στην αναστολή της ανάπτυξης υπολογίστηκε ως βιωσιμότητα% των κυττάρων όπου τα κύτταρα DMSO-αγωγή λήφθηκαν ως 100% έλεγχος.

κλωνογονική δοκιμασία

Το αποτέλεσμα της θεραπείας επί κλωνογονική επιβίωση των καρκινικών κυττάρων του προστάτη προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία σχηματισμού αποικίας. Τόσο CWR22Rν1 και C

4-2 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις (20, 40 & amp? 60 μg /ml) του ΜΕΜ σε RPMI-1640 πλήρες μέσο. Μετά την αγωγή, τα κύτταρα επανα-επιστρώθηκαν εις τριπλούν σε μία πλάκα καλλιέργειας ιστού 6-φρεατίων με 5.000 κύτταρα /φρεάτιο και καλλιεργήθηκαν σε 5% CO2 στους 37 ° C για 8 ημέρες με μέσο ανάπτυξης που αντικαθίσταται με /χωρίς ΜΕΜ κάθε 2 ημέρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια χρωματίστηκαν με 0.5% κρυσταλλικό ιώδες (σε μεθανόλη: H

2O? 1: 1) και ελήφθησαν εικόνες χρησιμοποιώντας μια ψηφιακή φωτογραφική μηχανή. Οι εικόνες ήταν αυξημένη χρήση του Adobe Photoshop για τη φωτεινότητα, την αντίθεση και αιχμηρά για την ομοιομορφία της εμφάνισης.

κυτταρικού κύκλου ανάλυσης /απόπτωσης με κυτταρομετρία ροής

CWR22Rν1 και C

4-2 κύτταρα υποβάλλονται σε επεξεργασία με ΜΕΜ (20-60μM: 24h) σε πλήρες μέσον τρυψινοποιήθηκαν και σταθεροποιήθηκαν σε 1% παραφορμαλδεΰδη: 1XPBS για μια ώρα και πλύθηκαν δύο φορές με ψυχρό PBS και φυγοκεντρήθηκαν. Το σφαιρίδιο αιωρήθηκε σε παγωμένο 70% αιθανόλη και αποθηκεύεται όλη τη νύκτα. Στη συνέχεια, τα κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν για 5 λεπτά στις 1000 rpm, και το σφαιρίδιο που ελήφθη πλύθηκε δύο φορές με ψυχρό PBS για να απομακρυνθεί η αιθανόλη. Τα κύτταρα σημάνθηκαν με ΡΙΤΟ και ιωδιούχο προπίδιο χρησιμοποιώντας το Αρο-Direct Kit (BD Pharmagen, CA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η ανάλυση διεξήχθη με ένα FACScan (Becton Dickinson, NJ). Περίπου 10.000 κύτταρα ανά δείγμα συλλέχθηκαν και τα ιστογράμματα DNA αναλύθηκαν με το λογισμικό ModFitLT (Αληθώς Software House, ΜΕ).

εκχύλιση πρωτεϊνών και κηλίδος Western ανάλυση

Μετά την επεξεργασία με ΜΕΜ παγωμένο λύσης ρυθμιστικό προστέθηκε στα κύτταρα (50 nmol /λίτρο Tris-HCl, 150 mmol /λίτρο NaCl, 1 mmol /λίτρο EGTA, 1 mmol /λίτρο EDTA, 20 mmol /λίτρο NaF, 100 mmol /λίτρο Na3VO4, 0.5% Nonidet Ρ-40, 1% Triton Χ-100, 1 mmol /λίτρο PMSF, ρΗ 7.4) με αναστολείς πρωτεάσης (Calbiochem, Germany) επωάστηκε πάνω σε πάγο για 20 λεπτά. Για την κηλίδωση Western πηκτές πολυ ακρυλαμιδίου 8-12% χρησιμοποιήθηκε για την επίλυση 40μg της πρωτεΐνης, μεταφέρθηκαν σε μια μεμβράνη νιτροκυτταρίνης, διερευνήθηκαν με κατάλληλα μονοκλωνικά πρωτογενή αντισώματα, και ανιχνεύθηκαν με χημειοφωταύγεια αυτοραδιογραφία μετά από επώαση με ειδικά δευτερογενή αντισώματα.

η γονιδιακή έκφραση ανάλυση

Ολικό RNA απομονώθηκε από κύτταρα χρησιμοποιώντας ένα εμπορικό κιτ RNeasy (Qiagen, CA) συγκέντρωση RNA μετρήθηκε φασματοφωτομετρικά στα 260 nm και cDNA έγινε, ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Το μίγμα της αντίδρασης παρασκευάσθηκε να περιέχει 10 μι FastStart καθολική SYBR πράσινο κύριο (Roche, Germany), αντίστροφους εκκινητές 6μΜ, και cDNA 10 μg, με ΚΝΑάση ελεύθερο νερό προστίθεται σε ένα συνολικό όγκο 20 μί. Η ανάλυση ενίσχυση και σε πραγματικό χρόνο έγινε για 40 κύκλους με τους ακόλουθους παράγοντες? 95 ° C (10 λεπτά) προκειμένου να ενεργοποιηθεί από Fast Έναρξη Taq DNA πολυμεράση? 60 ° C (1 λεπτό) για ενίσχυση και σε πραγματικό χρόνο ανάλυση. Τα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας 2

-ΔΔCT. Primer αλληλουχία που χρησιμοποιήθηκαν ήταν? AR Sense 5′-CTGGACACGACAACAACCAG-3 ‘? AR Αντινόημα 5’- CAGATCAGGGGCGAAGTAGA-3 ‘? GAPDH Sense 5′-AAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT-3? GAPDH Αντινόημα 5’-ACAAAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3 ‘.

ανοσοφθορισμού μικροσκοπία

C

4-2 και τα κύτταρα CWR22Rν1 σπάρθηκαν σε ένα δύο-θάλαμο γυάλινες πλάκες καλλιέργειας ιστών και αντιμετωπίζονται με 40 μg /ml ΜΕΜ σε 70% συρροή για 24 ώρες. Μετά την πλύση με PBS τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 2% παραφορμαλδεΰδη ακολουθούμενη από διαπερατότητας με μεθανόλη και αποκλεισμός με 2% ορό. Η επώαση με πρωτογενή αντισώματα όλη τη νύκτα ακολουθήθηκε από επώαση με κατάλληλες φθοροφόρο tagged δευτερογενή αντισώματα. Αντιξεθωριάσματος DAPI (Invitrogen, ΝΥ) χρησιμοποιήθηκε ως μέσο στήριξης και αντικηλίδωση. Για την ανάλυση, χρησιμοποιήθηκε Bio-Rad Radiance 2100 σύστημα MP Rainbow για βιολογική απεικόνιση. Για την ανίχνευση αποπτωτικών και νεκρωτικών κυττάρων αννεξίνης-ν-Fluos Χρώση Kit (Roche, Ελβετία) χρησιμοποιήθηκε σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Zeiss LSM 410 συνεστιακή μικροσκοπία χρησιμοποιήθηκε για να μετρηθεί φθορισμός. Τα κύτταρα βάφονται με Annexin-V και μη χρωματισμένα κύτταρα σε ένα επιλεγμένο πεδίο μετρήθηκαν για να εξακριβωθεί η έκταση της απόπτωσης και νέκρωσης.

PSA ELISA

Για τον ποσοτικό προσδιορισμό των επιπέδων του PSA στο C

4-2 και CWR22Rν1 κύτταρα ανθρώπινου PSA κιτ ELISA (Anogen, Ontario, Canada) χρησιμοποιήθηκε σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

Ηθικοί για μελέτες σε ζώα

αθυμικά μελέτες γυμνά ποντίκια διεξήχθησαν σύμφωνα στις θεσμικές κατευθυντήριες γραμμές για τη φροντίδα και χρήση των ζώων και εγκρίθηκαν από φροντίδας των ζώων και την Επιτροπή χρήσης, Σχολή Ιατρικής και Δημόσιας Υγείας του Πανεπιστημίου του Wisconsin-Madison.

In vivo μοντέλο ξενομοσχεύματος όγκου

αθυμικών (ηυ /ηυ) αρσενικά γυμνά ποντίκια ελήφθησαν από NxGen Biosciences (San Diego, CA) στεγάστηκαν υπό συνθήκες χωρίς παθογόνα (12 ώρες φωτός /12h σκοτάδι πρόγραμμα) και τροφοδοτείται με ένα αυτόκαυστο adlibitum δίαιτα. Έχουμε επιλέξει κύτταρα CWR22Rν1 για τον προσδιορισμό των in vivo επιδράσεις της ΜΕΜ όπως αυτά τα κύτταρα σχηματίζουν την ταχεία και επαναλήψιμη όγκων σε γυμνούς ποντικούς. Η εμφύτευση των κυττάρων CWR22Rν1 είναι επίσης υπεύθυνη για την έκκριση σημαντικών ποσοτήτων του PSA στην κυκλοφορία του αίματος του ξενιστή. ξενομοσχεύματα όγκου σε ποντίκια καθορίστηκαν με υποδόρια ένεση κυττάρων CWR22Rν1 (1 × 10

6) αναμιγνύεται με Matrigel (Collaborative Biomedical Products, ΜΑ) σε αναλογία 1: 1. Δεκαοκτώ ζώα επιλέχτηκαν τυχαία σε τρεις ομάδες που αποτελούνται από έξι ζώα η κάθε μία. Η πρώτη ομάδα ζώων που χρησιμεύουν ως ομάδα ελέγχου έλαβε DMSO ενδοπεριτοναϊκώς (ε.π.). Τα ζώα των ομάδων 2 και 3 έλαβαν ε.π. ένεση του ΜΕΜ, 1.25mg και 2,5 mg ανά ζώο, αντίστοιχα, δύο φορές την εβδομάδα και σε όλη τη μελέτη του σωματικού βάρους, της δίαιτας και της κατανάλωσης νερού καταγράφηκαν. Ο όγκος του όγκου υπολογίσθηκε από τον τύπο 0,5238 × L1 L2 × × H (L1 = μακρά διάμετρος, L2 = μικρή διάμετρο, και Η = ύψος του όγκου) και τα μεγέθη των όγκων μετρήθηκαν δύο φορές την εβδομάδα. Τα ζώα θανατώθηκαν με τη μέθοδο εισπνοή CO2 ακόλουθες κατευθυντήριες γραμμές ARAC, όταν ο όγκος του όγκου έφτασε σε ~ 1200 χιλιοστά

3. Συλλέχθηκαν δείγματα αίματος από το κάτω γνάθου εξαέρωσης και ο ορός διαχωρίζονται από το πλήρες αίμα αποθηκεύτηκε στους -20 ° C. Ορού επίπεδα PSA αναλύθηκαν με το κιτ PSA ELISA που περιγράφεται παραπάνω. Η &? Ε χρώση διαφάνειες του πνεύμονα, νεφρού, ήπατος, καρδιάς και του εγκεφάλου παρασκευάστηκαν για να εξετάσει τις πιθανές τοξικές επιδράσεις της θεραπείας ΜΕΜ

Ανοσοϊστοχημεία

ιστούς όγκων τομές βάφτηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη για. μορφολογική απεικόνιση. Επιπλέον, οι ιστοί σταθεροποιήθηκαν σε 10% φορμαλίνη υποβλήθηκαν σε ανοσοϊστοχημική ανάλυση. Εν συντομία, μετά αποπαραφινώσεως σε ρυθμιστικό κιτρικού νατρίου, οι τομές επωάστηκαν για μία νύχτα με αντισώματα έναντι διασπασμένης κασπάσης-3 και ιστόνης 3-φωσφορικής (Η3-Ρ) [1:75] (Cell Signaling, ΜΑ) που ακολουθείται από επώαση με τα κατάλληλα συζευγμένο με HRP δευτερογενούς αντισώματα, diamminobenzidine /DAB (DAKO, CA) χρώση και την καταπολέμηση χρώση με αιματοξυλίνη. Μετά την τοποθέτηση με Permount, οι τομές καλύφθηκαν με καλυπτρίδες και χρώση αναλύθηκε από έναν έμπειρο παθολόγο τυφλωμένο σε ομάδες θεραπείας.

Στατιστική Ανάλυση

Όλοι στατιστική ανάλυση διεξήχθη με GraphPad Prism (San Diego , CA) και οι τιμές ρ & lt?. 0.05 θεωρήθηκαν σημαντικές

Αποτελέσματα

φυτοχημική ανάλυση των ΜΕΜ

ΜΕΜ μαζί με κ-εξάνιο, βουτανόλη, οξικό αιθυλεστέρα και υπολειμματικό υδατικό κλάσματα διαχωρίστηκαν με ανάλυση LC-MS. Αυτή η τεχνική χρησιμοποιείται κυρίως για να δημιουργήσει ένα δακτυλικό αποτύπωμα του φυτοχημικές σύνθεση του ΜΕΜ. Το εκχύλισμα φαίνεται να είναι ένα πολύπλοκο μίγμα αγνώστων φυτοχημικά όπως φαίνεται στην κορυφή βάσης χρωματογράφημα του χρωματογραφήματος HILIC (-νε) (Εικ. 1). Η HILIC κίνηση του ΜΕΜ έδειξε την παρουσία 164 ενώσεις που βασίζονται σε κορυφές βάση που παράγεται από μοριακή μάζα χρόνος και κατακράτηση των ενώσεων (Εικ 1Α?. Δεδομένα επισυνάπτεται ως S1_Dataset). Επεκτείνοντας την ίδια ανάλυση δεδομένων με τα άλλα κλάσματα σε HILIC λειτουργία (-νε), το κλάσμα κ-βουτανόλη περιέχονται 79 ενώσεις, ενώ ο οξικός αιθυλεστέρας και η-εξάνιο κλασμάτων έδειξε 69 και 40 ενώσεις αντίστοιχα. C18 RP (-νε) χρωματογράφημα του υπολειμματικού υδατικού κλάσματος έδειξε την παρουσία 84 ενώσεων, ενώ ο HILIC (-νε) έδειξε 83 ενώσεις. Με βάση την προκαταρκτική αποδεικτικά στοιχεία που προκύπτουν από τα δεδομένα LC-MS, που περιγράφονται παραπάνω (Εικ. 1Α), περαιτέρω ανάλυση διεξήχθη για να κατηγοριοποιήσει τις ενώσεις της αντικειμενικής υπόστασης των ΜΕΜ, χρησιμοποιώντας ανιχνευτές σειρά UV-διόδου. Caffeic οξύ και η κερκετίνη-3-ραμνοζίδιο ταυτοποιήθηκαν με σύγκριση UV τους και MS φάσματα στα αντίστοιχα εσωτερικά πρότυπα. υν φάσματα των κλασμάτων η-εξάνιο, οξικό αιθυλεστέρα και η-βουτανόλη αποκάλυψε την παρουσία καφεϊκό οξύ και η κερκετίνη-3-ραμνοζίδιο σε ποικίλες συγκεντρώσεις υποδεικνύοντας ότι ΜΕΜ έχει υψηλή περιεκτικότητα σε φλαβονοειδή με γνωστή αντικαρκινική δράση (Εικόνα 1Β?. S1 Εικ ).

α. Πίνακας συνολικός αριθμός των ενώσεων που βρίσκονται σε ΜΕΜ και διάφορα κλάσματα του με HILIC και C18 RP χρωματογραφίας, με βάση το χρόνο κατακράτησης και μοριακή μάζα? Σύνολο χρωματογραφήματα ιόντων διαφόρων κλασμάτων: κλάσμα οξικό αιθυλεστέρα (-νε HILIC)? κλάσμα κ-βουτανόλη (-νε HILIC)? η-εξάνιο κλάσματος (-νε HILIC)? υδατικό κλάσμα (-νε HILIC)? υδατικό κλάσμα (-νε C18 RP). σι. χρωματογραφήματα υπεριώδους του οξικού αιθυλεστέρα κ-εξάνιο και κ-βουτανόλη κλάσματα ΜΕΜ, στα 280, 320 & amp? 370 nm, με το καφεϊκό οξύ και quercetin 3-ραμνοζίδιο εσωτερικών προτύπων.

Η

ΜΕΜ αναστέλλει την ανάπτυξη και τη βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων του προστάτη

Δεδομένου ότι και οι δύο αυτές ενώσεις είναι γνωστό ότι διαθέτουν δραστηριότητες αντικαρκινική , ζητήσαμε από το εάν η ίδια το εκχύλισμα θα ήταν πιο αποτελεσματική στην αναστολή της ανάπτυξης και της βιωσιμότητας των κυττάρων καρκίνου του προστάτη. Για τη διερεύνηση της αντι-πολλαπλασιαστικού δυναμικού των ΜΕΜ, εκτελέσαμε 3- (4, 5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2, 5-διφαινυλ τετραζόλιο (ΜΤΤ) έναντι ανδρογόνων ευαίσθητα (C

4-2 και CWR22Rν1) και ανδρογόνα-ανεξάρτητο (PC3 και DU-145) καρκινικά κύτταρα του προστάτη. Παρατηρήσαμε ότι η θεραπεία ΜΕΜ (10-180μg /ml για 24 ώρες και 48 ώρες) σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη που προκαλείται αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. ανάλυση πορεία Χρόνος αποκάλυψε ότι υπήρχε μόνο μια μικρή διαφορά μεταξύ της μείωσης της κυτταρικής βιωσιμότητας των κυττάρων στις 24 ώρες και 48 ώρες, υποδηλώνοντας ότι κύτταρα καρκίνου του προστάτη ανταποκρίνονται στη θεραπεία ΜΕΜ εντός 24 ωρών. Όπως φαίνεται στο (Εικ. 2Α), το IC

50 τιμές του ΜΕΜ επεξεργασμένου CWR22Rν1 ήταν 47.4 & amp? 42 μg /ml? για C

4-2, 52.8 & amp? 44,4 μg /ml? για PC3, 61,8 & amp? 36 μg /ml? και για DU145, 90,6 & amp? 88,2 μg /ml για 24 και 48 ώρες αντίστοιχα. Τα δεδομένα πρότειναν ότι ανδρογόνο ευαίσθητη C

4-2 και CWR22Rν1 κύτταρα έδειξαν ελαφρώς καλύτερη ευαισθησία στην θεραπεία ΜΕΜ από DU145 και PC3cells (Εικ. 2Α). Κλωνογονική δοκιμασία επικυρωμένων περαιτέρω αυτά τα ευρήματα, όπου CWR22Rν1 και C

4-2 κύτταρα υποβάλλονται σε επεξεργασία για επτά ημέρες με ΜΕΜ σε 20, 40 & amp? 60 μg /ml έδειξαν μια σημαντική δοσοεξαρτώμενη αναστολή του σχηματισμού αποικιών σε σχέση με τους χωρίς θεραπεία ελέγχους (Σχ. 2Β). Τα διαφορετικά κλάσματα του ΜΕΜ διαχωρίζονται επί τη βάσει της πολικότητας σε διαφορετικούς διαλύτες όπως η-εξάνιο, οξικό αιθυλεστέρα, η-βουτανόλη και νερό ερευνήθηκαν επίσης για ανασταλτική της ανάπτυξης δράση τους επί κυττάρων CWR22Rν1. Το n-εξάνιο και τα υδατικά κλάσματα αποδείχθηκε ότι είναι πιο ισχυρή στην αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων CWR22Rν1 (20 & amp? 36μg /ml) σε σύγκριση με την βουτανόλη και οξικό αιθυλεστέρα κλάσματα (39,6 & amp? 66.8μg /ml). (Εικ. 2C)

α. τα καρκινικά κύτταρα του προστάτη υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ΜΕΜ για 24/48 ώρες, και η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με ανάλυση ΜΤΤ. Ο πίνακας δείχνει το IC

50

CWR

22Rν1, C

4-2, PC-3 και DU145 σε 24 και 48 ώρες. Μέση ± SD των πειραμάτων που πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν φαίνεται. σι. Δοσο-εξαρτώμενο αποτέλεσμα των ΜΕΜ επί κλωνογονίας του

CWR

22Rν1 και C

4-2 κυττάρων όπως ανιχνεύεται με δοκιμασία σχηματισμού αποικίας. Λεπτομέρειες περιγράφονται στο υλικό μεθόδους. ντο. Επίδραση διαφόρων κλασμάτων (η-εξάνιο, οξικό αιθυλεστέρα, η-βουτανόλη και υδατικό) επί της βιωσιμότητας του

CWR

22R ν1 κύτταρα, προσδιορίζεται με δοκιμασία ΜΤΤ. * P & lt? 0,05 και ** p & lt?. 0.01 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Η

ΜΕΜ προκαλεί G2 σύλληψη φάση των καρκινικών κυττάρων του προστάτη

Για να εκτιμηθεί το προφίλ του κυτταρικού κύκλου των ΜΕΜ-θεραπεία του προστάτη καρκινικά κύτταρα εκτελέσαμε ανάλυση κυτταρομετρίας ροής και παρατηρήθηκε η επίδραση του ΜΕΜ στην κατανομή του κυτταρικού κύκλου. Ένα σημαντικό δοσοεξαρτώμενη αύξηση του πληθυσμού των κυττάρων στη φάση G2 του κυτταρικού κύκλου παρατηρήθηκε σαν αποτέλεσμα της θεραπείας ΜΕΜ σε CWR22Rν1 και C

4-2 κύτταρα. Η κατανομή κυτταρικού κύκλου φάση G2 για C

4-2 ήταν 25,7%, 44,61%, 59,52% και για CWR22Rν1was 38,6%, 47,72% και 57,72% σε 20, 40 και οι συγκεντρώσεις 60μΜ ΜΕΜ αντίστοιχα (σχήμα 3Α.? S2 σχήμα). Η αύξηση του πληθυσμού των κυττάρων G2 φάση συνοδεύεται από μια ταυτόχρονη μείωση της G0 /G1 και κυτταρικό πληθυσμό S φάση. Στη συνέχεια εξετάσαμε την επίδραση της ΜΕΜ επί ρυθμιστικών μορίων κυτταρικού κύκλου λειτουργική στην G2 φάση του κυτταρικού κύκλου. Η ανάλυση ανοσοκηλιδώσεως έδειξε ότι η θεραπεία ΜΕΜ έως C

4-2 και CWR22Rν1 οδήγησε σε μειωμένη πρωτεΐνη εκφράσεις cdks 2, 4 & amp? 6 και κυκλίνες Β1, D1, D2 & amp? Ε σε σύγκριση με τα δείγματα αναφοράς άνευ αγωγής (Σχ 3Α και 3Β?. S3 Εικ). Αυτό συσχετίστηκε με αξιοσημείωτη επαγωγή ρ21 και ρ27 σε κύτταρα κατεργασμένα ΜΕΜ (Εικ 3D?. S3 Εικ).

α.

CWR

22Rν1 και C

4-2 κύτταρα επεξεργασμένα με ΜΕΜ για 24h βάφτηκαν με ιωδιούχο προπίδιο και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Ποσοστό του πληθυσμού κυττάρων σε G2-φάση του κυτταρικού κύκλου φαίνεται στο κουτί του κάθε ιστόγραμμα. Μέση ± SD των πειραμάτων που πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν φαίνεται. b-d. Επίδραση της θεραπείας ΜΕΜ επί ρυθμιστικές πρωτεΐνες του κυτταρικού κύκλου: Προϊόντα λύσης ολικού κυττάρου του

CWR

22Rν1 και C

4-2 κύτταρα με /χωρίς ΜΕΜ (20-60 μg /ml: 24h) υποβλήθηκαν σε SDS- ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου. Ίση φόρτωση επιβεβαιώθηκε από της ανιχνεύσεως με GAPDH. Τα ανοσοαποτυπώματα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων με παρόμοια αποτελέσματα.

Η

ΜΕΜ επάγει την απόπτωση μέσω της ενεργοποίησης των ενδογενών και εξωγενών οδού

Για να εξεταστεί αν η παρατηρούμενη μείωση στην βιωσιμότητα των κυττάρων συνδέεται με επαγωγή της απόπτωσης εκτελέσαμε χρώση Annexin ΜΕΜ αγωγή καρκινικών κυττάρων του προστάτη. Χρησιμοποιήσαμε αννεξίνης V χαρακτηρισμένες με FITC, η οποία έχει μια ισχυρή και ειδική συγγένεια για φωσφατιδυλοσερίνη, να παρακολουθεί την μετατόπιση της προς την μεμβράνη πλάσματος. κύτταρα κατεργασμένα ΜΕΜ έδειξαν μια σημαντική αύξηση στο πράσινο φθορισμό σε αντίθεση με χωρίς θεραπεία ελέγχους που δείχνει ότι η θεραπεία με επαγόμενη ΜΕΜ απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα προστάτη (S4 Εικ). ανάλυση κυτταρομετρίας ροής πραγματοποιήθηκε στη συνέχεια για την ποσοτικοποίηση του αριθμού των κυττάρων που υφίστανται απόπτωση σαν αποτέλεσμα της θεραπείας ΜΕΜ. Ένα σημαντικό δοσοεξαρτώμενη αύξηση στον πληθυσμό των αποπτωτικών κυττάρων παρατηρήθηκε σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές, ένα αποτέλεσμα της θεραπείας ΜΕΜ (Σχ 4Α?. S4 Εικ). ανάλυση ανοσοκηλίδας χρησιμοποιήθηκε δίπλα για να μελετηθεί η έκφραση των πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην κυτταρική απόπτωση. Caspase-3, ένα μέλος της οικογένειας κασπάσης ασπαρτικού-ειδικών πρωτεασών κυστεΐνης παίζει κεντρικό ρόλο στην εκτέλεση του αποπτωτικού προγράμματος. ΡΑΚΡ-1 είναι ένα από τα πολλά γνωστά κυτταρικά υποστρώματα των κασπασών και διάσπαση της PARP-1 με κασπάσες θεωρείται ότι είναι το σήμα κατατεθέν της απόπτωσης [16]. κύτταρα κατεργασμένα ΜΕΜ έδειξαν αυξημένη έκφραση του ενεργοποιημένου κασπάσης-3? που συνδέονται με την διάσπαση PARP (Σχήμα 4Β?. S5 Εικ) περαιτέρω επικύρωση ότι η απόπτωση είναι ο κύριος μηχανισμός του ΜΕΜ-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο. Για να διερευνηθεί αν επάγεται ΜΕΜ απόπτωση προκαλείται μέσω της ενεργοποίησης του ενδογενούς ή εξωγενούς οδούς μελετήσαμε την επόμενη την έκφραση των κασπασών -8 και -9 σε ΜΕΜ επεξεργασμένα κύτταρα. Βρήκαμε μια επαγωγή διασπασμένη κασπάση-8 σε κύτταρα κατεργασμένα με 20, 40 και 60 μg /ml του ΜΕΜ (σχήμα 4Γ?. S5 Εικ). Η ταυτόχρονη μείωση στην προ-μορφή της κασπάσης-9 και Bid σε CWR22Rν1 και C

4-2 κύτταρα, κατεργασία μετά ΜΕΜ πρότεινε την ενεργοποίηση και των δύο εξωγενών και ενδογενών οδούς της απόπτωσης. Εκτιμήσαμε την επίδραση του εκχυλίσματος σχετικά με την Bcl-2 οικογένεια πρωτεϊνών, που εμπλέκονται στην απόπτωση. ΜΕΜ κατεργασμένα κύτταρα έδειξαν αύξηση στην έκφραση προ-αποπτωτικών Βαχ και Bak και μία μείωση στην έκφραση των αντι-αποπτωτικών Bcl-2 και Bcl-X

L πρωτεΐνες (Εικόνα 4D?. S5 Σχήμα).

α.

CWR

22Rν1 και C

4-2 κύτταρα κατεργασμένα με ΜΕΜ (20-60 μg /ml: 24h) σημάνθηκαν με FITC και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Ποσοστό αποπτωτικών κυττάρων με την αντίστοιχη δόση του ΜΕΜ παρουσιάζεται σε κάθε ιστόγραμμα. Μέση ± SD των πειραμάτων που πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν φαίνεται. b-d. Λύματα ολόκληρων κυττάρων του

CWR

22Rν1 και C

4-2 κύτταρα με /χωρίς ΜΕΜ (20-60 μg /ml: 24h) θεραπεία υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση πηκτής SDS-πολυακρυλαμιδίου. Επίδραση της θεραπείας ΜΕΜ επί πρωτεΐνες που εμπλέκονται σε οδούς της απόπτωσης. Ίση φόρτωση επιβεβαιώθηκε από της ανιχνεύσεως με GAPDH. Τα ανοσοαποτυπώματα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων με παρόμοια αποτελέσματα.

Η

ΜΕΜ μειώνει AR και έκφραση PSA σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη

Τα ανδρογόνα παίζουν σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη και PSA, ένα πολύ γνωστό γονίδιο που αποκρίνονται στο ανδρογόνο είναι σήμερα η πιο αποδεκτή δείκτης για την εκτίμηση της εξέλιξης του καρκίνου του προστάτη σε ανθρώπους [17]. Η επίδραση της θεραπείας ΜΕΜ επί AR και PSA έκφραση εξετάστηκε σε CWR22Rν1and C

4-2 κυτταρικές σειρές που απασχολούν ανοσοκηλίδωση και RT-PCR. Μια σημαντική μείωση της έκφρασης της πρωτεΐνης AR παρατηρήθηκε με τη θεραπεία με ΜΕΜ (Σχήμα 5Α και 5Β?. S6 Εικ). χρώση ανοσοφθορισμού των CWR22Rν1 & amp? C

4-2 κύτταρα έδειξαν μείωση πυρηνικό εντοπισμό του AR σε ΜΕΜ κατεργασμένα κύτταρα σε σύγκριση με μάρτυρες (Εικ. 5Β) .Η CWR22Rν1 και C

4-2 του καρκίνου του προστάτη κύτταρα εμφανίζουν υψηλά επίπεδα πρωτεΐνης ενδοκυτταρικών PSA, όπως αποδεικνύεται από μια 34-kDa ζώνη PSA (εικ. 5Α). Η εξαρτώμενη από τη δόση επίδραση της ΜΕΜ επί CWR22Rν1 και C

4-2 κυττάρων είχε σαν αποτέλεσμα σημαντική μείωση στα επίπεδα της πρωτεΐνης PSA σε 20, 40 και 60 οι συγκεντρώσεις μg /ml (Σχήμα 5Α?. S6 Εικ). Η μείωση στην έκφραση της πρωτεΐνης συνοδεύτηκε από μειωμένα επίπεδα μεταγραφής του AR σε κύτταρα κατεργασμένα ΜΕΜ (Σχ 5C?. S6 Εικ). Έχουμε ακόμη προσδιοριστεί τα εκκρίνεται επίπεδα PSA στο CWR22Rν1 και C

4-2 κυτταρικές σειρές, χρησιμοποιώντας την ποσοτική sandwich τεχνική ELISA. Μια σημαντική μείωση στα επίπεδα PSA σημειώθηκε στις δύο κυτταρικές σειρές με ΜΕΜ (40 μg /ml) αγωγή (Σχ. 5D).

α. Λύματα ολόκληρων κυττάρων του

CWR

22Rν1 και C

4-2 κύτταρα με /χωρίς ΜΕΜ (20-60 μg /ml: 24h) υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση πηκτής SDS-πολυακρυλαμιδίου. Ίση φόρτωση επιβεβαιώθηκε από της ανιχνεύσεως με GAPDH. Τα ανοσοαποτυπώματα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων με παρόμοια αποτελέσματα. σι.