Αφηρημένο

Το εύρος της έκφρασης HER2 από πρωτογενείς καρκίνους του ανθρώπου ωοθηκών παραμένει αμφιλεγόμενη, που αμφισβητεί την καταλληλότητα της ως καθολική αντιγόνο σε αυτό μοχθηρία. Για να αντιμετωπιστούν αυτά τα ζητήματα, θα πραγματοποιηθεί εκτενής ανάλυση της έκφρασης HER2 σε ένα ευρύ πάνελ των πρωτογενών όγκων καθώς ιδρύθηκε και βραχυπρόθεσμα ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές των ωοθηκών. Συμβατική ανοσοϊστοχημική (IHC) ανάλυση των πολλαπλών τόπων όγκου σε 50 περιπτώσεις υψηλού βαθμού ωοθηκών ορώδες καρκίνωμα αποκάλυψε υπερέκφραση του HER2 σε 29% των αξιολογούνται sites. Ωστόσο, πιο ευαίσθητες μεθόδους ανίχνευσης συμπεριλαμβανομένων κυτταρομετρίας ροής, ανάλυση στυπώματος western και Q-PCR αποκάλυψε έκφραση HER2 σε όλα τα φρέσκα καρκινικά κύτταρα προέρχονται από πρωτογενή ασκίτη ή συμπαγών όγκων, καθώς και όλων των γνωστών και βραχυπρόθεσμα καλλιεργημένων καρκινικών κυτταρικών γραμμών. Τα καρκινικά κύτταρα γενικά εξέφρασαν HER2 σε υψηλότερα επίπεδα από ό, τι αυτή που βρέθηκε σε φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα της επιφάνειας των ωοθηκών (ΟΣΕ). Κατά συνέπεια, γενετικής μηχανικής ανθρώπινα Τ κύτταρα που εκφράζουν ένα χιμαιρικό υποδοχέα αντιγόνου HER2-ειδική (CAR) αναγνωρίζονται και αντιδρά ενάντια σε όλες τις εγκατεστημένος ή πρωτογενή ωοθηκική καρκινικά κύτταρα δοκιμάζονται με ελάχιστη ή καθόλου αντιδραστικότητα έναντι των φυσιολογικών κυττάρων OSE. Εν κατακλείδι, όλοι οι καρκίνοι του ανθρώπινου ωοθηκών εκφράζουν ανοσολογικά ανιχνεύσιμα επίπεδα HER2, υποδεικνύοντας ότι η μέτρηση IHC υποτιμά την πραγματική συχνότητα των καρκίνων των ωοθηκών HER2-έκφραση και μπορεί να περιορίσει την πρόσβαση των ασθενών σε διαφορετικά κλινικά σημαντική θεραπείες HER2-στόχο.

Παράθεση : Λανίτη Ε, Dangaj D, Hagemann IS, ΓΔ Τραγούδι, Καλύτερη Α, Σανδαλτζόπουλος R, et al. (2012) πρωτογενή ανθρώπινα επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα ωοθηκών Ευρέως Express HER2 σε ανοσολογικά ανιχνεύσιμα επίπεδα. PLoS ONE 7 (11): e49829. doi: 10.1371 /journal.pone.0049829

Επιμέλεια: Shannon M. Hawkins, Baylor College of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 13 Ιούλη, 2012? Αποδεκτές: 17 Οκτωβρίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 26, Νοεμ 2012

Copyright: © 2012 Λανίτη et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Καρκίνος των ωοθηκών έρευνα Ταμείο, Αμμώδης Rollman Ίδρυμα καρκίνου των ωοθηκών, National Institutes of Health (1R21CA152540) και η κοινή Αντικαρκινικού Κέντρου Fox Chase και το Πανεπιστήμιο της Πενσυλβάνια καρκίνου των ωοθηκών σπορίων (Ρ50 CA083638). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο

ERBB2

πρωτο-ογκογονιδίου κωδικοποιεί έναν υποδοχέα κινάσης τυροσίνης διαμεμβράνης πρωτεΐνη που εμπλέκεται στην ανάπτυξη και πρόοδο πολλών καρκίνων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου των ωοθηκών [1], [2]. Η κακή ρύθμιση της σηματοδότησης HER2 σε καρκίνο των ωοθηκών (OVCA) προκύπτει από είτε ενίσχυση του γονιδίου ή υπερέκφραση και οδηγεί σε ταχύτερη κυτταρική ανάπτυξη [3], βελτιωμένη επιδιόρθωση του DNA [4] και αυξημένο σχηματισμό αποικίας [5]. Η υπερέκφραση του HER2 σχετίζεται με αυξημένο κίνδυνο εξέλιξης και θανάτου ιδίως μεταξύ των γυναικών με ΦΥΓΩ σταδίου Ι και ΙΙ OVCA [6]. Ωστόσο, κανένας συσχετισμός έχει βρεθεί μεταξύ της παρουσίας υπερέκφραση του HER2 και το στάδιο της νόσου, υποδηλώνοντας ότι η ενεργοποίηση των υπερέκφραση του HER2 είναι ευρεία και μπορεί να συμβεί τόσο στο πρώιμο και όψιμο στάδια της [7] ασθένεια. Αυτές οι ιδιότητες φαίνεται να κάνει HER2 ένα ελκυστικό μόριο για στοχευμένη ανοσοθεραπεία σε γυναίκες με HER2-θετικό καρκίνο των ωοθηκών, όπου φυσικά απαντώμενο CD4

+ και CD8

+ Τ κυτταρικές αποκρίσεις έχουν παρατηρηθεί [8].

έκφραση πρωτεΐνης HER2 είναι πιο συχνά ανιχνεύεται μέσω ημι-ποσοτική ανάλυση IHC στις τομές παραφίνης ιστούς χρησιμοποιώντας καθιερωμένα πρωτόκολλα που χρησιμοποιούνται για την αξιολόγηση των ασθενών με καρκίνο του μαστού που εξετάζονται για Herceptin (trastuzumab) θεραπεία-HER2 αντι [9]. Η έκταση στην οποία HER2 εκφράζεται από OvCas παραμένει αμφιλεγόμενη, καθώς ο ρυθμός της HER2-θετικών OvCas αναφερθεί στην βιβλιογραφία κυμαίνεται από 4,9% έως 52,5% [6], [7], [10], [11], [12] , [13], [14], [15]. Ωστόσο, σε μία μελέτη που εκτελούνται από Hellstrom et al., Όλες οι κυτταρικές σειρές όγκων που είχαν καθοριστεί

in vitro

από στερεό όγκο ή ασκίτη εκφράζονται HER2 προτείνοντας ένα επιλεκτικό πλεονέκτημα ανάπτυξης για HER2-θετικών καρκινικών κυττάρων σε καλλιέργεια [16 ]. Μία καθιερωμένη κυτταρική γραμμή δείχθηκε να είναι ευαίσθητα σε HER2-κατευθυνόμενη εξαρτώμενη από αντίσωμα κυτταρική κυτταροτοξικότητα (ADCC), ωστόσο, η έκφραση HER2 και την ευαισθησία ADCC δεν ήταν αξιολογείται σε κύτταρα που προέρχονται από φυσιολογικές ωοθήκες. Επιπλέον, HER2 ανάλυση της έκφρασης χρησιμοποιούνται κυτταρομετρίας ροής με τη μέθοδο ανίχνευσης μοναδικό και περιορίζεται σε ένα σχετικά μικρό αριθμό περιπτώσεων, στηριζόμενη σε μεγάλο βαθμό από in vitro καλλιέργεια κυττάρων.

Στην παρούσα μελέτη, η οποία συστάθηκε κυτταρικές σειρές καρκίνου των ωοθηκών, πρωτογενή βραχυπρόθεσμη καλλιεργημένες κυτταρικές γραμμές και φρέσκο ​​ωοθηκών καρκινικά κύτταρα που προέρχονται από ασκίτη και τα δείγματα στερεού όγκου αξιολογήθηκαν για έκφραση HER2 χρησιμοποιώντας διάφορες μεθόδους ανίχνευσης, συμπεριλαμβανομένων των ποσοτικών PCR (Q-PCR), ανάλυση στυπώματος western και κυτταρομετρίας ροής, και τα επίπεδα έκφρασης σε σύγκριση με αντίστοιχα επίπεδα σε φυσιολογικά κύτταρα επιφανειακού επιθηλίου των ωοθηκών. Περαιτέρω, ανοσολογικά δραστικά επίπεδα HER2 μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ανθρώπινα Τ κύτταρα τα οποία είχαν τροποποιηθεί γενετικά ώστε να εκφράζουν ένα χιμαιρικό υποδοχέα αντιγόνου HER2-ειδική (CAR). Αντι-HER2 CAR Τ κύτταρα αξιολογήθηκαν για την ικανότητά τους να αναγνωρίζουν OvCas HER2 που εκφράζουν και τα φυσιολογικά κύτταρα. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι όλες οι OVCA δείγματα εκφράζουν HER2, και ότι αυτό το επίπεδο της έκφρασης είναι αρκετή για να προκαλέσει ανοσολογική αναγνώριση.

Α.

ανοσοχρώση που δείχνει την περιφερειακή πολυμορφία της έκφρασης HER2 σε υψηλής ποιότητας θηλώδες ορώδες αδενοκαρκίνωμα των ωοθηκών. επίπεδα έκφρασης HER2 βαθμολογήθηκαν σε μια κλίμακα 0-3 (σκορ 0 = μη ανιχνεύσιμο, βαθμολογία: 3 = ισχυρή χρώση). Αρχική μεγέθυνση ήταν 200 ×.

Β.

Heatmap απεικόνιση του επιπέδου έκφρασης HER2 σε 50 περιπτώσεις πρωτογενούς και του μεταστατικού καρκινώματος των ωοθηκών, καθώς σκόραρε με χρώση IHC.

C

κατανομή συχνότητας των χώρων που εκφράζουν HER2 σε επίπεδα που κυμαίνονται από την βαθμολογία 0 έως 3. Ο μέσος αριθμός των αξιολογούνται χώρων για τις περιπτώσεις με μη ανιχνεύσιμο ή ανιχνεύσιμη έκφραση HER2 ήταν παρόμοια (4,2 έναντι 3,7 αντίστοιχα?.

P

= 0,19). .

D

κατανομή συχνότητας είτε πρωτογενείς ή μεταστατικές θέσεις που εκφράζουν HER2 σε επίπεδα που κυμαίνονται από την βαθμολογία 0 έως 3. Μια μεγαλύτερη συχνότητα των βασικών θέσεων του όγκου εκφράζεται HER2 (36%? 30/84) σε σύγκριση με μεταστατικές θέσεις (24 %? 27/111) και είχε μια υψηλότερη μέση βαθμολογία έκφραση του HER2 (0,37

vs

0.21,

P

= 0.04).. Δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά δεν παρατηρήθηκε συγκρίνοντας τα επίπεδα έκφρασης μεταξύ των πρωτογενών και μεταστατικών sites που εκφράζονται HER2 σε οποιοδήποτε επίπεδο (1,03

vs.

0.86,

P

= 0,26).

P

τιμές υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας την ανάλυση t-test αταίριαστο μαθητή.

Η

Υλικά και Μέθοδοι

καρκινικά κύτταρα και γραμμές

Οι χορηγοί τέθηκε σε μια Πανεπιστήμιο της Πενσυλβάνια Διοικητικού κριτική Θεσμική (IRB) -approved κλινικό πρωτόκολλο και να υπογραφεί μια ενημερωμένη συγκατάθεση πριν από όγκο ή τη συλλογή του αίματος. Για συμπαγείς όγκους ή φυσιολογικά δείγματα ωοθήκης, δείγμα κύβους σε RPMI-1640, πλένεται και φυγοκεντρείται (800 rpm, 5 λεπτά, 15-22 ° C), και επαναιωρήθηκαν σε ενζυματική ρυθμιστικό πέψης (0,2 mg /ml κολλαγενάση και 30units /ml DNase σε RPMI-1640) για τη διάρκεια της νύχτας περιστροφή σε θερμοκρασία δωματίου. συλλογές ασκίτη πλύθηκαν και κρυοσυντηρημένα πριν από τη μελέτη. Βραχυπρόθεσμες καλλιεργημένα πρωτογενή γραμμές ευγενώς από το Δρ Richard Carroll στο Πανεπιστήμιο της Πενσυλβανίας [17]. Ιδρύθηκε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές των ωοθηκών και του καρκίνου του μαστού, το ανθρώπινο κύτταρο Τ λεμφοβλάστης-σαν κυτταρική γραμμή CEM και η κυτταρική γραμμή 293Τ αγοράστηκαν (ATCC). Κανονική IOSE-6 κυτταρικές σειρές IOSE-4 και ευγενικά από τον Dr. Birrer από Dana-Farber /Harvard Κέντρο Καρκίνου [18] και η 398 κυτταρική γραμμή ήταν ένα δώρο από τον Δρ Λιν Ζανγκ από το Πανεπιστήμιο της Πενσυλβάνια [19]. 293Τ κύτταρα και κυτταρικές γραμμές όγκου διατηρήθηκαν σε πλήρες μέσο? RPMI-1640 (Invitrogen) συμπληρωμένο με 10% (ν /ν) θερμο-απενεργοποιημένο FBS, 2 mM L-γλουταμίνη, και 100 μg /mL πενικιλλίνη και 100 U /ml στρεπτομυκίνη.

A.

ERBB2

επίπεδα mRNA σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου ωοθηκών με Q-PCR.

ERBB2

επίπεδα του mRNA των κυτταρικών σειρών καρκίνου των ωοθηκών είναι σε σχέση με εκείνο του ErbB2-αρνητικών κυττάρων CEM. Όλα καρκίνο των ωοθηκών κυτταρικές σειρές εκφράζουν

ΕΚΒΒ2

mRNA. Β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένα ενδογενές γονίδιο ελέγχου. Αποτελέσματα απεικονίζουν τη μέση ± SD φρεατίων εις τριπλούν. Μέση σχετική

ΕΚΒΒ2

έκφρασης του mRNA μεταξύ συσταθεί και βραχυπρόθεσμες OVCA κυτταρικές σειρές δεν ήταν στατιστικά διαφορετικό (

P

= 0.45).

P

αξία υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την ανάλυση t-test αταίριαστο μαθητή.

B

Ανίχνευση της έκφρασης HER2 επιφανειακής πρωτεΐνης (συμπληρωμένο ιστογράμματα) από ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές των ωοθηκών με κυτταρομετρία ροής.? ελέγχου ισότυπου αντίσωμα (ανοικτά ιστογράμματα).

C.

Ανάλυση Western blot της έκφρασης πρωτεΐνης HER2 σε αντιπροσωπευτικές κυτταρικές γραμμές που εκφράζουν διαφορικά ποσά του HER2. HER2 πρωτεΐνη εκφράζεται σε διάφορα επίπεδα σε όλες τις κυτταρικές γραμμές ωοθηκών δοκιμάστηκαν. Β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος.

Η

Η ανοσοϊστοχημεία

έγκριση του διοικητικού συμβουλίου επανεξέταση Θεσμικών ελήφθη. Εμείς ανακτηθεί εγγραφές από 50 διαδοχικούς ασθενείς με μεταστατικό θηλώδες ορώδες καρκίνο των ωοθηκών (ΦΥΓΩ στάδιο ΙΙΒ και άνω) που υποβάλλονται σε πρωτογενή εκτομή στο ίδρυμά μας μεταξύ 2005 και 2008. Τα πλακίδια επανεξετάζονται και σχολιασμένη και επιλέχθηκαν τμήματα ιστού σε παραφίνη ενσωματωμένο να κατασκευάσει μια μικροσυστοιχία ιστό της πρωτογενείς και μεταστατικούς όγκους. 206 Το σύνολο των καταθέσεων του όγκου (πρωτογενείς sites και μεταστάσεις) εκπροσωπήθηκαν στη συστοιχία. Μία μέση 3,7 θέσεις περιελήφθησαν ανά ασθενή. Οι πιο συχνές μεταστατικές θέσεις που περιλαμβάνονται επίπλουν, περιτόναιο (π.χ., cul-de-sac), ορογόνο της μήτρας, και τοίχωμα του εντέρου. Για κάθε μπλοκ, τριπλούν πυρήνες 0,6 mm από όγκων τοποθετήθηκαν σε μικροσυστοιχία ιστού. 5 μm τομές παραφίνης χρωματίστηκαν με αντι-ανθρώπινο αντίσωμα HER2 κουνελιού (Dako) σύμφωνα με πρότυπα πρωτόκολλα. έκφραση HER2 σε κάθε πυρήνα βαθμολογήθηκε με μικροσκοπία φωτός στα 200 × μεγέθυνση χρησιμοποιώντας μία ημιποσοτική κλίμακα που κυμαίνεται από 0 έως 3. Πυρήνες δείχνει λιγότερο από 10% του όγκου δεν βαθμολογήθηκαν. Για κάθε σημείο του όγκου, το τελικό σκορ ήταν ο μέσος όρος των βαθμολογιών για όλους τους αξιολογήσιμους πυρήνες.

Η

Ποσοτική PCR

RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας RNA εύκολο κιτ (Qiagen). cDNA δημιουργήθηκε από 1 μg RNA χρησιμοποιώντας First Strand Ready-To-Go χάντρες (GE Healthcare). Real-time PCR πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν με τη χρήση εκκινητών Applied Biosystem για

ERBB2

και Β-ακτίνης.

ERBB2

επίπεδα του mRNA σε καρκινικά κύτταρα ομαλοποιήθηκαν σε β-ακτίνη, και σε σύγκριση με εκείνους σε CEM, και παρουσιάζονται ως φορές

ERBB2

επίπεδο mRNA. απόκτηση και ανάλυση δεδομένων διεξήχθη σύμφωνα με τις οδηγίες της Applied Biosystems του.

Μια

.

ΕΚΒΒ2

ποσοτικοποίηση mRNA σε CD45-εξαντλημένο πρωτογενή ασκίτη καρκινικά κύτταρα. SKOV-3 και CEM χρησιμοποιήθηκαν ως θετικός και αρνητικός HER2-κυτταρική σειρά που εκφράζει ελέγχει αντίστοιχα. Ράβδοι απεικονίζουν τη μέση τιμή ± SD τιμές φρεατίων εις τριπλούν.

Β

.

ΕΚΒΒ2

ποσοτικοποίηση mRNA σε πρωτογενή στερεά καρκινικά κύτταρα CD45-εξαντλημένο. Δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά στη μέση

ΕΚΒΒ2

mRNA επίπεδο παρατηρήθηκε μεταξύ ασκίτη και συμπαγείς όγκους (

P

= 0.46).

Γ.

Επιφανειακή έκφραση του HER2 (στερεά ιστογράμματα) από εκπρόσωπο το Ber-EP4

+ CD45

– περίφραξη ασκίτη και στερεών όγκων που προέρχονται από τα καρκινικά κύτταρα παρακολουθείται με κυτταρομετρία ροής? ελέγχου ισότυπου αντίσωμα (ανοικτά ιστογράμματα). Δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά στο επίπεδο της πρωτεΐνης HER2 παρατηρήθηκε μεταξύ ασκίτη ή συμπαγείς όγκους που προέρχονται κύτταρα (

P

= 0,95).

D.

Ανάλυση Western blot της έκφρασης πρωτεΐνης HER2 χύμα προϊόντα λύσης συμπαγή όγκο. Β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ενδογενή γονιδιακού ελέγχου. OVCAR-3 και CEM χρησιμοποιήθηκαν ως θετικοί και αρνητικοί έλεγχοι για έκφραση HER2. Ρ τιμές υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας την ανάλυση t-test αταίριαστο μαθητή.

Η

κυτταρομετρίας ροής

Ποντίκι αντι-ανθρώπινου CD3, CD4, CD8, CD45, CD69, CD107a και CD107b mAbs (

BD Biosciences)

χρησιμοποιήθηκαν για την φαινοτυπική ανάλυση. 7-AAD χρησιμοποιήθηκε για χρώση βιωσιμότητας. επιφανειακή έκφραση HER2 αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας βιοτίνη-συζευγμένο αντι-HER2 affibody (Abcam) ακολουθούμενη από ΡΕ-επισημασμένη στρεπταβιδίνη. Αντι-HER2 επιφανειακή έκφραση CAR αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ανασυνδυασμένη ανθρώπινη HER2 Fc χίμαιρα που ακολουθείται από ΡΕ-συζευγμένο αντι-huIgG. Απόκτηση και ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα BD FACS CANTO II με λογισμικό DIVA.

Α.

ΕΚΒΒ2

mRNA ποσοτικό προσδιορισμό σε φυσιολογικά κύτταρα ΟΣΕ (398, IOSE-4, IOSE -6 και 1744) από την Q-PCR. SKOV-3 και CEM χρησιμοποιήθηκαν ως θετικός και αρνητικός HER2 κυτταρικές σειρές που εκφράζουν αντίστοιχα. Μπαρ δείχνουν τη μέση ± SD τιμή φρεατίων εις τριπλούν.

Β

έκφραση της πρωτεΐνης HER2 Επιφάνεια (στερεά ιστογράμματα) από φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα των ωοθηκών με κυτταρομετρία ροής.? ελέγχου ισότυπου αντίσωμα (ανοικτά ιστογράμματα).

C-D.

Σύγκριση το

ΕΚΒΒ2

επίπεδα του mRNA και της πρωτεΐνης μεταξύ των ωοθηκών ασκίτη καρκίνου, στερεών όγκων και φυσιολογικών κυττάρων του ΟΣΕ. (

C

) Κάθετη διαγράμματα διασποράς του

ΕΚΒΒ2

mRNA σε ασκίτη, με συμπαγείς όγκους και φυσιολογική ΟΣΕ καθορίζεται από Q-PCR. Η μέση της κάθε ομάδας υποδεικνύεται από την οριζόντια γραμμή.

P

= 0,0498 κατά τη σύγκριση των

ΕΚΒΒ2

mRNA σε ασκίτη vs φυσιολογικά κύτταρα του ΟΣΕ?

P

= 0,0210 κατά τη σύγκριση των

ΕΚΒΒ2

mRNA σε συμπαγείς όγκους έναντι των φυσιολογικών κυττάρων του ΟΣΕ. (

D

) Κάθετη διαγράμματα διασποράς των επιπέδων πρωτεΐνης σε ασκίτη, με συμπαγείς όγκους και φυσιολογική ΟΣΕ καθορίζεται με κυτταρομετρία ροής. Η μέση της κάθε ομάδας υποδεικνύεται από την οριζόντια γραμμή

P

= 0,0616 κατά τη σύγκριση HER2 πρωτεΐνης σε ασκίτη vs φυσιολογικά κύτταρα ΟΣΕ?

P

= 0,1749 κατά τη σύγκριση της πρωτεΐνης HER2 σε συμπαγείς όγκους έναντι των φυσιολογικών κυττάρων του ΟΣΕ.

P

τιμές υπολογίσθηκαν χρησιμοποιώντας ανάλυση t-test unpaired σπουδαστή.

Η

Western Blotting

μονοστοιβάδες κυττάρων πλύθηκαν με ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο διάλυμα (PBS) και λύθηκαν σε ρυθμιστικό RIPA (50 mM Tris-HCl (ρΗ 7.0), 1.0% ΝΡ-40, 0.1% δεοξυχολικό οξύ, 30 mM Na

3νο

4, 1 mM PMSF). Τα προϊόντα λύσης διαυγάστηκαν με φυγοκέντρηση και προσδιορίζεται ποσοτικά χρησιμοποιώντας ένα κιτ Nanoorange (Invitrogen). 15 μg ολικής πρωτεΐνης ανά λωρίδα αναλύθηκε με ηλεκτροφόρηση δωδεκύλ νάτριο (SDS-PAGE) σε προ-cast κλίση (4-15%) γέλες (Bio-Rad) στα 120 V για 60 λεπτά. Η πρωτεΐνη μεταφέρθηκε από το πήκτωμα σε μεμβράνη μεταφοράς Immobilon-P για 30 λεπτά, μπλοκάρει τη διάρκεια της νύχτας με 5% γάλα /PBST και αποτυπώθηκαν χρησιμοποιώντας 1 μg /ml του ποντικού αντι-ανθρώπινου HER2 mAb (κλώνος 3Β5, BD Biosciences). Οι μεμβράνες πλύθηκαν 3 χ με PBST και στυπώθηκε με συζευγμένο με HRP δευτερογενές αντίσωμα αντι-ποντικού για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Β-ακτίνη ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας αντι-ανθρώπινα Β-ακτίνη HRP (1:30,000). Οι μεμβράνες επωάστηκαν με ECL Plus (GE Healthcare) για 5 λεπτά και εκτέθηκαν σε φιλμ για 15-30 δευτερόλεπτα.

Μια

. Σχηματική αναπαράσταση του Anti-HER2 κατασκεύασμα χιμαιρικού αντιγόνου υποδοχέα (CAR) που περιέχει το κυτοσολικό τομέα CD3ζ μόνο (C6.5-z). C6.5, αντι-HER2 scFv? VL, μεταβλητό ελαφριάς αλυσίδας? L, Linker? VH, μεταβλητό βαριάς αλυσίδας? ΤΜ, διαμεμβρανική περιοχή. έκφραση ΑΥΤΟΚΙΝΗΤΩΝ C6.5 scFv (γκρι ιστογράμματα) εντοπίστηκε στην ανθρώπινη CD4

+ και CD8

+ – περίφραξη Τ κύτταρα χρησιμοποιώντας ανασυνδυασμένη ανθρώπινη HER2-Ρο χιμαιρική πρωτεΐνη 10 ημέρες μετά από μεταγωγή, σε σύγκριση με μη μεταδιηγερμένα κύτταρα Τ (ανοιχτά τα ιστογράμματα ). Ποσοστό της μεταγωγής CAR ενδείκνυται.

Β.

Anti-HER2 CAR μετατραπέντα κύτταρα Τ παράγουν IFN-γ ειδικά μετά από διέγερση με ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές των ωοθηκών. CAR μετάγονται ή μη μεταδιηγερμένα κύτταρα Τ καλλιεργήθηκαν μόνο (καμία) ή διεγείρονται όλη τη νύχτα με ανθρώπινο HER2

+ καθιερωθεί και βραχυπρόθεσμες ωοθηκών καρκινικές κυτταρικές σειρές ή HER2

– γραμμές ελέγχου CEM και MDA468. IFN-γ ποσοτικοποιήθηκε από υπερκείμενα άνευ κυττάρου με ELISA.

Γ.

Αντι-HER2 CAR Τ κύτταρα εκκρίνουν IFN-γ μετά από διέγερση με HER2

+ πρωτογενή ασκίτη (αριστερά) ή στερεά ωοθηκών (μέση) καρκινικών κυττάρων. Ελάχιστες ποσότητες ΙΡΝ-γ ανιχνεύτηκαν μετά από διέγερση με τα φυσιολογικά κύτταρα των ωοθηκών επιφάνεια επιθηλιακών 398, IOSE-4, IOSE-6 ή 1744 (δεξιά). Οι συγκεντρώσεις κυτοκίνης (pg /ml) αναφέρονται ως μέσος όρος ± SEM των τριπλών φρεατίων.

Η

Anti-HER2 CAR Κατασκευή

PCR προϊόντων που περιέχουν τη C6.5Y100KA HER2 scFv [20] έγιναν ευγενώς από Silvana Canevari (Instituto Nazionale dei Tumori, Ιταλία) και στη συνέχεια κλωνοποιήθηκε εντός του φορέα pCR2.1-ΤΟΡΟ χρησιμοποιώντας το ΤΟΡΟ τΑ Cloning Kit (Invitrogen). Η αλληλουχία C6.5 scFv [21] DNA αναπτύχθηκε από το ανωτέρω πλασμίδιο χρησιμοποιώντας QuikChange πολλαπλών Τοποκατευθυνόμενη Μεταλλαξογένεση Kit (Stratagene). Το τελικό πλασμίδιο χρησιμοποιήθηκε ως εκμαγείο για PCR ενίσχυση ενός 795-bp C6.5 scFv χρησιμοποιώντας τους ακόλουθους εκκινητές: 5′-GCGGGATCCATGGCCCAGGTGCAGCTGTTGCAGTCTGGGGCA-3 ‘(BamHI είναι υπογραμμισμένη) και 5′-GCGGCTAGCCGCACCTAGGACGGTCAGCTTGGTCCCTCCGCC-3’ (NheI είναι υπογραμμισμένο ). Το προκύπτον PCR προϊόν υποβλήθηκε σε πέψη με BamHI και NheI και συνδέθηκε εντός αυτο-αδρανοποίηση pCLPS φορέα λεντοϊού έκφρασης τρίτης γενιάς που περιέχει μια CD3ζ σηματοδότησης αλληλουχία CAR, με έκφραση διαγονιδίου οδηγείται από τον προαγωγέα CMV. Το προκύπτον κατασκεύασμα ονομάστηκε pCLPS-C6.5-z.

C6.5 CAR Τ κύτταρα αποκοκκιώνονται και εκφράζουν δείκτες ενεργοποίησης των Τ κυττάρων σε απόκριση σε HER2-ειδική διέγερση. C6.5 CAR Τ κύτταρα καλλιεργήθηκαν χωρίς κύτταρα στόχους (καμία) ή με τους υποδεικνυόμενους στόχους HER2-αρνητικό ή -θετικό καθιερωθεί και πρωτογενές κύτταρο όγκου ή φυσιολογικά κύτταρα OSE για 5 ώρες ενώ χρωματίστηκαν με αντι-CD107a, b αντίσωμα συζευγμένο με FITC. Μετά την περίοδο επώασης, τα Τ κύτταρα χρωματίστηκαν για CD8 και CD69 και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής.

Η

Ανασυνδυασμένη Lentivirus Παραγωγή

υψηλού τίτλου ελαττωματικό αντιγραφής φορείς λεντοϊών παρήχθησαν και συμπυκνώθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [22]. Εν συντομία, κύτταρα 293Τ επιμολυσμένα με 7 μα pVSV-G πλασμίδιο, 18 ug πλασμιδίου pRSV.REV, το πλασμίδιο 18 ug pMDLg /p.RRE, και 15 μg πλασμιδίου μεταφοράς pCLPS-C6.5-z χρησιμοποιώντας Express (ανοιχτή Biosytems). Viral υπερκείμενο συνελέγη σε 24 ώρες και 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. Σωματίδια ιού συμπυκνώνονται με υπερφυγοκέντρηση για 3 ώρες σε 25,000 rpm με ρότορα Beckman SW28 (Beckman Coulter) και επαναιωρήθηκαν σε 0,4 ml RPMI.

Τ Cell Transduction

Πρωτογενή ανθρώπινα Τ κύτταρα αγοράστηκαν από την Ανθρώπινα Ανοσολογίας πυρήνα στο Πανεπιστήμιο της Πενσυλβάνια απομονώθηκαν από υγιείς εθελοντές δότες μετά από λευκαφαίρεση με αρνητική επιλογή. Όλα τα δείγματα συλλέχθηκαν στο πλαίσιο ενός Πανεπιστημίου Institutional Review Board-εγκεκριμένο πρωτόκολλο, και γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από κάθε δότη. Τ κύτταρα διεγέρθηκαν σε πλήρες μέσο με αντι-CD3 και αντι-CD28 mAb επικαλυμμένα σφαιρίδια (Invitrogen) και μετάγονται με ανασυνδυασμένο CAR κωδικοποιεί lentivirus σε ΜΟΙ ~5-10 όπως περιγράφεται [22].

κυτοκίνης Release Δοκιμασίες

1 × 10

5 Τ κύτταρα συν-καλλιεργήθηκαν με 1 χ 10

5 κυττάρων στόχων ανά φρεάτιο εις τριπλούν σε τρυβλία 96 φρεατίων με στρογγυλό πυθμένα σε τελικό όγκο 200 υΐ πλήρους μέσου. Μετά 20~24 hr, υπερκείμενα άνευ κυττάρου αναλύθηκαν για την παρουσία ΙΡΝ-γ χρησιμοποιώντας είτε ένα κιτ ELISA (Biolegend) ή Cytokine Bead Array (BD Biosciences), σύμφωνα με τις οδηγίες των κατασκευαστών.

Δοκιμασία αποκοκκίωση

Δοκιμασία διεξήχθη όπως περιγράφεται [23] με μικρές τροποποιήσεις. 1 × 10

5 Τ κύτταρα συν-καλλιεργήθηκαν με 1 χ 10

5 κυττάρων-στόχων σε 100 μΙ μέσου ανά φρεάτιο σε πλάκα 96 φρεατίων εις τριπλούν. Καλλιέργειες ελέγχου περιείχαν μόνο του Τ κύτταρα. Αντι-CD107a και Anti-CD107b Ab (10 υΐ /φρεάτιο) ή IgG1 συζευγμένα σε FITC (BD Biosciences), και 1 ul /δείγμα μονενσίνης (BD Biosciences) προστέθηκαν σε καλλιέργεια και επωάστηκαν για 5 ώρες στους 37 ° C. Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS, χρωματίστηκαν για έκφραση του CAR, CD8 και CD69 και αναλύονται με κυτταρομετρία ροής, όπως περιγράφεται παραπάνω.

Δοκιμασία Chromium Release

δοκιμασίες απελευθέρωσης 51Cr διεξήχθησαν όπως περιγράφεται [24]. Τα κύτταρα στόχοι σημάνθηκαν με 100 μΟί

51Cr στους 37 ° C για 1,5 ώρες. Τα κύτταρα στόχοι εκπλύθηκαν τρεις φορές σε PBS, επαναιωρήθηκαν σε μέσο καλλιέργειας σε 1 × 10

5 βιώσιμα κύτταρα /ml και 100 μΙ προστίθενται ανά φρεάτιο μιας πλάκας 96-φρεατίων ν-πυθμένα. Κύτταρα-τελεστές πλύθηκαν δύο φορές σε μέσο καλλιέργειας και προστέθηκαν σε φρεάτια στις δεδομένες αναλογίες. Οι πλάκες φυγοκεντρήθηκαν γρήγορα να εγκατασταθούν κύτταρα, και επωάζονται στους 37 ° C σε ένα 5% CO

2 επωαστή για 18 ώρες μετά τον οποίο χρόνο συλλέχθηκαν τα υπερκείμενα, μεταφέρθηκε σε lumar-πλάκα (Packard) και απαριθμήθηκαν χρησιμοποιώντας 1450 Microbeta Liquid Scintillation Counter (Perkin-Elmer). Αυθόρμητη

απελευθέρωσης 51Cr αξιολογήθηκε σε κύτταρα στόχους που επωάστηκαν μόνο με μέσο. Η μέγιστη απελευθέρωση

51Cr μετρήθηκε σε κύτταρα στόχους που επωάστηκαν με SDS σε τελική συγκέντρωση 2% (ν /ν). Η επί τοις εκατό ειδική λύση υπολογίστηκε ως (πειραματική – αυθόρμητη λύση /μέγιστη – αυθόρμητη λύση) φορές 100.

Στατιστική Ανάλυση

GraphPad Prism 4.0 (GraphPad Software) χρησιμοποιήθηκε για τους στατιστικούς υπολογισμούς.

P

& lt? 0,05 τιμές θεωρήθηκαν σημαντικές. R-τετράγωνο τιμές (R

2) υπολογίστηκαν με τη χρήση γραμμικής παλινδρόμησης μέσω του Microsoft Excel.

Αποτελέσματα

ανοσοϊστοχημική ανίχνευση του HER2 έκφρασης σε καρκίνο των ωοθηκών

έκφραση HER2 ήταν αξιολογηθεί σε 50 περιπτώσεις υψηλού βαθμού ορώδες καρκίνωμα των ωοθηκών χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημική ανάλυση (IHC) σε μικροσυστοιχία ιστού (ΤΜΑ). Μεμονωμένες περιπτώσεις ποικίλουν σε σχέση με τον αριθμό των τοποθεσιών όγκου διαθέσιμες για ανάλυση. Όλες οι περιπτώσεις περιείχαν τουλάχιστον ένα κύριο σημείο της κάκωσης, ενώ η πλειοψηφία των περιπτώσεων (96%) είχαν τόσο της πρωτοβάθμιας όσο και της ≥1 μεταστατικό χώρο στάθμευσης. Για πολλά δείγματα, υπήρχαν ≥2 (62%) ή ≥3 (42%) μεταστατικές θέσεις που διατίθενται στην TMA. Σύμφωνα με IHC βαθμολόγησης, HER2 εκφράστηκε σε διάφορα επίπεδα μεταξύ των 50 περιπτώσεων που κυμαίνονται από μη ανιχνεύσιμα (σκορ 0) έως έντονη χρώση (σκοράρει 3+? Σχήμα 1Α). Θετική έκφραση HER2 σε οποιοδήποτε επίπεδο ανιχνεύθηκε σε 26 περιπτώσεις (52%), ενώ δεν ήταν ανιχνεύσιμη HER2 σε οποιαδήποτε θέση σε 24 περιπτώσεις (Σχήμα 1Β). Από τις 26 περιπτώσεις που εκφράζουν HER2 σε μία ή περισσότερες θέσεις, μόνο 6 (23%) εξέφρασε HER2 σε όλες τις θέσεις με IHC? τέτοιες περιπτώσεις ζυγίστηκαν προς υψηλότερη έκφραση HER2. Οι περισσότερες περιπτώσεις που εκφράζεται HER2 σε οποιαδήποτε θέση (20/26) εμφάνισαν ασύμφωνα έκφρασης (ανιχνεύσιμη έναντι μη ανιχνεύσιμη) σε μία ή περισσότερες θέσεις όγκου. Ο μέσος αριθμός αξιολογήθηκαν sites ήταν παρόμοια μεταξύ των 26 περιπτώσεων με ανιχνεύσιμο HER2 και τις 24 περιπτώσεις χωρίς ανιχνεύσιμη HER2 (4.2 vs. 3.7, αντίστοιχα? Μέσο καλλιέργειας

P

= 0,19). Ετερογένεια στην σχηματοποίηση της έκφρασης πρωτεΐνης HER2 μεταξύ των διαφόρων τόπων σε μεμονωμένες περιπτώσεις ήταν παρούσα με πολλαπλά πρότυπα: ανιχνεύσιμη σε όλα (6/50)? ανιχνεύσιμη στην πρωτοβάθμια, αλλά μη ανιχνεύσιμη σε μεταστατικό όγκο (8/50)? ανιχνεύσιμη σε μεταστατικό αλλά μη ανιχνεύσιμη σε πρωτογενείς όγκους (5/50)? ανιχνεύσιμο σε τουλάχιστον ένα κύριο και ένα μεταστατικές θέσεις (7/50). 195 θέσεις όγκου αξιολογήθηκε, 138 (71%) δεν έδειξε ανιχνεύσιμη έκφραση HER2 (Σχήμα 1 C). Πενήντα επτά (29%) είχαν θετική έκφραση HER2? 25% (49/195) με & gt? 0≤1 βαθμολογίας HER2? 2,5% (5/195) με & gt? 1≤2 βαθμολογίας HER2? και 1,5% (3/195) με & gt? βαθμολογίας 2≤3 HER2. Μια μεγαλύτερη συχνότητα των βασικών θέσεων του όγκου εκφράζεται HER2 (36%? 30/84) σε σύγκριση με μεταστατικές θέσεις (24%? 27/111) και είχε μια υψηλότερη μέση βαθμολογία έκφραση του HER2 (0,37

vs

0.21,

P

= 0,04? Σχήμα 1D). Μεταξύ πρωτοβάθμιας και μεταστατικές θέσεις που εκφράζονται HER2 σε οποιοδήποτε επίπεδο, δεν υπήρχε στατιστικά σημαντική διαφορά σε επίπεδο έκφρασης (1.03

vs.

0.86,

P

= 0,26). Εν κατακλείδι, IHC επιτρέπει την ανίχνευση της έκφρασης HER2 σε 29% του συνόλου των τόπων και περίπου το ήμισυ του συνόλου των προηγμένων OVCA τις περιπτώσεις που εξετάστηκαν.

HER2 εκφράζεται από όλες τις γραμμές των ωοθηκών Cancer Cell

Το σχετικά χαμηλή ευαισθησία της ανάλυσης IHC μπορεί να επηρεάσει την ανίχνευση χαμηλών πρωτεϊνών αφθονίας και ως εκ τούτου παραποιούν την πραγματική συχνότητα των καρκίνων που εκφράζουν το HER2. Για να αξιολογηθεί καλύτερα η έκφραση HER2 σε OVCA, 12 εγκατεστημένος και 7 βραχυπρόθεσμες κυτταρικές σειρές OVCA μετρήθηκαν για

ERBB2

επίπεδα mRNA με Q-PCR, και σε σύγκριση με εκείνη που ανιχνεύεται από CEM, μια ανθρώπινου Τ κυττάρου λεμφοβλάστης που μοιάζει κυτταρική γραμμή που έχει έλλειψη έκφρασης HER2 [25]. Όλες οι κυτταρικές σειρές OVCA εκφράζεται

ERBB2

mRNA, αν και σε διάφορα επίπεδα (Σχήμα 2Α). Αυξημένη

ERBB2

έκφραση mRNA, σε σχέση με τον έλεγχο CEM, κυμάνθηκε από 63- έως 6614-φορές σε καθιερωμένες γραμμές και από 40- έως 1088-φορές σε πρωτογενείς κυτταρικές σειρές μικρής διάρκειας. Μέση σχετική

ERBB2

έκφραση του mRNA μεταξύ καθοριστεί (815 φορές) και οι βραχυπρόθεσμες OVCA κυτταρικές γραμμές (372 φορές) δεν ήταν στατιστικά διαφορετικές μεταξύ (

P

= 0.45).

ΕΚΒΒ2

mRNA δεν ανιχνεύθηκε στη γραμμή ελέγχου CEM, αλλά ήταν ανιχνεύσιμη σε χαμηλά επίπεδα στη γραμμή ελέγχου του καρκίνου του μαστού, MDA468, η οποία εκφράζει

ΕΚΒΒ2

mRNA, αλλά όχι στην επιφάνεια της πρωτεΐνης HER2 [25] .

έκφραση πρωτεΐνης HER2 εξετάστηκε σε καθιερωμένες και κυτταρικές βραχυπρόθεσμες πρωτογενείς γραμμές όγκου με χρώση μη-διαπερατά κύτταρα με ένα εξαιρετικά ευαίσθητο αντι-ΗΕΚ2 affibody [25], ένας συνδέτης υψηλής συγγένειας εναντίον της εξωκυτταρικής περιοχής του HER2 , που ακολουθείται από ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Αντιπροσωπευτικά ιστογράμματα δείχνουν καθιερωμένες κυτταρικές γραμμές που εκφράζουν υψηλά OVCA, ενδιάμεσα ή χαμηλά επίπεδα επιφάνειας του HER2 πρωτεΐνης και αρνητικές κυτταρικές γραμμές ελέγχου χωρίς ανιχνεύσιμη έκφραση HER2 (Σχήμα 2Β). Όλα ιδρύθηκε (n = 12) και βραχυπρόθεσμα (n = 7) OVCA κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν έδειξαν επιφανειακή έκφραση της πρωτεΐνης HER2 (Πίνακας 1). Τα περισσότερα κύτταρα σε καθιερωμένες (97,7 ± 1,3%) και οι βραχυπρόθεσμες σειρές (88.9 ± 4.8%) εξέφρασαν πρωτεΐνη HER2, με ένα υψηλότερο ποσοστό στις καθιερωμένες γραμμές (

P

= 0,03) (Πίνακας 1). Τα μέσα επίπεδα πρωτεΐνης HER2 μετρήθηκαν με ειδική μέση ένταση φθορισμού (MFI) κινήθηκαν προς την επίτευξη υψηλότερων σε καθιερωμένες κυτταρικές γραμμές (1906 ± 1221 ΜΧΠ? Μονάδες ένταση φθορισμού) σε σύγκριση με κυτταρικές σειρές βραχυπρόθεσμη (594 ± 165 FIU), αλλά δεν ήταν σημαντικά διαφορετικές (

P

= 0,43) (Πίνακας 1), σύμφωνα με τα αποτελέσματα mRNA. HER2 πρωτεΐνη και

ΕΚΒΒ2

τα επίπεδα έκφρασης του mRNA από όλες τις κυτταρικές σειρές OVCA συσχετίζονταν σημαντικά (Ρ

2 = 0,83? Υπολογίζονται χρησιμοποιώντας γραμμική παλινδρόμηση). έκφραση της πρωτεΐνης HER2 Cellular επιβεβαιώθηκε με ανάλυση κηλίδος western (αντιπροσωπευτικά δείγματα φαίνεται? Σχήμα 2C).

Ευρεία HER2 έκφρασης στην Πρωτοβάθμια καρκίνου των ωοθηκών Δείγματα

Από

in vitro

πολιτισμό μπορεί επιλεκτικά εμπλουτίσουν για OVCA κυττάρων HER2-έκφραση [16], μετρήσαμε την έκφραση HER2 σε μη καλλιεργημένα καρκινικά κύτταρα που προέρχονται απευθείας από το πρωτογενές περιτοναϊκή OVCA ασκίτη ή πρόσφατα εκτομή συμπαγείς όγκους. Καρκινικά κύτταρα από ασκίτη ή δείγματα στερεού όγκου εμπλουτίστηκαν με μαγνητική εξάντληση των CD45

+ λευκοκύτταρα και αξιολογήθηκαν για τη σχετική

ERBB2

επιπέδων mRNA μέσω Q-PCR (Σχήμα 3Α, Β). Όλα τα κύτταρα πρωτογενούς όγκου δοκιμάζονται αμόρφωτος (n = 22) που εκφράζεται

ERBB2

mRNA σε επίπεδα που κυμαίνονται από 35- έως 1225-φορές υψηλότερη από ό, τι τα κύτταρα CEM. Δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά στη μέση

ΕΚΒΒ2

παρατηρήθηκε επίπεδο του mRNA μεταξύ ασκίτη και συμπαγείς όγκους (477

ν

s 583, αντίστοιχα?.

P

= 0,46). Η κυτταρομετρία ροής πραγματοποιήθηκε με τη χρήση αντι-ΗΕΚ2 affibody έδειξε ότι οι μη-διαπερατά κύτταρα όγκου (BerEp4

+ CD45

-) σε όλα τα πρωτογενή ασκίτη (n = 22) και δείγματα στερεού όγκου (n = 10) εκφρασμένη πρωτεΐνη HER2 επιφάνεια, έστω και σε διαφορετικό επίπεδο, σε συμφωνία με την ανίχνευση του

ΕΚΒΒ2

mRNA από την Q-PCR (Πίνακας 2? αντιπροσωπευτικά δεδομένα φαίνεται στο Σχήμα 3C). Δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά στο επίπεδο της πρωτεΐνης HER2 παρατηρήθηκε μεταξύ ασκίτη ή συμπαγείς όγκους που προέρχονται κύτταρα (7209 ± 1197 ΜΧΠ

vs

7407 ± 2531 ΜΧΠ, αντίστοιχα?.

P

= 0,95), σε συμφωνία με αποτελέσματα mRNA. ανάλυση Western blot πραγματοποιήθηκε σε λύματα ολόκληρων όγκων έδειξε επίσης πανταχού παρούσα έκφραση του HER2 στην πρωτοβάθμια συμπαγείς όγκους (αντιπροσωπευτικά δείγματα φαίνεται στο Σχήμα 3D).

Οι ανιχνεύσιμοι HER2 έκφρασης στην Κανονική επιθηλιακά κύτταρα ωοθηκών

Τρεις απαθανάτισε ωοθηκών επιθήλιο κυτταρικές γραμμές επιφάνεια (ΟΣΕ) και ένα κύριο δείγμα μη καλλιεργημένα κυττάρου (1744) που προέρχεται από φυσιολογικές ωοθήκες ελέγχθηκαν για έκφραση HER2. Όλα τα φυσιολογικά κύτταρα ΟΣΕ εξέφρασαν χαμηλά επίπεδα του

ERBB2

mRNA που κυμαίνονταν από 35 φορές έως 217 φορές υψηλότερα από τα κύτταρα CEM ελέγχου (128 ± 5,5? Σχήμα 4Α). Η κυτταρομετρία ροής (Σχήμα 4Β) και ανάλυση κηλίδος western (δεν φαίνονται) έδειξαν ότι όλα τα κανονικά κύτταρα εκφράζουν χαμηλά ΟΣΕ ακόμη ανιχνεύσιμα επίπεδα HER2 πρωτεΐνης. κυτταρικές σειρές IOSE-4 IOSE-6 και εξέφρασαν υψηλότερα επίπεδα πρωτεΐνης από το 398 και γραμμή 1744 δείγμα φυσιολογικού ωοθήκη, σύμφωνα με τα αποτελέσματα του mRNA.

Στη συνέχεια συνέκριναν τα επίπεδα

ERBB2

mRNA και πρωτεΐνη σε φυσιολογικά κύτταρα ΟΣΕ, κακοήθη ασκίτη και πρωτογενή στερεά που προέρχονται από όγκους καρκινικών κυττάρων (Εικόνες 4C-D). Ασκίτη και τα δείγματα στερεού όγκου εκφράζεται γενικά υψηλότερα επίπεδα του

ΕΚΒΒ2

mRNA και της πρωτεΐνης σε σύγκριση με τα κύτταρα του ΟΣΕ, αν και μια επικάλυψη σε επίπεδο έκφρασης υπήρχε μεταξύ των ομάδων. Ασκίτης και συμπαγείς όγκους που εκφράζονται πολύ πιο

ΕΚΒΒ2

mRNA από τον ΟΣΕ κύτταρα (ασκίτης, 483 ± 319 φορές,

P

= 0,0498? Στερεά όγκου, 583 ± 330 φορές,

P

= 0,0210? ΟΣΕ, 128 ± 93 φορές). επίπεδα πρωτεΐνης HER2 έτεινε να είναι υψηλότερη σε ασκίτη (5825 ± 1202 φορές) και τα δείγματα στερεού όγκου (7,407 ± 2,531-φορές) σε σύγκριση με την κανονική ΟΣΕ (1429 ± 111 φορές), αλλά σε χαμηλή στατιστική σημασία (ασκίτης

v.

s ΟΣΕ

P

= 0,0616?. Στερεά

vs

ΟΣΕ

P

= 0,1749). Διακύμανση των επιπέδων έκφρασης HER2 σε δείγματα ΟΣΕ ήταν περιορισμένη, επιτρέποντας μια αξιόπιστη διάκριση δείγματα όγκων που υπερεκφράζουν το HER2. Συγκριτικά, το 75% (9/12) του ασκίτη και 90% (9/10) των συμπαγών όγκων εξέφραζαν υψηλότερα επίπεδα HER2 σε σύγκριση με ΟΣΕ, και 91% (20/22) των ασκίτη και 80% (8/10) στερεού όγκοι είχαν υψηλότερα επίπεδα πρωτεΐνης HER2 από τα φυσιολογικά κύτταρα OSE.

HER2-ειδικά Τ κύτταρα να αναγνωρίζουν όλα Κυτταρικών γραμμών Καρκίνωμα ωοθηκών

Οι χιμαιρικοί υποδοχείς αντιγόνου (αυτοκίνητα) συνδυάζουν την εξειδίκευση του αντισώματος για μία επιφάνεια αντιγόνου με το τελεστή δραστικότητα των Τ λεμφοκυττάρων [26]. HER2-συγκεκριμένο αυτοκίνητο που εκφράζουν τα Τ κύτταρα μπορούν να ασκήσουν ισχυρές, εξαρτώμενη από τη δόση

in vitro

δραστικότητα κατά του όγκου έναντι HER2-θετικών κυττάρων-στόχων [20], [25]. Να διερευνήσει το βαθμό στον οποίο η έκφραση ευρεία HER2 από OVCA προσδίδει ευαισθησία σε HER2-στοχευμένη ανοσοθεραπεία, ανθρώπινο δότη Τ κύτταρα γενετικά τροποποιημένα ώστε να εκφράζουν ένα αντι-HER2 CAR (C6.5) [27], με αυτόν τον τρόπο τον επαναπροσδιορισμό τους ενάντια επιφάνεια HER2, και ελέγχονται για συγκεκριμένη δραστηριότητα ενάντια OvCas. Το κατασκεύασμα C6.5 CAR αποτελείται από το scFv C6.5 συνδέονται με μια άρθρωση και διαμεμβρανική περιοχή CD8α, που ακολουθείται από ένα ενδοκυτταρικό CD3ζ περιοχή σηματοδότησης (C6.5-z? Σχήμα 5Α). Πρωτογενή ανθρώπινα CD4

+ και CD8

+ Τ κύτταρα αποτελεσματικά μετάγονται με το αυτοκίνητό χρησιμοποιώντας φορείς λεντοϊών με απόδοση μεταγωγής επαναλήψιμα & gt? 60% (Σχήμα 5Α).