Αφηρημένο

Ο μεταστατικός καρκίνος του νεφρού εκδηλώνεται πολλαπλές υπογραφές της γονιδιακής έκφρασης. Απόκλιση σε έκφραση του ώριμου miRNAs έχει συνδεθεί με καρκίνους του ανθρώπου. Σημασία του miR-21 σε καρκινώματα νεφρικών κυττάρων προτείνεται από profiling μελέτες χρησιμοποιώντας δείγματα καρκινικού ιστού. Ωστόσο, ο ρόλος του miR-21 σε λειτουργία προκαλούν νεφρική τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και εισβολή δεν έχει ακόμη αποδειχθεί. Χρησιμοποιώντας καλλιεργημένα κύτταρα νεφρικού καρκινώματος, έχουμε αποδείξει αυξημένη έκφραση του ώριμου miR-21, μαζί με προ-και pri-miR-21 με αυξημένη μεταγραφή σε σύγκριση με την κανονική εγγύς σωληνοειδή επιθηλιακά κύτταρα. Η υπερέκφραση του miR-21 Sponge για τη σβέση επίπεδα ενδογενούς miR-21 ανέστειλε πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και την εισβολή των νεφρικών καρκινικών κυττάρων. Σε περίπτωση απουσίας μετάλλαξης στο ογκοκατασταλτικό γονίδιο ΡΤΕΝ, τα επίπεδα πρωτεΐνης ΡΤΕΝ συχνά προς τα κάτω σε καρκίνο του νεφρού. Θα δείξουμε ότι το miR-21 στόχους ΡΤΕΝ mRNA 3 ‘αμετάφραστη περιοχή για να μειώσει την έκφραση της πρωτεΐνης PTEN και αυξάνει τη φωσφορυλίωση της Akt σε νεφρικά καρκινικά κύτταρα. Προς τα κάτω ρύθμιση του ΡΤΕΝ καθώς και η υπερέκφραση μόνιμα ενεργών Akt κινάση εμπόδισε miR-21 Sponge επαγόμενη αναστολή της νεφρικής πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων και τη μετανάστευση. Επιπλέον, δείχνουμε ότι miR-21 Sponge ανέστειλε την αδρανοποίηση φωσφορυλίωση του καταστολέα όγκου πρωτεΐνη tuberin και εξασθενημένα ενεργοποίηση TORC1. Τέλος, αποδεικνύουμε ότι η έκφραση μόνιμα ενεργών TORC1 εξασθενημένος miR-21 Sponge μεσολάβηση καταστολή του πολλαπλασιασμού και της μετανάστευσης των νεφρικών καρκινικών κυττάρων. Τα αποτελέσματά μας αποκαλύπτουν ένα στρώμα μετα-μεταγραφική ρύθμιση της PTEN από μεταγραφική ενεργοποίηση του miR-21 για να αναγκάσει το κανονικό ογκογόνο Akt /TORC1 αγωγό σηματοδότηση για να οδηγήσει νεφρική τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και εισβολή

Παράθεση:. Dey Ν, Das F, Ghosh-Choudhury Ν, Mandal CC, Parekh DJ, Block K, et al. (2012) microRNA-21 διέπει TORC1 ενεργοποίησης στον Καρκίνο Νεφρική κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της εισβολής. PLoS ONE 7 (6): e37366. doi: 10.1371 /journal.pone.0037366

Επιμέλεια: Soumitro Pal, Νοσοκομείο Παίδων της Βοστόνης & amp? Ιατρική Σχολή του Χάρβαρντ, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 22 Δεκεμβρίου, 2011? Αποδεκτές: 20 Απρ, 2012? Δημοσιεύθηκε: 4, Ιουνίου, 2012

Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης, χωρίς όλα τα πνευματικά δικαιώματα, και δεν μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, να μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο λόγο. Το έργο γίνεται διαθέσιμα υπό την Creative Commons CC0 αφοσίωση δημόσιο τομέα

Χρηματοδότηση: α. Ηνωμένες Πολιτείες Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας (NIH) επιχορήγηση RO1 DK50190 να GGC υποστήριξε αυτό το έργο. Μέρος της εργασίας αυτής υποστηρίχθηκε επίσης από VA Υπηρεσία Έρευνας επιχορήγησης Αξίας κριτική για GGC. GGC υποστηρίζεται επίσης από ίδρυμα ερευνών νεανικού διαβήτη 1-2008-185 επιχορηγήσεις και είναι αποδέκτης της VA Senior Βραβείο Έρευνας Σταδιοδρομίας Scientist. NGC υποστηρίζεται από VA Merit Review, ΝΙΗ RO1 AR 52425 επιχορηγήσεις και Ronald P. Williams Ορθοπεδικά Ογκολογία Αναπτυξιακή Βραβείο Έρευνας από το Cancer Therapy και Research Center, San Antonio, Τέξας. KB, BSK και ΗΕΑ υποστηρίζονται από επιχορηγήσεις, ΝΙΗ RO1 CA 131272 (KB), ΝΙΗ RO1 DK 077295 (BSK), ΝΙΗ RO1 DK078971 (ΗΕΑ), ΝΙΗ RC2A 036613 (BSK) και VA Υπηρεσία Βραβείο Επιστήμονας Έρευνας Σταδιοδρομίας (KB) και Merit αναθεώρηση βραβεία (KB, BSK και ΗΕΑ)

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνωμα νεφρών αντιπροσωπεύει το πιο κοινό. νεφρού κακοήθεια? έχουν περίπου 70.000 νέες περιπτώσεις έχουν αναφερθεί κατά το έτος 2011 (www.cancer.gov). Μεταξύ των πέντε υποτύπους, σαφείς κυττάρων νεφρικό καρκίνωμα (RCC) αντιπροσωπεύει περίπου το 70% των περιπτώσεων [1]. Περίπου το 30% των ασθενών με RCC αναπτύσσουν διεισδυτική νόσο συνήθως μετάσταση στα οστά, τους πνεύμονες, τον εγκέφαλο και το ήπαρ [2], [3]. Απώλεια της έκφρασης πρωτεΐνης VHL (νοη Hippel-Lindau) λόγω μετάλλαξη βλαστικής σειράς, biallellic σωματική μετάλλαξη ή υπερμεθυλίωση του γονιδιακού τόπου του ενέχει υψηλό κίνδυνο για σαφείς κυττάρων νεφρικού καρκινώματος, τα αιμαγγειώματα και φαιοχρωμοκυττωμάτων [4], [5]. Ελαττωματικά έκφραση VHL προκαλεί σταθεροποίηση των παραγόντων μεταγραφής Hifα, οι οποίες συμβάλλουν στην αυξημένη έκφραση του αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF) για τη διατήρηση της αγγειακής φύσης του όγκου. Επίσης, Hifα ρυθμίζει αναερόβια αναπνοή που βρίσκονται συχνά σε RCC [5]. Hifα-ανεξάρτητη λειτουργία της VHL έχει αναφερθεί στην οδήγηση καρκίνωμα νεφρών, συμπεριλαμβανομένης της ρύθμισης του γήρατος [5], [6]. Επιπλέον, VHL όγκων θετικά νεφρών χρησιμοποιούν εναλλακτικούς μηχανισμούς για την αύξηση παράγοντες Hifα μεταγραφής για την έκφραση του VEGF, και, Hifα ανεξάρτητη ρύθμιση προς τα άνω του υποδοχέα του αυξητικού παράγοντα [5], [7].

miRNAs είναι σύντομες μη κωδικοποιητική ολιγονουκλεοτίδια με ατελή συμπληρωματικότητα κυρίως στην 3 ‘αμετάφραστη περιοχή (UTR) του mRNA που στόχο [8], [9], [10]. Σχεδόν 1.000 miRNAs στον άνθρωπο ρυθμίζουν την έκφραση του ενός τρίτου του συνολικού κωδικοποίησης πρωτεΐνης μεταγραφικό στο μετα-μεταγραφικό και μεταφραστικό επίπεδο [9]. miRNAs δρουν κυρίως με αναστολή της μετάφρασης mRNA αν και αποικοδόμηση του mRNA και της διάσπασης του mRNA μπορεί επίσης να συνεισφέρει στην αρνητική ρύθμιση των επιπέδων της πρωτεΐνης. Ακατάλληλη έκφραση του miRNAs έχουν συνδεθεί με την ογκογένεση [10], [11]. Τα miRNAs κωδικοποιούνται από τις ιντρονικές και διαγονιδιακές καθώς εξόνιο αλληλουχίες στο γονιδίωμα [12]. Αυτά συντίθενται κυρίως από την RNA πολυμεράση ΙΙ-εξαρτώμενη μεταγραφή για την παραγωγή pri-miRNA φουρκέτα, η οποία δεσμεύει συγκρότημα Drosha /DGCR8. Το δίκλωνο RNA-πρωτεΐνη δεσμεύσεως DGCR8 αναγνωρίζει τα εγγύς βάσεις (~ 10 bp) του PRI-miRNA αρχέγονα που ακολουθείται από διάσπαση της από το ένζυμο RNase III Drosha να απελευθερώσει το προ-miRNA μικρή φουρκέτα [13]. Exportin-5 και ο σύντροφός Ran-GTP της επάγει την πυρηνική εξαγωγή της προ-miR στο κυτταρόπλασμα, όπου υποβάλλεται σε επεξεργασία από το Dicer RNase III /TRBP να αποδώσει ~ 22 νουκλεοτιδίων μικρά RNA διπλής όψης. Ο κλώνος οδηγός τότε ενσωματώνεται μέσα τελεστή Argonaute συγκρότημα για να σχηματίσει RISC (RNA επαγόμενη σύμπλεγμα σίγησης) και να δεσμεύει με ατελή συμπληρωματικότητα με το mRNA για μεταφραστική καταστολή [12].

Πρόσφατες εκθέσεις δημιουργήσει μια σταθερή ρόλος των ειδικών miRNA υπογραφή της νεφρικής ογκογένεση. Προφίλ πειράματα έδειξαν ότι τα περισσότερα miRNAs προς τα κάτω σε RCC από υπερεκφράζεται [14], [15], [16], [17]. Για παράδειγμα, σε μια αρχική οθόνη 470 miRNAs, μόνο έξι miRNAs βρέθηκαν να ρυθμίζεται προς τα πάνω σε RCC ενώ 15 ρυθμίστηκαν προς τα κάτω [16]. Σε μια άλλη μελέτη, μόνο το 2 miRNAs αυξήθηκαν σε RCC, συμπεριλαμβανομένων miR-21, ενώ η έκφραση της 17ης miRNAs μειώθηκε [17]. Ομοίως, μια πιο πρόσφατη έκθεση έδειξε αυξημένη έκφραση του miR-21 μεταξύ 9 miRNAs, ενώ η έκφραση της 26ης miRNAs κατεστάλη [14]. Πρόσφατα, μια εκτεταμένη μελέτη χρησιμοποιώντας ένα μεγάλο αριθμό δειγμάτων καρκίνου από 31 διαφορετικές συμπαγείς όγκους περιγράφεται μία σημαντική αύξηση στην miR-21 υποδηλώνει τη λειτουργία του στην ογκογένεση [18]. Ωστόσο, λειτουργικό ρόλο του σε πολλούς καρκίνους συμπεριλαμβανομένων νεφρικού καρκινώματος δεν έχει διευκρινιστεί. Στην παρούσα μελέτη, βρίσκουμε αυξημένη έκφραση των ώριμων, προ- και PRI-miR-21 σε νεφρικά καρκινικά κύτταρα σε σύγκριση με την κανονική εγγύς σωληνοειδή επιθηλιακά κύτταρα. Αυτή η αύξηση στην miR-21 συνδέθηκε με μειωμένα επίπεδα ΡΤΕΝ. Εξουδετέρωση του miR-21 εμπόδισε τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και την εισβολή των κυττάρων αυτών ταυτόχρονη με την αύξηση της PTEN και μειωμένη tuberin φωσφορυλίωση και ενεργοποίηση mTORC1.

Αποτελέσματα

αυξημένη έκφραση του miR-21 στο νεφροκυτταρικό καρκίνωμα

προφίλ έκφρασης των miRNAs χρησιμοποιώντας δείγματα όγκων από ασθενείς με νεφρική καρκίνωμα έχει αναφερθεί. Σε τρεις μελέτες, η έκφραση του miR-21 βρέθηκε να είναι αυξημένη [14], [17], [19]. Ωστόσο, σε μια άλλη μελέτη σε 16 διαυγοκυτταρικό νεφρικό καρκίνωμα και δείγματα νεφρικό καρκίνωμα 4 χρωμόφοβο, miR-21 δεν ανιχνεύθηκε [16]. Χρησιμοποιήσαμε ένα πάνελ ιστών όγκου από νεφρική καρκινώματα σαφής κύτταρο για την ανίχνευση της έκφρασης του ώριμου miR-21. Σε πραγματικό χρόνο qRT-PCR αποκάλυψε σημαντικά αυξημένη έκφραση του ώριμου miR-21 σε κάθε βαθμού 2 (3 από 3) και βαθμού 3 (3 από 3) δείγματα καρκίνωμα νεφρικών κυττάρων (Εικ. S1 Α και S1B). Στη συνέχεια, μελετήθηκε η έκφραση του miR-21 σε κύτταρα νεφρικού καρκινώματος ACHN. Βρήκαμε σημαντικά αυξημένη έκφραση του ώριμου miR-21 σε κύτταρα ACHN σε σύγκριση με τις κανονικές HK2 εγγύς σωληνοειδή επιθηλιακά κύτταρα (Εικ. 1Α). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν σε ένα άλλο καρκίνο του νεφρού κυτταρική γραμμή Caki-2 (Σχ. S2). Πρόσφατες εκθέσεις έδειξαν ότι miR-21 ρυθμίζεται στο επίπεδο της ωρίμανσης [20]. Επομένως, εξετάσαμε τα επίπεδα προ-miR-21. Σε πραγματικό χρόνο qRT-PCR έδειξε σημειώνονται έκφραση της προ-miR-21 σε κύτταρα ACHN σε σύγκριση με ΚΘ2 κύτταρα (Εικ. 1Β). Παρομοίως, αυξημένη έκφραση του pri-miR-21 ανιχνεύθηκε επίσης στα κύτταρα ACHN (Εικ. 1 C). Η αύξηση αυτή των pri-miR πρότεινε ένα μεταγραφικό μηχανισμό της έκφρασης miR-21. Για να εξεταστεί άμεσα την μεταγραφική ρύθμιση του miR-21 έκφρασης, χρησιμοποιήσαμε ένα miR-21 υποκινητή καθοδηγείται λουσιφεράση πυγολαμπίδας κατασκεύασμα ανταποκριτή (MIR-21-Luc). Δοκιμές μεταβατικής μεταμόλυνσης σε κύτταρα ACHN αποκάλυψε αυξήθηκε σημαντικά μεταγραφή του γονιδίου αναφοράς (Σχ. 1D). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι αυξημένα επίπεδα της ώριμης miR-21 σε κύτταρα νεφρικού καρκινώματος μπορεί να προκύψουν από την αύξηση της μεταγραφής του miR-21 γονίδιο για την παραγωγή pri-mir-21

(Α – Γ). Σύνολο RNAs από HK2 εγγύς σωληνοειδή επιθηλιακά κύτταρα και ACHN νεφρικά καρκινικά κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση ώριμη miR-21 (πάνελ Α), προ-miR-21 (πάνελ Β) και PRI-miR-21 (πάνελ C) σε πραγματικό χρόνο qRT-PCR, όπως περιγράφεται στην ενότητα Υλικά και μέθοδοι. Μέση τιμή ± SE των 4 μετρήσεων παρουσιάζεται. Στο πάνελ Α και Β, * ρ = 0,004 έναντι κυττάρων HK2. Στο πλαίσιο C, * ρ = 0,02 έναντι κυττάρων HK2. (D) και τα κύτταρα HK2 ACHN επιμολύνθηκαν με miR-21-Luc ανταποκριτή μαζί με Renilla null πλασμίδιο. Τα κυτταρολύματα χρησιμοποιήθηκαν για να προσδιοριστεί η δραστικότητα λουσιφεράσης, όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι. Μέση τιμή ± SE 6 μετρήσεις εμφανίζεται. * P = 0,001 vs κύτταρα HK2. (Ε) αυξημένη φωσφορυλίωση της ρ65 NFkB σε νεφρικά καρκινικά κύτταρα. Τα προϊόντα λύσης των κυττάρων HK2 και ACHN ανοσοστυπώθηκαν με αντισώματα φωσφο-ρ65 (Ser-536), ρ65 και ακτίνη. (F) Mutant p65 S536A αναστέλλει miR-21 μεταγραφής. ACHN νεφρικά καρκινικά κύτταρα συνεπιμολύνθηκαν με miR-21-Luc και φορέα έκφρασης ρ65 S536A. Η δραστικότητα λουσιφεράσης προσδιορίστηκε στα κυτταρικά λύματα. Μέση τιμή ± SE της τετραπλούν μετρήσεις εμφανίζεται. * Ρ = 0.02 vs φορέα. Κάτω πάνελ δείχνουν έκφραση του ΗΑ-tagged ρ65 S536A και ακτίνης.

Η

Η μεταγραφή του miR-21 γονίδιο έχει πρόσφατα αποδειχθεί ότι ρυθμίζεται από ΝΡκΒ [21]. ΝΡκΒ ρυθμίζεται αυξητικά σε καρκίνο του νεφρού [22], [23]. Η μεταγραφική δραστικότητα του ρ65 υπομονάδας του ΝΡκΒ εξαρτάται από τη φωσφορυλίωση της σε Ser-536 [24]. Επομένως, εξετάσαμε τη φωσφορυλίωση της ρ65. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Ε, φωσφορυλίωση του ρ65 σε Ser-536 ήταν σημαντικά αυξημένη στα νεφρικά καρκινικά κύτταρα ACHN σε σύγκριση με τα κύτταρα HK2. Επιπλέον, τα επίπεδα ενισχυμένη ρ65 παρατηρήθηκαν επίσης (Σχ. 1Ε, μεσαίο πλαίσιο). Στη συνέχεια, εξετάσαμε την εμπλοκή του ΝΡκΒ σε μεταγραφή του miR-21 σε νεφρικά καρκινικά κύτταρα. miR-21-Luc ανταποκριτή συνεπιμολύνθηκε με είτε το μεταλλαγμένο S536A του p65 ή με ένα πλασμίδιο φορέα. Η έκφραση του p65 S536A ανέστειλε σημαντικά την δραστηριότητα ανταποκριτή στα κύτταρα ACHN. Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι προς τα πάνω ρύθμιση του miR-21 μπορεί εν μέρει να οφείλεται στην αυξημένη δραστηριότητα του ΝΡκΒ σε νεφρικά κύτταρα καρκίνου.

miR-21 ρυθμίζει τον πολλαπλασιασμό και την εισβολή των νεφρικά καρκινικά κύτταρα

θεωρείται miR-21 να είναι ένα ογκο-miR σε πολλούς καρκίνους. Ωστόσο, ο ρόλος του στην νεφροκυτταρικό καρκίνωμα δεν έχει διερευνηθεί. Ως εκ τούτου, ελέγξαμε την εμπλοκή του miR-21 σε μιτογένεση κυττάρων ACHN, χρησιμοποιώντας ένα φορέα πλασμίδιο που εκφράζει επτά αντίγραφα του διογκωμένου θέσης δέσμευσης miR-21 τοποθετείται στο 3 ‘άκρο του CMV υποκινητή με γνώμονα GFP mRNA (σχ. S3) [ ,,,0],25]. Η έκφραση αυτού του κατασκευάσματος χρησιμεύει ως «σφουγγάρι» που αποσβένει τα επίπεδα της ενδογενούς miR-21 [25], [26]. κύτταρα ACHN επιμολύνθηκαν με αυτό το κατασκεύασμα (MIR-21 Sponge). σύνθεση DNA μετρήθηκε ως

ενσωμάτωση 3Η-θυμιδίνης. Η έκφραση του miR-21 Sponge ανέστειλε σημαντικά τη σύνθεση του DNA σε κύτταρα ACHN (Σχ. 2Α και το σχ. S4A). Για να επιβεβαιωθεί αυτή η παρατήρηση, πραγματοποιήσαμε δοκιμασία πολλαπλασιασμού μετρώντας τον αριθμό των κυττάρων μετά την επιμόλυνση miR-21 σφουγγάρι. Η έκφραση του miR-21 Sponge κατέστειλε την κυτταρική ανάπτυξη (Σχ. 2Β και Σχ. S4B).

κύτταρα ACHN επιμολύνθηκαν με miR-21 Sponge ή φορέα πλασμίδια. (Α) άνευ ορού κύτταρα επωάστηκαν με

3Η-θυμιδίνης και την ενσωμάτωσή του στο DNA προσδιορίστηκε όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι [115]. Μέση τιμή ± SE των 12 μετρήσεων φαίνεται. * Ρ = 0,004 έναντι φορέα μόνο. (Β) Τα κύτταρα μετρήθηκαν σε υποδεικνυόμενα χρονικά διαστήματα, όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι. Diamond και πλατεία σύμβολα αντιπροσωπεύουν φορέα και miR-21 Σφουγγάρι-επιμολυσμένα κύτταρα, αντίστοιχα. Μέσα ± SE τριπλών μετρήσεων δείχνονται. * Ρ & lt? 0,05 vs φορέα μόνο. (C) άνευ ορού κύτταρα σπάρθηκαν στους μεμβράνη σε έναν θάλαμο trans-καλά. δοκιμασία μετανάστευση εκτελέστηκε και τα μετεγκατεστημένα κύτταρα στην αντίθετη πλευρά της μεμβράνης βάφτηκαν όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι [111]. (Δ) Οι λεκέδες στα κύτταρα τα οποία μετανάστευσαν στον πίνακα Γ εκλούστηκαν όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι [111]. Μέση τιμή ± SE των τριπλών μετρήσεων παρουσιάζεται. * P & lt? 0,0001 έναντι κύτταρα φορέα-επιμολυσμένα. (Ε) Τα επιμολυσμένα κύτταρα στερούνται ορού σπάρθηκαν στους μεμβράνη κολλαγόνου-ενσωματωμένα σε ένα θάλαμο trans-καλά. δοκιμασία Εισβολή διεξήχθη και τα κύτταρα εισέβαλαν στην απέναντι πλευρά της μεμβράνης βάφτηκαν όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι [111]. (F) Οι λεκέδες στα εισέβαλαν κύτταρα στον πίνακα Ε εκλούστηκαν όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι [111]. Μέση τιμή ± SE των τριπλών μετρήσεων παρουσιάζεται. * P & lt?. 0.001 vs κύτταρα φορέα-επιμολυσμένα

Η

καρκίνωμα νεφρών είναι συχνά εξαιρετικά μεταστατικό. Ελέγξαμε εάν miR-21 ελέγχει την κυτταρική μετανάστευση ACHN χρησιμοποιώντας δοκιμασία θαλάμου trans-καλά. Τα κύτταρα καλλιεργούνται σε ένα μέσο χωρίς ορό στην κορυφή της μεμβράνης μετανάστευσε στον πυθμένα της μεμβράνης (Σχ. 2C, πάνελ Α). Η έκφραση του miR-21 Sponge απέτρεψε τη μετανάστευση των κυττάρων ACHN (Εικ. 2C και Σχ. S4C). Ποσοτικοποίηση αυτών των αποτελεσμάτων δείχνει σημαντική αναστολή της μετανάστευσης των νεφρικών καρκινικών κυττάρων σε απόκριση προς miR-21 Sponge (Σχ. 2D).

Το αρχικό στάδιο στη μετάσταση αποτελείται από τοπικά εισβολής από καρκινικά κύτταρα (ενδαγγείωση). Για να εξεταστεί η μεταστατικό δυναμικό των ACHN νεφρικά καρκινικά κύτταρα, χρησιμοποιήσαμε μία δοκιμασία εισβολή χρησιμοποιώντας κολλαγόνο ενσωματωμένο μεμβρανών σε trans-φρεάτια. Vector-επιμολυσμένα κύτταρα ACHN έδειξε αξιοσημείωτη εισβολή (Σχ. 2Ε, πάνελ Α). Η έκφραση του miR-21 Sponge μπλοκάρει την εισβολή των καρκινικών κυττάρων (Σχ. 2Ε και το Σχ. S4D). Ποσοτικοποίηση έδειξε σημαντική αναστολή της εισβολής των κυττάρων ACHN από miR-21 Σφουγγάρι (Σχ. 2F).

miR-21 Στόχοι ΡΤΕΝ σε καρκινικά κύτταρα νεφρών

Μετάλλαξη στο ΡΤΕΝ ογκοκατασταλτικό γονίδιο ή μειωμένη της έκφραση συμβάλλουν στην ογκογένεση και τη μετάσταση των καρκίνων πολλών [27], [28]. Ωστόσο, ΡΤΕΝ μετάλλαξη δεν βρίσκεται συχνά σε νεφροκυτταρικό καρκίνωμα [29]. PTEN έχει επικυρωθεί να είναι ένας στόχος του miR-21 [30]. Ερευνήσαμε τα επίπεδα ΡΤΕΝ σε ACHN νεφρικά καρκινικά κύτταρα. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3Α, η αφθονία του ΡΤΕΝ σε ACHN ήταν σημαντικά μειωμένη σε σύγκριση με εκείνη σε HK2 κύτταρα. Ταυτόσημα αποτελέσματα λήφθηκαν σε Caki-2 κυτταρική σειρά νεφρικού καρκινώματος (Σχ. S5A). ΡΤΕΝ μειώνει τα επίπεδα της PIP

3, η οποία ελέγχει τη φωσφορυλίωση /ενεργοποίηση της Akt [27], [31], [32]. Μειωμένα επίπεδα ΡΤΕΝ σε κύτταρα ACHN και Caki-2 σχετίζεται με αυξημένη φωσφορυλίωση της Akt σε Thr-308 και Ser-473 (Σχ. 3Β και Σχ. S5B), υποδεικνύοντας ενεργοποίηση του [32].

(Α ) Τα προϊόντα λύσης των κυττάρων από τρία ανεξάρτητα φρεάτια των κυττάρων HK2 και ACHN ανοσοστυπώθηκαν με ΡΤΕΝ και ακτίνη αντισώματα. (Β) Οι ίδιες κυτταρικά λύματα ανοσοστυπώθηκαν με φωσφο-Akt (Thr-308), φωσφο-Akt (Ser-473) και Akt αντισώματα.

Η

Στη συνέχεια, εξετάσαμε κατά πόσο miR-21 στόχους ΡΤΕΝ . Χρησιμοποιήσαμε ένα κατασκεύασμα ανταποκριτή κατά την οποία η 3’UTR του ΡΤΕΝ mRNA κλωνοποιείται καθοδικά του γονιδίου λουσιφεράσης πυγολαμπίδας (ΡΤΕΝ 3’UTR-Luc) [25]. κύτταρα ACHN επιμολύνθηκαν με αυτό το ρεπόρτερ και τον φορέα ή miR-21 πλασμίδιο έκφρασης. Η έκφραση του miR-21 ανέστειλε σημαντικά την δραστηριότητα ανταποκριτή (Σχ. 4Α και το Σχ. S6a). Για να επιβεβαιωθεί αυτή η παρατήρηση, χρησιμοποιήσαμε miR-21 σφουγγάρι. Η έκφραση του miR-21 Sponge αύξησε σημαντικά την δραστικότητα της λουσιφεράσης του ΡΤΕΝ 3’UTR-Luc (Σχ. 4Β και σχ. S6B). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι σε νεφρικά καρκινικά κύτταρα, ΡΤΕΝ μπορεί να είναι ένας προς τα κάτω στόχος του miR-21. Για να δοκιμάσετε αυτό, εξετάσαμε PTEN επίπεδο πρωτεΐνης στο miR-21 Σφουγγάρι-επιμολυσμένα κύτταρα ACHN. miR-21 Sponge αύξησε την αφθονία του ΡΤΕΝ (Σχ. 4C και Εικ. S6C), ταυτόχρονα με μειωμένη φωσφορυλίωση της Akt σε Thr-308 και Ser-473 (Εικ. 4D).

(Α και Β) κύτταρα ACHN επιμολύνθηκαν με ρΟΜν-miR-21 πλασμίδιο έκφρασης (Α) ή miR-21 Sponge (Β) και φορέα μαζί με το κατασκεύασμα ανταποκριτή ΡΤΕΝ 3’UTR-Luc. Τα κυτταρολύματα χρησιμοποιήθηκαν για να προσδιοριστεί η δραστικότητα λουσιφεράσης, όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι. Μέση τιμή ± SE 6 μετρήσεις εμφανίζεται. Στο πλαίσιο Α, * ρ = 0,02 έναντι φορέα μόνο. Στο πλαίσιο Β, * ρ = 0,002 έναντι φορέα μόνο. (Γ και Δ) Κυτταρολύματα miR-21 Sponge-επιμολυσμένα κύτταρα ACHN ανοσοστυπώθηκαν με ΡΤΕΝ και αντισώματα ακτίνης (πάνελ C), και φωσφο-Akt (Ser-473), φωσφο-Akt (Thr-308) και Akt αντισώματα (πίνακας D).

η

miR-21 Ρυθμίζει τον καρκίνο των νεφρών τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση μέσω του PTEN /Akt Άξονα

Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι πάνω από το miR-21 προάγει την ενεργοποίηση της Akt από μείωση των επιπέδων ΡΤΕΝ σε ασθενείς με νεφρική καρκινικά κύτταρα (Σχ. 4). Προκειμένου να διερευνηθεί άμεσα το ρόλο αυτού του μονοπατιού σηματοδότησης στον πολλαπλασιασμό νεφρικών καρκινικών κυττάρων, επιμολύναμε κύτταρα ACHN και Caki-2 με miR-21 Sponge και siRNAs που στοχεύουν ΡΤΕΝ (siPTEN). Όπως αναμενόταν, miR-21 Sponge ανέστειλε τη σύνθεση του DNA (Σχ. 5Α και Σχ. S7A). Σε αντίθεση, η διαμόλυνση του siPTEN εμπόδισε σημαντικά miR-21 Sponge επαγόμενη αναστολή της σύνθεσης του DNA (Σχ. 5Α και Σχ. S7A, S7B και S7C). Ομοίως, siPTEN αντέστρεψε την μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων που προκαλείται από ACHN miR-21 Sponge (Εικ. 5Β και Σχ. S8). Στη συνέχεια, προσδιορίζεται η επίδραση των siPTEN για ACHN και Caki-2 κυτταρική μετανάστευση. Η έκφραση του miR-21 Sponge μείωσε την μετάβαση των δύο αυτών νεφρικών καρκινικών κυτταρικών γραμμών. siPTEN κατέστειλε σημαντικά την ανασταλτική δράση του miR-21 Sponge για τη μετανάστευση κυττάρων (Σχ. 5C, 5D και Σχ. S9 και S10).

κύτταρα ACHN επιμολύνθηκαν με miR-21 Sponge μαζί με πισίνες siRNA που στοχεύει ΡΤΕΝ mRNA Οπως αναφερεται. (Α)

ενσωμάτωση 3Η-θυμιδίνης προσδιορίστηκε όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι [115]. Μέση τιμή ± SE 6 μετρήσεις εμφανίζεται. * P & lt? 0,05 έναντι φορέα? ** P & lt? 0.05 vs miR-21 Σφουγγάρι-επιμολυσμένα κύτταρα. (Β) Τα επιμολυσμένα κύτταρα μετρήθηκαν σε υποδεικνυόμενα χρονικά διαστήματα. Τα σύμβολα διαμάντι, τετράγωνο και σταυρό αντιπροσωπεύουν φορέα, miR-21 Σφουγγάρι και miR-21 Σφουγγάρι συν πισίνα siRNA κατά της ΡΤΕΝ, αντίστοιχα. Μέση τιμή ± SE των τριπλών μετρήσεων παρουσιάζεται. * P & lt? 0,05 έναντι φορέα και μόνο? ** P & lt? 0.01 vs μόνη miR-21 σφουγγάρι. (Γ) Τα επιμολυσμένα κύτταρα σπάρθηκαν σε μεμβράνη σε θαλάμους trans-φρεατίων και τα κύτταρα τα οποία μετανάστευσαν κηλιδώθηκαν όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι [111]. (D) Οι λεκέδες από τις μεμβράνες στο πάνελ C εκλούστηκαν και η απορρόφηση στα 590 nm μετρήθηκε. Μέση τιμή ± SE από 3 ανεξάρτητους θαλάμους εμφανίζεται. * P & lt? 0.001 vs φορέα και μόνο? ** P & lt?. 0,001 vs miR-21 Σφουγγάρι

Η

Η δράση φωσφατάσης λιπιδίων του PTEN είναι γνωστό ότι ρυθμίζει την φωσφορυλίωση της Akt [27]. Δείξαμε παραπάνω ότι το μειωμένο επίπεδο ΡΤΕΝ σε νεφρικά καρκινικά κύτταρα συσχετίζεται με αυξημένη φωσφορυλίωση της Akt (Εικ. 3 και το Σχ. S5). Από miR-21 ρυθμίζει το επίπεδο της πρωτεΐνης ΡΤΕΝ, το οποίο με τη σειρά του ενεργοποιεί Akt, ελέγξαμε το ρόλο αυτής της κινάσης στον πολλαπλασιασμό νεφρικών καρκινικών κυττάρων σε σχέση με miR-21. Εμείς επιμολυσμένα κύτταρα ACHN και Caki-2 με ιδιοσυστατικά ενεργή Gag-Ακί, μαζί με miR-21 Sponge [33]. Η έκφραση του Gag Akt αντιστραφεί σημαντικά την αναστολή της σύνθεσης του DNA που προκαλείται από miR-21 Sponge (Σχ. 6Α, το Σχ. S11A και το Σχ. S12). Έκφραση του Gag Akt αντιστραφεί επίσης τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων με miR-21 Σφουγγάρι (6Β και σχήματα. S13A). Ομοίως, συστατικώς δραστική Akt εμπόδισε σημαντικά την αναστολή της μετανάστευσης των κυττάρων ACHN σε απόκριση προς miR-21 Sponge (Σχ. 6C, 6D και το Σχ. S13B). Ταυτόσημα αποτελέσματα ελήφθησαν με Caki-2 νεφρικά καρκινικά κύτταρα (Σχ. S14A, S14B και S14C). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι miR-21 στόχους ΡΤΕΝ mRNA για να καταστείλει την έκφραση της πρωτεΐνης, η οποία οδηγεί σε Akt-εξαρτώμενη πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των νεφρικών καρκινικών κυττάρων.

κύτταρα ACHN επιμολύνθηκαν με miR-21 Sponge μαζί με ιδιοσυστατικά ενεργή Gag Akt πλασμίδια όπως υποδεικνύεται. (Α)

ενσωμάτωση 3Η-θυμιδίνης προσδιορίστηκε όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι [115]. Μέση τιμή ± SE 6 μετρήσεις εμφανίζεται. * P & lt? 0.01 vs φορέα? ** P & lt? 0.001 vs μόνη miR-21 σφουγγάρι. (Β) Τα επιμολυσμένα κύτταρα μετρήθηκαν σε υποδεικνυόμενα χρονικά διαστήματα. Τα σύμβολα διαμάντι, τετράγωνο και σταυρό αντιπροσωπεύουν φορέα, πλασμίδια έκφρασης του miR-21 Σφουγγάρι και miR-21 Σφουγγάρι συν Gag Akt, αντίστοιχα. * P & lt? 0,01 έναντι φορέα και μόνο? ** P & lt? 0.001 vs μόνη miR-21 σφουγγάρι. (Γ) Τα επιμολυσμένα κύτταρα σπάρθηκαν σε μεμβράνη σε θαλάμους trans-φρεατίων και τα κύτταρα τα οποία μετανάστευσαν κηλιδώθηκαν όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι [111]. (D) Οι λεκέδες από τις μεμβράνες στο πάνελ C εκλούστηκαν και η απορρόφηση μετρήθηκε. Μέση τιμή ± SE από 3 ανεξάρτητους θαλάμους εμφανίζεται. * P & lt? 0.001 vs φορέα και μόνο? ** P & lt?. 0,001 vs miR-21 Σφουγγάρι

Η

miR-21 ρυθμίζει TORC1 Δραστηριότητα για την πρόκληση του καρκίνου των νεφρών τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση

Ενεργός Akt φωσφορυλιώνει το ογκοκατασταλτικό tuberin πρωτεΐνη σε Thr -1462 οδηγώντας σε απενεργοποίηση της και Rheb διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση της TORC1 [34], [35], [36]. Έχουμε αποδείξει ότι μειορρύθμιση του ΡΤΕΝ λόγω της αυξημένης έκφρασης miR-21 σε νεφρικά καρκινικά κύτταρα ενεργοποιεί Akt (Εικ. 3), η οποία συμβάλλει στον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση αυτών των κυττάρων (Σχ. 5 και 6). Δοκιμάσαμε το ρόλο του miR-21 στο tuberin φωσφορυλίωση. κύτταρα ACHN επιμολύνθηκαν με miR-21 σφουγγάρι. Λόγω της αυξημένης ενεργοποίησης Akt, κύτταρα ACHN εμφανίζουν ενισχυμένη φωσφορυλίωση tuberin (Εικ. 7Α, διάδρομος 1). Έκφραση του miR-21 Σφουγγάρι ανέστειλε την φωσφορυλίωση της tuberin (Σχ. 7Α και Εικ. S15A). Παρόμοια με αυξημένη tuberin φωσφορυλίωση, κύτταρα ACHN έδειξε επαυξημένης φωσφορυλίωση της S6 κινάσης σε Thr-389 (Σχ. 7Β, λωρίδα 1), μετρούμενο ως υποκατάστατο για δραστικότητα TORC1. miR-21 Σφουγγάρι μπλοκάρει S6 κινάση φωσφορυλίωση (Εικ. 7Β). Αυτή η μείωση της φωσφορυλίωσης της κινάσης S6 με miR-21 Sponge συσχετίστηκε με την αναστολή της φωσφορυλίωσης mTOR σε Ser-2448 (Σχ. 7C). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι miR-21 ρυθμίζει δραστικότητα TORC1 στα νεφρικά καρκινικά κύτταρα. Για να εξεταστεί κατά πόσον miR-21 Sponge-εξαρτώμενη αναστολή mTOR οφείλεται στην αδρανοποίηση της Rheb, συνεπιμολύναμε κύτταρα ACHN με miR-21 Sponge και συστατικώς δραστικό πλασμίδιο έκφρασης Rheb και τα αποτελέσματα συγκρίθηκαν με εκείνη της miR-21 Sponge-επιμολυσμένα κύτταρα. ενεργοποίηση του mTOR εξετάστηκε στα κυτταρικά λύματα. Έκφραση των συστατικώς δραστικής Rheb αντιστραφεί το ανασταλτικό αποτέλεσμα του miR-21 Sponge στην κινάση φωσφορυλίωση S6 (Σχ. 7D και το Σχ. S15B). Ομοίως, η μειωμένη φωσφορυλίωση της mTOR από miR-21 Σφουγγάρι επίσης προληφθεί με μόνιμα ενεργό Rheb (Σχ. 7Ε και Σχ. S15C). Αυτά τα αποτελέσματα συμπερασματικά αποδεικνύουν ότι το miR-21-μεσολάβηση φωσφορυλίωση /απενεργοποίηση του tuberin ενεργοποιεί Rheb για την αύξηση της δραστικότητας του mTOR.

κύτταρα ACHN επιμολύνονται με miR-21 σφουγγάρι ή φορέα. Τα κυτταρολύματα ανοσοστυπώθηκαν με φωσφο-tuberin (Thr-1462), tuberin (πάνελ Α), φωσφο-S6 κινάση (Thr-389), S6 κινάση (πίνακας Β), φωσφο-mTOR (Ser-2448) και mTOR (πίνακας ΝΤΟ). miR-21 χρησιμοποιεί την ενεργοποίηση Rheb για τη δραστηριότητα TORC1. κύτταρα ACHN συνεπιμολύνθηκαν με miR-21 Σφουγγάρι και CA Rheb πλασμίδιο. Τα κυτταρικά λύματα ανοσοστυπώθηκαν με φωσφο-S6 κινάση (Thr-389), S6 κινάση (πάνελ D), φωσφο-mTOR (Ser-2448) και mTOR (πίνακας Ε).

Η

Για να διευκρινιστεί κατά πόσον miR-21-ενεργοποιημένου TORC1 συμβάλλει στην εξάπλωση των νεφρικών καρκινικών κυττάρων, μπορούμε συνεπιμολυσμένα κύτταρα ACHN και Caki-2 με miR-21 Sponge και συστατικώς δραστικό φορέα έκφρασης mTOR.

ενσωμάτωση 3Η-θυμιδίνης προσδιορίστηκε. Έκφραση των συστατικώς δραστικής mTOR εμπόδισε σημαντικά την αναστολή της σύνθεσης DNA μέσω miR-21 Sponge (Εικ. 8Α, το Σχ. S16 και το Σχ. S17). Ομοίως, συστατικώς δραστική mTOR ανέστειλε την miR-21 Sponge μεσολάβηση μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων ACHN (Σχ. 8Β και το Σχ. S18A). Στη συνέχεια εξετάσαμε την επίδραση της συστατικώς δραστικής mTOR στη νεφρική μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων. miR-21 Σφουγγάρι καταργηθεί μετανάστευση ACHN και κυττάρων Caki-2 (Εικ. 8C, Σχ. S18B και Εικ. S19). Ωστόσο, η συνέκφραση μόνιμα ενεργών mTOR με miR-21 Sponge ανέστρεψε σημαντικά την αναστολή στη μετανάστευση των δύο νεφρικών καρκινικών κυτταρικών σειρών σε απόκριση προς miR-21 Sponge (Σχ. 8C, 8D και το Σχ. S19). Λαμβανόμενα μαζί αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι miR-21 συμβάλλει στην νεφρική τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και μετανάστευση μέσω TORC1.

κύτταρα ACHN επιμολύνθηκαν με miR-21 Sponge μαζί με συστατικώς δραστική πλασμίδια mTOR όπως υποδεικνύεται. (Α)

ενσωμάτωση 3Η-θυμιδίνης προσδιορίστηκε όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι [115]. Μέση τιμή ± SE 6 μετρήσεις εμφανίζεται. * P & lt? 0.001 vs φορέα? ** P & lt? 0.001 vs μόνη miR-21 σφουγγάρι. (Β) Τα επιμολυσμένα κύτταρα μετρήθηκαν σε υποδεικνυόμενα χρονικά διαστήματα. Τα σύμβολα διαμάντι, τετράγωνο και σταυρό αντιπροσωπεύουν φορέα, miR-21 Σφουγγάρι και miR-21 Σφουγγάρι συν ουσιαστικά δραστική πλασμίδια έκφρασης mTOR (CA), αντίστοιχα. * P & lt? 0,01 έναντι φορέα και μόνο? ** P & lt? 0.001 vs μόνη miR-21 σφουγγάρι. (Γ) Τα επιμολυσμένα κύτταρα σπάρθηκαν σε μεμβράνη σε θαλάμους trans-φρεατίων και τα κύτταρα τα οποία μετανάστευσαν κηλιδώθηκαν όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι [111]. (D) Οι λεκέδες από τις μεμβράνες στο πάνελ C εκλούστηκαν και η απορρόφηση στα 590 nm μετρήθηκε. Μέση τιμή ± SE από 3 ανεξάρτητους θαλάμους εμφανίζεται. * P & lt? 0.001 vs φορέα και μόνο? ** P & lt? 0,001 vs miR-21 Σφουγγάρι

Η

Συζήτηση

Σε νεφρική καρκινικά κύτταρα, θα παρέχει στοιχεία για την έκφραση των pri-miR-21 για την παραγωγή προ- και ώριμα. miR-21, η οποία συμβάλλει στον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση /εισβολή. Έχουμε δείξει μια αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ του miR-21 επίπεδα και PTEN αφθονία. Έχουμε αποδείξει ότι miR-21-ευαίσθητο ΡΤΕΝ ρυθμίζει πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των νεφρικών καρκινικών κυττάρων μέσω ενεργοποίησης της Akt. Τέλος, έχουμε καθιερώσει ένα ρόλο για miR-21 που διεγείρεται TORC1 σε νεφρική πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων και τη μετανάστευση (Εικ. 9).

Ενισχυμένη miR-21 εξασθενεί τα επίπεδα πρωτεΐνης ΡΤΕΝ, με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση του Akt, που αδρανοποιεί tuberin για την αύξηση της δραστηριότητας TORC1 που οδηγεί σε πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και την εισβολή των νεφρικών καρκινικών κυττάρων.

Η

Η αλλαγμένη ελέγχου της γονιδιακής έκφρασης δίκτυα σηματοδότησης για τη ρύθμιση των βιολογικών εξόδους, οι οποίες συμβάλλουν στην κυτταρική μεταμόρφωση και μετάσταση. Αν και μεταγραφική ρύθμιση των γονιδίων για την παραγωγή mRNAs μεσολαβεί μια ουσιαστική συμβολή στην ογκογένεση, πρόσφατη ανακάλυψη των miRNAs παίζει ένα ρόλο παρόμοιο με παράγοντες δέσμευσης της μεταγραφής του DNA είναι εγκατεστημένος στη ρύθμιση της έκφρασης των γονιδίων-στόχων από μετα-μεταγραφικό μηχανισμό. Πολλά miRNAs έχουν ταυτοποιηθεί και χαρακτηριστεί ως προωθητές όγκων, καθώς και καταστολείς όγκων. Για παράδειγμα, η εκφράζεται παντού miRNA, miR-21, συχνά ρυθμίζεται αυξητικά σε πολλούς καρκίνους συμπεριλαμβανομένων του μαστού, του πνεύμονα, νευροβλάστωμα, το γλοιοβλάστωμα, λευχαιμία, καρκίνο του στομάχου, χολαγγειοκαρκίνωμα, καρκίνο του παχέος εντέρου και ηπατοκυτταρικό καρκίνο [37], [38], [39] , [40], [41], [42]. Ωστόσο, πληροφορίες σχετικά με το λειτουργικό ρόλο του miR-21 είναι διαθέσιμο μόνο από το

in vitro

μελέτες. Μόνο πρόσφατα ο

in vivo

ρόλος του miR-21 σε ανάπτυξη καρκίνου έχει αποδειχθεί σε προ-Β-κυττάρων λεμφώματος και μη μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα. Και στις δύο αυτές καρκίνους, η έκφραση του miR-21 είναι σημαντικά αυξημένη [43], [44], [45]. Χρησιμοποιώντας μοντέλα ποντικών υπερέκφρασης καθώς και διαγραφή του miR-21, Medina et al και Hatley et al έδειξαν πρόσφατα μια πολύ ειδική ρόλο αυτού του miRNA στην ανάπτυξη των προ-Β-κυττάρων λεμφώματος και μη μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα, αντίστοιχα [ ,,,0],46], [47].

miR-21 ρυθμίζει τον πολλαπλασιασμό και μιτοχονδριακή αποπτωτικά μονοπάτια που ελέγχεται από πρωτεΐνες καταστολής όγκου, ρυθμιστές του κυτταρικού κύκλου και αυξητικούς παράγοντες [48], [49]. miR-21 εκφράζεται άφθονα σε νεφρικά σωληνάρια εγγύς [50]. Σε ζωικά μοντέλα, η αυξημένη έκφραση του miR-21 συνδέεται με ινωτικών διαταραχών των νεφρών και της νεφρικής ισχαιμικής βλάβης [51], [52], [53], [54]. Πρόσφατα, έχουμε αναφερθεί αυξημένη έκφραση του miR-21 σε ένα μοντέλο του τύπου 1 διαβητικής νεφροπάθειας [25]. Δείξαμε ότι miR-21 ρυθμίζει υπερτροφία του εγγύς σωληναρίου επιθηλιακών κυττάρων, υποδεικνύοντας την παθολογικό ρόλο αυτού του miRNA σε νεφρικές ασθένειες [25]. Παρομοίως, miRNA μελέτες προφίλ προσδιορίζονται αυξημένη έκφραση του miR-21 σε θηλώδη καρκινώματα νεφρικών κυττάρων [14], [19], [55] και οι δύο σαφή κύτταρο και. Αντιθέτως, σε μια πρόσφατη ανάλυση μικροσυστοιχιών 30 βαθμούς 1 και 2 σαφής ιστό νεφροκυτταρικού καρκινώματος, miR-21 αναφέρθηκε ότι ρυθμίζεται προς τα κάτω κατά περισσότερο από 2 φορές [56]. Είναι ενδιαφέρον ότι, το ασθενές αμοιβαία συσχέτιση ανιχνεύθηκε μεταξύ επιβίωσης των ασθενών με σαφείς κυττάρων νεφρικού καρκινώματος και έκφραση miR-21 [55]. Στην έκθεση αυτή, προς τα κάτω ρύθμιση των miR-21 βρέθηκε σε VHL ανεπάρκεια RCC4 νεφρική κυτταρική σειρά καρκίνου [55]. Ανασύσταση του VHL οδήγησε σε αυξημένη έκφραση του miR-21 σε ένα Hifα-ανεξάρτητο τρόπο. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι το 42% των σαφών κυτταρικούς όγκους δείχνουν μετάλλαξη VHL και το 10% των όγκων φέρουν μεθυλίωση στον υποκινητή VHL [57], [58], [59]. Στην παρούσα μελέτη, δείχνουν μια σημαντική αύξηση στην έκφραση miR-21 στο VHL θετικό ACHN και Caki-2 νεφρικά καρκινικά κύτταρα σε σύγκριση με φυσιολογικά εγγύς σωληνοειδή επιθηλιακά κύτταρα (Εικ. 1 και το Σχ. S2) [60]. Επιπλέον, τα αποτελέσματα μας δείχνουν σημαντικά ενισχυμένη έκφραση miR-21 σε 100% του βαθμού 2 και βαθμού 3 ιστών νεφρική όγκου σε σύγκριση με συμφωνημένα ιστό ελέγχου (Εικ. S1). Επιπλέον, χρησιμοποιώντας ένα VHL αρνητική νεφρική καρκινική κυτταρική γραμμή, 786-O βρήκαμε σημαντικά αυξημένη έκφραση του miR-21 σε σύγκριση με HK2 εγγύς σωληνοειδή επιθηλιακά κύτταρα (Εικ. S20). Αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι ανεξάρτητα από την κατάσταση VHL, νεφρικά καρκινικά κύτταρα εκφράζουν υψηλά επίπεδα miR-21. Εμφανίζουν

μεταστατικά κύτταρα νεφρικού καρκινώματος αυξήθηκε ΤΟΡβ-εξαρτώμενη Smad 2/3 σηματοδότηση [61]. Πρόσφατα ένας ρόλος του ΤΟΡβ στην αύξηση των επιπέδων της ώριμης miR-21 έχει αναφερθεί [62]. Αυτοί οι συγγραφείς περιέγραψαν μία λειτουργία μετεγγραφής ανεξάρτητη από ΤΟΡβ-ειδικών Smad πρωτεΐνες, οι οποίες προσλαμβάνονται μέσα στο RNase III Drosha μέσω αλληλεπίδρασης με ελικάση RNA P68. Αυτό το συγκρότημα μικροεπεξεργαστή στρατολογεί pri-miR-21 για να διευκολύνουν την παραγωγή των προ-miR-21, αυξάνοντας έτσι τα επίπεδα των ώριμων miR-21 [62]. Αυτή η μελέτη δεν διαπίστωσε καμία αύξηση των pri-miR-21 σε απάντηση προς TGFβ. Πιο πρόσφατα, η ίδια ομάδα ανέφερε την παρουσία του στοιχείου δέσμευσης TGFβ-ειδικά Smad στην περιοχή στέλεχος της pri-miR-21, το οποίο προσλαμβάνει Smad απευθείας στο pri-miR 21-συγκρότημα Drosha μικροεπεξεργαστή /για αύξηση της επεξεργασίας για την παραγωγή προ-miR