Αφηρημένο

Σας έθεσε ως στόχο να μελετήσει τις βασικές δράστες της αντίστασης και της ευαισθησίας σε αναστολείς κινάσης τυροσίνης ErbB2, όπως η λαπατινίμπη σε καρκίνους του μαστού και του πνεύμονα ErbB2-θετική. Ένα κύτταρο-βασισμένη

in vitro μεταλλαξιγένεση

μοντέλο αντίσταση lapatinib τοποκατευθυνόμενη προσδιόρισε διάφορες μεταλλάξεις, συμπεριλαμβανομένου του φύλακα ErbB2 μετάλλαξη ErbB2-T798I, ως μεσολάβηση αντίσταση. ErbB2-T798I μηχανικής μοντέλα κυττάρων δείχνουν πράγματι αντίσταση στη λαπατινίμπη αλλά παραμένουν ευαίσθητοι στη μη αναστρέψιμο αναστολέα EGFR /ErbB2, PD168393, υποδηλώνουν πιθανές στρατηγικές εναλλακτική θεραπεία για να ξεπεράσει την αντίσταση. μελέτες έκφρασης προφίλ γονίδιο εντόπισε μια επίλεκτη ομάδα των κατάντη στόχων ρυθμίζεται από τη σηματοδότηση ErbB2 και να καθορίσει PHLDA1 ως αμέσως ρυθμίζεται προς τα κάτω γονιδίου μετά ογκογόνο ErbB2 αναστολή σηματοδότησης. Βρίσκουμε σημαντική ρύθμιση προς τα κάτω των PHLDA1 σε πρωτοπαθή καρκίνο του μαστού και PHLDA1 είναι στατιστικά σημαντικά λιγότερο εκφράζονται σε ErbB2 αρνητική σε σύγκριση με ErbB2 θετικούς όγκους συνάδει με τον κανονισμό της με ErbB2. Τέλος, PHLDA1 μπλοκ υπερέκφραση σηματοδότησης AKT, αναστέλλει την ανάπτυξη των κυττάρων και ενισχύει λαπατινίμπη ευαισθησία υποστηρίζοντας περαιτέρω σημαντική αρνητική συνάρτηση ρυθμιστής ανάπτυξης. Τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι PHLDA1 θα μπορούσε να έχει βασικό ανασταλτικό λειτουργίες σε ErbB2 οδηγείται πνεύμονα και τον καρκίνο του μαστού και την καλύτερη κατανόηση των λειτουργιών του θα μπορούσε να επισημάνω σε νέες θεραπευτικές επιλογές. Συνοπτικά, οι μελέτες μας ορίζουν νέους τρόπους διαμόρφωσης της ευαισθησίας και της αντίστασης στην αναστολή ErbB2 σε καρκίνους ErbB2-εξαρτώμενη

Παράθεση:. Li G, Wang Χ, Hibshoosh Η, Jin C, Halmos Β (2014) Διαμόρφωση του ErbB2 αποκλεισμός στην ErbB2-Θετική καρκίνοι: Ο ρόλος της ErbB2 Μεταλλάξεις και PHLDA1. PLoS ONE 9 (9): e106349. doi: 10.1371 /journal.pone.0106349

Επιμέλεια: Jun Li, η Sun Yat-sen University Medical School, Κίνα

Ελήφθη: 17 Σεπτεμβρίου 2013? Αποδεκτές: 6 του Αυγούστου του 2014? Δημοσιεύθηκε: 19, Σεπτεμβρίου, 2014

Copyright: © 2014 Li et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από την αμερικανική Εταιρεία Καρκίνου (δεν χορηγούν RSG-08-303-01-ΤΒΕ να BH) και ΝΙΗ /National Cancer Institute εξειδικευμένο πρόγραμμα της ερευνητικής αριστείας σε Ανθρώπινο Καρκίνο του πνεύμονα P50 επιχορήγηση CA90578-04 (BH). βοήθεια ιστοπαθολογική εξέταση που παρέχονται από τον Μοριακής Παθολογίας κοινόχρηστο πόρο, Herbert Irving Comprehensive Κέντρο Καρκίνου. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ErbB2 είναι μια κυτταρική μεμβράνη επιφάνεια δεσμευμένο υποδοχέα κινάσης τυροσίνης και εμπλέκεται στα μονοπάτια μεταγωγής σήματος που οδηγεί σε κυτταρική ανάπτυξη και πολλαπλασιασμό. Αυτό το γονίδιο ενισχύεται σε 10-20% των καρκίνων του μαστού, και τα αποτελέσματα ενίσχυσης σε πρωτεΐνη υπερέκφραση, η οποία δηλώνει ένα επιθετικό φαινότυπο [1] – [4]. Η υπερέκφραση, ενίσχυση και περιστασιακά ενεργοποιούμενες μεταλλάξεις του ErbB2 εμφανίζονται επίσης σε άλλους καρκίνους, συμπεριλαμβανομένων των μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα [5], [6]. Το εξανθρωπισμένο αντίσωμα trastuzumab (Herceptin) έναντι υπερεκφρασμένης ErbB2 έχει αποδειχθεί ότι είναι αποτελεσματική στη θεραπεία του μαστού και γαστρικών καρκίνων με ενίσχυση ErbB2 [7]. Περαιτέρω, σωματικές μεταλλάξεις στον τομέα κινάσης του ErbB2 ανακαλύφθηκαν σε διάφορα στερεά καρκίνους συμπεριλαμβανομένου του πνεύμονα και του μαστού καρκίνωμα [8] – [12]. Πιο πρόσφατα, /ErbB2 αναστολείς κινάσης τυροσίνης EGFR διπλής έχουν επίσης δείξει υπόσχεση σε κλινικές μελέτες. Μια διπλή, αναστρέψιμος αναστολέας του EGFR /ErbB2, λαπατινίμπη (Tykerb) ειδικότερα έχει επιδείξει σημαντική δραστηριότητα σε καρκίνους του μαστού ErbB2-θετική και τώρα έχει εγκριθεί για χρήση σε αυτή την ένδειξη [13]. https://en.wikipedia.org/wiki/HER2/neu – cite_note-3Inhibition του ErbB2 αυτοφωσφορυλίωσης τυροσίνης από lapatinib καταργεί κατάντη Ras-Raf-ERK1 /2 και ΡΙ3Κ-ΑΚΤ ανάπτυξη /σηματοδότηση επιβίωσης σε ErbB2 που υπερεκφράζουν κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού και σε ασθενείς με καρκίνους υπερεκφράζει ErbB2 μαστού [14].

Η ομοιόμορφη ανάπτυξη της επίκτητης αντοχής στη λαπατινίμπη, δυστυχώς, περιορίζει την κλινική αποτελεσματικότητα του. Σε ανάλογο ρυθμίσεις, δευτερογενή μεταλλάξεις, όπως KIT εξώνιο 17 μεταλλάξεις στο ανθεκτικών στο imatinib GIST και EGFR Τ790Μ σε EGFR-μεταλλαγμένο καρκίνων του πνεύμονα είναι κοινά μηχανισμούς αντοχής [8], [15]. Δεν υπάρχει in vivo δεδομένα που διατίθενται σήμερα για πιθανούς μηχανισμούς αντίστασης στην λαπατινίμπη. Σε ένα in vitro σύστημα μοντέλο, το δευτερεύον μετάλλαξη, ErbB2 T798I προσδίδει την ισχυρότερη επίδραση αντίσταση λαπατινίμπη σε κύτταρα Ba /F3 και είναι ανάλογη με τον υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα Τ790Μ [16] – [18]. Μια πρόσφατη μελέτη δείχνει ότι σε συστήματα μοντέλο in vitro η ανάπτυξη της συν-εξάρτησης από τις οδούς της ER-σηματοδότηση θα μπορούσε να είναι ένας άλλος πιθανός μηχανισμός για την λαπατινίμπη αντίσταση [19]. Υπάρχει επίσης δεδομένα που να υποδηλώνουν την εμπλοκή της ενεργοποίησης AXL σε λαπατινίμπη αντοχή σε ErbB2 θετικό καρκίνο του μαστού [20]. Σαφώς, υπάρχουν επίσης και άλλοι μηχανισμοί. Δεδομένων των δυσκολιών απόκτησης δειγμάτων πρωτογενούς ασθενής, είναι σημαντικό να κατασκευαστεί πειραματικά κυψελοειδή συστήματα για διαλογή σχετικών μηχανισμό αντίστασης που τότε επιτρέπουν τη δοκιμή εναλλακτικών αναστολέων να ξεπεράσει την αντίσταση. Είναι ξεκάθαρες ότι η ΑΚΤ /PI3K και μονοπάτια /ΜΑΡΚ ΕΚΚ είναι το κλειδί άμεση κατάντη δράστες της ErbB2 ογκογόνο σηματοδότηση. Ωστόσο, η στόχευσή τους έχει σοβαρές ελλείψεις όσον αφορά την τοξικότητα και ένα στενό θεραπευτικό δείκτη δεδομένης της σημαντικής φυσιολογικούς ρόλους τους. Ως εκ τούτου, η καλύτερη κατανόηση της ολόκληρης της συστοιχίας των μεταγενέστερων αλλαγών θα πρέπει να επιτρέπουν την ταυτοποίηση νέων αγώγιμων στόχων και την ανάπτυξη πιο αποτελεσματικών και ανθεκτικό στρατηγικές για τη θεραπεία των καρκίνων ErbB2-θετική.

Στη μελέτη μας, θέτουμε με το διπλό στόχο να προωθήσει την κατανόησή μας στους δύο αυτούς τομείς κεντρικό ογκογόνων ErbB2 ΣΗΜΑΤΟΔΟΣΙΑ επίκτητη αντοχή και καθοδικός τελεστής και διαμορφωτή μονοπάτια. Πρώτον, ιδρύσαμε ευαισθησία στην θεραπεία λαπατινίμπη του ErbB2-θετικών πνεύμονα και καρκίνου του μαστού κυτταρικές γραμμές, που προσδιορίζονται μια σειρά υποθετικών αποκτήθηκαν μεταλλάξεις αντίστασης και απέδειξαν ότι μεταλλάξεις ErbB2-T798 οδηγήσει σε αντίσταση που μπορούν να ξεπεραστούν με την μη αναστρέψιμο αναστολέα ErbB2, PD168393. Στη συνέχεια, ολοκληρώσαμε ένα προφίλ γονιδιακής έκφρασης μελέτη προσδιορίζοντας ένα πλήκτρο ομάδας των γονιδίων στόχων νωρίς ErbB2 και να εντοπίσει PHLDA1 ως νέου κατάντη στόχος της ErbB2 σηματοδότησης με ένα λειτουργικό ρόλο στην αρνητική τους μηχανισμούς ανατροφοδότησης για να τελειοποιήσουν την έξοδο της σηματοδότησης ErbB2 και ενισχύοντας έτσι σημαντικά η ευαισθησία του ErbB2-θετικό καρκίνο του μαστού κύτταρα να λαπατινίμπη. Οι μελέτες μας παρέχει πολλές νέες δυνατότητες για να επεκτείνει τα οφέλη της αναστολής ErbB2 στη διαχείριση των καρκίνων ErbB2-εξαρτώμενη.

Υλικά και Μέθοδοι

Ασθενών Υλικό

Ο ιστός του καρκίνου του μαστού και ο κανονικός ιστός του μαστού που περιβάλλει τον όγκο λήφθηκαν από ίδιο ασθενή. Οι ιστοί σταθεροποιημένα με φορμαλίνη χρησιμοποιήθηκαν για τη μελέτη ανοσοϊστοχημεία. Το σχέδιο εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας της Νέας Υόρκης Presbyterian Hospital του Πανεπιστημίου Columbia, και οι ασθενείς έδωσαν γραπτή συγκατάθεση, σύμφωνα με τη Διακήρυξη του Ελσίνκι.

Αντιδραστήρια

EGF αγοράστηκε από την Sigma- Aldrich (St. Louis, ΜΟ), PD168393 και CL387,785 αγοράστηκαν από την Calbiochem (Billerica, ΜΑ), λαπατινίμπη αγοράστηκε από Σέλεκ Χημικών Προϊόντων (Houston, TX). Φάρμακα διαλύθηκαν σε DMSO για να δώσουν ένα μητρικό διάλυμα /L 10 mmol και η τελική συγκέντρωση του DMSO σε όλα τα πειράματα ήταν & lt?. 0,1%

Cell Culture

Calu3, HCC827, H1975, HCC202, HCC1569, HCC1937 και T47D κύτταρα διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% FBS, τα κύτταρα SKBR3 διατηρήθηκαν σε μέσο McCoy συμπληρωμένο με 10% FBS. MDA-MB-468 και MDA-MB-436 κύτταρα διατηρήθηκαν σε μέσο L-15 Leibovitz συμπληρωμένο με 10% FBS, τα κύτταρα MCF-7 κύτταρα διατηρήθηκαν σε μέσο ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% FBS. Όλα τα κύτταρα αναπτύχθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα με 5% CO

2 και ήταν στη λογαριθμική φάση ανάπτυξης κατά την έναρξη της όλα τα πειράματα. Τα MCF-7, MDA-MB-468 και MDA-MB-436 κύτταρα που παρέχονται εδώ είναι ευγενική προσφορά του Δρ Μάθιου Μάουρερ (Πανεπιστήμιο Columbia). Όλες οι κυτταρικές γραμμές αρχικά αγοράστηκαν από την ATCC (Manassas, VA)

ErbB2 μεταλλαξογένεση, την παραγωγή της βιβλιοθήκης, και αντοχή φαρμάκου οθόνη

Ο pcDNA3.1 πλασμίδιο κατασκεύασμα. (-) – ErbB2-HA ήταν που παράγεται όπως περιγράφηκε προηγουμένως [8]. Εμείς εισήγαγε ένα νέο ένζυμο τοποθεσία ΑαβΙ στη θέση 1457 του cDNA ErbB2. Στη συνέχεια, ανακατεύονται όλη την διαμεμβρανική περιοχή και τυροσινικής κινάσης δέσμευση του ErbB2 με χώνευση ΑαβΙ-AfeI (AfeI site-θέση 3191). Χρησιμοποιώντας το μεταλλαγμένο pcDNA3.1 (-) – ErbB2-ΗΑ πλασμίδιο, εκτελέσαμε τυχαία μεταλλαξογένεση χρησιμοποιώντας εκκινητές που καλύπτει την περιοχή 1.457 – 3.191 στην παρουσία 50 μmol /L ΜηΟΙ

2. Υποκλωνοποίηση σε ρ-ΟΕΜ-Τ Easy φορέα και αλληλούχιση των επιμέρους αποικιών έδειξε ότι ουσιαστικά όλα τα προϊόντα PCR περιείχε μεταλλάξεις, με το 50% των προϊόντων που περιέχουν 1-bp αλλαγή. Η πισίνα του ενισχυμένων θραυσμάτων ϋΝΑ υπέστη πέψη με AgeI και AfeI και επανασυνδέθηκε μέσα στον σκελετό pcDNA3.1 (-) – φορέα ErbB2-ΗΑ. Γονικά κύτταρα SKBR3 επιμολύνθηκαν με μεταλλαχθέντων βιβλιοθήκες. κλώνοι κυττάρων επιλέχθηκαν με φρέσκο ​​μέσο που περιείχε 500 μg /mL G418 και 1 mmol /L λαπατινίμπη μετά από 24-ώρες διαμόλυνση. Ένα μήνα αργότερα, οι αποικίες των κυττάρων απομονώθηκαν και ενισχύθηκαν περαιτέρω με την παρουσία και των δύο G418 και λαπατινίμπη και στη συνέχεια η περιοχή της κινάσης της τυροσίνης του ErbB2 ήταν resequenced. ευθυγράμμιση και ανάλυση της αλληλουχίας έγινε με DNASTAR και λογισμικού Mutation SURVEYOR (SoftGenetics, State College, PA).

Δημιουργία του πλασμιδίου ErbB2 T798I κατασκευάσει

Ο φορέας έκφρασης ErbB2 T798I δημιουργήθηκε από ιστότοπο- κατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση (κιτ μεταλλαξογένεσης QuickChange, Stratagene, Santa Clara, CA) του pcDNA3.1 (-) – πλασμιδιακό κατασκεύασμα ErbB2-ΗΑ. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για τοπο-κατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση ήταν T798I, 5′-CACGGTGCAGCTGGTGATACAGCTTATGCCCTATG-3 ‘(νοηματικό) και 5′-CATAGGGCATAAGCTGTATCACCAGCTGCACCGTG-3’ (antisense). Η σωστή ακολουθία του παραγόμενου κατασκευάσματος επιβεβαιώθηκε με επανεύρεση της αλληλουχίας. Κατασκευάσαμε επίσης μια έκφραση άγριου τύπου ErbB2 κατασκευάσει ως έλεγχος για δοκιμασίες μορφομετατροπής. Παροδική διαμόλυνση μελέτες έγιναν χρησιμοποιώντας Cos-7 κύτταρα με αυτές τις ανασχηματισμένες πλασμίδια. Η ανάλυση στυπώματος Western χρησιμοποιήθηκε για να επιβεβαιώσει την επιτυχία της διαμολύνσεως με τη χρήση ενός αντισώματος αντι-tag αιμοσυγκολλητίνης. G418 (500 μg /mL) χρησιμοποιήθηκε για την επιλογή σταθερά επιμολυσμένων κυττάρων και απομονωμένες αποικίες συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας δακτυλίους κλωνοποίησης και συνέχισαν να καλλιεργηθούν με την παρουσία του G418. Η έκφραση της μεταλλαγμένης πρωτεΐνης ErbB2 T798I επιβεβαιώθηκε με την ανίχνευση της έκφρασης της ετικέτας αιμοσυγκολλητίνης όπως παραπάνω.

Cell Growth Αναστολή Ανάλυση

Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε κάθε φρεάτιο των 96 φρεατίων σε μέσο κυττάρου που περιέχει 10% FBS. 24 ώρες μετά την επίστρωση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με καθορισμένες συγκεντρώσεις των αναστολέων. Η συγκέντρωση του DMSO στο μέσο ρυθμίστηκε στο 0.1%. Μετά από 72 ώρες επώασης, οι αριθμοί των βιώσιμων κυττάρων μετρήθηκαν με χρήση 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -5- (3-καρβοξυμεθοξυφαινυλ) -2- (4-σουλφοφαινυλο) -2

H

-tetrazolium, εσωτερικό άλας (MTS? απορρόφηση της φορμαζάνης στα 490 nm? CellTiter96, Promega, Madison, WI) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Κάθε δοκιμασία αποτελείται από τρεις πανομοιότυπα φρεάτια της ίδιας συγκέντρωσης φαρμάκου. Η IC50 προσδιορίστηκε από τις καμπύλες δόσης-απόκρισης.

ανοσοαποτύπωσης

Για να αξιολογηθεί η ενεργοποίηση σηματοδότησης ErbB2, τα κύτταρα στερήθηκαν τροφής για 12 ώρες και στη συνέχεια επωάστηκαν με λαπατινίμπη ή PD168393 επί 3 ώρες ακολουθούμενη από EGF ( 100 ng /ml) ή ερεγουλίνη (20 ng /ml) διέγερσης για 15 λεπτά. Λύματα ολόκληρων κυττάρων διαχωρίστηκαν σε 8% πηκτές πολυακρυλαμιδίου με SDS, μεταφέρθηκαν σε νιτροκυτταρίνη, και η έκφραση πρωτεΐνης ανιχνεύθηκε με τη χρήση του αντιδραστηρίου Western Lightning Χημειοφωταύγειας (Perkin-Elmer Life Science, Wellesley, ΜΑ). Φωσφο-Ακί (Ser473), φωσφο-ΕΚΚ 1/2 (T202 /Y204), ολική Akt-, ολική ΕΚΚ και GAPDH αντισώματα αγοράστηκαν από την Cell Signaling Technology (Beverly, ΜΑ). Αντισώματα προς ErbB2 (C-18), PHLDA1 [21] – [23] και ετικέτα αιμοσυγκολλητίνης (F-7) αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Αντίσωμα που κατευθύνεται έναντι φωσφο-ErbB2 (Y1248) αγοράστηκε από την R &? Συστήματα D (Minneapolis, ΜΝ). αντισώματα Δευτερεύουσα αντι-ποντικού και αντι-κουνελιού αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές.

αννεξίνης /ιωδιούχου προπιδίου και BrdU δοκιμασίες

Για αμφότερες τις δοκιμασίες, τα δείγματα αναλύθηκαν σε ένα κύτταρο φθορισμός ενεργοποιούμενη σάρωση κυτταρόμετρο EPICS XL MCL (Beckman Coulter, Miami, FL ). ιωδιούχο προπίδιο αννεξίνη (ΡΙ) δοκιμασία απόπτωσης /διεξήχθη σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Annexin V-FLUOS κιτ χρώσης, Roche Applied Science, Indianapolis, ΙΝ). Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 1 × 10

6 κύτταρα /φρεάτιο σε πλάκες 10 εκατοστά? 24 ώρες μετά την επίστρωση των μέσων ενημέρωσης αναζωογονήθηκε από συγκεκριμένες συγκεντρώσεις των αναστολέων, στη συνέχεια επωάστηκαν για επιπλέον 72 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια σε επεξεργασία με θρυψίνη, πλύθηκαν με PBS, επαναιωρήθηκαν σε αννεξίνη /προπιδίου ρυθμιστικού χρώση με ιωδιούχο (Roche Applied Science), και στη συνέχεια αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με λογισμικό FlowJo (Tree Star, Ashland, OR). Βρωμο-δεοξυουριδίνη (BrdU) δοκιμασία κυτταρικού πολλαπλασιασμού διεξήχθη σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (FITC BrdU Kit Flow, BD Pharmingen, San Diego, CA). Εν συντομία, τα κύτταρα Calu3 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με λαπατινίμπη σε διαφορετικές συγκεντρώσεις (τελική συγκέντρωση: 0, 0,1, 1, 3, και 10 mmol /L) για 3 ημέρες, στη συνέχεια, σε στιγμιαία σήμανση για 60 λεπτά με 10 μΜ BrdU, συλλέγονται με θρυψινοποίηση και διαπερατά με BD ρυθμιστικό Cytoperm, χρωματίστηκαν με φθορίζοντα αντισώματα αντι-BrdU, αντίθετα με 7-αμινο-ακτινομυκίνη D για τη συνολική περιεκτικότητα DNA και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές.

Oligonucleotide Array Ανάλυση

Calu3 και SKBR3 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 60% συρροή σε μέσο καλλιέργειας και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με λαπατινίμπη (1 μm) ή DMSO ( 0,01%) ως έλεγχος για 6 ώρες. Το ολικό κυτταρικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ RNAeasy mini (Qiagen, Germantown, MD). την ποιότητα του RNA εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας το σταθμό Ηλεκτροφόρηση Experion Αυτοματοποιημένο (Bio-Rad) και υπολογίζεται από οπτικών ινών φασματοφωτομετρία χρησιμοποιώντας το Nanodrop ND-1000 (Nanodrop Inc., Wilmington, DE, USA). cDNA συντέθηκε, επισημαίνονται και υβριδοποιήθηκε σε Affymetrix μικροσυστοιχίες HG-U133A και σαρώνεται. Η τιμή της έκφρασης για κάθε γονίδιο υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό Affymetrix GeneChip και τη μέθοδο Στιβαρή πολλαπλών μικροπλακετών Μέση (RMA) για την εξαγωγή του σήματος.

Προεπεξεργασία, φιλτράρισμα και στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα μικροσυστοιχιών αναλύθηκαν και το ποσοστό εσφαλμένης ανακάλυψη υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας SAM (Πανεπιστήμιο του Stanford, CA). Array εξομάλυνση και τον υπολογισμό των τιμών έκφραση του τσιπ πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση DNA-Chip Analyzer (dchip). Για σχολιασμό των προκυπτόντων γονιδίων, χρησιμοποιήθηκε το πρόγραμμα περιήγησης γονίδιο οντολογία NetAffymetrix (https://ww.affymetrix.com). Τα διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια με ≥2 ή ≤0.5 φορές αλλαγή, q-τιμή ≤1% αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας t-τεστ και σε σύμπλεγμα με το σύμπλεγμα πακέτο λογισμικού 3.0 [24].

ποσοτική δοκιμασία PCR

Ολικό RNA από δείγματα εις τριπλούν απομονώθηκε χρησιμοποιώντας RNAeasy μίνι κιτ (Qiagen). cDNA συντέθηκε με την M-MLV αντίστροφη μεταγραφάση (SuperScipt III ανάστροφης μεταγραφάσης, Invitrogen, Grand Island, ΝΥ) με τη χρήση ολιγο (dT) αρχικά τεμάχια από την Invitrogen. Όλα τα δείγματα αναλύθηκαν με τη Roche LightCycler χρησιμοποιώντας τις Syber πράσινο ανιχνευτές. Οι αλληλουχίες εκκινητών φαίνονται στον Πίνακα S1. Τα επίπεδα έκφρασης GAPDH χρησιμοποιήθηκαν ως εσωτερικές αναφορές για την κανονικοποίηση cDNA εισόδου. Αναλογίες επίπεδο κάθε γονιδίου σε GAPDH στη συνέχεια υπολογίστηκε.

Ανοσοϊστοχημεία

σταθεροποιημένα με φορμαλίνη τομές καρκινικού ιστού του μαστού πρωτογενούς αποπαραφινοποιήθηκαν και επανυδατώθηκαν και επωάστηκαν με υπεροξείδιο του υδρογόνου 0,6% εντός μεθανόλης. λύση ανάκτησης στόχο, pH 9,0 (Dako, Carpinteria, CA) χρησιμοποιήθηκε για την ανάκτηση του αντιγόνου. Τα πλακίδια επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα για όλη τη νύχτα στους 4 ° C που ακολουθείται από χρώση με τη χρήση του R.T.U Vectastain καθολική Quick Kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA) με αιματοξυλίνη πυρηνική αντιχρωματισμός. Τέλος, διαφάνειες αφυδατώνονται διαδοχικά με αιθανόλη, εκκαθαρίζονται με ξυλόλιο. Το αντίσωμα αντι-PHLDA1 χρησιμοποιήθηκε σε αραίωση 1:50 (Santa Cruz Biotechnology). Η ένταση της χρώσης της PHLDA1 βαθμολογήθηκε με έναν πίνακα επικυρωμένο παθολόγος του καρκίνου του μαστού ως 0 (καθόλου έκφραση), 1+ (ασθενής έκφραση), 2+ (μέτρια έκφραση) και 3+ (ισχυρή έκφραση) και το ποσοστό (0-1,0 ) θετικά χρωματισμένων κυττάρων όγκου αξιολογήθηκε επίσης για να δημιουργήσει ένα σύνθετο H-βαθμολογία (ένταση όρος Χ τοις εκατό θετικό, το εύρος των πιθανών τιμών μηδέν έως 3,0). Silver in situ υβριδισμού (SISH) χρησιμοποιήθηκε για να προσδιορισθεί η κατάσταση ErbB2 σε δείγματα ανθρώπινου καρκίνου του μαστού [25]. Η αναλογία του ErbB2 /χρωμόσωμα 17 υπολογίστηκε διαιρώντας τη συνολική βαθμολογία για ErbB2 από τη συνολική βαθμολογία για το χρωμόσωμα 17. Μία αναλογία & lt? 1.8 έδειξε ότι ErbB2 γονίδιο δεν ενισχύθηκε, ενώ μία αναλογία & gt? 2.2 έδειξε ενίσχυση του γονιδίου . Για τις υποθέσεις με αναλογία μεταξύ 1.8 και 2.2, τα σήματα από 20 περισσότερους πυρήνες όγκου μετρήθηκαν σε κάθε αντικειμενοφόρο πλάκα και ένα νέο δείκτης υπολογίσθηκε.

Το πλασμίδιο κατασκευάζει και κυτταρική επιμόλυνση

Πλήρους μήκους cDNA αλληλουχία του ανθρώπινη PHLDA1 ενισχύθηκε από γονιδιωματικό DNA των κυττάρων HCC827. PHLDA1 ακολούθως τροποποιούνται με ένα ΗΑ-tag στο Ο-άκρο με επικαλυπτόμενη PCR να διακρίνει πλασμίδιο που προέρχεται από φυσική πρωτεΐνη και υποκλωνοποιήθηκε εντός του pcDNA3.1 (-) φορέα ραχοκοκαλιάς. Η ακρίβεια του κατασκευάσματος επιβεβαιώθηκε με άμεση αλληλούχιση του DNA. κύτταρα SKBR3 επιμολύνθηκαν παροδικά με κενό pcDNA3.1 (-) (pcDNA3.1 (-) – EV) ή PHLDA1 (pcDNA3.1 (- PHLDA1 -)) φορείς έκφρασης χρησιμοποιώντας Fugene 6 (Roche Applied Science). Σταθερά επιμολυσμένα επελέγησαν υποκλώνοι με G418 σε συγκέντρωση 500 μg /ml ξεκινώντας 48 ώρες μετά την διαμόλυνση

Anchorage ανεξάρτητη δοκιμασία δοκιμασία ανάπτυξης και της μετανάστευσης

Για αγκύρωσης ανεξάρτητη δοκιμασία ανάπτυξης, pcDNA3.1 (. – ) -EV και pcDNA3.1 (-) – PHLDA1 σταθερά επιμολυσμένα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν, μετρήθηκαν δύο φορές χρησιμοποιώντας αιμοκυτόμετρο και επιστρώθηκαν στα 5000 κύτταρα /ml σε κορυφή βύσματα που αποτελείται από 0.4% αγαρόζη SeaPlaque (FMC Bioproducts, Rockland, μΕ) σε ΜοΟογ’δ μέσο 5Α. Μετά από 25 ημέρες, οι αποικίες φωτογραφήθηκαν και μετρήθηκαν. Το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές με τριπλότυπα καθένα. Μέσος αριθμός αποικιών από κάθε πείραμα απεικονίσθηκαν. Για τις δοκιμασίες μετανάστευσης, συρρέουσες μονοστοιβάδες pcDNA3.1 (-) – EV και pcDNA3.1 (-) – PHLDA1 σταθερά επιμολυσμένα κύτταρα χαραχθεί με ένα στείρο ρύγχος πιπέτας 10 μΙ. Οι πλάκες στη συνέχεια πλύθηκαν και επωάστηκαν στους 37 ° C σε 10% μέσο 5Α FBS /του McCoy επί 48 ώρες

κλωνογονιδιακή επιβίωση δοκιμασία

Δύο χιλιάδες pcDNA3.1. (-) – EV και pcDNA3 0.1 (-) – κύτταρα PHLDA1 SKBR3 τοποθετήθηκαν σε τρυβλία 6 cm και αφέθηκαν να αναρρώσουν για 24 ώρες. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με 0.1 μΜ ή 0.5 μΜ λαπατινίμπης και αφέθηκαν να αναπτυχθούν για 10 ημέρες. Στη συνέχεια, οι πλάκες βάφτηκαν με κυανούν του μεθυλενίου για 4 ώρες και προσδιορίστηκαν ο αριθμός των αποικιών με περισσότερα από 50 κύτταρα σε κάθε πλάκα. Ένα σύνολο των μη επεξεργασμένων πλακών συμπεριλήφθηκαν ως έλεγχοι για τον προσδιορισμό της αποτελεσματικότητας επιμετάλλωση για ανεξάρτητες κυτταρικές γραμμές. Ο πραγματικός αριθμός των κυττάρων /πλάκα προσδιορίστηκε με βάση την ικανότητα επίστρωσης από κάθε κυτταρική σειρά και ο αριθμός των κυττάρων που απλώθηκαν ανά δίσκο. Αυτοί οι αριθμοί στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκαν για να υπολογιστεί το ποσοστό επιβίωσης. Επίσης, κάθε αγωγή εκτελέστηκε εις τριπλούν, προκειμένου να καθοριστεί η SD για κάθε σημείο δεδομένων.

Στατιστική ανάλυση

Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση χ τετράγωνο ή δύο δειγμάτων

t

-ΜΕΛΕΤΕΣ ανάλογα με την περίπτωση, με το

P

-τιμή του & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά των τριών ξεχωριστών πειραμάτων.

Αποτελέσματα

λαπατινίμπη και PD168393 να προκαλέσει αναστολή της ανάπτυξης και την απόπτωση σε ErbB2-θετική Calu3 και τα κύτταρα SKBR3

Εμείς διεξήγαγε την πρώτη ανάπτυξη των κυττάρων MTS δοκιμασίες για να εξεταστεί αν η αναστολή της ErbB2 με lapatinib, ένας αναστρέψιμος διπλή EGFR /ErbB2 τυροσίνης κινάσης, ή PD168393, η οποία αναστέλλει μη αναστρέψιμα ErbB2, μπορεί να οδηγήσει στην αναστολή της ανάπτυξης του ErbB2-θετικών καρκινικών κυττάρων, όπως ErbB2-θετικό καρκίνο Calu3 πνεύμονα και SKBR καρκινικές κυτταρικές σειρές -3 μαστού. Βρήκαμε ότι τόσο λαπατινίμπη και PD168393 ανέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη των κυττάρων SKBR3 Calu3 και (Εικ. 1Α). Περαιτέρω έρευνα χρησιμοποιώντας χρώση αννεξίνης V έδειξε ότι τόσο η λαπατινίμπη και PD168393 που προκαλείται από εξέχοντες απόπτωση στα δύο κύτταρα Calu3 και SKBR3 (Εικ. 1Β και 1C). ανάλυση ενσωμάτωσης BrdU διεξήχθη για να δείξει την μειωμένη πολλαπλασιασμός αυτών των δύο κυτταρικών σειρών με επεξεργασία λαπατινίμπη. Η λαπατινίμπη επεξεργασμένα κύτταρα Calu3 παρουσίασαν σημαντικά υψηλότερη G

1 πληθυσμού συνάδει με G

1 σύλληψης σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Εικ. 1D) και αυτό επιβεβαιώθηκε περαιτέρω σε κύτταρα SKBR3 (Σχήμα S1). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η λαπατινίμπη προκαλεί διακοπή του κυτταρικού κύκλου στην

1 φάση G και την επακόλουθη απόπτωση σε κύτταρα Calu3 και SKBR3. Για να προσδιοριστεί το αποτέλεσμα επί οδών κατάντη σηματοδότησης, τα επίπεδα φωσφορυλίωσης των οδών ΜΑΡ κινάσης και ΑΚΤ αξιολογήθηκαν σε αυτά τα δύο μοντέλα κυτταρικής ErbB2-θετικό, και στιβαρή αποκλεισμός και των δύο οδών σηματοδότησης βρέθηκε (Σχ. 1Ε, Εικόνα S2). Το εύρημα αυτό συσχετίζεται με τα αποτελέσματα των δοκιμασιών αναστολής της ανάπτυξης γίνεται, γεγονός που υποδηλώνει ότι η αναστολή ανάπτυξης που προκαλείται από λαπατινίμπης και PD168393 μπορεί να ρυθμίζεται μέσω της αποτελεσματικής αποκλεισμό της κινάσης ΜΑΡ και τις οδούς ΑΚΤ.

A. Ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός των κυττάρων SKBR3 Calu3 και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις της λαπατινίμπης και PD168393 όπως προσδιορίζεται από τη δοκιμασία MTS. Β λαπατινίμπη και PD168393 επάγει κυτταρική απόπτωση στα κύτταρα Calu3 και SKBR3. Εκπρόσωπος αννεξίνη V /ιωδιούχο προπίδιο κυτταρομετρία ροής? οι αριθμοί αντιπροσωπεύουν το ποσοστό των κυττάρων στο κατάλληλο τεταρτημόριο. C. Ποσοτικός προσδιορισμός της απόπτωσης. Δ λαπατινίμπη προκαλεί διακοπή του κυτταρικού κύκλου σε κύτταρα Calu3 όπως ανιχνεύεται από BrdU και ποσοτικός προσδιορισμός 7-ADD. φάση R1-G1? φάση R2-G2? R3-S φάση? R4-G0 φάση. απάντηση Ε δόσης της λαπατινίμπης και PD168393 επί της φωσφορυλίωσης του ErbB2, ΑΚΤ και ERK σε κύτταρα Calu3 και SKBR3 στην ανταπόκριση στη θεραπεία EGF. p-ErbB2: φωσφορυλιωμένη ErbB2? t-ErbB2: συνολική-ErbB2? p-AKT: φωσφορυλιωμένη ΑΚΤ? t-AKT: συνολική ΑΚΤ? p-ERK: φωσφορυλιωμένη ERK? t-ΕΚΚ:. ολική ΕΚΚ

Η

Χαρακτηρισμός της αντίστασης μεταλλαγμένων ErbB2-T798I

Στη συνέχεια, ακολούθησε μια τυχαία στρατηγική μεταλλαξιγένεσης με σκοπό την αξιολόγηση της δευτεροβάθμιας μεταλλάξεις ErbB2 που μπορεί να οδηγήσει σε λειτουργική αντίσταση στη λαπατινίμπη. Πρώτον, η όλη διαμεμβρανική και κινάσης τυροσίνης περιοχή του ErbB2 (θέσεις 1.457 – 3.191) ήταν τυχαία μεταλλαγμένων. Στη συνέχεια, το μεταλλάχθηκε ErbB2 αναθεωρήθηκε σε pcDNA3.1 (-) – ErbB2-HA ραχοκοκαλιά και διαμολύνθηκε σε SKBR-3 κύτταρα. Δημιουργήσαμε ανθεκτικών στα φάρμακα κλώνων SKBR-3 κυττάρων παρουσία και των δύο /mL G418 και 1 mmol /L λαπατινίμπης και προσδιορίζονται 9 ξεχωριστές υποκαταστάσεις 500 μg αμινοξέων που επηρεάζουν 5 υπολείμματα από απομονωμένα κλωνική παράγωγα. Υποκαταστάσεις στις πέντε θέσεις εντοπίστηκαν: P944L (3 περιπτώσεις), T798I (2 περιπτώσεις), T798M (1 περίπτωση), C576S (1 περίπτωση), R487P (1 περίπτωση), και E542G (1 περίπτωση). Η κρίσιμη υπόλειμμα gatekeeper θρεονίνης στην περίπτωση του ErbB2 είναι T798- το οποίο αντιστοιχεί στο T790 του EGFR, καθώς και T315 της κινάσης ABL. Με βάση την αλληλουχία νουκλεοτιδίων του ErbB2, είναι σημαντικά πιο πιθανό ότι η μετάλλαξη θα μεταβάλλει την αλληλουχία να T798I (απαιτεί αλλαγή ενός ζεύγους βάσεων) έναντι T798M (απαιτεί δύο αλλαγές ζευγών βάσεων). Ως εκ τούτου, T798I επιλέχθηκε για περαιτέρω μελέτες.

T798I αναγεννήθηκε με τοποκατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση και χρησιμοποιήθηκε για παροδική διαμόλυνση μελέτες σε κύτταρα Cos-7. Σε pcDNA3.1 (-) – ErbB2-wt Cos7 κύτταρα, 1 mmol /L λαπατινίμπη αναστέλλει σημαντικά την φωσφορυλίωση του ErbB2. Αντίθετα, σε pcDNA3.1 (-) – ErbB2-T798I επιμολύνσεις, επίμονη ErbB2 φωσφορυλίωση σημειώθηκε παρουσία λαπατινίμπη σε συγκεντρώσεις που κυμαίνονται από 0,1 έως 10 μmol /L, επιβεβαιώνοντας την αλλαγή στην ευαισθησία των ναρκωτικών που αντιστοιχούν στα ευρήματα της MTS δοκιμασίες (Σχ. 2Α). Για να επιβεβαιωθεί αυτή η παρατήρηση, δημιουργήσαμε επίσης μια σταθερά επιμολυσμένα κλώνο κυττάρων Calu3 με το pcDNA3.1 (-) – ErbB2-T798I-ΗΑ πλασμίδιο κατασκεύασμα και βρήκε πολύ συνεπής αποτέλεσμα (Σχήμα 2Β.). Εκτιμήσαμε το επίπεδο αντίστασης που pcDNA3.1 (-) – ErbB2-T798I που ανατίθενται στην λαπατινίμπη δημιουργώντας καμπύλες δόσης-απόκρισης από δοκιμασίες MTS σε pcDNA3.1 (-) – ErbB2-T798I σταθερές επιμολύνσεις. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν παρουσία αυξανόμενων συγκεντρώσεων λαπατινίμπης κυμαίνονται από 0 έως 10 μmol /L. pcDNA3.1 (-) – ErbB2-wt Calu3 κύτταρα αναστέλλεται ισχυρά με λαπατινίμπη (IC

50, 2,3 μmol /L). κύτταρα Calu3 εκφράζουν pcDNA3.1 (-) – ErbB2-T798I ήταν λιγότερο ευαίσθητα στη λαπατινίμπη με IC

50, 6,5 μmol /L (Σχήμα 2C).

Α.. Δόσης απόκρισης της λαπατινίμπης και PD168393 επί φωσφορυλίωση του ErbB2 σε κύτταρα Cos7 μετά από 24 ώρες από παροδική επιμόλυνση με ErbB2-wt και ErbB2-T798I φορείς. Σύνολο ErbB2, ΗΑ και το επίπεδο έκφρασης GAPDH ως μάρτυρες. ανταπόκριση Β Δόση λαπατινίμπης και PD168393 επί της φωσφορυλίωσης του ErbB2, ΑΚΤ και ERK σε ErbB2-κβ και ErbB2-T798I κλώνους σταθερή Calu3 κυττάρων. Σύνολο ErbB2, η συνολική ΑΚΤ, ολική ΕΚΚ, το επίπεδο ΗΑ και έκφραση GAPDH ως μάρτυρες. αναστολή C. δοσοεξαρτώμενες ανάπτυξη που προκαλείται από τη θεραπεία της λαπατινίμπης και PD168393 επί 72 ώρες σε ErbB2-wt και ErbB2-T798I κυτταρικών κλώνων σταθερά Calu3 όπως ανιχνεύεται με την δοκιμασία MTS. Δ λαπατινίμπη και PD168393 επάγει κυτταρική απόπτωση σε ErbB2-κβ και ErbB2-T798I κυτταρικών κλώνων σταθερή Calu3 μετά τη θεραπεία 72 ώρες. Ε ποσοτικοποίηση της απόπτωσης.

Η

Έχουμε αναλύσει περαιτέρω τις λειτουργικές συνέπειες T798I αξιολογώντας την κυτταρική απόπτωση που προκαλείται από λαπατινίμπη, όπως ορίζεται από δοκιμασίες ιωδιούχου απόπτωση Annexin /προπιδίου. Θεραπεία της pcDNA3.1 (-) – ErbB2-wt Calu3 κυττάρων με 1 μmol /L λαπατινίμπης οδήγησε σε εμφανή αύξηση του ποσοστού των αποπτωτικών κυττάρων, ενώ οι ίδιες συγκεντρώσεις είχαν επάγεται σημαντικά λιγότερο απόπτωση σε pcDNA3.1 (-) – ErbB2-T798I σταθερά προϊόντα επιμόλυνσης (Εικ. 2D και 2Ε). Αυτά τα αποτελέσματα ήταν σύμφωνα με παροδικές μελέτες επιμόλυνσης που επιδιώκονται στα κύτταρα SKBR3 (Σχήμα S3, S4 και S5).

Μια εναλλακτική PD168393 αναστολέας ErbB2 μπορεί να ξεπεράσει την αντίσταση

Στη συνέχεια, ελέγξαμε τους κλώνους T798I Calu3 κατά η μη αναστρέψιμη ErbB2 /EGFR αναστολέας PD168393. Πραγματοποιήσαμε πρότυπες δοκιμασίες MTS ακόλουθες 72 ώρες αγωγής φαρμάκου χρησιμοποιώντας ένα εύρος συγκεντρώσεων από 0 έως 10 μmol /L. Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι PD168393 μπορούσε να ξεπεράσει T798I που προκαλείται από την αντίσταση ενάντια λαπατινίμπη (Σχ. 2C). Αυτός ο αναστολέας ήταν εξίσου αποτελεσματικό έναντι pcDNA3.1 (-) – ErbB2-T798I έναντι pcDNA3.1 (-) – ErbB2-wt μορφομετατροπείς. Σε μελέτες σηματοδότησης, βρήκαμε ότι PD168393 αναστέλλει πλήρως ΑΚΤ και φωσφορυλίωση ERK σε συγκεντρώσεις τόσο χαμηλές όσο 0,03 μmol /L, έτσι ώστε για να δείξει καλύτερα την κατάντη αλλαγή σηματοδότηση, χρησιμοποιήσαμε ένα εύρος συγκεντρώσεων από 0 έως 0,1 μmol /L. Σηματοδοσίας μελέτες έδειξαν ότι η θεραπεία με PD168393 μπορεί αναστέλλουν ισχυρά καθοδικά σηματοδότηση συσχετίζεται όπως φωσφο-ΑΚΤ και ERK (Εικ. 2Β). επίπεδο φωσφορυλίωσης ErbB2 σε κύτταρα με μεταλλαγμένη ErbB2 μεταβλήθηκε αλλά σε μικρότερο βαθμό από PD168393 αναστολής υποδεικνύουν μερική αναστολή (Εικ. 2Β). Μελέτες αννεξίνης /ιωδιούχο προπίδιο έδειξε περαιτέρω την επαγωγή απόπτωσης με αυτή την ένωση τόσο pcDNA3.1 (-) – ErbB2-wt και pcDNA3.1 (-) – κυτταρικοί κλώνοι ErbB2-T798I Calu3 (Εικ. 2D και 2Ε). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι T798I θα μπορούσε να είναι ένας σημαντικός μηχανισμός αντίστασης σε όγκους λαπατινίμπη επεξεργασμένα, αλλά και υποδηλώνουν πιθανή αποτελεσματικότητα των μη αναστρέψιμους αναστολείς ErbB2.

Gene προφίλ έκφρασης των λαπατινίμπη επεξεργασμένα κύτταρα

Στη συνέχεια, θέτουμε έξω για να μελετήσει μια ολοκληρωμένη σειρά των μεταγενέστερων μεταβολών ως αποτέλεσμα αποτελεσματική αναστολή ErbB2. Προηγουμένως, σε παρόμοιες μελέτες που έχουν δείξει ότι το νωρίτερο στις 6 ώρες αναστολής σηματοδότησης, ο αναστολέας μη αναστρέψιμη EGFR, CL-387 785 θα μπορούσε να προκαλέσει μια σημαντική αλλαγή της μεταγραφής σε μια μικρή και αντιπροσωπευτική ομάδα των βασικών κατάντη δράστες των ογκογόνων σηματοδότησης EGFR, συμπεριλαμβανομένων σημαντικά συστατικά της οδού, όπως η κυκλίνη D1, DUSPs κλπ σε EGFR μεταλλαγμένο καρκίνων του πνεύμονα [1], [26], [27]. Με ανάλογο τρόπο, στόχος μας ήταν να προσδιορίσει τα πρώτα τελεστές του ErbB2 μεταβολές που προκαλούνται γονιδιακή έκφραση σε ErbB2-θετικά κύτταρα. Για να προσδιοριστούν τα βασικά γονίδια που εκφράζονται διαφορικά στα κύτταρα SKBR3 που έλαβαν θεραπεία με λαπατινίμπη (1 mmol /L) για 6 ώρες, μια έκφραση του γονιδίου μελέτη προφίλ έγινε εις τριπλούν σε ολικό κυτταρικό RNA χρησιμοποιώντας Affymetrix HG-U133A μάρκες. Τα μη επεξεργασμένα δεδομένα έκφρασης έτοιμη τροφή, ανακλιμακωμένα, διηθείται, και αναλύθηκαν όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Τα γονίδια μεταβάλλονται από λαπατινίμπη θεραπεία φαίνονται στον Πίνακα S2. Αυτή η ανάλυση έδειξε ότι 110 γονίδια δείκτη ήταν κάτω-ρυθμίζονται και 73 γονίδια ήταν μέχρι ρυθμίζονται με τα αυστηρά κριτήρια που της αλλαγής φορές τουλάχιστον 2 και η αξία της Delta & gt? 5, όταν τα δείγματα λαπατινίμπη αγωγή συγκρίθηκαν με τα κύτταρα υπό αγωγή με όχημα (η τιμή δέλτα είναι μια παράμετρος ρύθμιση που μπορεί να αλλάξει δυναμικά κατώτατα όρια για σημασίας).

μια σύγκριση του καταλόγου αυτού του γονιδίου με τα προηγούμενα δεδομένα μας τον εντοπισμό των μεταβολών γονιδίου μετά την αναστολή του EGFR σε EGFR-εξαρτώμενο καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων [27], [28 ] έδειξε μια αξιοσημείωτη επικάλυψη μεταξύ των διαμορφωμένων σημαντικά γονίδια στα δύο ανεξάρτητα πειράματα (Πίνακας 1). Περισσότερο από το ήμισυ των γονιδίων που ταυτοποιούνται σε προηγούμενη μελέτη μας της ρύθμισης γονιδίου με αποκλεισμό EGFR ήταν σημαντικά διαμορφωμένο κατά αναστολή ErbB2 σε ErbB2-θετικά καρκινικά κύτταρα, καθώς υποδηλώνει υψηλά κοινόχρηστο ογκογόνο οδούς. Έξι από τα κορυφαία ErbB2 /γονίδια EGFR-ρυθμίζονται, DUSP6, DUSP4, PHLDA1, επιλέχθηκαν και επιβεβαιώθηκε να ρυθμίζεται σε μεγάλο βαθμό από την ποσοτική ανάλυση αντίστροφη μεταγραφή-PCR σε RNA που αποκτήθηκε από κύτταρα λαπατινίμπη επεξεργασμένα PHLDA2, CCNG2 και DRE1 (Εικ. 3) . ανάλυση

Ποσοτική PCR της γονιδιακής ρύθμισης με επεξεργασία λαπατινίμπη για 6 ώρες στα κύτταρα SKBR3 και Calu3. Διπλώστε την επαγωγή σε σχέση με 0 έλεγχος ώρας καταγράφεται μετά από κανονικοποίηση από GAPDH. Δ: p & lt? 0,05? ×: p & lt? 0,01? †: p & lt? 0.005? *: P & lt? 0.001

Η

PHLDA1 ρυθμίζεται προς τα κάτω από την αναστολή του EGFR /ErbB2

Στη συνέχεια, αποφάσισε να επικεντρωθεί στο μυθιστόρημα κατάντη του γονιδίου-στόχου, PHLDA1 ως πρωτεΐνη. ότι προηγουμένως δεν είχε εντοπιστεί να συμμετάσχει σε ErbB2 /EGFR οδηγείται μονοπάτια. Αυτό το γονίδιο ανήκει στην ομάδα πρωτεϊνών τομέα πλεκστρίνης-ομολογίας και πιθανολογείται ότι λειτουργούν μέσω παρεμβολής με τη λειτουργία της ενεργοποίησης ΑΚΤ ΡΙ3-κινάσης αναστέλλοντας έτσι με βάση την εργασία σε ένα άλλο μέλος της οικογένειας, PHLDA3 [29]. Ανάλυση Western blotting πράγματι έδειξε ότι PHLDA1 ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω σημαντικά ταχύτερο 6 ώρες προς EGFR ή την αναστολή ErbB2 σε επίπεδο πρωτεΐνης όπως επίσης ότι συνιστά άμεση απόκριση (Εικ. 4). Π.χ.