Αφηρημένο

Ιστορικό

Ένας από τους κύριους μηχανισμούς που θα μπορούσαν να παράγουν αντίσταση να αντινεοπλασματικά φάρμακα σε καρκινικά κύτταρα είναι η δεσμευτική κασέτα (ABC) μεταφορείς ΑΤΡ. Οι μεταφορείς ABC μπορεί να μειώσει σημαντικά την ενδοκυτταρική συγκέντρωση της αντινεοπλασματικών φαρμάκων, αυξάνοντας την εκροή τους, μειώνοντας έτσι την κυτταροτοξική δραστικότητα των αντινεοπλασματικών φαρμάκων. Ένα από αυτά τα μεταφορέων, η πολλαπλή ανθεκτική πρωτεΐνη 7 (MRP7, ABCC10), έχει πρόσφατα αποδειχθεί ότι παράγουν αντίσταση σε αντινεοπλασματικά φάρμακα, αυξάνοντας την εκροή του paclitaxel. Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε τις επιδράσεις της BCR-Abl αναστολείς της τυροσινικής κινάσης του imatinib, το nilotinib και το dasatinib σχετικά με τη δραστηριότητα και την έκφραση των MRP7 σε κύτταρα ΗΕΚ293 επιμολυσμένα με MRP7, ορίζεται ΗΕΚ-MRP7-2.

Μεθοδολογία και /ή Κύρια Ευρήματα

Εμείς αναφέρει για πρώτη φορά ότι το imatinib και nilotinib αντιστραφεί MRP7 μεσολάβηση αντίσταση σε πολλά φάρμακα. Τα αποτελέσματά μας ΜΤΤ δοκιμασία έδειξε ότι η έκφραση MRP7 σε κύτταρα ΗΕΚ-MRP7-2 δεν επηρεάσθηκε σημαντικά από επώαση με 5 μΜ του imatinib ή nilotinib για μέχρι 72 ώρες. Επιπλέον, imatinib και nilotinib (1-5 μΜ) παρήγαγε μία σημαντική εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση αναστροφή των MRP7 μεσολάβηση πολυφαρμακευτικής αντίστασης ενισχύοντας την ευαισθησία των κυττάρων ΗΕΚ-MRP7-2 στην πακλιταξέλη και βινκριστίνη. Το imatinib και nilotinib, σε 5 μΜ, αύξησε σημαντικά τη συσσώρευση των [

3Η] -πακλιταξέλη στα κύτταρα ΗΕΚ-MRP7-2. Η επώαση των κυττάρων ΗΕΚ-MRP7-2 με imatinib ή nilotinib (5 μΜ) επίσης ανέστειλε σημαντικά την εκροή του paclitaxel.

Συμπεράσματα

Το imatinib και nilotinib αντίστροφη MRP7 μεσολάβηση αντίσταση πακλιταξέλη, οι περισσότεροι πιθανόν λόγω της αναστολής τους της εκροής του paclitaxel μέσω MRP7. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η imatinib ή nilotinib, σε συνδυασμό με άλλα αντινεοπλασματικά φάρμακα, μπορεί να είναι χρήσιμη στη θεραπεία ορισμένων μορφών καρκίνου ανθεκτική

Παράθεση:. Shen Τ, Kuang YH, Ashby CR Jr, Lei Υ, Chen Α, Zhou Y, et al. (2009) Το imatinib και του nilotinib Αντίστροφη ανθεκτικότητας σε πολλά φάρμακα στα καρκινικά κύτταρα μέσω της αναστολής της εκροής Δραστηριότητα του MRP7 (ABCC10). PLoS ONE 4 (10): e7520. doi: 10.1371 /journal.pone.0007520

Συντάκτης: Debbie Fox, Το Ινστιτούτο Έρευνας για τα παιδιά στο Νοσοκομείο Παίδων Νέα Ορλεάνη, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 11 Ιούνη, 2009? Αποδεκτές: 2η Σεπτεμβρίου, 2009? Δημοσιεύθηκε: 20 Οκτωβρίου του 2009

Copyright: © 2009 Shen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από τα ταμεία της από το Πανεπιστήμιο Έρευνας του Αγίου Ιωάννη Seed Grant Νο 579-1110-7002 (Z.-S. Chen) και Πρωτοβάθμια Φροντίδα Ιατρική Associates, PC (Flushing, NY) επιχορήγηση Νο 582-2082-7601 (Ζ -S. Chen). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Αν και η κλινική χρήση της χειρουργικής επέμβασης, ακτινοβολίας και χημειοθεραπείας έχουν μειωθεί τα ποσοστά υποτροπής του καρκίνου, την κυτταρική αντίσταση σε χημειοθεραπευτικά φάρμακα είναι ένα μείζον εμπόδιο στην θεραπεία του καρκίνου [1], [2]. Η αποτελεσματικότητα της χημειοθεραπείας μπορεί να περιορίζεται λόγω της επίκτητης αντοχής από προηγούμενη θεραπεία. Κατά συνέπεια, ερευνητικές στρατηγικές για την παράκαμψη τέτοια αντίσταση σε καρκινικά κύτταρα έχουν γίνει ένα ρεύμα επίκεντρο για την ανάπτυξη νέων συνδυαστικών χημειοθεραπευτικών στρατηγικών. Τόσο εγγενή και επίκτητη αντίσταση φαρμάκου μπορεί να παράγει πολλές αλλαγές σε διάφορες κυτταρικές οδούς, που οδηγεί σε μείωση της κυτταροτοξικότητας, και έτσι την αποτελεσματικότητα, των αντινεοπλασματικών φαρμάκων [3]. Επομένως, ασθενείς με καρκίνο που λαμβάνουν πολλαπλές θεραπείες μπορεί να γίνει όλο και περισσότερο ευαίσθητη σε χημειοθεραπευτικούς παράγοντες.

Ένα από τα βασικά κυτταρικών μηχανισμών που μπορεί να παράγει αντίσταση στην αντινεοπλαστική θεραπεία περιλαμβάνει την εκροή των φαρμάκων από τα καρκινικά κύτταρα με ειδικά μεταφορείς διαμεμβρανική ή αντλίες [4]. Αυτές οι πρωτεΐνες μεταφορέα προέρχονται από την υπεροικογένεια της κασέτας ΑΤΡ-σύνδεσης (ABC) μεταφορείς που μοιράζονται κοινές δομικές και λειτουργικές ιδιότητες [5]. Ένας αριθμός από μελέτες έχουν δείξει ότι η πλειοψηφία των μελών της οικογένειας C του ABC μεταφορέων είναι πολλαπλά φάρμακα πρωτεΐνες αντίστασης (MRPs), οι οποίες χαρακτηρίζονται από διασταυρούμενη αντοχή σε πολλά συντακτικώς μη συναφών φαρμάκων [2], [4].

Ένας αριθμός μελετών δείχνουν ότι τα καρκινικά κύτταρα που εκφράζουν το ABC C οικογένειας μεταφορέα MRP7 /ABCC10 μπορούν να αναπτύξουν αντίσταση σε διάφορους χημειοθεραπευτικά φάρμακα. Για παράδειγμα, αδενοκαρκίνωμα ανθρώπινου σιελογόνου αδένα (SGA) κύτταρα που υπερεκφράζουν MRP7 mRNA και την οθόνη πρωτεΐνη MRP7 σημαντική αντίσταση σε βινκριστίνη [6]. έκφραση MRP7 έχει επίσης ανοσοϊστοχημικά εντοπιστεί σε ποντίκια που φέρουν όγκο ξενο-μεταμόσχευσις ανθρώπινη SGA μετά από θεραπεία με βινκριστίνη [6]. Επιπλέον, E

217βG, ένας ανταγωνιστικός αναστολέας της MRP7 μεταφοράς, μειώθηκε σημαντικά η συσσώρευση docetaxel σε ανθρώπινα κύτταρα SGA [6]. Σε γενικές γραμμές, οι ενώσεις που είναι αναστολείς της δραστικότητας MRP7 μεταφοράς μετριασμό ή αντίσταση σε καρκινικά κύτταρα που εκφράζουν την πρωτεΐνη MRP7 αντιστρέψει.

Τα κύτταρα MRP7 υπερεκφράζουν προσδίδουν ανθεκτικότητα σε πολλά αντικαρκινικά φάρμακα συμπεριλαμβανομένης paclitaxel, βινκριστίνη και βινβλαστίνη [7]. Πρόσφατες εργασίες ανέφερε επίσης ότι τα κύτταρα MRP7-overexpresssing προσδίδουν αντοχή σε νουκλεοσιδικά ανάλογα και epithilone B [8]. Προηγουμένως, στο εργαστήριο μας, έχουμε δείξει ότι η κεφαρανθίνη, ένα biscoclaurine προερχόμενο αλκαλοειδές, αντιστρέφεται MRP7 μεσολάβηση αντίσταση paclitaxel [9].

αναστολείς τυροσίνης κινάσης (ΤΚΙδ) μπορεί να αντιστρέψει την αντίσταση των καρκινικών κυττάρων να αντινεοπλασματικά φάρμακα μέσω πολλαπλών μηχανισμών. Για παράδειγμα, σε ανθρώπινα κύτταρα SGA, MRP7, P-gp, και MRP1 ήταν όλα ανιχνεύθηκαν μετά από παρατεταμένη έκθεση σε βινκριστίνη [6]. Πρόσφατα, εμείς και άλλοι έχουν αναφέρει ότι ορισμένα από τα TKIs είναι ισχυροί ρυθμιστές της ABC μεταφορέων, συμπεριλαμβανομένων των P-gp και BCRP /ABCG2 [10], [11]. Πρόσφατα αποτελέσματα από το εργαστήριο μας πρότεινε ότι το nilotinib αντιστρέφει σημαντικά Ρ-gp- και BCRP μεσολάβηση MDR [12].

Σε αυτή τη μελέτη, ένας από τους κύριους στόχους ήταν να προσδιοριστούν ενώσεις ΤΚΙ που θα αντιστρέψει MRP7 μεσολάβηση των ναρκωτικών αντίσταση. Κατά συνέπεια, είναι πιθανό ότι TKIs, σε συνδυασμό με άλλα αντινεοπλασματικά φάρμακα, μπορεί να είναι χρήσιμη στη θεραπεία των καρκίνων που εκφράζουν πρωτεΐνες MDR, συμπεριλαμβανομένων των μεταφορέων ABC. Μια σημαντική ανακάλυψη σχετικά με TKIs ήταν ότι ορισμένες αποκαλούμενες «μικρό μόριο» φάρμακα θα μπορούσε να αναστείλει δραστηριότητα ΤΚ με ανταγωνισμό με ΑΤΡ για δέσμευση με την ενδοκυτταρική καταλυτική περιοχή της ΤΚ του υποδοχέα, η οποία παρήγαγε αναστολή διαφόρων κατάντη καταρράκτες σηματοδότησης από αυτοφωσφορυλίωση [13]. Είναι ενδιαφέρον, το imatinib, το nilotinib και το dasatinib είναι αναστολείς της συστάδας ΤΚ σημείο διακοπής περιοχή- Abelson (BCR-ABL) και ΚΙΤ, ένα TK υποδοχέα κατηγορίας III [14] – [18]. Το γονίδιο BCR-Abl συνδέεται με μια απορύθμιση της λειτουργίας ΤΚ και στη συνέχεια οδηγεί σε κακοήθη μετασχηματισμό σε χρόνια μυελογενή λευχαιμία (CML) [19], [20]. Η αναγνώριση των BCR-Abl γονιδίου και αντίστοιχη πρωτεΐνη του έχει οδηγήσει στην ανάπτυξη φαρμάκων μικρού μορίου έχουν σχεδιαστεί για να μπλοκάρουν την ενεργοποίηση του BCR-Abl TKIs μέσω ανταγωνιστικών πρόσδεσης στην θέση δέσμευσης ΑΤΡ [19]. Συνολικά, ο πρωταρχικός στόχος αυτής της μελέτης ήταν να καθοριστεί εάν η BCR-ABL TKIs θα μπορούσε να αντιστρέψει MRP7 μεσολάβηση MDR.

Υλικά και Μέθοδοι

2.1. Οι κυτταρικές σειρές

ΗΕΚ293 κύτταρα και το cDNA MRP7 ήταν γενναιόδωρα από τον Dr. Gary Kruh (Πανεπιστήμιο του Ιλινόις στο Σικάγο, Chicago, IL). Τα επιμολυσμένα κύτταρα ΗΕΚ-MRP7-2 και κενό φορέα επιμολυσμένα κύτταρα ΗΕΚ293-pcDNA3.1 καθιερώθηκαν από κύτταρα ΗΕΚ293 μέσω ηλεκτροδιάτρησης [9]. Το γονικό κύτταρο ανθρώπινου επιδερμοειδούς καρκινώματος γραμμή φάρμακο-ευαίσθητες ΚΒ-3-1 και τα αντίστοιχα P-gp υπερεκφράζουν κυτταρική γραμμή του ΚΒ-C2 προσεφέρθησαν ευγενώς από τους Drs. Gottesman (NCI, Bethesda, MD) και Akiyama (Kagoshima University, Japan), αντιστοίχως. Τα κύτταρα ΚΒ-C2 καθιερώθηκαν από ΚΒ-3-1 κύτταρα με την έκθεσή τους σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις κολχικίνης σε σταδιακή σταδιακό τρόπο (έως 2 μg /ml) και συλλογή των κυττάρων που ήταν ανθεκτικά [20]. Όλες αυτές οι κυτταρικές γραμμές αναπτύχθηκαν ως μονοστοιβάδες προσκολλημένα σε φιάλες με τροποποιημένο μέσο Eagle του Dulbecco (DMEM) συμπληρωμένο με 10% βόειο ορό, 2 mM γλουταμίνη, 100 μονάδες /ml πενικιλίνη, και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη υπό τυπικές συνθήκες καλλιέργειας κυττάρων σε μια υγροποιημένο επωαστή που περιέχει 5% CO

2 στους 37 ° C.

2.2. Υλικά |

DMEM, βόειο ορό και πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη αγοράσθηκαν από τη Hyclone (Logan, UT). Το nilotinib (Tasigna®) (Σχ. 1 Β) ελήφθη ως δώρο από τη Novartis φαρμακευτικά προϊόντα (Basel, Ελβετία). Imatinib (Εικ. 1Α) και dasatinib (Εικ. 1C) αγοράστηκαν από ChemieTeck Inc. (Indianapolis, ΙΝ). Η πακλιταξέλη, βινκριστίνη, δοξορουβικίνη, κολχικίνη, φθοριούχο ρ-aminophenylmethylsulfonyl, αλβουμίνη βόειου ορού, διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) και 1- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -3,5-diphenylformazan (ΜΤΤ), το αντίσωμα κατσίκας πολυκλωνικό κατά MRP7 (C-19), η μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού έναντι της P-gp (P7965), η δευτερεύουσα υπεροξειδάση αρμορακίας-επισημασμένο αντι-κατσίκας ή IgG αντι-ποντικού αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, ΜΟ) . Ένα πολυκλωνικό αντίσωμα εναντίον ανθρώπινου MRP1 /ABCC1 παρασχέθηκε ευγενώς από τον Dr. Akiyama (Πανεπιστήμιο Kagoshima, Ιαπωνία) [21]. Ένα μονοκλωνικό αντίσωμα BXP-34 έναντι BCRP αποκτήθηκε από Signet Laboratories Inc. (Dedham, ΜΑ). [

3Η] -πακλιταξέλη (45 μCi /mmol) αγοράστηκε από Moravek Biochemicals (Brea, CA).

Η

2.3. Παρασκευή κυτταρικής λύσης

Συρρέοντα κύτταρα μονοστιβάδας σε Τ-25 φιάλη συλλέχθηκαν και ξεπλύθηκαν δύο φορές με ψυχρό PBS. Τα κυτταρικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό δοκιμασίας Ραδιοανοσοκαθίζηση [1 × PBS, 1% Nonidet Ρ-40, 0.5% δεοξυχολικό νάτριο, 0.1% SDS, 100 μΜ ρ-ΑΡΜδΡ, 10 μΜ leupeptin, και 10 μΜ απροτινίνης] για 30 λεπτά σε πάγο με περιστασιακή κουνιστή που ακολουθείται από φυγοκέντρηση στις 12.000 rpm στους 4 ° C για 15 λεπτά. Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης των κυτταρολυμάτων προσδιορίστηκαν με την δοκιμασία πρωτεΐνης Bradford [22]. Το υπερκείμενο που περιέχει συνολική κυτταρολύματα συλλέχθηκαν και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C μέχρι τη χρήση.

2.4. Ανοσοκηλίδωση

Ίση ποσότητα του ολικού κυτταρολυμάτων (40 μg) αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση 4-12% δωδεκυλοθειϊκού νατρίου polycrylamide γέλης (SDS-PAGE) και μεταφέρθηκαν ηλεκτροφορητικά σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης [23]. Τα κυτταρολύματα μετουσιώθηκαν σε 100 ° C ποτήρι νερό για 5 λεπτά πριν από τη φόρτωση επί του 4-12% SDS-PAGE. Η πηκτή έτρεξε στο ρυθμιστικό ηλεκτροφόρησης SDS (25 mM Tris βάση, 0.192 Μ γλυκίνη, 1% SDS) σε 170 V για 2 ώρες. Η μεταφορά διεξήχθη σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα μεταφοράς (25 mM βάση Tris, 0.192 Μ γλυκίνη, ρΗ 8,3) στους 30 V για 2 ώρες. Η μεμβράνη νιτροκυτταρίνης στη συνέχεια εμβαπτίζεται σε 5% αποβουτυρωμένο γάλα για να εμποδίσει μη ειδικής δέσμευσης για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Η μεμβράνη στη συνέχεια ανοσοστυπώθηκαν όλη την νύχτα με πρωτεύοντα αντισώματα (πολυκλωνικά ή μονοκλωνικά MRP7 P-gp και αντισώματα BCRP σε 1:500 και πολύκλωνα MRP1 σε 1:3,000) στους 4 ° C. Την επόμενη ημέρα, η μεμβράνη πλύθηκε τρεις φορές με ρυθμιστικό TBST (0,3% Tris, 0,8% NaCl, 0,02% KCI, 0,05% Tween 20) που ακολουθείται από τριών ωρών επώαση με δευτερογενή αντισώματα του πολυκλωνικού αντι-MRP7 ή μονοκλωνικά αντι- P-gp στο 1:1000. Το σύμπλεγμα πρωτεΐνης-αντισώματος μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα ενισχυμένο σύστημα ανίχνευσης χημειοφωταύγειας (Amersham, NJ). Η μεμβράνη στη συνέχεια εκτίθεται σε φιλμ για την ανάπτυξη. Η ακτίνη που χρησιμοποιείται συμβατικά έλεγχος φόρτωσης χρησιμοποιήθηκε για να ανιχνεύσει ίση φόρτωση σε κάθε λωρίδα στα δείγματα που παρασκευάστηκαν από προϊόντα λύσεως κυττάρων.

2.5. Ανάλυση της ευαισθησίας φαρμάκου

Η

ευαισθησία φαρμάκου αναλύθηκε χρησιμοποιώντας μια ελαφρώς τροποποιημένη ΜΤΤ χρωματομετρική δοκιμασία [23]. Άδειο φορέα επιμολυσμένα κύτταρα ΗΕΚ293-pcDNA3.1 και MRP7-επιμολυσμένα κύτταρα ΗΕΚ293-MRP7-2 σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων εις τριπλούν στα 5000 κύτταρα /φρεάτιο. Μετά από επώαση σε DMEM συμπληρωμένο με 10% βόειο ορό στους 37 ° C για 24 ώρες, τα αντινεοπλασματικά φάρμακα αραιώθηκαν σε διάφορες συγκεντρώσεις και επωάστηκαν με τα κύτταρα συνεχώς για 72 ώρες. Οι πιθανοί αναστολείς προστέθηκαν 1 ώρα πριν από την προσθήκη των αντικαρκινικών φαρμάκων.

Μετά την επώαση φαρμάκου 72 h, 20 μΐ ΜΤΤ (4 mg /ml) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και η πλάκα επωάστηκε περαιτέρω για 4 ώρες, επιτρέποντας βιώσιμα κύτταρα να αναπτυχθούν από το κίτρινο χρώμα ΜΤΤ σε σκούρο μπλε κρυστάλλους φορμαζάνης. Στη συνέχεια, το μέσο απομακρύνθηκε ήπια χωρίς ανάδευση του συγκολλητικού μονοστοιβάδα κυττάρων, και 100 μΐ DMSO προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο για να διαλυθούν οι κρύσταλλοι φορμαζάνης. Οι πλάκες ανακινείται καλά για 5 λεπτά, και ένα αναγνώστη μικροπλάκας OpSys διαβάσει την απορρόφηση στα 570 nm από DYNEX Technologies Inc. (Chantilly, VA). Ο βαθμός αντίστασης υπολογίστηκε διαιρώντας το IC

50 για τα κύτταρα MDR με εκείνη των γονικών κυττάρων, ότι ο βαθμός της αναστροφής MDR υπολογίστηκε διαιρώντας το IC

50 των κυττάρων με το αντικαρκινικό φάρμακο στην απουσία αναστολέα από αυτή που λαμβάνεται με την παρουσία του αναστολέα. Οι συγκεντρώσεις που απαιτούνται για την αναστολή της ανάπτυξης κατά 50% των κυττάρων ελέγχου υπολογίστηκαν από καμπύλες επιβίωσης χρησιμοποιώντας την μέθοδο Bliss [23].

Τα αντινεοπλασματικά φάρμακα που χρησιμοποιούνται περιλαμβάνονται η πακλιταξέλη, βινκριστίνη και δοξορουβικίνη σε διάφορες συγκεντρώσεις έως και μια τελική συγκέντρωση 10, 1, και 1 μΜ, αντίστοιχα. Η BCR-Abl TKIs, όπως nilotinib και το imatinib, χρησιμοποιήθηκαν στη συνέχεια σε μη τοξικές συγκεντρώσεις των 1, 2.5 και 5 μΜ για τον έλεγχο κατά βινκριστίνη και δοξορουβικίνη. Σε αυτή τη μελέτη, επιλέξαμε πρώτα ένα ενιαίο μη τοξική δόση (5 μΜ) για να εξετασθούν τα αποτελέσματα του TKIs επί MRP7 μεσολάβηση αντίσταση στην πακλιταξέλη. Μόλις καθοριστεί και η οποία TKIs είχε την πιο σημαντική επίδραση αντιστροφή, όπως imatinib και nilotinib, μπορούμε στη συνέχεια επιλέγονται τρεις συγκεντρώσεις (1, 2.5 ή 5 μΜ) για κάθε ΤΚΙ να διαπιστωθεί αν εφέ ανατροπή τους ήταν εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση στην πακλιταξέλη, βινκριστίνη και δοξορουβικίνη .

2.6. συσσώρευσης του φαρμάκου και εκροής

Τα ΗΕΚ293-pcDNA3.1 γονικά κύτταρα και κύτταρα ΗΕΚ-MRP7-2 επιμολυσμένα κύτταρα σπάρθηκαν σε δύο φιάλες Τ75 και επωάζονται με ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% βόειο ορό στους 37 ° C. Μετά τα κύτταρα ήταν 60 έως 95% συρρέοντα, κάθε αναστολέας προστέθηκε σε χωριστές φιάλες και τα κύτταρα επωάστηκαν για 1 ώρα. Τα κύτταρα στη συνέχεια σε επεξεργασία με θρυψίνη και δύο κλάσματα (48 × 10

6 κύτταρα) από κάθε κυτταρική γραμμή εναιωρήθηκαν στο μέσο. Ακολούθως, τα κύτταρα εναιωρούνται στο μέσο που περιέχει [

3Η] -πακλιταξέλη σε συγκέντρωση 0,1 μΜ με ή χωρίς την nilotinib TKIs και imatinib (5 μΜ) για 1 ώρα στους 37 ° C. Μία ώρα αργότερα, το μέσο επώασης αντικαταστάθηκε από το μέσο που περιέχει την TKIs χωρίς paclitaxel. Κλάσματα (1 × 10

6 κύτταρα) συνελέγησαν σε διάφορα χρονικά σημεία (0, 20, 60, και 120 λεπτά). Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν με παγωμένο PBS και κάθε δείγμα τοποθετήθηκε σε υγρό σπινθηρισμού για τη μέτρηση της ραδιενέργειας σε έναν μετρητή Packard TRI-CARB 1900CA υγρού σπινθηρισμού από την Packard Instrument Inc. (Downers Grove, IL).

2.7. Στατιστική ανάλυση

Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές και οι διαφορές προσδιορίστηκαν με t-test δύο ουρών Student. Η a priori στατιστικής σημαντικότητας ορίστηκε στο

P

& lt?. 0.05

Αποτελέσματα

3.1. Έκφραση MRP7 σε ΗΕΚ293-pcDNA3.1 και τα κύτταρα ΗΕΚ-MRP7-2

Σε αυτή τη μελέτη, οι δύο κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιήθηκαν ήταν ΗΕΚ293 κύτταρα επιμολυσμένα με είτε τον φορέα έκφρασης MRP7 ή τον έλεγχο κενό φορέα (pcDNA3.1 ). ανάλυση ανοσοκηλίδος διεξήχθη για να ανιχνεύσει το επίπεδο έκφρασης της πρωτεΐνης MRP7 στις προαναφερθείσες γραμμές. πρωτεΐνη MRP7 (ΜΒ 171 kD) εκφράστηκε σε κύτταρα ΗΕΚ-MRP7-2, αλλά όχι σε κύτταρα ΗΕΚ293-pcDNA3.1 (Εικ. 2Α). P-gp, με ένα μοριακό βάρος από 170 kD, ανιχνεύθηκε στα θετικές κυτταρικές γραμμές ελέγχου ΚΒ-C2, αλλά όχι στην ΚΒ-3-1, ΗΕΚ293-pcDNA3.1 ή ΗΕΚ-MRP7-2 κυτταρικές σειρές αρνητικού ελέγχου ( Σχ. 2Β). Μπορούμε επίσης διεξήγαγε πειράματα κηλίδος Western για να προσδιοριστεί εάν MRP1 και BCRP εκφράστηκαν σε κύτταρα ΗΕΚ293-pcDNA3.1 και ΗΕΚ-MRP7-2. Τα επίπεδα του MRP1 και BCRP στα δύο κύτταρα ΗΕΚ-MRP7-2 και κύτταρα ΗΕΚ293-pcDNA3.1 ήταν μη ανιχνεύσιμα. Τα ευρήματα αυτά είναι σημαντικά, όπως τυχόν ενέργειες που παρατηρήθηκαν με τους αναστολείς είναι απίθανο να οφείλεται στην αλληλεπίδρασή τους με P-gp, MRP1 και /ή BCRP.

(Α) Έκφραση MRP7 στην ΗΕΚ293-pcDNA3.1 ( λωρίδα 1) και τα κύτταρα MRP7-επιμολυσμένα (λωρίδα 2). (Β) Έκφραση της Ρ-gp σε ΗΕΚ293-pcDNA3.1 (λωρίδα 1), ΗΕΚ-MRP7-2 (λωρίδα 2), ΚΒ-3-1 (λωρίδα 3) και ΚΒ-C2 κύτταρα (λωρίδα 4). (C) Επίδραση 5 μΜ του imatinib στο επίπεδο έκφρασης του MRP7 (ΗΕΚ-MRP7-2) για 36 και 72 ώρες, αντίστοιχα. (D) Επίδραση 5 μΜ του nilotinib στο επίπεδο έκφρασης του MRP7 (ΗΕΚ-MRP7-2) για 36 και 72 ώρες, αντίστοιχα. Ίσες ποσότητες (40 μg πρωτεΐνης) των συνολικών κυτταρικού λύματος χρησιμοποιήθηκαν για κάθε δείγμα. Οι μεμβράνες νιτροκυτταρίνης ανοσοστυπώθηκαν με πρωτογενές αντίσωμα έναντι MRP7 ή ακτίνης στο 1:500 αραίωση, ή P-gp στο 1:500 αραίωση σε 4 ° C όλη τη νύκτα, και στη συνέχεια επωάστηκαν με συζευγμένο με HRP δευτερογενές αντίσωμα στο 1:1000 αραιώσεις σε θερμοκρασία δωματίου για 3 ώρες.

η

για να αξιολογηθεί η επίδραση του imatinib /nilotinib στην έκφραση της MRP7, τα κύτταρα ΗΕΚ-MRP7-2 επωάστηκαν με 5 μΜ του imatinib ή nilotinib για 36 και 72 ώρες, αντίστοιχα . Η επώαση των κυττάρων ΗΕΚ-MRP7-2 με imatinib ή nilotinib δεν μετέβαλε σημαντικά την έκφραση των επιπέδων πρωτεΐνης του MRP7 σε διαφορετικά χρονικά σημεία (Σχ. 2C και D). Αυτό υποδηλώνει ότι η επίδραση των αναστολέων στην απόκριση των κυττάρων στους αντικαρκινικά φάρμακα δεν οφείλεται στην ρύθμιση της έκφρασης MRP7.

3.2. Ανάλυση της ευαισθησίας φαρμάκου του MRP7 επιμολυσμένα κύτταρα ΗΕΚ293

Για να προσδιοριστεί το προφίλ ανθεκτικότητας στα φάρμακα της MRP7, την ευαισθησία των ΗΕΚ-MRP7-2 επιμολυσμένων κυττάρων σε συγκεκριμένα αντινεοπλασματικά φάρμακα συγκρίθηκε με εκείνη του ελέγχου φορέα μόνο κύτταρα, ΗΕΚ293-pcDNA3.1. Τα κύτταρα ΗΕΚ-MRP7-2 παρουσίασαν σημαντικά υψηλότερο επίπεδο ανθεκτικότητας σε πακλιταξέλη και βινκριστίνη (9.5- και αντίσταση 6,7 φορές σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου, αντίστοιχα) (Πίνακας 1). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η κυτταρική γραμμή ΗΕΚ-MRP7-2 ήταν σε θέση να παρέχουν ανθεκτικότητα σε διάφορα αντινεοπλασματικά φάρμακα, το οποίο είναι σύμφωνο με προηγούμενη αναφορά μας [9].

Η

3.3. Η επίδραση της TKIs στην ευαισθησία του MRP7 επιμολυσμένα κύτταρα ΗΕΚ293 σε αντικαρκινικά φάρμακα

Δοκιμάσαμε διάφορους BCR-Abl TKIs για να προσδιοριστεί αν θα μπορούσε να αντιστρέψει την αντοχή των κυττάρων ΗΕΚ293 που υπερεκφράζουν MRP7 στο αντινεοπλαστικό φάρμακο πακλιταξέλη και βινκριστίνη. Το μέγεθος της αναστροφής που παράγεται από το ΤΚΙδ στην πακλιταξέλη ήταν μεταβλητή (Πίνακας 1? Εικ. 3). Η προεπώαση των κυττάρων με imatinib ή nilotinib, σε 2,5 μΜ, ανέστρεψε σημαντικά την αντίσταση των κυττάρων ΗΕΚ-MRP7-2 στην πακλιταξέλη (Πίνακας 1, Σχ. 3Α και 3Β). Το imatinib και nilotinib παρήγαγε μια αντιστροφή 6.9- και 13.0-φορές, αντίστοιχα, της αντοχής σε paclitaxel. Το IC

50 του paclitaxel σε κύτταρα ΗΕΚ-MRP7-2 συν-καλλιεργήθηκαν με 2.5 μΜ nilotinib μειώθηκε σημαντικά από 207,0 ± 19,7 ηΜ έως 15.9 ± 0.9 ηΜ, και αυτή ήταν σημαντικά χαμηλότερη από εκείνη του paclitaxel στην ομάδα ελέγχου (21,9 ± 1,9 ηΜ). Η αντίσταση στην πακλιταξέλη αντιστράφηκε πλήρως όταν το imatinib συν-επωάστηκαν με πακλιταξέλη σε κύτταρα ΗΕΚ-MRP7-2. Ένα σημαντικά μεγαλύτερο αντιστροφή ελήφθη στις 5 μΜ (12,4-πλάσια) σε σύγκριση με τη συγκέντρωση 1 μΜ (4,7 φορές). Imatinib, στα 5 μΜ, αύξησε επίσης την ευαισθησία των κυττάρων σε πακλιταξέλη σε κύτταρα ΗΕΚ293-pcDNA3.1 κατά 2,2 φορές, αν και αυτό το αποτέλεσμα σε ΗΕΚ293-pcDNA3.1 ήταν σημαντικά χαμηλότερη από ότι στα επιμολυσμένα κύτταρα MRP7 (12,5 φορές) (Τραπέζι 1). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το imatinib BCR-Abl TKIs και nilotinib εξασθενημένα σημαντικά την αντίσταση στην πακλιταξέλη διαμεσολαβείται από MRP7. Αν και η συν-επώαση του ΗΕΚ293-pcDNA3.1 (κύτταρα ελέγχου) με nilotinib και πακλιταξέλη ενίσχυσαν επίσης την ευαισθησία στην πακλιταξέλη (α 2.5-φορές μετατόπιση σε κύτταρα ΗΕΚ293-pcDNA3.1), αυτή η αυξημένη ευαισθησία ήταν σημαντικά χαμηλότερη από εκείνη που προσδιορίζεται για τα MRP7 επιμολυσμένα κύτταρα (Πίνακας 1? Εικ. 3C). Αντίθετα, ένα άλλο BCR-Abl ΤΚΙ, dasatinib σε 2,5 μΜ, δεν αύξησε σημαντικά την ευαισθησία paclitaxel είτε ΗΕΚ293-pcDNA3.1 ή κυττάρων ΗΕΚ-MRP7-2 (Πίνακας 1, Σχ. 3C).

Δύο οι κυτταρικές σειρές, ΗΕΚ293-pcDNA3.1 και ΗΕΚ-MRP7-2, εκπροσωπήθηκαν ως ΗΕΚ293 και MRP7, αντίστοιχα. Μετά τη σπορά και την καλλιέργεια κυττάρων για 24 ώρες, ίσες ποσότητες PBS ή παραγόντων αναστροφής προστέθηκαν σε κύτταρα ΗΕΚ293-pcDNA3.1 (δείχνεται ως και, αντίστοιχα) και τα κύτταρα ΗΕΚ-MRP7-2 (δείχνεται ως και, αντίστοιχα) 1 ώρα πριν η προσθήκη του paclitaxel. Οι διάφορες συγκεντρώσεις πακλιταξέλης δεικνύονται στο σχήμα. Η τελική συγκέντρωση για το imatinib, το nilotinib ή το dasatinib ήταν 2,5 μΜ. Το παραπάνω σχήμα δείχνει ένα αντιπροσωπευτικό αποτέλεσμα για το imatinib, το nilotinib ή dasatinib.

Η

Εκτός από την πακλιταξέλη, εξετάσαμε επίσης την επίδραση της επιλεγμένης TKIs να ευαισθητοποιήσει κύτταρα σε ένα άλλο αντικαρκινικό φάρμακο, βινκριστίνη. Παρόμοια με τα ευρήματα με πακλιταξέλη, nilotinib και το imatinib (1, 2,5 και 5 μΜ) αναστραφεί σημαντικά MRP7 μεσολάβηση αντίσταση βινκριστίνη (2.1-, 6.8- και 9,0-φορές, αντίστοιχα, για το nilotinib? 2.4-, 6.9- και 8.2-φορές , αντίστοιχα, για το imatinib) σε συγκέντρωση-εξαρτώμενο τρόπο (Πίνακας 1). Εξετάσαμε επίσης την απόκριση των κυττάρων MRP7-επιμολυσμένα με ένα άλλο αντικαρκινικό φάρμακο, δοξορουβικίνη, με την παρουσία του imatinib, όπως η δοξορουβικίνη δεν είναι υπόστρωμα του MRP7 [23]. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι imatinib (1, 2,5 και 5 μΜ) δεν ευαισθητοποιεί σημαντικά την απόκριση του ελέγχου γονικών κυττάρων ΗΕΚ293-pcDNA3.1, ή αντίστροφη αντίσταση σε ΗΕΚ-MRP7-2 επιμολυσμένα κύτταρα, (Πίνακας 1) στη δοξορουβικίνη. Αυτό δείχνει ότι η απάντηση σε αυτές τις TKIs ήταν ειδική για MRP7, όπως η δοξορουβικίνη δεν είναι ένα υπόστρωμα για MRP7 και συνεπώς δεν θα μεσολαβήσει δοξορουβικίνη εκροή. Η δοξορουβικίνη είναι ένα υπόστρωμα της P-gp, MRP1 και BCRP, αλλά ούτε imatinib ούτε nilotinib αυξήθηκε σημαντικά η ευαισθησία δοξορουβικίνη των κυττάρων ΗΕΚ-MRP7-2, γεγονός που υποδηλώνει ότι η P-gp, MRP και BCRP δεν συμβάλλουν σημαντικά στην αντίσταση στα φάρμακα των HEK- MRP7-2.

σε γενικές γραμμές, το imatinib και nilotinib αντιστραφεί σημαντικά MRP7 μεσολάβηση αντίσταση στην πακλιταξέλη και βινκριστίνη, αλλά όχι δοξορουβικίνη. Επιπλέον, αυτή η αντιστροφή ήταν εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση (Πίνακας 1? Εικ. 3). Παρά το γεγονός ότι μια αύξηση στην ευαισθητοποίηση των κυττάρων ελέγχου ΗΕΚ293-pcDNA3.1 συνέβη κατά την έκθεση στο nilotinib ή imatinib, αυτή η επίδραση ήταν σημαντικά χαμηλότερη από εκείνη που προσδιορίζεται για τους ΗΕΚ-MRP7-2 επιμολυσμένα κύτταρα (Πίνακας 1? Εικ. 3).

3.4. Τα αποτελέσματα του imatinib και nilotinib για την ενδοκυτταρική συσσώρευση και εκροή του [

3Η] -πακλιταξέλη

Προκειμένου να καθοριστεί ο μηχανισμός με τον οποίο το imatinib και nilotinib ξεπεραστούν ή να αντιστρέψει MRP7 μεσολάβηση αντίσταση πακλιταξέλη, η επίδρασή τους στις η συσσώρευση των [

3Η] -πακλιταξέλη στα κύτταρα MRP7-επιμολυσμένα εξετάστηκε. Η ενδοκυτταρική συγκέντρωση της [

3Η] -πακλιταξέλη σε κύτταρα ΗΕΚ-MRP7-2 ήταν 30% αυτής που συσσωρεύτηκαν από τα κύτταρα ΗΕΚ293-pcDNA3.1 (Εικ. 4). Η συσσώρευση του paclitaxel ήταν σημαντικά αυξημένη (1,9 φορές) σε κύτταρα ΗΕΚ-MRP7-2 (Ρ & lt? 0,05) μετά από επώαση των κυττάρων είτε με imatinib ή nilotinib σε συγκέντρωση 5 μΜ. Σε κύτταρα ΗΕΚ293-pcDNA3.1, imatinib, αλλά δεν nilotinib, είχε ως αποτέλεσμα μια μικρή αύξηση στην ενδοκυτταρική συγκέντρωση του [

3Η] -πακλιταξέλη, αλλά αυτή η ευαισθητοποίηση ήταν μέτρια σε σύγκριση με την επίδραση του imatinib σε ΗΕΚ-MRP7- 2 κύτταρα.

Οι ενδοκυτταρικές συσσωρεύσεις paclitaxel σε ΗΕΚ293-pcDNA3.1 και τα κύτταρα ΗΕΚ-MRP7-2 μετρήθηκαν μετά την επώαση με 0.1 μΜ paclitaxel. Η ενδοκυτταρική συσσώρευση του paclitaxel σε κύτταρα ΗΕΚ293-pcDNA3.1 απουσία imatinib και nilotinib παρουσιάστηκαν στις αριστερές ράβδοι (▪). Η ενδοκυτταρική συσσώρευση του paclitaxel παρουσία 5 μΜ imatinib σε κύτταρα ΗΕΚ293-pcDNA3.1 δείχθηκε στα δεξιά (□). Η ενδοκυτταρική συσσώρευση του paclitaxel σε κύτταρα ΗΕΚ-MRP7-2 παρουσία 5 μΜ nilotinib δείχθηκε στα δεξιά (). Κάθε στήλη αντιπροσωπεύει τα μέσα (± SD). Όλα τα πειράματα έγιναν εις τριπλούν. * Ρ & lt? 0,05, δοκιμασία t του Student

Η

Με βάση τα παραπάνω αποτελέσματα, είναι πιθανό ότι η αύξηση της ενδοκυτταρικής paclitaxel που παράγεται από το imatinib και nilotinib θα μπορούσε να οφείλεται σε: (1) μία μείωση της. εκροή του paclitaxel και /ή (2) την αύξηση της πρόσληψης του paclitaxel. Ως εκ τούτου, ο επόμενος πείραμα διεξήχθη για να προσδιοριστεί εάν η αύξηση της συσσώρευσης paclitaxel που παράγεται από imatinib και nilotinib οφειλόταν σε μια αναστολή της πακλιταξέλης εκροής. Τα κύτταρα ΗΕΚ-MRP7-2 και κύτταρα ΗΕΚ293-pcDNA3.1 επωάστηκαν με πακλιταξέλη και χρονική πορεία για ενδοκυτταρική συσσώρευση του φαρμάκου προσδιορίστηκε (Εικ. 5). Όπως ήταν αναμενόμενο, τα κύτταρα ΗΕΚ-MRP7-2 κυκλοφόρησε ένα σημαντικά υψηλότερο ποσοστό των συσσωρευμένων paclitaxel σε σύγκριση με κύτταρα ΗΕΚ293-pcDNA3.1, και το ποσό της πακλιταξέλης που effluxed αυξήθηκε με τον χρόνο. Η συσσώρευση πακλιταξέλης σε 0 λεπτά της εκροής φαρμάκου ορίστηκε ως 1. Στα 60 λεπτά, σε κύτταρα επωάστηκαν σε μέσο ελεύθερο φαρμάκου, -60% της σωρευμένης paclitaxel εξήχθη από κύτταρα ΗΕΚ-MRP7-2 απουσία imatinib ή nilotinib . Αντιθέτως, σχεδόν όλη η πακλιταξέλη ήταν παρούσα μέσα στα κύτταρα ΗΕΚ-MRP7-2 επωάζονται με imatinib ή nilotinib σε μια τελική συγκέντρωση 5 μΜ για διαφορετικές χρονικές περιόδους. Για τα κύτταρα ελέγχου, η συγκέντρωση της πακλιταξέλης υποβάλλεται σε εκροή αυξήθηκε επίσης με το χρόνο, αλλά το επίπεδο της εκροής ήταν μόνο ελαφρώς μικρότερη από αυτή που παρατηρήθηκε σε κύτταρα επιμολυσμένα με MRP7. Σε αντίθεση, στα κύτταρα HE293-pcDNA3.1, ~ 30% της πακλιταξέλης που απελευθερώνεται μετά από 60 λεπτά υπό την απουσία των ενώσεων δοκιμής. Η επώαση των ΗΕΚ293-pcDNA3.1 κυττάρων με imatinib ή nilotinib (5 μΜ) ανέστειλαν επίσης την εκροή του paclitaxel, αν και το μέγεθος της επίδρασης ήταν σημαντικά χαμηλότερη από εκείνη που παρατηρήθηκε για τα κύτταρα ΗΕΚ-MRP7-2.

το ποσοστό του paclitaxel απελευθερώνεται απεικονίστηκε γραφικά ως συνάρτηση του χρόνου. Μετά από 1 ώρα επώασης του TKIs, [

3Η] -πακλιταξέλη συν-επωάζονται σε ΗΕΚ293-pcDNA3.1 με ΤΚΙ () ή χωρίς ΤΚΙ (), και εν τω μεταξύ σε κύτταρα ΗΕΚ-MRP7-2 με ΤΚΙ () ή χωρίς ΤΚΙ (). Τα κύτταρα πλύθηκαν και επανα-επωάστηκαν στο paclitaxel μέσο ελεύθερο. Στα χρονικά σημεία των 0 λεπτά, 20 λεπτά, 60 λεπτά και 120 λεπτά, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και τα επίπεδα του [

3Η] -πακλιταξέλη προσδιορίσθηκαν με απαρίθμηση σπινθηρισμού. Οι τιμές στα 0 λεπτά της εκροής φαρμάκου ορίστηκαν ως 1 για σύγκριση με τιμές που έχουν μετρηθεί από άλλα χρονικά σημεία. Κάθε σημείο αντιπροσωπεύει το μέσο (± SD) των τριών χωρίζονται πειράματα που γίνονται με τη χρήση τριπλούν δείγματα.

Η

Συζήτηση

Αυτή η μελέτη ήταν η πρώτη για τον εντοπισμό ότι το imatinib BCR-ABL TKIs και nilotinib , αλλά όχι dasatinib, μπορούσε να αντιστρέψει MRP7 μεσολάβηση MDR σε συγκέντρωση-εξαρτώμενο τρόπο.

ΗΕΚ293 κύτταρα επιμολυσμένα με το MRP7 ανασυνδυασμένο γονίδιο ΗΕΚ-MRP7-2 και κύτταρα ΗΕΚ293-pcDNA3.1 επιμολυσμένα με άδειο φορέα, χρησιμοποιήθηκαν για τις δοκιμές της λειτουργίας MRP7 εκροής. Αυτές οι διαμολυσμένες κυτταρικές σειρές έχουν προηγουμένως χρησιμοποιηθεί σε μελέτες που σχεδιάστηκαν για να προσδιοριστούν τα αποτελέσματα του κεφαρανθίνη για την αντιστροφή του MRP7 μεσολάβηση αντοχής σε paclitaxel [9]. Σε αυτή τη μελέτη, ανάλυση κηλίδος Western επιβεβαίωσε ότι η επιμόλυνση των κυττάρων με MRP7 ήταν επιτυχής, όπως πρωτεΐνες MRP7 εκφράστηκαν μόνο σε κύτταρα ΗΕΚ-MRP7-2, και όχι σε κύτταρα ΗΕΚ293-pcDNA3.1 (Εικ. 2). Οι κυτταρικές γραμμές εκτέθηκαν στις ακριβείς ίδιες πειραματικές συνθήκες και διαδικασίες, και καλλιεργήθηκαν με τα ίδια αντινεοπλασματικά φάρμακα για τον ίδιο χρόνο επώασης. Μπορεί να υποστηριχθεί ότι οι MRP7-επιμολυσμένα κύτταρα εξέφρασαν άλλες πρωτεΐνες, εκτός από MRP7, όπως P-gp, που μπορεί να συνέβαλε στην MDR. Ωστόσο, η ανάλυση στυπώματος Western έδειξε ότι ούτε η κυτταρική γραμμή ελέγχου ΗΕΚ293-pcDNA3.1, ούτε το ΗΕΚ-MRP7-2 επιμολυσμένη κυτταρική γραμμή, αποκωδικοποιούσε ανιχνεύσιμα επίπεδα Ρ-gp (Σχ. 2), η οποία μπορεί επίσης να μεσολαβήσει MDR. Επιπλέον, MRP1 και BCRP ήταν ανιχνεύσιμα τόσο ελέγχου ΗΕΚ293-pcDNA3.1 και επιμολυσμένα κύτταρα ΗΕΚ-MRP7-2 μέσω της ανάλυσης κηλίδος Western (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Συνεπώς, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η ΗΕΚ-MRP7-2 επιμολυσμένη κυτταρική γραμμή που εκφράζεται ειδικά MRP7, αλλά όχι P-gp, MRP, ή BCRP.

Προηγουμένως, έχει αναφερθεί ότι η κεφαρανθίνη και nilotinib ανέστρεψε σημαντικά P- GP-προκαλούμενης MDR σε κύτταρα ΗΕΚ-MRP7-2 [9] και BCRP-κυτταρικές σειρές που υπερεκφράζουν [24], αντίστοιχα. Από MRP7 και P-gp είναι παρόμοια σε δομή και λειτουργική δραστηριότητα, σχεδιάσαμε πειράματα για να καθοριστεί εάν το nilotinib θα μπορούσε να αντιστρέψει MRP7 μεσολάβηση φαρμακευτικής αντοχής σε paclitaxel. Λόγω της δομικής ομοιότητας μεταξύ MRP7 και P-gp, μια προηγούμενη μελέτη έδειξε ότι ορισμένοι P-gp αναστολείς ήταν σε θέση να αντιστρέψει σημαντικά την αντίσταση πακλιταξέλη σε κύτταρα ΗΕΚ-MRP7-2 υπερεκφράζουν MRP7 [9]. Βρήκαμε ότι η nilotinib (2,5 μΜ) σημαντικά ευαισθητοποιημένα MRP7-επιμολυσμένα κύτταρα ΗΕΚ293 στην πακλιταξέλη, καθώς σημαντικά ελάττωσε την IC

50 του paclitaxel σε κύτταρα MRP7-trasnfected, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. Παρά το γεγονός ότι nilotinib είναι ένας αναστολέας της Ρ-gp [24], αυτό δεν είναι ένα παράγοντας σύγχυσης στα πειράματά μας ως το P-gp πρωτεΐνη δεν εκφράζεται είτε σε ΗΕΚ293-pcDNA3.1 ή κυττάρων ΗΕΚ-MRP7-2 (Σχ. 2) .

σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε ότι ειδικές ΤΚΙδ: 1) μειώθηκε σημαντικά την αντίσταση σε πακλιταξέλη σε κύτταρα που υπερεκφράζουν MRP7 (Πίνακας 1? Σχήμα 3), 2) δεν ευαισθητοποιούν σημαντικά την απόκριση σε paclitaxel στο κενό. διάνυσμα επιμολυσμένα κύτταρα, αλλά το αποτέλεσμα ήταν σημαντικά χαμηλότερη από ότι στα επιμολυσμένα κύτταρα MRP7 (Εικ. 3), και 3) δεν αναστέλλουν ή επάγουν σημαντικά την έκφραση MRP7 (Σχ. 2C και D). Συνολικά, τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι διστακτικά των TKIs χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη αυτή, imatinib και nilotinib είναι ικανά αναστροφής MRP7 μεσολάβηση αντίσταση αναστέλλοντας την λειτουργία του MRP7. Μεταξύ των TKIs που εξετάσθηκαν έναντι paclitaxel, η ιματινίμπη BCR-Abl TKIs και nilotinib στα 5 μΜ αντιστρέφεται εντελώς MRP7 μεσολάβηση αντίσταση paclitaxel με ένα μέγεθος 12.5- και 21.0 φορές, αντίστοιχα (Πίνακας 1). Αντίθετα, ένα άλλο BCR-Abl ΤΚΙ, dasatinib, δεν παρήγαγε σημαντική αναστροφή του MRP7 μεσολάβηση αντίσταση paclitaxel (Πίνακας 1? Εικ. 3C). Επί του παρόντος, η εξήγηση για τη διαφορά μεταξύ του dasatinib σε σύγκριση με το nilotinib ή imatinib μένει να καθοριστεί. Μια πιθανή προσέγγιση που μπορεί να δώσει εικόνα για το θέμα αυτό θα ήταν ότι της σχέσης των διαρθρωτικών δραστικότητας (SAR). Με βάση τις χημικές δομές τους (Εικ. 1), το dasatinib δεν έχει ένα δαχτυλίδι 2-φαινυλαμινοπυριμιδίνης που υπάρχει στις δομές του nilotinib και το imatinib. Είναι πιθανό ότι η απουσία αυτού του δακτυλίου στο dasatinib θα μπορούσε να είναι ένας σημαντικός παράγοντας που διαφοροποιεί δραστηριότητα dasatinib από ότι είτε nilotinib ή imatinib. Μελέτες Λεπτομερής δομής-λειτουργίας θα απαιτηθεί για την οριοθέτηση της SAR για την αλληλεπίδραση αυτών των ΤΚΙδ με κύτταρα που υπερεκφράζουν MRP7. Επιπλέον, προτάθηκε ότι τα κύτταρα ΗΕΚ293-pcDNA3.1 επίσης ευαισθητοποιήθηκαν με συν-χορήγηση nilotinib ή imatinib (Πίνακας 1? Εικ. 5).