Αφηρημένο

Μια δομή λύση NMR υψηλής ποιότητας παρουσιάζεται για την πρωτεΐνη hMcl- 1 (171-327) η οποία περιλαμβάνει τα κατάλοιπα 171-327 του ανθρώπινου αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη Mcl-1 (HMCL-1). Δεδομένου ότι αυτό το κατασκεύασμα περιέχει τα μοτίβα αλληλουχίας τρία ομολογίας Bcl-2 (ΒΗ) που συμμετέχουν στον σχηματισμό μια θέση δέσμευσης για αναστολείς HMCL-1, θεωρείται ότι είναι ζωτικής σημασίας για την δομή που βασίζεται σε σχεδιασμό νέων αντικαρκινικών φαρμάκων αποκλεισμού ο MCL1 συναφή αντι-αποπτωτικό μονοπάτι. Ενώ είναι διαθέσιμες στο κοινό οι συντεταγμένες μιας δομής διαλύματος NMR για ένα αντίστοιχο κατασκεύασμα του ομολόγου ποντικού (mMcl-1), η δομή μας είναι η πρώτη ατομική δομή ανάλυση που αναφέρθηκαν για την «apo μορφή» της ανθρώπινης πρωτεΐνης. Σύγκριση των δύο δομών αποκαλύπτει ότι HMCL-1 (171-327) παρουσιάζει μία κάπως ευρύτερο συνδέτη /αναστολέα αύλακα σύνδεσης καθώς και μια διαφορετική κατανομή φορτίου εντός της αύλακας δέσμευσης ΒΗ3. Τα ευρήματα αυτά υποδεικνύουν έντονα ότι η διαθεσιμότητα του ανθρώπινου δομής είναι κρίσιμης σημασίας για την υποστήριξη μελλοντικό σχεδιασμό των φαρμάκων κατά του καρκίνου

Παράθεση:. Liu G, Poppe L, Aoki Κ, Yamane Η, Lewis J, Szyperski T (2014 ) Δομή NMR υψηλής ποιότητας του ανθρώπινου αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη τομέα Mcl-1 (171-327) για τον Καρκίνο Drug Design. PLoS ONE 9 (5): e96521. doi: 10.1371 /journal.pone.0096521

Επιμέλεια: Annalisa Pastore, Εθνικό Ινστιτούτο Ιατρικής Έρευνας, Ιατρικής Έρευνας του Συμβουλίου, Λονδίνο, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 17 Δεκεμβρίου, 2013? Αποδεκτές: 8, Απριλίου του 2014? Δημοσιεύθηκε: δεύτερης Μαΐου 2014

Copyright: © 2014 Liu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη χρηματοδοτήθηκε από την Amgen Inc. (www.amgen.com). LP, KA, ΗΥ και JL είναι υπάλληλοι της Amgen Inc. και Amgen Inc. έπαιξε ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, απόφαση για τη δημοσίευση και την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Αυτή η μελέτη ήταν που χρηματοδοτείται από την Amgen Inc., αλλά δεν υπάρχει καμία ανταγωνιστική ενδιαφέροντος που μπορούν προκατάληψη αυτή τη δουλειά. Αυτή η συνεργασία δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων να PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Η δυσλειτουργία της κυτταρικής απόπτωσης [1] είναι ένα σημαντικό χαρακτηριστικό γνώρισμα του καρκίνου. Η ρύθμιση της απόπτωσης εξαρτάται από την οικογένεια των πρωτεϊνών Bcl-2 τα οποία περιέχουν ένα ή περισσότερα ομολογίας Bcl-2 (ΒΗ) μοτίβα αλληλουχίας. Με βάση τη λειτουργία τους και την ομοιότητα των αντίστοιχων μοτίβων τους αλληλουχία BH, αυτές οι πρωτεΐνες μπορούν να ομαδοποιηθούν σε τρεις κατηγορίες [2], [3]: (i) σε πολλούς τομείς προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών όπως Βαχ και Bak, (ii) anti -apoptotic (δηλαδή, προ-επιβίωσης) πρωτεΐνες όπως Mcl-1, ΒοΙ-1, Bcl-x

L, Bcl-w και Bfl-1 /Α1, τα οποία παρουσιάζουν μία παρόμοια αρχιτεκτονική ως Βαχ και Bak, και (iii) αρκετές προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών η οποία περιλαμβάνει μόνο ένα μοτίβο αλληλουχίας ΒΗ3 όπως Bid, Bad, Bim, Puma, Noxa, HRK, BMF, και NBK /Bik ( «μόνο ΒΗ3» πρωτεΐνες). Το μοτίβο ΒΗ3 της κατηγορίας (iii) πρωτεΐνες σχηματίζει μία αμφιπαθή α-έλικα η οποία αλληλεπιδρά ειδικά με ένα υδρόφοβο θύλακα που σχηματίζεται στα δύο προ-αποπτωτικών κατηγορία (i), και αντι-αποπτωτικό κατηγορία (ii) πρωτεΐνες με συμμετοχή των αντίστοιχων μοτίβων τους BH [ ,,,0],2], [3]. Η αναστολή του σχηματισμού της προκύπτουσας πρωτεΐνης-πρωτεΐνης συγκρότημα προσφέρει μια πολλά υποσχόμενη στρατηγική για τη θεραπεία του καρκίνου. Για παράδειγμα, το μικρό μόριο Bcl-2 ανταγωνιστής ΑΒΤ-737 [4] αναστέλλει την αντι-αποπτωτική κατηγορία (ii) πρωτεΐνες Bcl-x

L, Bcl-w και Bcl-1, και ένα πτητικό συστατικό [5] που μπορεί να είναι χορηγείται από του στόματος επί του παρόντος σε κλινικές δοκιμές.

το αντι-αποπτωτικό, προ-επιβίωσης 350-υπολειμμάτων πρωτεΐνη Mcl-1 ( «μυελοειδούς λευχαιμίας κυττάρων-1 ‘) [2] είναι κατά κύριο λόγο αγκυρώνεται στην εξωτερική μιτοχονδριακή μεμβράνη από ένα Ο-τερματικό πεδίο trans-μεμβράνης και περιέχει τρεις τομείς BH αλληλουχία: ΒΗ3 (υπολείμματα 209-223), ΒΗ1 (252 έως 272) και ΒΗ2 (κατάλοιπα 304 έως 319) [2]. Mcl-1 αναστέλλει τον υποδοχέα-επαγόμενη απόπτωση θάνατο από την επιλεκτική δέσμευση σε περικομμένα Bid (tBid) [6] και μπορεί να απομονώσει ενδογενή Bak να εμποδίσει Bak μεσολάβηση κυτταρικό θάνατο. Επιπλέον, Mcl-1 αλληλεπιδρά με διάφορες ΒΗ3-μόνο πρωτεΐνες (Bim, προσφορά και Puma, Noxa και Bak). Ως εκ τούτου, Mcl-1 παίζει ένα ρόλο νωρίς σε απόκριση προς σήματα κατευθύνουν είτε επιβίωση κυττάρου ή θάνατο κυττάρου [2] και έχει δειχθεί ότι είναι προς τα πάνω ρυθμισμένα σε πολυάριθμες κακοήθεις όγκους. Προσεγγίσεις για την κατάργηση της αντι-aptototic λειτουργία του Mcl-1, είτε με τη μείωση της αφθονίας ή αδρανοποιώντας λειτουργική BH3-αύλακα σύνδεσης δείχνουν μεγάλη υπόσχεση για τη θεραπεία του καρκίνου [2], [4], [6], [7]. Εδώ παρουσιάζουμε την υψηλή ποιότητα κατασκευής λύση NMR του τμήματος πολυπεπτιδίου 171 έως 327 της ανθρώπινης Mcl-1 (HMCL-1), η οποία περιλαμβάνει τα τρία BH μοτίβα που θεωρούνται ζωτικής σημασίας για τη δομή σχεδιασμό φαρμάκων.

Αποτελέσματα και συζήτηση

Μια δομή NMR υψηλής ποιότητας HMCL-1 (171-327) λήφθηκε (Πίνακας 1) και τις συντεταγμένες κατατέθηκαν στο ΠΠ [8] (2mhs κωδικός ένταξης). Η δομή αποτελείται από επτά α-έλικες α1-α7 (κατάλοιπα 173-191, 204-235, 240 έως 253, 262 έως 280, 284-301, 303-308 και 311-319) που διατάσσεται για να σχηματίσει το χαρακτηριστικό «Bcl-2 πυρήνας «δομή [9] (Σχήμα 1). Οι έλικες είναι τοπικό και παγκόσμιο επίπεδο σαφώς καθορισμένες, ενώ το C-άκρο (υπολείμματα 320-327) και οι βρόχοι που συνδέουν, αντίστοιχα, έλικες α1 και α2, α3 έλικες και α4, και έλικες α4 και α5 είναι ευέλικτα διαταραγμένο. Η κεντρική α4 έλικας περιβάλλεται από τα άλλα έξι έλικες, με α1, α2, α3 και α5 συσκευάζεται γύρω από μία πλευρά, και α6 και α7 συσκευάζονται κατά Ν-άκρο της. Έλικες α2, α3, α4 και α7 συμμετέχουν στη διαμόρφωση της αύλακας πρόσδεσης ΒΗ3. Το ηλεκτροστατικό δυναμικό της επιφάνειας πρωτεΐνης είναι θετικός στα δύο άκρα της εγκοπής δέσμευσης ΒΗ3 (λόγω της παρουσίας του Arg 233, Lys 234, Arg 248 και Arg 263) και αρνητικά στο πλάι της έλικας πλευρά α3 (λόγω Asp 256) (Σχήμα 2). Αυτό δείχνει ότι η κατανομή του φορτίου στην αύλακα δέσμευσης ΒΗ3 του HMCL-1 (171-327) διαφέρει σαφώς από άλλους αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών [10].

(Α) ραχοκοκαλιά του 20 διαμορφομερών Cyana αντιπροσωπεύει την λύση δομή του HMCL-1 (171-327) μετά την υπέρθεση της ραχοκοκαλιάς Ν, C

α και άτομα C »των α-ελίκων για ελάχιστη rmsd. Τα τρία μοτίβα αλληλουχίας BH χρωματισμένο με πράσινο (ΒΗ3), κόκκινο (ΒΗ1) και το μπλε (BH2), αντίστοιχα. (Β) Κορδέλα σχέδιο της χαμηλότερης ενέργειας διαμορφωτή της HMCL-1 (171-327). α-έλικες α1-α7 επισημαίνονται και διαφορετικού χρώματος, και η Ν- και C-άκρα είναι χαρακτηρισμένα ως «

N ‘

» και «

Γ’

«. Τα στοιχεία παρήχθησαν χρησιμοποιώντας τα προγράμματα MOLMOL [36] και PYMOL [37].

Η

(Α) Για ανθρώπινη HMCL-1 (171-327) στον προσανατολισμό που φαίνεται στο Σχήμα 1 (αριστερά) και μετά την περιστροφή κατά 180 ° γύρω από τον κατακόρυφο άξονα (δεξιά). χρώματα επιφάνειας (μπλε για θετικά φορτισμένα? κόκκινο για αρνητικά φορτισμένα) έδειξε το ηλεκτροστατικό δυναμικό υπολογίζεται χρησιμοποιώντας PYMOL [37] και το πρωτόκολλο ηλεκτροστατική προεπιλογή κενό του. (Β) Το ίδιο όπως στο (Α), αλλά για το ποντίκι mMcl-1 (152 – 308).

Η

Συμπεριλαμβανομένων HMCL-1 μας (171 – 327) δομή, είκοσι δομές ατομικό ψήφισμα που περιέχει διαφορετικά κατασκευάσματα Mcl-1 είναι επί του παρόντος κατατεθεί στο ΠΣΠ. Εκτός από τις πρωτεΐνες των δύο «apo ‘HMCL-1 (171-327) και ποντικού mMcl-1 (152-308) [10] [ΠΠ κωδικός ένταξη 1wsx, 89% ταυτότητα αλληλουχίας με την ανθρώπινη πρωτεΐνη], οι δομές για δεκαεννέα πρωτεΐνη-συνδετήρα σύμπλοκα αποτέθηκαν (Πίνακας 2) [9], [11] – [18]. Σαφώς, ο μεγάλος αριθμός των διαθέσιμων δομών αντικατοπτρίζει την εξαιρετική ενδιαφέρον Mcl-1 ως ένας στόχος για την ανάπτυξη νέων φαρμάκων κατά του καρκίνου. Υπέρθεση των α-έλικες αποκαλύπτει, όπως αναμενόταν, στενή δομική ομοιότητα για όλες τις πρωτεΐνες Mcl-1 δομών (Σχήμα 3): η απόκλιση μέσης τετραγωνικής ρίζας (rmsd) οι τιμές κυμαίνονται 1,05 – 1,54 Μια σχετική με hMcl1-1 (171-327 ) (Πίνακας 2). Ωστόσο, η σύγκριση των δύο apo πρωτεΐνη δομές HMCL-1 (171-327) και mMcl-1 (152-308) με τις πολύπλοκες δομές δείχνει ότι η θύλακα σύνδεσης διευρύνεται κατά το σχηματισμό συμπλόκου (Πίνακας 2): οι αποστάσεις μεταξύ των C

α-άτομα των υπολειμμάτων His 224 στην έλικα α2 (205 His σε mMcl-1) και 252 του (His 233 σε mMcl-1) στο Ο-άκρο της έλικας α3 είναι, αντίστοιχα, -16 Α και ~ 14 Α σε HMCL-1 (171-327) και mMcl-1 (152-308), και ~18-21 Α στο συγκροτήματα.

(Α) Δομές της HMCL-1 (171-327) (πράσινο) και mMcl-1 (152 έως 308) (κυανό, ένταξη ΠΣΠ κωδικό 1wsx) μετά την υπέρθεση της ραχοκοκαλιάς Ν, C

α και άτομα C »των α-ελίκων για ελάχιστη rmsd. (Β) Κορδέλα κατάρτιση (μεγεθυνθεί σε (Α)) που δείχνει τις διαφορετικές δεσμευτικές πλάτη αυλάκι του ανθρώπου (πράσινο) και (κυανό) πρωτεΐνη του ποντικιού. Οι αποστάσεις μεταξύ των Cα ατόμων άνθρακα των καταλοίπων του 224 στην έλικα α2 (205 His σε mMcl-1) και His 252 (His 233 σε mMcl-1) στο C-τελικό άκρο του έλικα α3 επισημαίνονται: ~ 16 Å σε hMcl- 1 (171-327) και ~ 14 Å mMcl-1 (152-308) (Γ) Υπέρθεση όπως στο (Α) του HMCL-1 (171-327) (πράσινο) και mMcl-1 (152-308) (κυανό , 1wsx), και έξι επιλεγμένες Mcl-1 πολύπλοκες δομές (βλέπε επίσης πίνακα 2): ανθρώπινη Mcl-1 σε σύμπλοκο με Bim ΒΗ3 (ματζέντα, 2nla)? χιμαιρικό αρουραίος-ανθρώπινο rMcl-1 (171-208) HMCL-1 (209-327) σε σύμπλοκο με το ποντίκι mNoxaB ΒΗ3 (κίτρινο, 2rod)? ποντίκι mMcl-1 (152-308) σε σύμπλοκο με το ποντίκι NoxaA ΒΗ3 (ροζ, 2roc)? ποντίκι mMcl-1 (152-308) σε σύμπλοκο με το ποντίκι Puma ΒΗ3 (γκρι, 2jm6)? ποντίκι mMcl-1 (152-308) σε σύμπλοκο με το ποντίκι NoxaB ΒΗ3 (μοβ, 2rod)? χιμαιρικά αρουραίου-ανθρώπου mMcl-1 (171-208) HMCL-1 (209-327) σε σύμπλοκο με ανθρώπινη Bim ΒΗ3 (πορτοκάλι, 2nl9)? χιμαιρικό αρουραίος-ανθρώπινο mMcl-1 (171-208) HMCL-1 (209-327) σε σύμπλοκο με ανθρώπινη Bim ΒΗ3 (L62A, F68A) (ανοιχτό πράσινο, 3d7v) .Τα στοιχεία αυτά παρασκευάζονται με τα προγράμματα MOLMOL [36] και PYMOL [37].

η

το γεγονός ότι το ανθρώπινο apo πρωτεΐνη εμφανίζει μια κάπως ευρύτερη αύλακα σύνδεσης από το ομόλογο ποντικού (Πίνακας 2) μπορεί να είναι, τουλάχιστον εν μέρει, που αποδίδονται στην πλευρική αλυσίδα του Leu 246 στην ανθρώπινη πρωτεΐνη η οποία δεν είναι θαμμένη τόσο βαθιά όσο το αντίστοιχο Phe πλευρική αλυσίδα στην πρωτεΐνη ποντικού. Επιπλέον, κατά τη σύγκριση της ανθρώπινης και της πρωτεΐνης ποντικού, οι διαφορές που παρατηρήθηκαν για τις κατανομές φορτίου στην αύλακα ΒΗ3-σύνδεσης (σχήμα 2): η ανθρώπινη πρωτεΐνη είναι αρνητικά φορτισμένη από την πλευρά της έλικας α3, ενώ η αντίστοιχη επιφάνεια της πρωτεΐνης ποντικού είναι θετικά φορτισμένο. Η διαφορά αυτή προκύπτει από Ser 255 που αντιστοιχεί σε Lys 236 στην πρωτεΐνη του ποντικιού. Αξιοσημείωτα, HMCL-1 (171-327) είναι δομικά πιο παρόμοιο με το hMcl1 (171-327) -hBim ΒΗ3 σύμπλοκο (Σχήμα 3) από ό, τι σε αρο mMcl-1 (152 με 308) (Πίνακας 2).

στο σύνολό τους, τα διαρθρωτικά συγκρίσεις δείχνουν ότι, παρά την ταυτότητα αλληλουχίας 89% μεταξύ ανθρώπινης και ποντικού πρωτεΐνη, η διαθεσιμότητα του ανθρώπινου (171 έως 327) δομή HMCL-1 μπορεί να αναμένεται να είναι κρίσιμης σημασίας για την υποστήριξη μελλοντικό σχεδιασμό των φαρμάκων κατά του καρκίνου.

Υλικά και Μέθοδοι

NMR Παρασκευή δείγματος

Οι προκαταρκτικές μελέτες έδειξαν ότι HMCL-1 (171 έως 327) (UniProtKB /Swiss-Prot ID Q07820 /MCL1_HUMAN ) δεν είναι σταθερό σε διάλυμα. Ωστόσο, ο μεταλλάκτης Cys 286 → Ser είναι σταθερό για αρκετές εβδομάδες σε συγκεντρώσεις ~ 0.7 mM, και οι δύο άγριου τύπου και μεταλλαγμένων δεσμεύουν το πεπτίδιο ΒΙΜ-ΒΗ3 με την ίδια συγγένεια (Κ

δ ~ 60 ρΜ) σε προσδιορισμό Biacore . Ως εκ τούτου, θα λυθεί η δομή NMR του HMCL-1 (171-327) Cys 286 → Ser αναφέρεται ως HMCL-1 (171-327) σε αυτή την δημοσίευση.

HMCL-1 (171-327) ήταν κλωνοποιούνται, εκφράζονται, αναδιπλώθηκαν και καθαρίστηκαν ακόλουθα τυποποιημένα πρωτόκολλα για την παραγωγή ενός ομοιόμορφα

13C,

πρωτεϊνικό δείγμα 15N-επισημασμένο [19]. Εν συντομία, το γονίδιο κλωνοποιήθηκε σε pET21d (Novagen) παράγωγο αποδίδοντας το πλασμίδιο pSR482-21.1. Το προκύπτον κατασκεύασμα περιέχει επτά μη ενσωματωμένους υπολείμματα στο Ο-άκρο (LHHHHHH) για να διευκολύνει καθαρισμό πρωτεΐνης.

Escherichia Coli

BL21 (DE3) pMGK κύτταρα, ένα κωδικόνιο ενισχυμένη στέλεχος, μετασχηματίστηκαν με pMcl1-21.1, και καλλιεργήθηκαν σε ελάχιστο μέσο MJ9 [20] που περιέχει (

15NH

4)

2SO

4 και

U

–

13C-γλυκόζη ως μοναδικό αζώτου και διοξειδίου του άνθρακα πηγές. Double-πλυμένα έγκλειστα σωμάτια που περιέχουν HMCL-1 (171-327) διαλύθηκαν σε 8 Μ ρυθμισμένο υδροχλωρικής γουανιδίνης (VWR) που περιέχει 5 mM DTT, αργά αραιωμένο σε εννέα όγκους 20 mM Tris-HCl, 250 mM NaCl, 0.5 Μ ουρία, 10% γλυκερίνη, ρΗ 7,4, και αναδιπλώθηκε εντός 72 ωρών στους 4 ° C. HMCL-1 (171-327) καθαρίστηκε με χρήση ρητίνης συγγένειας Talon (Clontech) εφαρμόστηκε σε μία στήλη υψηλής απόδοσης HiTrap SP (GE Healthcare). Η τελική απόδοση του καθαρισμένου

U

–

13C,

πρωτεΐνη 15Ν (& gt? 98% ομοιογενής με SDS-PAGE? 20,3 kDa με φασματομετρία μάζας MALDI-TOF) ήταν -25 mg /L. Επιπλέον, ένα

U

–

15Ν και 5% βιοσυνθετικώς κατευθύνεται κλασματικά

13C-σημασμένο δείγμα [21] δημιουργήθηκε για εκχώρηση στέρεο-ειδική ομάδων ισοπροπυλίου μεθυλίου. δείγματα NMR παρασκευάστηκαν σε συγκέντρωση πρωτεΐνης 0.7 mM. Ένα ισοτροπικό συνολικό χρόνο περιστροφικού συσχετισμού των ~ 10 ns είχε συναχθεί από

φορές 15N γύρισμα χαλάρωσης που δείχνει ότι HMCL-1 (171 – 327) είναι μονομερής σε διάλυμα.

Φασματοσκοπία

NMR

NMR φάσματα καταγράφηκαν στους 25 ° C. Πέντε G-μήτρα μετασχηματισμού Fourier πειράματα (GFT) NMR [22], [23] και μια ταυτόχρονη 3D

15N /

13C

αλειφατικών /

13C

αρωματικών-επιλυθεί NOESY [24] [25] φάσμα (ανάμειξη χρόνος 60 ms? χρόνος μέτρησης: 48 ώρες) αποκτήθηκαν σε φασματόμετρο 750 ΜΗζ Varian INOVA εξοπλισμένο με ένα συμβατικό καθετήρα. 2D συνεχή χρόνο [

13C,

1] -HSQC φάσματα (18 ώρες) καταγράφηκαν για το 5% βιοσυνθετικά κατευθύνεται κλασματικά

επισήμανση 13C του δείγματος σε ένα φασματόμετρο 600 MHz Varian INOVA εξοπλισμένα με κρυογονική καθετήρα όπως περιγράφηκε [21], [26]. Φάσματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας τα προγράμματα NMRPipe [27] και XEASY [28].

Ακολουθία συγκεκριμένες ραχοκοκαλιά (H

N, H

α, Ν, C

α) και H

β /C

αναθέσεις συντονισμού β ελήφθησαν με τη χρήση (4,3) D HNNC

ΑΒΓ

α (63 ώρες) /(4,3) DC

ΑΒΓ

α (CO) NHN (62 ώρες), και (4,3) DH

ΑΒΓ

αβ (CO) NHN (69 ώρες) [23] μαζί με το πρόγραμμα AUTOASSIGN [29]. χημικές μετατοπίσεις περισσότερες περιφερειακές πλευρική αλυσίδα ανατέθηκαν με αλειφατικά (4,3) D Συνδιάσκεψης (87 ώρες) [23] και 3D

15N /

13C

αλειφατικών /

13C

αρωματικών-επιλυθεί [

1

1] -NOESY [24], [25]. Συνολικά, αναθέσεις ελήφθησαν για το 96% της σπονδυλικής στήλης και

1

β /

13C

β συντονισμούς και το 93% των συντονισμών πλευρική αλυσίδα η οποία είναι μεταβιβάσιμη με τα πειράματα NMR αναφέρονται παραπάνω (εκτός από το Ν-τερματικού ΝΗ

3

+, Pro

15N,

13C »προηγείται προλίνης υπολείμματα, Lys NH

3

+, Arg NH

2, ΟΗ, πλευρική αλυσίδα

13C και αρωματικά

13C

γ). Επιπλέον, 100% /100% από Val και Leu ομάδες ισοπροπυλίου με μη-εκφυλισμένη χημικές μετατοπίσεις πρωτονίων ήταν στερεο-ειδικώς ανατεθεί (Πίνακας 1). Οι χημικές μετατοπίσεις έχουν κατατεθεί στην BioMagResBank [30] (κωδικός προσχώρησης 19654).

1 Η-

1 όριο περιορισμούς επάνω απόσταση για τους υπολογισμούς δομής ελήφθησαν από NOESY (Πίνακας 1). Επιπλέον, ο σκελετός δίεδρη γωνία περιορισμοί προήλθαν από χημικές μετατοπίσεις χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα TALOS [31] για τα υπολείμματα που βρίσκονται σε σαφώς καθορισμένες δευτερογενή στοιχεία δομής (Πίνακας 1). Τα προγράμματα Cyana [32], [33] και Autostructure [34] χρησιμοποιήθηκαν παράλληλα να εκχωρήσετε ΝΟΕ μακράς εμβέλειας [24]. Οι τελικοί υπολογισμοί δομή πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση Cyana ακολουθούμενη από ρητή νερό φινέτσα μπάνιου χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα ΚΝΣ [35].

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Δρ Janet Cheetham για την πολύτιμη πρόταση να εξετάσει το μεταλλαγμένο C286S της HMCL-1 (171 έως 327) για τον προσδιορισμό της δομής NMR.