Αφηρημένο

Η συν-ανασταλτικό υποδοχέα προγραμματισμένος θάνατος-1 (PD-1) περιορίζει ανοσολογικές αποκρίσεις και πρόληψη αυτοανοσία, ωστόσο, οι όγκοι εκμεταλλευτεί αυτό το μονοπάτι για να ξεφύγουν από το ανοσοποιητικό καταστροφή. Η συν-διεγερτικό υποδοχέα ΟΧ40 ρυθμίζεται αυξητικά επί Τ κυττάρων μετά την ενεργοποίηση και αυξάνει κλωνική επέκταση, την επιβίωσή τους και την παραγωγή κυτοκίνης που εκτελούν. Αν και ανταγωνιστική αντι-PD-1 ή αγωνιστική αντι-ΟΧ40 αντισώματα μπορεί να προωθήσει την απόρριψη αρκετών όγκων ποντικού, ορισμένοι ασθενώς ανοσογόνα όγκοι ήταν ανθεκτικοί σε αυτή τη θεραπεία. Στην παρούσα μελέτη, αξιολογήσαμε τις κατά του όγκου αποτελεσμάτων και μηχανισμών συνδυαστικής PD-1 και αποκλεισμός ΟΧ40 πυροδότηση σε ένα μοντέλο ποντικού καρκίνου των ωοθηκών ID8. Παρόλο που η ατομική αντι-PD-1 ή θεραπεία ΟΧ40 mAb ήταν αναποτελεσματική στην προστασία του όγκου κατά 10 ημέρες εγκατεστημένος ID8 όγκου, σε συνδυασμό αντι-Ρϋ-1 /θεραπεία ΟΧ40 mAb αξιόλογα ανέστειλε την ανάπτυξη όγκων με 60% των ποντικών χωρίς όγκο 90 ημέρες μετά τον εμβολιασμό του όγκου . προστασία των όγκων συσχετίστηκε με συστημική ανοσοαπόκριση με τη μνήμη και εξειδίκευση αντιγόνου και απαιτείται CD4

+ κυττάρων και CD8

+ Τ κύτταρα. Η αντι-PD-1 /θεραπεία ΟΧ40 mAb αύξησαν τα CD4

+ και CD8

+ κυττάρων και μειωμένη ανοσοκατασταλτική CD4 + κυττάρων

FoxP3

+ ρυθμιστικά Τ (Treg) και CD11b

+ Gr- 1

+ μυελοειδή κατασταλτικά κύτταρα (MDSC), δίνοντας αφορμή για σημαντικά υψηλότερες αναλογίες των δύο τελεστών CD4

+ και CD8

+ κύτταρα να Treg και MDSC στην περιτοναϊκή κοιλότητα? Ποσοτικά δεδομένα RT-PCR κατέδειξε περαιτέρω την επαγωγή ενός τοπικού ανοσοδιεγερτικού περιβάλλον από αντι-Ρϋ-1 θεραπεία /ΟΧ40 mAb. Η σπληνική CD8

+ Τ κύτταρα από ποντικούς που υπέστησαν αγωγή σε συνδυασμό με mAb που παράγονται υψηλά επίπεδα της ΙΡΝ-γ κατά την διέγερση αντιγόνου όγκου και εμφάνισαν αντιγόνου-ειδική κυτταρολυτική δραστικότητα. Απ ‘όσο γνωρίζουμε, αυτή είναι η πρώτη μελέτη που εξετάζουν τις επιπτώσεις κατά του όγκου των συνδυασμένων αντι-Ρϋ-1 /ΟΧ40 mAb σε ένα μοντέλο καρκίνου των ωοθηκών ποντικού, και τα αποτελέσματά μας παρέχουν ένα σκεπτικό για κλινικές δοκιμές αξιολόγησης ανοσοθεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών με τη χρήση αυτού του συνδυασμού του mAb.

Παράθεση: Guo Z, Wang Χ, Cheng D, Xia Ζ, Λουάν M, Zhang S (2014) PD-1 αποκλεισμός και ΟΧ40 Πυροδότηση συνεργιστικά προστατεύει από την ανάπτυξη του όγκου σε ένα μοντέλο ποντικού για καρκίνο των ωοθηκών. PLoS ONE 9 (2): e89350. doi: 10.1371 /journal.pone.0089350

Επιμέλεια: Hiroshi Shiku, Mie Πανεπιστημίου Graduate School of Medicine, Ιαπωνία

Ελήφθη: 10 Νοέμ 2013? Αποδεκτές: 20 Ιανουαρίου, 2014? Δημοσιεύθηκε: 27 Φεβρουαρίου 2014

Copyright: © 2014 Guo et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Δωρεάν Ερευνητής του έργου της Shengjing Νοσοκομείου (No.200806). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Ιστορικό

ωοθηκών καρκίνωμα (OC) είναι η πιο θανατηφόρα κακοήθεια στις γυναίκες, με 22.280 νέες περιπτώσεις και 15.460 θάνατοι εκτιμάται στις Ηνωμένες Πολιτείες για το 2012 [1]. Το υψηλό ποσοστό θνησιμότητας από OC οφείλεται κατά κύριο λόγο στο προχωρημένο στάδιο της νόσου κατά τη διάγνωση. καρκίνοι Αρχικά στάδια μπορεί να θεραπευτεί σε έως και 90% των ασθενών με τις τρέχουσες θεραπείες [2], αλλά το ποσοστό αυτό πέφτει σημαντικά για προχωρημένη νόσο με περίπου 30% των ασθενών με προχωρημένο στάδιο OC επιβιώνουν 5 χρόνια μετά την αρχική διάγνωση [3]. Η τυπική θεραπεία για τον καρκίνο των ωοθηκών είναι η χειρουργική debulking ακολουθούμενη από πλατίνα-ταξάνης χημειοθεραπεία με βάση [4]. Αν και οι περισσότεροι ασθενείς ανταποκρίνονται στην χημειοθεραπεία κατά την πρώτη, η πλειοψηφία τους θα έχει τελικά μια υποτροπή και να πεθάνουν από τη νόσο. Ως εκ τούτου, νέες στρατηγικές απαιτούνται επειγόντως για τη βελτίωση των αποτελεσμάτων του καρκίνου των ωοθηκών.

Συσσωρευμένα στοιχεία δείχνουν ότι η ανοσοθεραπεία θα πρέπει να είναι αποτελεσματική για τη θεραπεία OC [5]. Πρώτον, OC κύτταρα εκφράζουν πολλά που σχετίζονται με όγκους αντιγόνων έναντι των οποίων έχουν ανιχνευθεί ειδικές ανοσοαποκρίσεις [6] – [10]. Δεύτερον, οι μελέτες άρχισαν με Coukos και συνεργάτες αναφέρουν όγκου ανοσοαπόκριση είναι ένας κρίσιμος προσδιοριστής της κλινική έκβαση των ασθενών με OC που υποστηρίζονται από τη στενή συσχέτιση μεταξύ της επιβίωσης αυτών των ασθενών και διήθηση όγκου με CD3

+ Τ κυττάρων στο μεγάλο σχολιασμένο κλινική δειγμάτων [11]. Τρίτον, αν και OC είναι μια καταστροφική ασθένεια, μεταστάσεις συχνά περιορίζονται στην περιτοναϊκή κοιλότητα όπου ο μικροπεριβάλλον του όγκου είναι άμεσα προσβάσιμο, η οποία παρακάμπτει την ανάγκη για συστηματική χορήγηση ανοσοδιεγερτικών θεραπείες [12]. Παρά την αφθονία αποδεικτικών στοιχείων που υποστηρίζουν OC ανοσοθεραπεία, κλινική επιτυχία με ανοσολογικές θεραπείες που βασίζονται για OC ήταν γενικά μέτρια [13].

προγραμματισμένος θάνατος 1 (PD-1) πρωτεΐνη αποτελεί βασικό coinhibitory υποδοχέα για τα Τ κύτταρα με δομή παρόμοια με εκείνη του CTLA-4, αλλά με μια ξεχωριστή βιολογική λειτουργία και επιλεκτικότητα προσδέματος [14]. PD-1 δρα κυρίως στους περιφερικούς ιστούς, όπου τα Τ κύτταρα μπορεί να αντιμετωπίσει την ανοσοκατασταλτική PD-1 συνδέτες PD-L1 (Β7-Η1) και PD-L2 (Β7-DC), τα οποία εκφράζονται από τα καρκινικά κύτταρα, στρωματικά κύτταρα, ή και τα δύο [15], [16]. Ο αποκλεισμός της αλληλεπίδρασης μεταξύ PD-1 και PD-L 1 ενισχύει Τ-κυττάρων ανοσοαποκρίσεων in vitro και μεσολαβεί προκλινικές αντικαρκινική δραστηριότητα [16] – [18]. PD-L1 είναι η κύρια PD-1 συνδέτη που είναι ρυθμισμένα προς τα πάνω σε συμπαγείς όγκους, όπου μπορεί να αναστέλλει την παραγωγή κυτοκινών και την κυτταρολυτική δραστικότητα του PD-1

+ διηθούν όγκο CD4

+ και CD8

+ Τ κύτταρα [14], [19]. Αυτά τα χαρακτηριστικά καθιστούν PD-1 /PD-L1 μονοπάτι ένας πολλά υποσχόμενος στόχος παρέμβαση για ανοσοθεραπεία όγκου, η οποία επικυρώνεται από το ανέφερε πρόσφατα αποτελέσματα από δύο κλινικές μελέτες που δείχνουν μονοκλωνικά αντισώματα ειδικά για PD-1 και PD-L1 προκαλέσει μια εντυπωσιακή αντικαρκινική δράση σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα, μελάνωμα και καρκίνο νεφρικών κυττάρων με πλήρη υποχώρηση επιτευχθεί σε ορισμένους ασθενείς [20] – [22]

ΟΧ40 (γνωστός και ως CD137) είναι ένα συνδιεγερτικό μόριο που ανήκει στην οικογένεια υποδοχέα TNF που εκφράζεται κυρίως στην. (Τ ΕΤΑ) κύτταρα ενεργοποιημένα ενεργά Τ και αφελής ρυθμιστικά Τ κύτταρα [23]. Η σύνδεση του ΟΧ40, κυρίως σε CD4

+ Τ κύτταρα, ενεργοποιεί NF-κΒ μονοπάτι και up-ρυθμίζει αντιαποπτωτική μόρια της οικογένειας Bcl-2, που οδηγεί σε κλωνική επέκταση των Τ κυττάρων, την ενεργοποίηση, τη μνήμη και την παραγωγή κυτοκίνης [24] – [26]. ΟΧ40 εμπλοκή σε CD4

+ FoxP3

+ κύτταρα Treg οδηγεί σε επέκταση, απενεργοποίηση, ή κυτταρικό θάνατο, ανάλογα με το τοπικό περιβάλλον [27] – [30]. Δεδομένου ότι ΟΧ40 ενεργοποίησης μπορεί ισχυρώς διεγείρει τα Τ κύτταρα και δυνητικά μπλοκάρουν /εξάλειψη ρυθμιστικών Τ κύτταρα, έχουν αγωνιστές ΟΧ40 διερευνηθεί σε πολλαπλά μοντέλα προκλινικές όγκου [31] – [34] και ένα μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-ανθρώπινου ΟΧ40 επί του παρόντος αξιολογείται σε κλινικές δοκιμές (αριθμοί καταχώρησης των κλινικών δοκιμών NCT01303705, NCT01416844, NCT01862900, NCT01644968 και NCT01642290).

Αν και PD-1 ή αγωνιστική ΟΧ40 αντισώματα ανταγωνιστή μπορεί να προωθήσει την απόρριψη κάποιων μυϊκών όγκων, ωστόσο, ελάχιστα αντισώματα όγκους όπως ο καρκίνος των ωοθηκών ID8 δεν ανταποκρίνονται στη θεραπεία με αντίσωμα μόνο [35]. Υποθέσαμε ότι η συνδυασμένη PD-1 αποκλεισμό και την ενεργοποίηση ΟΧ40 θα προωθήσει την αντικαρκινική ανοσία. Εδώ, με τη χρήση ID8 μοντέλο καρκίνου των ωοθηκών ποντικού, δείχνουμε ότι η συνδυασμένη αντι-Ρϋ-1 θεραπεία /ΟΧ40 mAb κατέστειλε σημαντικά των 10 ημέρες εγκατεστημένος περιτοναϊκή ανάπτυξη του όγκου ID8, με αποτέλεσμα το 60% των ποντικών που υπέστησαν αγωγή χωρίς όγκο 90 ημέρες μετά την ένεση του όγκου. Η στενότερη εξέταση αποκάλυψε ότι το συνδυασμένο αντι-Ρϋ-1 /ΟΧ40 mAb αυξήθηκε εμφανώς τα δραστικά Τ κύτταρα και εξασθενημένα των ανοσοκατασταλτικών κυττάρων σε καρκινικές περιοχές με την επαγωγή της συστημικής αντιγονο-ειδική απόκριση CTL.

Μέθοδοι

Ποντίκια

Γυναίκα C57BL (6-8 εβδομάδων) αγοράστηκαν από το Πειραματικό Κέντρο ζώων του China Medical University. Η χρήση ζώων εγκρίθηκε από το Διοικητικό Συμβούλιο Institutional Review της Κίνας Ιατρικού Πανεπιστημίου

Cell Culture

ID8, ένας κλώνος του ωοθηκικού καρκινώματος MOSEC των C57BL /6 προέλευσης ήταν ένα δώρο από τον Dr. George Coukos ( University of Pennsylvania, Philadelphia, USA) [36]. Ποντικού κύτταρα μελανώματος Β16, TC1 καρκίνο του πνεύμονα και κύτταρα EL4 λεμφώματος κυττάρων Τ τα προμηθευτήκαμε από την ATCC (Manassas, VA). Τα καρκινικά κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πλήρες μέσο ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% FBS (Thermo Scientific, Rockford, IL), 100 U /mL πενικιλλίνη και 100 μg /mL στρεπτομυκίνη, πριν κυτταρικά εναιωρήματα παρασκευάστηκαν και μεταμοσχεύθηκαν σε ποντίκια. Τα κύτταρα EL4 και τα κύτταρα σπλήνας διατηρήθηκαν σε πλήρες μέσο RPMI-1640 συμπληρωμένο με 10% FBS, 25 mM HEPES, 2 mM γλουταμίνη, 100 U /mL πενικιλλίνη και 100 μg /mL στρεπτομυκίνη.

μονοκλωνικά αντισώματα ( mAbs)

Θεραπευτικές αντι-ΟΧ40 (κλώνος ΟΧ-86? Catalog #: BE0031), αντι-Ρϋ-1 (κλώνος RMT3-23? Catalog # BE0115), αντι-CD4 (GK1.5 κλώνος? Catalog #: BE0003-1), αντι-CD8 (κλώνος 2,43? Catalog #: BE0061), αντι-ΝΚ1.1 (κλώνος ΡΚ136? Catalog #: BE0036) και αρουραίου ελέγχου IgG2a mAb (κλώνος 2Α3? Catalog #: BE0089) αγοράστηκαν από BioXcell (West Lebanon, ΝΗ). Τα αντισώματα που χρησιμοποιούνται για την κυτταρομετρία ροής αγοράστηκαν από Tianjing Sungene (Tianjing, Κίνα) και eBioscience (San Diego, CA).

Τα πειράματα σε ζώα

Ποντίκια (5 ή 10 ποντίκια /ομάδα) ενέθηκαν ενδοπεριτοναϊκά (IP), με 1 × 10

κύτταρα 6 ID8 σε 0,1 mL PBS. Τις ημέρες 10, 14 και 18 μετά τον εμβολιασμό του όγκου, κάθε ποντικός έλαβε την ί.ρ. ένεση 200 μg του ελέγχου, αντι-Ρϋ-1, αντι-ΟΧ40 ή αντι-PD-1 /ΟΧ40 mAb σε 200 μL PBS. Οι ποντικοί ζυγίστηκαν δύο φορές εβδομαδιαίως και ελέγχεται καθημερινά για την κλινική ένδειξη πρησμένο κοιλιές ενδεικτικό του σχηματισμού ασκίτη και για την απόδειξη της τοξικότητας όπως αναπνευστική δυσφορία, την κινητικότητα, την απώλεια βάρους, διάρροια, καμπούρα στάση του σώματος, και η αποτυχία να τρώνε ενώ ιστοπαθολογική διεξήχθη σε κύρια όργανα (δηλαδή, το ήπαρ, τους νεφρούς, τα έντερα, πνεύμονες, και του παχέος εντέρου). Μετά από οδηγίες του ιδρύματος, τα ποντίκια σκοτώθηκαν όταν ανέπτυξαν ασκίτη και είχε μια αύξηση βάρους T-bet:For:5′-CGGTACCAGAGCGGCAAGT-3′, Rev: 5′-AGCCCCCTTGTTGTTGGTG-3 ‘? FoxP3: Για: 5’-CAGCTGCCTACAGTGCCCCTAG-3 ‘, Rev: 5′-CATTTGCCAGCAGTGGGTAG-3′? IFN-γ: Για: 5’-AAAAACCTAAAAAATCTAAATAACT-3 ‘, Rev: 5′-ATCAACAACAACTCCTTTTCCACTT-3′? IL-10: Για: 5’-CTCTTACTGACTGGCATGAGG-3 ‘, Rev: 5′-CCTTGTAGACACCTTGGTCTTGGAG-3’. Ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR διεξήχθη μέσω ABI PRISM 7500 Real-Time PCR systerm (Applied Biosystems) με 1 × SYBR Green Οικουμενική PCR βασικού μείγματος (Takara). Τα επίπεδα μεταγραφημάτων υπολογίστηκαν σύμφωνα με τη μέθοδο 2-ΔΔCt, κανονικοποιημένη στην έκφραση GAPDH, και εκφράζεται ως φορές μεταβολής σε σχέση με τον έλεγχο.

Ανάλυση του ΙΡΝ-γ και IL-10 παραγωγή από PIC

Ποντίκια με ένεση ip με 1 × 10

6 ID8 κύτταρα 10 ημέρες νωρίτερα εγχύθηκαν τρεις φορές σε διάστημα 4 ημερών με 200 μg ελέγχου ή αντι-PD-1 /ΟΧ40 mAb. Επτά ημέρες μετά την τελευταία ένεση mAb, ομαδοποιήθηκαν PIC (2 × 10

6 /φρεάτιο) συλλέχθηκαν από ποντικούς που υπέστησαν αγωγή στη συνέχεια διεγέρθηκαν με 50 ng /ml ΡΜΑ και 1 μg /ml ιονομυκίνη για 6 ώρες πριν από την ανάλυση της IL- 10 και ΙΡΝ-γ έκκριση σε υπερκείμενα καλλιέργειας με Mouse ΙΡΝ-γ /IL-10 Quantikine ELISA Kit σύμφωνα με το εγχειρίδιο. (R &? συστήματα D, Minneapolis, ΜΝ)

Αξιολόγηση των ειδικών για το αντιγόνο ανοσολογικής απόκρισης

Απομονωμένα σπληνοκύτταρα από ποντικούς που υπέστησαν αγωγή καλλιεργήθηκαν σε παρουσία 10 μg /mL H-2Db-περιορισμένο mesothelin πεπτίδια προερχόμενα (αμινοξύ 406-414) ή τον έλεγχο HPV-Ε7-πεπτίδιο που προέρχεται από (αμινοξύ 49-57 ? όλα από GenScript, Nanjing, CA) για 3 ημέρες. IFN-γ στα υπερκείμενα προσδιορίστηκε με Mouse ΙΡΝ-γ Quantikine ELISA Kit (R &? Συστήματα D). Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν επίσης μετά από κανονικοποίηση του ποσοστού του σπληνός CD8

+ Τ κύτταρα.

Για προσδιορισμούς CTL mesothelin-ειδικά, κύτταρα δράστες αποκτήθηκαν με τη συγκαλλιέργεια 5 × 10

6 σπληνοκυττάρων με 5 × 10

5 UV-ακτινοβολημένα κύτταρα ID8 για 4 ημέρες. Peptide-παλμική EL4 κύτταρα στόχους παρήχθησαν με προσθήκη 10 μg /ml πεπτιδίου και επώαση για 4 ώρες. CTL δραστικότητα μετρήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ CytoTox96 μη ραδιενεργού κυτταροτοξικότητας Assay (Promega, Madison, WI) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα κύτταρα στόχοι επωάστηκαν με ποικίλους αριθμούς κυττάρων-δραστών για περίπου 4 ώρες, και τα υπερκείμενα στη συνέχεια αναλύονται για γαλακτικής αφυδρογονάσης απελευθέρωση. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως επί τοις εκατό ειδική λύση, η οποία υπολογίζεται ως (πειραματική απελευθέρωση-αυθόρμητη απελευθέρωση /Σύνολο απελευθέρωσης αυθόρμητη απελευθέρωση) × 100. Σε μερικά πειράματα, τα κύτταρα-τελεστές επωάσθηκαν με αντι-CD4 ή CD8 αντίσωμα (10 μg /mL) για 2 ώρες πριν από τον προσδιορισμό CTL.

Για την αξιολόγηση αντίσωμα mesothelin-ειδικό, εφαρμόσαμε την μέθοδο που περιγράφηκε προηγουμένως [37] . Αίμα λήφθηκε από παρθένα ποντίκια (5 ποντίκια) ή μεμονωμένων ποντικών που υπέστησαν αγωγή με mAb όταν ευθανασία (5 ποντίκια) ή 2 mAb υπό μακροχρόνια αγωγή επιζώντες (90 ημέρες μετά τον εμβολιασμό του όγκου? 4 ποντίκια). Η παρουσία του mesothelin-ειδικών αντισωμάτων προσδιορίστηκε με χρώση των ID8 καρκίνο των ωοθηκών κύτταρα ποντικού χρησιμοποιώντας ορό από ποντικούς που υπέστησαν αγωγή σε αραίωση 1:200, που ακολουθείται από χρώση με δευτερεύον φυκοερυθρίνη (ΡΕ) συζευγμένο αντίσωμα αντι-ποντικού IgG (eBioscience). Χρώση με εμπορικά διαθέσιμα αντι-mesothelin IgG (SC-33672? Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas) συν δευτερεύον αντίσωμα ή δευτερεύον αντίσωμα μόνο χρησιμοποιήθηκε ως θετικός ή αρνητικός έλεγχος. Οι αναλογίες μέση ένταση φθορισμού (MFI) από θετικό μάρτυρα ή ορούς να MFI από αρνητικό έλεγχο υπολογίστηκαν.

Στατιστικά

Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SEM. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση t-test GraphPad Prism 5. Student χρησιμοποιήθηκε για να συγκριθεί η στατιστική διαφορά μεταξύ των δύο ομάδων και μονόδρομη ANOVA για να συγκριθούν τρεις ή περισσότερες ομάδες. Τα ποσοστά επιβίωσης αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Kaplan-Meier και αξιολογήθηκαν με τη δοκιμασία log-rank με διόρθωση Bonferroni. Σημαντικές διαφορές έγιναν δεκτές στο ρ & lt?. 0.05

Αποτελέσματα

Σε συνδυασμό αντι-PD-1 /θεραπεία ΟΧ40 mAb προκάλεσε μια συνεργιστική αντικαρκινική δράση σε ποντίκια ID8 φέρουν όγκο

αξιολόγησε την αντικαρκινική αποτελεσματικότητα απλών ή συνδυασμένων αντι-Ρϋ-1 και αντι-ΟΧ40 mAb σε C57BL /6 ποντίκια μεταμοσχεύονται ip 10 ημέρες προηγουμένως με 1 × 10

κύτταρα 6 ID8. Τα ανεπεξέργαστα ποντίκια και ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με έναν έλεγχο mAb αναπτυχθεί ασκίτη περίπου 30 ημέρες μετά τον εμβολιασμό του όγκου και έπρεπε να θυσιαστούν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [38]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α, είτε ενιαία mAb είχε μικρή επίδραση στην ανάπτυξη των 10 ημερών εγκατεστημένος ID8 όγκου που οδηγεί στο σχηματισμό ασκίτη σε σχεδόν ταυτόχρονα με μη επεξεργασμένο ή τον έλεγχο mAb ποντίκια με αγωγή? Ωστόσο, σε συνδυασμό αντι-Ρϋ-1 θεραπεία /ΟΧ40 mAb αύξησε σημαντικά τη συνολική επιβίωση των ποντικών με 60% (6 από τους 10 ποντικούς) των ποντικών χωρίς όγκο (επιβεβαιώθηκε με λαπαροτομία) 90 ημερών μετά την ένεση του όγκου (ρ & lt? 0.001, σε συνδυασμό mAb σύγκριση σε μεμονωμένες ή τον έλεγχο mAb), και ακόμη και τα ποντίκια υπέκυψαν σε ανάπτυξη του όγκου επίσης είχαν σημαντικά παρατεταμένη μέσος χρόνος επιβίωσης (MST) σε σύγκριση με τον έλεγχο ή μονά mAb αγωγή ποντίκια (Εικόνα 1Β? MST 30,90, 34,00, 75,75 34.00and ημέρες ελέγχου, αντι- PD-1, αντι-ΟΧ40 και αντι-PD-1 /ΟΧ40 ομάδα? ρ & lt? 0.001, σε συνδυασμό mAb συγκριτικά με μονό ή τον έλεγχο mAb). Το βάρος του μαζών όγκου από ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με συνδυασμένη mAb επίσης σημαντικά μειωμένη σε σύγκριση με εκείνη από τον έλεγχο ή μονά ποντίκια που έλαβαν θεραπεία mAb (Σχήμα 1 C). Μια επανάληψη του πειράματος έδωσε παρόμοια αποτελέσματα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Σε αυτά τα πειράματα σε ζώα, δεν παρατηρήσαμε κάποια εμφανή τοξικότητα όπως το βάρος ή τριχόπτωση σε ποντικούς που έλαβαν μία ή συνδυασμένη αντι-Ρϋ-1 /ΟΧ40 mAb. Επιπλέον, έχουμε επίσης δεν ανίχνευσε καμία έκφραση PD-1 και ΟΧ40 μορίων και των αντίστοιχων συνδέτες τους PD-L1 /PD-L2 και OX40L στην επιφάνεια του ID8 καρκίνο των ωοθηκών κύτταρα (τα δεδομένα δεν φαίνονται), αποκλείοντας την πιθανότητα ότι η αναστολή της ανάπτυξη του όγκου ID8

in vivo

άμεσα διαμεσολαβείται από αντι-PD-1 ή αντι-ΟΧ40 mAb.

Α, ποντίκια (10 ποντικοί ανά ομάδα) μεταμοσχεύθηκαν ip με 1 × 10

6 ID8 κύτταρα 10 ημέρα πριν υπέστησαν αγωγή τρεις φορές με 200 μg του ελέγχου, αντι-Ρϋ-1, αντι-ΟΧ40 και αντι-PD-1 /ΟΧ40 mAb στις 4 ημέρες διάστημα και τη συνολική επιβίωση των ποντικών ήταν εγγεγραμμένος. Β, ο μέσος χρόνος επιβίωσης των ποντικών με ανάπτυξη του όγκου υπολογίστηκε. C, η περιτοναϊκή μάζες όγκου ζυγίστηκε όταν οι ποντικοί υποβλήθηκαν σε ευθανασία με κάθε dot αντιπροσωπεύουν κάθε ποντίκι. D, Μακροχρόνια επιβιώνουν (90 ημέρες μετά την πρώτη πρόκληση όγκου) ποντικών (4 ποντικοί ανά ομάδα) από 2 ομάδα αγωγής mAb επανα-προκλήθηκαν με κύτταρα ID8 ί.ρ. ή s.c. ή με συγγενή μη συνδεδεμένους TC1 κύτταρα μεταμοσχεύονται s.c., και στη συνέχεια τη συνολική επιβίωση των ποντικών καταγράφηκε. Ε, Ποντίκια (5 ποντικοί ανά ομάδα) που έλαβαν θεραπεία με συνδυασμένη αντι-Ρϋ-1 /ΟΧ40 mAb ενέθηκαν επίσης με ένα αντι-CD4, αντι-CD8, αντι-ΝΚ1.1, ή mAb ελέγχου με 500 μg εκάστου mAb ανά ποντικό 1 ημέρα πριν και δύο ημέρες μετά την πρόκληση όγκου που ακολουθείται από ένεση 200 μg κάθε 5 ημέρες μετά τη διάρκεια των πειραμάτων. Έφεραν όγκο χωρίς θεραπεία ποντικοί ήταν ως αρνητικοί έλεγχοι (UNT). Συνολική επιβίωση των ποντικών καταγράφηκε. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων εκτός από D και Ε, που ήταν από ένα πείραμα. *** P & lt? 0.001, σε συνδυασμό mAb vs έλεγχο ή ενιαία mAb ποντίκια που έλαβαν αγωγή με Α-C? *** P & lt? 0.001, υποδορίως ή i.p.ID8 vs s.c.TC1 σε C? * P & lt? 0,05, έλεγχο ή ΝΚ1.1 vs UNT, CD4 ή CD8 στο Δ

Η

Ποντίκια απορρίπτοντας κύτταρα ID8 μετά από συνδυασμένη θεραπεία ήταν ανθεκτικά σε μεταγενέστερη επαναχορήγησης ε.π. ή s.c. με την ίδια κυτταρική γραμμή, αλλά όχι s.c. με άσχετες TC1 καρκινικά κύτταρα πνεύμονα (Σχήμα 1 D). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η συνδυασμένη αγωγή επάγει μία ειδική και μακροχρόνια αντικαρκινική ανοσολογική απόκριση σε ποντικούς που υπέστησαν αγωγή. πειράματα εξάντληση των λεμφοκυττάρων υποσύνολο απέδειξαν ότι η προστασία του όγκου από αντι-Ρϋ-1 /ΟΧ40 mAbs ήταν εξαρτημένη από τον CD4

+ και CD8

+ Τ κύτταρα όπως αφαίρεση των CD4

+ ή CD8

+ Τ κύτταρα αλλά όχι ΝΚ κύτταρα κατήργησε εντελώς την αντικαρκινική δράση που παρέχει το αντι-Ρϋ-1 /ΟΧ40 mAb θεραπεία (Σχήμα 1 Ε).

Συνδυασμένη αντι-Ρϋ-1 θεραπεία /ΟΧ40 mAb αυξάνει σημαντικά αναλογίες τόσο CD4 και CD8 Τ κύτταρα για να Treg και MDSC

για να διερευνήσει τους μηχανισμούς που διέπουν τη συνέργεια μεταξύ PD-1 αποκλεισμό και την ενεργοποίηση ΟΧ40, αναλύσαμε τα αποτελέσματα των μεμονωμένων ή σε συνδυασμό mAb στην περιτοναϊκή κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος που διηθούν όγκο (PIC) που συλλέγονται από ποντίκια που έλαβαν θεραπεία 3 ή 7 ημέρες μετά την τελευταία ένεση mAb. Σε σύγκριση με τον έλεγχο ή την ενιαία mAb, σε συνδυασμό mAb αύξησε σημαντικά τα ποσοστά των δραστικών CD4

+ FoxP3

– (μέση τιμή για τον έλεγχο, αντι-PD-1, αντι-ΟΧ40 και αντι-PD-1 /ΟΧ40 ομάδα: 8,24%, 8,20%, 8,70%, 18,78% την ημέρα 3 και 7,66%, 8,02%, 12,22%, 22,80% την ημέρα 7? ρ & lt? 0,05) και CD8 + (μέση τιμή 6,62%, 6,74%, 7,20%, 23,24% την ημέρα 3 και 5,88, 7,22, 12,90, 29,26 την ημέρα 7? ρ & lt? 0,01) Τ κυττάρων και μείωσε την συχνότητα των CD11b

+ GR-1

+ μυελοειδή προερχόμενα καταστολέα κύτταρα (MDSC? μέση τιμή 12,58% , 10,86%, 13,62%, 6,53% κατά την ημέρα 3 και 14,58%, 10,28%, 14,20%, 3,28% την ημέρα 7? ρ & lt? 0,05 και 0,01 για την ημέρα 3 και 7 αντίστοιχα) σε PIC την ημέρα 3 μετά την αγωγή και οι αλλαγές έγιναν πιο εμφανή την ημέρα 7 μετά την αγωγή (Σχήμα 2Α-D)? Ωστόσο, καμία μεταβολή στο ποσοστό των CD4

+ FoxP3

+ ρυθμιστικά Τ κύτταρα (Treg) παρατηρήθηκε σε ποντικούς που συνδυάστηκαν mAb κατεργασία σε δύο χρονικά σημεία αξιολογήθηκαν. Αυτές οι αντικρουόμενες αλλαγές στην τελεστές και ανοσοκατασταλτικών κυττάρων οδήγησε στις σημαντικά αυξημένες αναλογίες των δύο τελεστών CD4

+ και CD8

+ Τ κύτταρα να Treg και MDSC σε περιτοναϊκή κοιλότητα των ποντικών που έλαβαν συνδυασμένη θεραπεία mAb (Σχήμα 2Ε-Η) . Όσον αφορά την ατομική μεταχείριση mAb, εμπλοκή ΟΧ40 αυξημένα σημαντικά το ποσοστό των CD4

+ FoxP3

+ Treg (1,01%, 0,93%, 1,33%, 1,03% κατά την ημέρα 3 και 1,07%, 0,84%, 1,84%, 0,97% την ημέρα 7? ρ & lt? 0,05 την ημέρα 7) με μέτρια αύξηση του ποσοστού των τελεστών CD4

+ FoxP3

– και CD8 + Τ κύτταρα την ημέρα 7 μετά την αγωγή? Ωστόσο, και μόνο αποκλεισμός PD-1 ήπια εξασθενημένα τα επίπεδα των ανοσοκατασταλτικών Treg και MDSC σε περιτοναϊκή κοιλότητα. Σημειώσαμε μια αύξηση σε απόλυτο αριθμό του συνόλου των κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος από 2 ποντίκια mAb σε επεξεργασία σε δύο χρονικά σημεία που αναλύθηκαν (μέση τιμή (× 10

6 /ποντίκι): 3.5, 3.7, 3.8, 5.6 κατά την ημέρα 3 και 3.7, 3.8, 4,0, 6,2 την ημέρα 7? ρ & lt?. 0.05) και οι αλλαγές σε απόλυτο αριθμό των κάθε υποσυνόλου είχε μια παρόμοια τάση με τα ποσοστά τους (τα δεδομένα δεν φαίνονται)

ποντίκια (5 ποντίκια ανά ομάδα) εγχύθηκαν ε.π. με 1 × 10

6 ID8 κύτταρα 10 ημέρες νωρίτερα εγχύθηκαν τρεις φορές σε διάστημα 4 ημερών με 200 μg του ελέγχου, μόνο ή σε συνδυασμό αντι-PD-1 /ΟΧ40 mAb. Τρεις ή επτά ημέρες αργότερα, περιτοναϊκή πλύσεις από ποντικούς που υπέστησαν αγωγή αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής για τη σύνθεση των διαφόρων ανοσοποιητικού υποσύνολα. Τα ποσοστά των CD4

+ FoxP3

– Τ κύτταρα, CD8

+ Τ κύτταρα, CD4

+ FoxP3

+ Treg και CD11b

+ GR-1

+ MDSC σε τα CD45

+ περιτοναϊκά κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος που φαίνεται στο Α, Β, C και D αντίστοιχα με κάθε κουκκίδα αντιπροσωπεύει δεδομένα από κάθε ποντικό. Οι αναλογίες των δύο CD4

+ και CD8

+ Τ κύτταρα να Treg και MDSC φαίνεται στο E, F, G και Η αντίστοιχα με κάθε κουκκίδα αντιπροσωπεύει δεδομένα από κάθε ποντικό. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά 2 ανεξάρτητων πειραμάτων, * P & lt? 0.05, ** P & lt? 0,01

Η

Περαιτέρω ανάλυση φαινοτύπου έδειξε ότι αυξήθηκε σημαντικά το ποσοστό των CD44

+ CD62L

– τελεστή /μνήμη. (μέση τιμή για τον έλεγχο, αντι-PD-1, αντι-ΟΧ40 και αντι-PD-1 /ΟΧ40 ομάδα: 9,4%, 10,3%, 14,0%, 33,4% και 18,6%, 21,6%, 26,2%, 53,0% για την CD4 και CD8 κύτταρα? p & lt? 0,01 και για τα δύο κύτταρα) και CD44

+ CD62L

+ κεντρική μνήμη (35%, 40,9%, 42,8%, 54,2% και 37,7%, 36,7%, 34,6%, 36,9 % για τα κύτταρα CD4 και CD8? ρ & lt? 0,05 για τα κύτταρα CD4) κύτταρα παρατηρήθηκε σε περιτοναϊκά κύτταρα CD4 + και CD8 + Τ από αντι-Ρϋ-1 /ΟΧ40 mAb αγωγή ποντικούς σε σύγκριση με εκείνη από τον έλεγχο ή μονά mAb αγωγή ποντικούς (Σχήμα 3Α, Β ), των οποίων περιείχε υψηλότερα επίπεδα αφελείς CD4 ΣΜΕ

+ και CD8

+ Τ κύτταρα (48,2%, 44,1%, 37,2%, 9,73% και 32,7%, 33,6%, 27,1%, 6,3% για τα CD4 και κύτταρα CD8? p & lt? 0,01 και για τα δύο κύτταρα) με CD44

-CD62L

+ φαινότυπο (Σχήμα 3C). Οι αντιπροσωπευτικές dotplots δείχθηκαν στο Σχήμα 3D.

Ποντίκια (5 ποντίκια ανά ομάδα) εγχύθηκαν ί.ρ. με 1 × 10

6 ID8 κύτταρα 10 ημέρες νωρίτερα εγχύθηκαν τρεις φορές σε διάστημα 4 ημερών με 200 μg του ελέγχου, μόνο ή σε συνδυασμό αντι-PD-1 /ΟΧ40 mAb. Επτά ημέρες αργότερα, η έκφραση του CD44 και CD62L σε περιτοναϊκή CD4

+ και CD8

+ Τ κύτταρα από ποντικούς αγωγής αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής. Οι συχνότητες των CD44

+ CD62L

– τελεστή /μνήμη, CD44

+ CD62L

+ κεντρική μνήμη και CD44

-CD62L

+ αφελής κυττάρων σε περιτοναϊκή CD4

+ και τα CD8

+ Τ κύτταρα φαίνεται στο Α, Β και C αντίστοιχα. Οι αντιπροσωπευτικές dotplots φαίνεται στο D με ανώτερο, μέσο και κάτω πάνελ προβολή ισοτόπου, χρώση CD44 και CD62L σε περιφραγμένη CD4

+ και CD8

+ Τ κύτταρα, αντίστοιχα. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά 2 ανεξάρτητων πειραμάτων, * P & lt? 0.05, ** P & lt?. 0.01

Η

Συνοπτικά, τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν ότι η ταυτόχρονη PD-1 αποκλεισμού και ΟΧ40 ενεργοποίηση δημιουργεί υψηλότερες αναλογίες δραστικά Τ κύτταρα να ανοσοκατασταλτικά κύτταρα σε περιτοναϊκή κοιλότητα των ποντικών που έλαβαν, το οποίο αντιπροσωπεύει την μετατόπιση του κανονικά κατασταλτικής περιβάλλον του όγκου σε μια πιο διεγερτική κατάσταση η οποία είναι περισσότερο ανεκτική για ανοσολογική καταστροφή του όγκου.

Συνδυασμένη αντι-Ρϋ-1 /ΟΧ40 mAb επεξεργασία καλλιεργήσει ένα τοπικό ανοσοδιεγερτικό μικροπεριβάλλον

για να τεκμηριώσει περαιτέρω τη μετατόπιση της μικροπεριβάλλον του όγκου, είμαστε δίπλα εξέτασε την έκφραση του ανοσοποιητικού που σχετίζονται με τα γονίδια σε προσφάτως απομονωθεί ΣΜΕ κατά τις ημέρες 3 έως 7 μετά τη θεραπεία mAb. Χρησιμοποιώντας ποσοτική RT-PCR, παράγοντες που συνδέονται με ενεργοποίηση του ανοσοποιητικού συστήματος (Τ-ποντάρισμα και ΙΡΝ-γ) και αυτές που σχετίζονται με ανοσοκατασταλτική /ρυθμιστική δραστηριότητα (FoxP3 και IL-10) αξιολογήθηκαν για τα σχετικά επίπεδα της έκφρασης. Την ημέρα 3 μετά την αγωγή, σε μια εποχή που παρατηρήθηκαν αυξημένες συχνότητες των κυττάρων τελεστών Τ, τα επίπεδα μεταγραφής για την T-στοίχημα και γονιδίων ΙΡΝ-γ είχαν σημαντικά ενισχυμένη στην ομάδα συνδυασμένης θεραπείας (Σχήμα 4Α, Β). Αντιθέτως, η έκφραση του γονιδίου της ανοσοκατασταλτικής κυτοκίνης IL-10 ήταν μειώθηκαν απότομα ενώ FoxP3 γονίδιο παρέμεινε αμετάβλητη (Σχήμα 4C, D), η οποία ήταν σύμφωνη με την αλλαγή του Treg και MDSC Φωτ. Η μεταβολή στην έκφραση των Τ-στοίχημα, ΙΡΝ-γ και IL-10 γονίδια ήταν εντονότερη κατά την ημέρα 7 μετά την αγωγή. Με βάση τις αναλογίες των διεγερτικών-to-ρυθμιστικές μεταγραφές γονίδιο (αναλογίες των δύο T-bet /FoxP3 και IFN-γ /IL-10), καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι η συνδυασμένη θεραπεία καλλιεργήσει ένα τοπικό ανοσο-ενεργοποίησης μικροπεριβάλλον του όγκου (Σχήμα 4Ε, F ). Ενιαία ΟΧ40 Σκανδάλιση μετρίως αύξησαν την έκφραση όλων των τεσσάρων γονιδίων, ωστόσο, καμία ανύψωση παρατηρήθηκε και T-στοίχημα /FoxP3 και IFN-γ /IL-10 αναλογίες.

Ποντίκια (5 ποντίκια ανά ομάδα) εγχύθηκαν ί.ρ. με 1 × 10

6 ID8 κύτταρα 10 ημέρες νωρίτερα εγχύθηκαν τρεις φορές σε διάστημα 4 ημερών με 200 μg του ελέγχου, μόνο ή σε συνδυασμό αντι-PD-1 /ΟΧ40 mAb. Τρεις ή επτά ημέρες αργότερα, η έκφραση του Th1 σχετιζόμενη Τ-στοίχημα και γονιδίων ΙΡΝ-γ και ανοσορυθμιστικές FoxP3 και IL-10 γονίδια στο PIC από ποντικούς που υπέστησαν αγωγή αναλύθηκε με ποσοτική RT-PCR. Η έκφραση του Τ-στοίχημα, IFN-γ, FoxP3 και IL-10 γονίδια δείχνονται στα Α, Β, Γ και Δ, αντίστοιχα. Οι αναλογίες των δύο Τ-στοίχημα /FoxP3 και IFN-γ /IL-10 φαίνεται στην Ε και F αντίστοιχα. Προσφάτως απομονωθεί PIC από ποντικούς που υπέστησαν αγωγή διεγέρθηκαν με 50 ng /ml ΡΜΑ και 1 μg /ιονομυκίνη ml για 6 ώρες (όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι) και τα υπερκείμενα αξιολογήθηκαν για επίπεδα IL-10 (G) και ΙΡΝ-γ (H ). Τα δεδομένα εκφράστηκαν ως Μ ± SEM από 5 ποντικούς και αντιπροσωπευτικές των 2 ανεξάρτητων πειραμάτων, * Ρ & lt? 0,05, ** Ρ & lt? 0,01, *** Ρ & lt?. 0.001

Η

Για να εξασφαλισθεί ότι οι μεταβολές σε IFN -γ και IL-10 έκφραση RNA συσχετίζεται με μεταβολές στο επίπεδο πρωτεΐνης, PIC απομονώθηκαν τις ημέρες 3 έως 7 μετά την αγωγή και διεγέρθηκαν in vitro πριν από την ανάλυση της ΙΡΝ-γ και IL-10 επίπεδα έκκρισης με ELISA. Αξιοσημείωτα, PIC απομονώνονται 3 και 7 ημέρες μετά την έναρξη της συνδυασμένης θεραπείας mAb παρήγαγαν σημαντικά υψηλότερα επίπεδα πρωτεΐνης ΙΡΝ-γ και χαμηλότερα επίπεδα της IL-10 κυτοκίνης σε σύγκριση με εκείνη που συγκομίζονται από τον έλεγχο ή μονά mAb αγωγή ποντικούς σε αυτά τα ίδια χρονικά σημεία (Σχήμα 4G , η).

Συνδυασμένη αντι-Ρϋ-1 /θεραπεία ΟΧ40 mAb προκάλεσε μία αντιγονο-ειδική απόκριση CTL

καθώς τα κύτταρα εκφράζουν το ID8 mesothelin, ένα καλά χαρακτηρισμένο αντιγόνο όγκου [38], συλλέξαμε σπληνοκύτταρα από ποντικούς που υπέστησαν αγωγή, και τον ίδιο αριθμό των σπληνοκυττάρων καλλιεργήθηκε με την παρουσία 10 μg /mL του H-2Db-περιορισμένο mesothelin-ειδικό πεπτίδιο (αμινοξύ 406-414) ή τον έλεγχο HPV-Ε7 πεπτίδιο (αμινοξέα 49 -57) για 3 ημέρες και αναλύθηκαν ΙΡΝ-γ παραγωγή σε υπερκείμενα καλλιέργειας με ELISA. Σε σύγκριση με ότι από τον έλεγχο ή μονά mAb-αγωγή ποντικούς, σπληνοκύτταρα από συνδυασμένη mAb αγωγή ποντίκια παρήγαγαν σημαντικά υψηλότερα επίπεδα της ΙΡΝ-γ όταν διεγείρονται με το πεπτίδιο mesothelin (Ρ & lt? 0,01? Σχήμα 5Α). Αριθ αυξημένη έκκριση IFN-γ παρατηρήθηκαν σε σπληνοκύτταρα από όλες τις ομάδες ποντικών, όταν διεγέρθηκαν με HPV ελέγχου πεπτίδιο, καταδεικνύοντας την επαγωγή mesothelin ειδική ανοσολογική απόκριση σε ποντικούς που έλαβαν συνδυασμένη θεραπεία mAb. Αξιολογήσαμε περαιτέρω την κυτταρολυτική δραστικότητα σπληνοκυττάρων από έλεγχο ή συνδυασμένα ποντικούς που υπέστησαν αγωγή mAb. Κύτταρα σπλήνας διεγέρθηκαν πάλι με κύτταρα ID8 UV-ακτινοβολημένα για 4 ημέρες πριν από διεξήχθησαν ΟΤΙ δοκιμασίες χρησιμοποιώντας κύτταρα παλλόμενα με EL4 mesothelin ή HPV-Ε7 πεπτίδιο που προέρχεται από τα κύτταρα-στόχους. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Β και 5C, σπληνοκύτταρα από αντι-Ρϋ-1 /ΟΧ40 ποντικούς που υπέστησαν αγωγή εμφάνισαν σημαντικά υψηλότερα επίπεδα κυτταροτοξική δραστικότητα έναντι των κυττάρων EL4 πάλλονται με mesothelin αλλά όχι με το πεπτίδιο HPV-Ε7.