Αφηρημένο

Τα ραδιοϊσότοπα που εκπέμπουν ηλεκτρόνια (βήτα σωματίδια), όπως ραδιενεργό ιώδιο, μπορεί να σκοτώσει αποτελεσματικά τα κύτταρα-στόχους , συμπεριλαμβανομένων των καρκινικών κυττάρων. Υδατικό

32Ρ [PO

4] είναι ένας καθαρός β-εκπομπός που έχει χρησιμοποιηθεί για αρκετές δεκαετίες για τη θεραπεία μη κακοήθων ανθρώπινου μυελοϋπερπλαστικές ασθένειες.

32Ρ [PO

4] άμεσα σε σχέση με ένα πιο ισχυρό καθαρό βήτα-εκπομπού, το κλινικά σημαντικό

90Y ισότοπο.

In vitro

,

32Ρ [PO

4] ήταν πιο αποτελεσματική στην θανάτωση των κυττάρων από ό, τι ήταν το πιο ισχυρό ισότοπο

90Y (P ≤ 0.001) και, επίσης, προκάλεσε σημαντικά περισσότερο διπλής έλικας του DNA διαλείμματα από ό, τι

90Y.

In vivo

, μία απλή ενδοφλέβια δόση χαμηλή δόση του υδατικού στοιχειακού

32Ρ ανέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου στον συγγενικό μοντέλο καρκίνου ποντικού (

P

≤ 0,001). Η επίδραση αυτή ασκείται με άμεση ενσωμάτωση στο εκκολαπτόμενο αλυσίδες DNA, με αποτέλεσμα την διπλή έλικα θραύσης, έναν μοναδικό μηχανισμό δεν αναπαραχθεί από άλλα, πιο ισχυρό ραδιοϊσότοπα εκπομπής ηλεκτρονίων.

32Ρ [PO

4] θα πρέπει να θεωρείται για την ανθρώπινη κλινικές δοκιμές ως δυνητικό νέο αντικαρκινικό φάρμακο

Παράθεση:. Cheng Υ, Kiess AP, Herman JM, Pomper MG, Μέλτζερ SJ, Αβραάμ JM (2015) Φώσφορος-32, ένα Κλινικά διαθέσιμο φάρμακο, αναστέλλει τον καρκίνο ανάπτυξης επάγοντας DNA διπλό σκέλος Θραύση. PLoS ONE 10 (6): e0128152. doi: 10.1371 /journal.pone.0128152

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Abhijit De, ACTREC, Μνημείο Κέντρο Tata, ΙΝΔΙΑ

Ελήφθη: 19 Δεκέμβρη, 2014? Αποδεκτές: 22 Απριλίου, 2015? Δημοσιεύθηκε: 1 Ιούν 2015

Copyright: © 2015 Cheng et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. το ερευνητικό έργο χρηματοδοτήθηκε από το National Cancer Institute CA133012-01, National Institutes of Health χάρτη πορείας DK087454-01, National Cancer Institute CA146799, National Cancer Institute CA190040, και Sidney Kimmel Cancer κέντρο Πιλοτικό Grant έργου. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Beta σωματίδια (ηλεκτρόνια) που εκπέμπεται από ραδιοϊσότοπα είναι γνωστά για να σκοτώσει αποτελεσματικά τα καρκινικά κύτταρα. Αυτό το εύρημα έχει ήδη κλινικώς αξιοποιηθεί χρησιμοποιώντας

131I για τη θεραπεία του καρκίνου του θυρεοειδούς [1], μια στρατηγική ακόμη χρησιμοποιηθεί με επιτυχία σε περισσότερες από 50% αυτών των ασθενών στις Ηνωμένες Πολιτείες, με πάνω από ένα ποσοστό ίασης 90%. Ομοίως, σωματιδίων βήτα-εκπομπής ραδιοεπισημασμένα αντισώματα που κατευθύνονται έναντι CD20, συμπεριλαμβανομένων των

131I-Bexxar (tositumomab) και

90Y-Zevalin (ibritumomab tiuxetan), έχουν χρησιμοποιηθεί κατά το λέμφωμα μη Hodgkin [2,3]. Επιπλέον,

90Y-σημασμένο πρόσδεμα υποδοχέα σωματοστατίνης χρησιμοποιείται για τη θεραπεία νευροενδοκρινών όγκων [4]. Τα ηλεκτρόνια που εκπέμπονται από

32Ρ έχουν ένα ενδιάμεσο μεταξύ εκείνων του

131I και το πιο ισχυρό

90Y επίπεδο ενέργειας, με αποτέλεσμα μια μήκος διαδρομής μέχρι και 5 mm σε ανθρώπινους ιστούς [5]. Τα ηλεκτρόνια που εκπέμπονται από τα ραδιοϊσότοπα μπορούν να χτυπήσουν χιλιάδες κύτταρα. Το προκύπτον φαινόμενο γειτνιάσεως ενισχύει το θανατηφόρο δυναμικό κάθε σωματίδιο βήτα εκπέμπεται σε ή κοντά σε όγκο. Ωστόσο, όπως θα δείξουμε παρακάτω, έχουμε ανακαλύψει ότι μεταξύ όλων των διαθέσιμων ισότοπα βήτα-εκπομπής,

32Ρ κατέχει μια μοναδική χημικά και ακτινολογικά με βάση το διπλό σκέλος μηχανισμό θραύσης, η οποία προσδίδει μεγαλύτερη αποτελεσματικότητα κατά των όγκων σε σχέση με άλλες β-εκπομπούς συγκρίσιμων δύναμη.

Ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου που προέρχεται εγκατεστημένος σε ανοσοκατεσταλμένους ποντικούς είναι ένα πολύτιμο εργαλείο για τον έλεγχο της αποτελεσματικότητας των αντικαρκινικών παραγόντων υποψήφιος [6-9]. Έχουμε διαπιστώσει προηγουμένως ότι μια ενιαία, ενδοφλέβια ένεση χαμηλή δόση των [

32Ρ] ΑΤΡ αναστέλλει σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου για αρκετές εβδομάδες σε μοντέλα ποντικών ξενομοσχεύματος [10,11]. Επειδή ΑΤΡ είναι ένα μικρό φυσικώς ενυπάρχον μόριο, ραδιοεπισημασμένη μορφή ενέχει ορισμένα πλεονεκτήματα έναντι των μεγαλύτερων συνθετικές ενώσεις ως πιθανός θεραπευτικός κατά του καρκίνου, συμπεριλαμβανομένων των χαμηλότερων ανοσογονικότητα, μεγαλύτερη διείσδυση του όγκου, και ανώτερη φαρμακοκινητική [12]. Ανόργανα [

32Ρ] PO

4, ένα απλό υδατικό ιόν, έχει χρησιμοποιηθεί για δεκαετίες ως ένα θεραπευτικό μέσο για αληθή πολυκυτταραιμία και βασική θρομβοκυτταραιμία [13]. Αυτό ιόντων χρησιμοποιήθηκε επίσης στο παρελθόν για ανακούφιση του πόνου των οστών που οφείλεται σε μεταστάσεις, όπου θεωρήθηκε να ενσωματωθούν σε εξωκυτταρικό πλέγμα [14]. Ωστόσο, υδατικό

χρήση 32Ρ δεν έχει καθιερωθεί ως κύρια στρατηγική κατά του καρκίνου

per se

.

Η κλινική εφαρμογή της

32Ρ πρώτη απόπειρα το 1930 [15 -18]. Από εκείνη τη στιγμή,

Χρήση 32Ρ γενικά έχει περιοριστεί σε κολλοειδή μορφή ανάρτησης, όπου

32Ρ αποτελεί συστατικό ενός σύνθετου, αδιάλυτο σωματίδιο [19-22]. Αυτή η μορφή

32Ρ τυπικά εγχέεται απευθείας εντός του όγκου, με το κολλοειδές εναιώρημα πρόληψη της ραδιοϊσότοπο από την έξοδο από την επιδιωκόμενο στόχο και τη διάδοση σε όλο το σώμα. Η διοίκηση του υδατικού

32Ρ ως πρωταρχικό παράγοντα κατά του καρκίνου δεν έχει μελετηθεί, εκτός από την παρηγορητική χρήση του για την ανακούφιση του πόνου που οφείλεται σε μεταστάσεις στα οστά.

Πρόσφατα πειραματικά ευρήματα έχουν οδηγήσει στην ανάπτυξη και χρήση της α- και β-εκπομπός

223Ra να στοχεύουν επιλεκτικά οστικές μεταστάσεις σε ασθενείς με ευνουχισμό ανθεκτικό καρκίνο του προστάτη [23,24]. Αρχικά αναπτύχθηκε από μια νορβηγική εταιρεία Algeta, Alpharadin είχε εγκριθεί για χρήση στις Ηνωμένες Πολιτείες το 2013, και τώρα στο εμπόριο από την Bayer με το όνομα Xofigo [25]. Έτσι,

223Ra είναι η τελευταία απλή ραδιενεργό στοιχείο για να γίνει ένα αποτελεσματικό φάρμακο κατά του καρκίνου.

Είμαστε τώρα αναφέρουν ότι ένα ενιαίο, ενδοφλέβια έγχυση χαμηλής δόσης των υδατικών

32Ρ αποτελέσματα στην ταχεία, σημαντική αναστολή της ανάπτυξης προ-καθιερωμένων ανάπτυξη του όγκου σε ένα μοντέλο ποντικού ανοσοεπαρκή (συγγενή). Δείχνουμε επίσης ότι

32Ρ είναι πιο αποτελεσματική από τις αντίστοιχες δόσεις της υψηλότερης ενέργειας εξωκυττάριο ηλεκτρόνια, όπως αυτά που εκπέμπονται από

90Y, μια βήτα-ραδιοϊσότοπο εκπομπής σε κοινή χρήση σήμερα. Παρέχουμε αποδείξεις ότι αυτό υψηλότερα αποτελέσματα αποτελεσματικότητας από την άμεση ενσωμάτωση των

32Ρ σε εν τη γενέσει του DNA, προκαλώντας διπλό σκέλος θραύση του DNA μέσω ενός συνδυασμένου χημικά ακτινολογικές μηχανισμό που δεν μπορεί να αναπαραχθεί από άλλα ραδιοϊσότοπα β εκπομπής, όπως

131I και

90Y. Το εύρημα αυτό έχει άμεσες συνέπειες για τη διευρυμένη επεξεργασία των πρωτογενών ανθρώπινων καρκίνων.

Μέθοδοι

Μέτρηση

in vitro

θανάτωση των κυττάρων από

32Ρ και

90Y

Δύο χιλιάδες κύτταρα του ποντικού /c CRL2836 κυτταρική γραμμή BALB ή την ανθρώπινη κυτταρική γραμμή HeLa S3 αναπτύχθηκαν σε πλήρες θρεπτικό μέσο σε μία πλάκα 96 φρεατίων και εξετέθησαν την Ημέρα 0 έως είτε 0, 1, 2.5, ή 5 μθί

ραδιοϊσοτόπων 90Y ή το [

32Ρ] PO

4 ραδιοϊσοτόπων σε πλήρες θρεπτικό μέσο. Μετά από επώαση 24 h, το μέσο ραδιοϊσότοπο που περιέχει απομακρύνθηκε και αντικαταστάθηκε με μη-ραδιενεργό πλήρες μέσο (Ημέρα 1). δοκιμασίες WST-1 πολλαπλασιασμού (Roche Applied Science, Indianapolis, ΙΝ) πραγματοποιήθηκαν κατά τις ημέρες 1, 2, 3, 4, ή 5 για την απευθείας μέτρηση της κυτταρικής ανάπτυξης. Κάθε πείραμα διεξήχθη εις τριπλούν. Οι κυτταρικές γραμμές ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA) και χρησιμοποιήθηκαν εντός έξι μηνών από την αγορά.

Αξιολόγηση της δίκλωνα σπασίματα του DNA

Δέκα χιλιάδες κύτταρα HeLa S3 σπάρθηκαν επάνω σε Lab-TekII διαφάνειες θάλαμο (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, ΜΑ). Την ημέρα 0, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0 ή 3 μθί

32Ρ ή

90Y σε πλήρες μέσο. Την Ημέρα 1, όλες οι εκβαθύνσεις πλένονται απαλά και προστέθηκε φρέσκο ​​μη ραδιενεργού μέσου. Κατά την ημέρα 1, ημέρα 2, ή την Ημέρα 3, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 10% φορμαλίνη σε θερμοκρασία δωματίου για 10 λεπτά, πλύθηκαν με PBS για δύο λεπτά, και διαπερατά με 0,2% Triton Χ-100 με 10% FBS σε PBS για 15 λεπτά . Μετά από μια έκπλυση με PBS, οι πρωτογενείς αντι-ανθρώπινο αντίσωμα Η2ΑΧ ποντικού σε αραίωση 1: 1000 (Millipore, Billerica, ΜΑ) επωάστηκαν για 1 ώρα σε θερμοκρασία περιβάλλοντος, στη συνέχεια πλύθηκε δύο φορές με PBS για 5 λεπτά. Μια αραίωση 1: 400 κατσίκας αντι-ποντικού IgG με Alexa Fluor (Life Technologies, Grand Island, ΝΥ) επωάστηκε για 1 ώρα σε θερμοκρασία περιβάλλοντος και πλύθηκαν δύο φορές με PBS για 5 λεπτά. Τα κύτταρα βάφτηκαν με διάλυμα Hoechst. (1: 1000)

Εκτίμηση παροχών

32Ρ ενσωματώθηκε στο DNA

Εκατόν πενήντα χιλιάδες CRL2836 ποντικού ή ανθρώπου HeLa S3 κύτταρα σπάρθηκαν επί ενός έξι -Καλά πλάκα καλλιέργειας κυττάρων και αναπτύχθηκαν για 24 ώρες (που ορίζεται ως ημέρα 0). Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν όλη τη νύκτα είτε με

32Ρ [ΡΟ

4], που καλλιεργούνται για 2 ημέρες σε μη ραδιενεργό μέσο και το DNA εκχυλίζεται (3 ημέρες)? ή καλλιεργούνται για 24 ώρες, επωάστηκαν με

32Ρ [PO

4] για 24 ώρες, καλλιεργούνται για 24 ώρες σε μη ραδιενεργό μέσο και το DNA που εξάγεται (2 ημέρες)? ή καλλιεργούνται για 48 ώρες, επωάστηκαν με

32Ρ [PO

4] για 24 ώρες, πλένονται με πλήρες μέσο και το νουκλεϊκό οξύ που εκχυλίζεται (1 μέρα). DNA εκχυλίζεται με τη χρήση της DNAeasy Αίματος και Kit Tissue (Qiagen, Valencia, CA) και δείγματα επωάστηκαν με ή χωρίς τέσσερις μονάδες ϋΝάσης Ι (New England Biolabs, Ίπσουιτς, ΜΑ) για δύο ώρες στους 37 ° C πριν έτρεξαν τα δείγματα σε ένα πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου 5%, εκτίθεται σε φιλμ όλη τη νύχτα στους 4 ° C και να αναπτυχθεί.

Δοκιμασία για την απόπτωση σε κυτταρικές σειρές επωάστηκαν με

32Ρ.

εκατό χιλιάδες CRL2836 κύτταρα ποντικού ή κύτταρα HeLa S3 σπάρθηκαν σε κάθε φρεάτιο πλακών καλλιέργειας 6 φρεατίων και αναπτύχθηκαν για 24 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με 0, 2,5, 5, 10 ή 20 uCi

32Ρ [ΡΟ

4] σε δύο ml πλήρες μέσο για 24 ώρες, και μη ραδιενεργά μέσο προστίθεται για επιπλέον 24 ώρες. Η πρωτεΐνη εκχυλίστηκε από κάθε φρεάτιο χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό διάλυμα RIBA (Cell Signaling Technology, Boston, ΜΑ), η πρωτεΐνη ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ δοκιμασίας πρωτεΐνης BCA (Pierce, Rockford, IL), και παρόμοιες ποσότητες έτρεξαν σε ένα πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου 10 έως 20% , και στυπώθηκε σε νιτροκυτταρίνη. Ένα στύπωμα western χρησιμοποιώντας ένα πρωτογενές αντίσωμα σε διασπασμένη κασπάση 3 πρωτείνη (Cell Signaling Technology, Boston, ΜΑ) χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η απόπτωση. Ένα δεύτερο στύπωμα western με ταυτόσημες ποσότητες πρωτεΐνη ανιχνεύθηκε με αντίσωμα έναντι β-ακτίνης (Cell Signaling Technology, Boston, ΜΑ).

Καθιέρωση όγκων ποντικού

/c καθορίστηκαν συγγενή ποντίκια BALB όγκους ποντικών με ένεση 2 Χ 10

6 BALB /c κύτταρα όγκου CRL2836 (American Type Cell Culture, Manassas, VA) σε έναν όγκο 0,2 ml (50% Matrigel, 50% 1 Χ PBS) υποδορίως στο αριστερό πίσω και δεξιό πίσω πλευρά. Όλοι οι ποντικοί ήταν γυναίκες, ηλικίας 10 εβδομάδων, και αγοράστηκαν από την Charles River Laboratories (Wilmington, ΜΑ).

32Ρ-Mediated ανάπτυξη του όγκου αναστολή

Μετά από δέκα ημέρες, κατά την διάρκεια του οποίου χρόνου καλά-αγγείωση των όγκων έγινε καθιερωμένη, μια ένεση 5 μθί μονοσφωσφορικής μορφής της

32Ρ (Perkin-Elmer, Cat. # NEX06000, Waltham, ΜΑ) εγχύθηκε ενδοφλεβίως

μέσω

τη φλέβα της ουράς σε 0.1 mL 1 Χ HBSS. Έξι όγκοι (τρία ζώα) μελετήθηκαν για κάθε ομάδα. Μετά την ένεση, η αύξηση του όγκου μετρήθηκε τρεις φορές την εβδομάδα με ένα ψηφιακό παχύμετρο και ο όγκος προσδιορίστηκε με τη χρησιμοποίηση του τύπου: όγκος = ½ (πλάτος)

2 Χ (μήκος). Τα ποντίκια διατηρήθηκαν στο Μηχανισμό Πανεπιστημίου Johns Hopkins, σύμφωνα με τα πρότυπα Εργαστήριο Επιτροπή Ζώων Πόρων υπό την εποπτεία και έγκριση της φροντίδας των ζώων και τη χρήση επιτροπής του Πανεπιστημίου Johns Hopkins Θεσμική (IACUC).

Η στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα από το πολλαπλασιασμό των κυττάρων WST-1 παρουσιάστηκαν ως μέσοι ± τυπική απόκλιση, και η σημαντικότητα προσδιορίσθηκε με τη χρήση

t

δοκιμών του unpaired Student. Οι όγκοι των όγκων των μη επεξεργασμένων και επεξεργασμένων ποντικών εμφανίζονται ως μέσοι ± SE? Δεν ακραίες τιμές αποκλείστηκαν για οποιοδήποτε λόγο. Η σημαντικότητα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το

t

δοκιμή του αταίριαστο του Student.

Αποτελέσματα

Τα κύτταρα που εκτίθενται σε [

32Ρ] PO

4 συγκρίθηκαν με εκείνα που εκτέθηκαν σε πανομοιότυπα μετρήσεις ανά λεπτό της πιο ισχυρό εκπομπού βήτα-σωματιδίων,

90Y, μετά την οποία πραγματοποιήθηκαν δοκιμασίες πολλαπλασιασμού WST-1 κυττάρων (Σχήμα 1). Διαφορετικές κυτταρικές γραμμές αναμένεται να καταδείξουν διαφορετικά επίπεδα ευαισθησίας σε ραδιοϊσότοπα. Η μΟί δόση 1 έδειξε ότι τα κύτταρα HeLa ήταν λιγότερο ευαίσθητα σε ισότοπα βήτα-εκπομπής από κύτταρα ήσαν CRL2836 BALB /c ποντικό, το οποίο δημιουργήθηκε ως ένα οστεοσάρκωμα και απομονώθηκαν αφού είχε κάνει μετάσταση στον πνεύμονα. Τόσο το 2,5 μCi και 5 δόσεις μCi κατέδειξε παρόμοια αποτελέσματα στις δύο κυτταρικές σειρές. Αν και

90Y θα είχε αναμένεται να είναι πιο θανατηφόρα από

32Ρ (με βάση τα υψηλότερα ενέργειας ηλεκτρόνια του),

32Ρ σκότωσε κύτταρα πιο αποτελεσματικά από ό, τι έκανα

90Y. Στις συγκρίσεις των 2,5 μCi και 5 δόσεις μCi, [

32Ρ] PO

4 παράγεται ποσοστά επιβίωσης σε Ημέρα 5 που ήταν μόλις το ήμισυ αυτών που παράγονται από

90Y.

Η WST- 1 δοκιμασία πολλαπλασιασμού έγινε για να προσδιοριστεί το επίπεδο της θανάτωσης κυττάρων από

32Ρ ή

90Y. BALB /c CRL2836 καρκινικά κύτταρα ή κύτταρα HeLa S3 εκτέθηκαν σε 0 Ci, 1 μΟί, 2.5 μCi, ή 5 μΟί σε πλήρες μέσο. Μετά από 24 ώρες, το μέσο αλλάχθηκε και τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μη-ραδιενεργό πλήρες μέσο. WST-1 ανιχνεύσεις πολλαπλασιασμού των κυττάρων έγιναν σε Ημέρες 1, 2, 3, 4, και 5 εις τριπλούν. Η μέση δείχνεται συν /πλην την τυπική απόκλιση. δύο όψεων t-test του φοιτητή καθορίζεται η

P

τιμή που εμφανίζεται.

Η

Οι αναλύσεις H2AX χρησιμοποιήθηκαν για να συγκρίνουν διπλό σκέλος θραύση του DNA σε κύτταρα επωάζονται με

32Ρ

vs

.

90Y (Σχήμα 2) [26,27]. Αυτή η δοκιμασία ανιχνεύει με ακρίβεια θραύση σε δύο κλώνους του DNA στην ίδια γονιδιωματική θέση. Πυρηνική χρώση κυττάρων HeLa S3 αποδειχθεί σημαντική, εξαρτώμενη από τον χρόνο διπλής ίνας θραύση του DNA σε κύτταρα που εκτίθενται σε

32Ρ, ενώ εκείνα που εκτίθενται σε πανομοιότυπα επίπεδα

ακτινοβολία 90Y-based είχαν πολύ λιγότερη ή καθόλου ανιχνεύσιμο DNA διπλής έλικος θραύση. Πέψη με ϋΝάση Ι έδειξε ότι χορηγείται

32Ρ είχαν άμεσα ενσωματωθεί στο κυτταρικό DNA (Σχήμα 3Α). Περισσότερο από το ήμισυ του

32Ρ συγκρατείται από τα κύτταρα που επωάστηκαν με

32Ρ [PO

4] για 24 ώρες και στη συνέχεια καλλιεργούνται σε μη ραδιενεργό μέσο για 48 ώρες πριν από το DNA εκχυλίζεται ήταν μόνιμα ενσωματώνεται στο κυτταρικό DNA. Για να καθοριστεί εάν ο κυτταρικός θάνατος ενέχει την απόπτωση καθώς και νέκρωση, κύτταρα CRL2836 ποντικού ή κύτταρα HeLa S3 επωάστηκαν με διάφορες ποσότητες

32Ρ για 24 ώρες, αντικαθίσταται με μη ραδιενεργό μέσο για επιπλέον 24 ώρες, και τα κύτταρα αναλύθηκαν με Western blot για την παρουσία διασπασμένη κασπάση 3 υποδεικνύοντας την απόπτωση (Εικόνα 3Β). Τα κύτταρα CRL2836 αποδειχθεί καθαρά ότι η απόπτωση που εμπλέκονται στην κυτταρικού θανάτου, ενώ τα κύτταρα HeLa S3 δεν έδειξε ανιχνεύσιμο διασπασμένη κασπάση 3 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αντίσωμα που κατευθύνεται έναντι β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε για να επαληθευτεί η ίση φόρτωση πρωτεϊνών ποσών στα φρεάτια πηκτώματος. κύτταρα HeLa S3 εκφράζουν Ε6 από HPV 18 και καθίστανται ρ53 null οποία αναστέλλει σοβαρά τις λειτουργίες απόπτωσης [28,29].

κύτταρα HeLa S3 ή BALB ποντίκι /c CRL2836 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε πολλαπλά τμήματα διαφανειών θαλάμου και εξετέθησαν σε 0 μCi ή 3 μCi [

32Ρ] PO

4 ή

90Y σε πλήρες μέσο κατά την Ημέρα 0. Μετά από 24 ώρες, το μέσο αλλάχθηκε και τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μη-ραδιενεργό πλήρες μέσο. Κατά την ημέρα 1, 2, ή 3, η παρουσία του δίκλωνα σπασίματα του DNA στα κύτταρα προσδιορίστηκε με χρώση για φωσφορυλιωμένη ιστόνες H2-AX που δείχνουν διπλό σκέλος βλάβη του DNA.

Η

A.

32Ρ άμεσα ενσωματώνεται στο κυτταρικό DNA. Mouse CRL2836 ή ανθρώπινες κυτταρικές σειρές HeLa S3 επωάστηκαν για μια νύχτα με

32Ρ [ΡΟ

4] και στη συνέχεια αναπτύχθηκαν για 48 ώρες σε μη-ραδιενεργό μέσο (λωρίδες 1 έως 4), ή αναπτύχθηκαν για 24 ώρες σε μη ραδιενεργό μέσο, ​​αναπτύχθηκαν επί 24 ώρες με

32Ρ [ΡΟ

4], και στη συνέχεια αναπτύχθηκαν για 24 ώρες σε μη-ραδιενεργό μέσο (διαδρομές 5 έως 8), ή αναπτύχθηκαν για 48 ώρες σε μη-ραδιενεργό μέσο, ​​τότε καλλιεργούνται για 24 ώρες με

32Ρ [PO

4] (λωρίδες 9 έως 12). Τα εκχυλισθέντα νουκλεϊνικά οξέα επωάστηκαν με ϋΝάση Ι, τα προϊόντα της πέψης υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου 5% και εκτέθηκαν σε φιλμ. Β απόπτωση που προκαλείται από

32P στα κύτταρα CRL2836 ποντίκι. κύτταρα Mouse CRL2836 επωάστηκαν με 0, 2,5, 5, 10 ή 20 μCi

32Ρ [ΡΟ

4] για 24 ώρες, και μη ραδιενεργά μέσο προστίθεται για επιπλέον 24 ώρες. Η πρωτεΐνη εκχυλίστηκε από κάθε φρεάτιο και αναλύθηκαν για απόπτωση με κηλίδες Western χρησιμοποιώντας αντίσωμα για να διασπαστεί πρωτείνη κασπάση-3 (λωρίδες 1 έως 5). Αντίσωμα έναντι βήτα-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε για να επαληθεύσει ταυτόσημες ποσότητες πρωτεΐνης φορτώθηκαν (λωρίδες 6 έως 10).

Η

Προηγουμένως, δείξαμε σημαντική αναστολή της HeLa S3 νεοπλασιών κυττάρων ξενομοσχεύματος σε γυμνά ποντίκια με μία μόνο χαμηλή -dose ενδοφλέβια (IV) ένεση [

32Ρ] ΑΤΡ. Εδώ, επιλέξαμε ανοσολογικού συγγενή ποντίκια BALB /c για να ανακεφαλαιώσουμε στενότερα ανθρώπινη κακοήθεια. Μια απλή IV ένεση υδατικών [

32Ρ] PO

4 αναστέλλεται σημαντικά εγκατεστημένος ανάπτυξη συγγενή όγκου σε ποντικούς BALB /c (Σχήμα 4). Δεν υπάρχουν εμφανείς δυσμενείς επιπτώσεις της [

32Ρ] PO

4 συγκρίνοντας το βάρος των ποντικών που υπέστησαν αγωγή με τις ομάδες ελέγχου (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα).

συγγενή ποντίκια BALB /c CRL2836 όγκων καθορίστηκαν οι πίσω πλευρές των ποντικών BALB /c κατά την Ημέρα 0. Μετά από δέκα ημέρες, κατά τις οποίες οι όγκοι έγιναν καλή αγγείωση, οι ποντικοί έλαβαν ένεση 5 μθί [

32Ρ] PO

4 ενδοφλεβίως μέσω της φλέβας της ουράς. Οι όγκοι των όγκων δείχνονται ως μέσος όρος από έξι όγκους μείον /συν το πρότυπο σφάλμα του μέσου όρου. δύο όψεων t-test του φοιτητή καθορίζεται το

P

τιμή που εμφανίζεται. Ένθετο: Εκπρόσωπος της εικόνας σε 35 ημέρες μετά την έγχυση των κυττάρων CRL2836, που δείχνει δύο ποντίκια ελέγχου στα αριστερά, και ένα ποντίκι που έλαβε ένα 5 uCi [

32Ρ] PO

4 δόσεων (δεξιά)

Η.

Συζήτηση

Αυτή η μελέτη τεκμηριώνει την ανακάλυψή μας ότι μια εφάπαξ ενδοφλέβια δόση του

32Ρ ραδιοϊσοτόπων αναστέλλει σημαντικά την ανάπτυξη των προ-εγκατεστημένων όγκων σε μυϊκό συγγενικό μοντέλο, ενώ ταυτόχρονα τη δημιουργία του μηχανισμού στηρίζεται αυτό το αντι -cancer αποτέλεσμα. Συγκεκριμένα, δείχνουμε ότι υδατικού

32Ρ έχει ενσωματωθεί εν τω γεννάσθαι DNA, όπου ισοτοπική ψαλίδια αποσύνθεση δύο κλώνοι, προκαλώντας διπλό σκέλος θραύση όπως αποδεικνύεται από φωσφορυλίωση του ιστόνης Η2-AX.

in vitro

Τα πειράματά μας δείχνουν επίσης ότι το καθαρό β-εκπομπός

32Ρ είναι ανώτερο από το πιο ισχυρό καθαρό βήτα-εκπομπός

90Y στην κυτταροτοξικότητα του όγκου, και, τέλος, ότι η απόπτωση συμβάλλει σε αυτήν την κυτταροτοξικότητα.

Σχήμα 5 απεικονίζει έναν προτεινόμενο μηχανισμό για

32Ρ που προκαλείται θανάτωση κυττάρων. Σε αυτό το σχηματικό,

32Ρ ενσωματώνεται απευθείας εντός ενός κλώνου αναδιπλασιαζόμενο DNA. Ραδιενεργό διάσπαση του

32Ρ σε

32S προκαλεί χημική θραύση του ίδιου κλώνου DNA. Στη συνέχεια, το ηλεκτρόνιο απελευθερώνεται από αυτό το γεγονός αποσύνθεση χρειάζεται να ταξιδέψουν μόνο 2 nm να φθάσει το αντίπλευρο σκέλος της διπλής έλικας, αποκόπτοντας το και προκαλώντας έτσι μια διπλού κλώνου διάλειμμα σε αυτό το γονιδιωματικό τόπο. Ο μηχανισμός αυτός βρίσκεται σε πλήρη αντίθεση με μη-ενσωματωμένη βήτα-εκπομπής ραδιοϊσότοπα, όπου μόνο ένα μικρό κλάσμα των εκπεμπόμενων ηλεκτρονίων ταξιδεύουν στον ακριβή προσανατολισμό αναγκαία η επίτευξη ενός κλώνου συν αντίθετο κλώνο της και να προκαλέσει ένα διάλειμμα διπλού κλώνου DNA [30,31] . Με

32Ρ, η ακραία εγγύτητα του αντίπλευρου κλώνου στόχου προς την αποσύνθεση που παράγεται ηλεκτρόνιο κάνει αυτή διπλό σκέλος θραύση πολύ πιο πιθανό να συμβεί [32].

Το ραδιοϊσότοπο ενσωματώνεται στο ριβόζης-φωσφορικού ραχοκοκαλιά του DNA σε διαιρούμενα κύτταρα. Η διαδικασία της αποσύνθεσης σε θείο (

32S) σπάει τη ραχοκοκαλιά των ομολόγων του αρχικού κλώνου σε ποσοστό 67% και απελευθερώνει ένα σωματίδιο βήτα υψηλής ενέργειας (ηλεκτρονίων) που πρέπει να ταξιδέψουν μόνο δύο nm σε όλη την έλικα στο αντίθετο κλώνο στόχο. Παρά το γεγονός ότι ένα εκπεμπόμενο ηλεκτρόνιο που ταξιδεύει στο τέλειο προσανατολισμό από αυτό

φθορά 32Ρ να διακόψει το αντίθετο σκέλος θα συμβεί μόνο σε ένα μικρό ποσοστό του χρόνου, εξακολουθεί να είναι πολύ υψηλότερη και πιο αποτελεσματική από ό, τι αυτά τα ηλεκτρόνια που παράγονται από άλλα beta -την παραγωγή ραδιοϊσοτόπων πάνω στην κυτταρική επιφάνεια ή στο κυτταρόπλασμα που πρέπει να ταξιδέψει αποστάσεις που είναι συνήθως χίλιες φορές ή περισσότερο μεγαλύτερη σε μήκος.

η

Υδατικό [

32Ρ] PO

4 προσφέρει πολλά πιθανά πλεονεκτήματα έναντι άλλων αντικαρκινικών θεραπευτικών παραγόντων. Πρώτον, επιτρέπει την ταχεία συστημική διανομή και ενσωμάτωση σε πρωτογενείς όγκους και

32Ρ κατά προτίμηση απορροφάται από ταχέως πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα, όπως τα καρκινικά κύτταρα. Επιπλέον, [

32Ρ] PO

4 βελτιώνει την προηγούμενη άμεση έγχυση του σωματιδιακού κολλοειδούς

32Ρ σε πρωτογενείς όγκους, αφού υδατικό [

32Ρ] PO

4 επιτρέπει μια απλή ενδοφλέβια ένεση [33-35].

Δεύτερον,

32Ρ είναι ήδη ένα FDA-εγκεκριμένο φάρμακο, με ένα γνωστό προφίλ χαμηλής τοξικότητας [36]. Προηγούμενες κλινικές μελέτες του

32Ρ-ορθοφωσφορικό [ΡΟ

4] σε υδατικό διάλυμα για αληθή πολυκυτταραιμία και βασική θρομβοκυτταραιμία έχουν δημιουργήσει ανεκτά επίπεδα δόσης, ιδιαίτερα όσον αφορά την μυελοκαταστολή [36]. Στο πλαίσιο αυτό, αξίζει να σημειωθεί ότι δεν υπάρχουν προφανείς τοξικές παρενέργειες εμφανίστηκαν σε οποιοδήποτε από τα συστήματα μοντέλου έχουμε μελετηθεί μέχρι σήμερα. Η άλλη ανησυχία με τη χρήση της σε αυτούς τους καλοήθεις διαταραχές αιματολογικές υπήρξε αυξημένη συχνότητα εμφάνισης των επόμενων οξεία μυελογενή λευχαιμία (AML) [37,38], αλλά σε ασθενείς με προχωρημένους συμπαγείς όγκους αυτό είναι λιγότερο από μια ανησυχία, δεδομένου ότι τα επόμενα AML συμβαίνει μόνο σε 10%

δέκα χρόνια

μετά

θεραπεία 32Ρ [39]. Επιπλέον, αυτή η νέα ένδειξη και μέθοδο χρήσης για υπάρχον φάρμακο εξοικονομεί σημαντικό χρόνο και δαπάνη, σε σχέση με την επένδυση που απαιτείται για νέες αντικαρκινικών παραγόντων.

Τρίτον, σε αντίθεση με άλλα ισότοπα βήτα-εκπομπής, όπως

131I και

90Y,

32Ρ ενσωματώνεται άμεσα στις εν τη γενέσει του DNA [40,41]. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι η ενσωμάτωση αυξάνει δραματικά το κύτταρο-δολοφονία απόδοση των

32Ρ, δεδομένου ότι η διάσπαση των ενσωματωθεί

32Ρ σε θείο σπάει χημικά το πρώτο σκέλος του DNA και το κυκλοφόρησε ηλεκτρόνιο πρέπει να ταξιδέψει μόνο 2 nm να φθάσει ετερόπλευρο κλώνο DNA του. Έτσι, αυτή η διαδικασία προκαλεί αποτελεσματικά διπλής ίνας θραύση του DNA, η οποία απαιτείται για να ξεπεραστεί η έμφυτη οδούς επιδιόρθωσης του DNA και να επιτύχει τον κυτταρικό θάνατο. Σε αντίθεση με

32Ρ, άλλα ισότοπα εκπομπής ηλεκτρονίων (όπως

131I και

90Y) εκπέμπουν ηλεκτρόνια από τις αποστάσεις των 1.000 έως 5.000 nm μακριά από το DNA, μερικά 500- έως 2.500 φορές μακρύτερα από την απόσταση από μια ανώνυμη

32Ρ άτομο από την αδελφή του DNA κλώνο του [42-44].

είναι ενδιαφέρον να σημειωθεί ότι στις αρχές ερευνητές εκτελούν αλληλουχίας Sanger με [

32Ρ] dATP στη δεκαετία του 1980 σημείωσε ότι αλληλουχίας προϊόντα που απαιτούνται ηλεκτροφόρηση εντός δύο ημερών μετά την αντίδραση αλληλούχισης, διαφορετικά συγκροτήματα φάνηκε να διασπείρει και ήταν δύσκολο να ερμηνευθούν [45]. Η ίδια αρχή μπορεί να λειτουργεί με το

32Ρ ως αντικαρκινικός παράγοντας. Η διάσπαση της

32Ρ σε θείο ψαλίδι χημικά το σκέλος του DNA στο οποίο έχει ενσωματωθεί. Υποθέτουμε ότι αυτό το γεγονός, σε συνδυασμό με την εξαιρετικά στενή γειτνίαση του ενσωματωμένου ραδιοϊσότοπο στην αδελφή DNA κλώνο του, οδηγεί σε μια δραματική αύξηση της απόδοσης των κυττάρων-θανάτωσης

vs

. άλλους πομπούς β-σωματιδίων, όπως

131I και

90Y, οι οποίες δεν έχουν ενσωματωθεί εν τη γενέσει του DNA. Οι προκύπτουσες επιπτώσεις για την πιθανή κλινική θεραπεία της πρωτοπαθούς ανθρώπινων όγκων είναι προφανείς και εκτεταμένες.

Ευχαριστίες

Θα θέλαμε να ευχαριστήσουμε τον κ Gilbert Πράσινο για εξειδικευμένη τεχνική βοήθεια για την έγχυση των ποντικιών.