Αφηρημένο

Ιστορικό

που προέρχονται από όγκους διαλυτών παραγόντων, συμπεριλαμβανομένων των διαλυτών μορίων HLA, μπορεί να συμβάλει στον καρκίνο του ανοσοποιητικού διαφυγής και επομένως αντίκτυπο στην κλινική πορεία των κακοήθων νόσων. Αναφέραμε προηγουμένως ότι τα κύτταρα μελανώματος παράγουν,

in vitro

, διαλυτές μορφές του μη κλασική μόριο MHC τάξης Ι HLA-E (sHLA-Ε). Προκειμένου να διερευνηθεί η παραγωγή sHLA-Ε από διάφορους όγκους και για την αντιμετώπιση πιθανή αξία της ως δείκτη όγκου που σχετίζεται, έχουμε αναπτύξει μια ειδική ELISA για την ποσοτικοποίηση των sHLA-Ε σε βιολογικά υγρά.

Μεθοδολογία /Principal Εκτίμηση

έχουμε αναπτύξει ένα sHLA-Ε ειδικές και ευαίσθητες ELISA και δείξαμε ότι ο ορός επίπεδα sHLA-Ε ήταν σημαντικά αυξημένα (P & lt? 0,01) σε ασθενείς με μελάνωμα (n = 127), σε σύγκριση με υγιείς δότες (n = 94 ). sHLA-Ε ανιχνεύθηκε επίσης στα υπερκείμενα καλλιέργειας μιας ευρείας ποικιλίας κυτταρικών γραμμών όγκου (n = 98), συμπεριλαμβανομένων των μελανωμάτων, του νεφρού, του παχέος εντέρου και μαστού. Οι κυτοκίνες ρύθμιση της παραγωγής sHLA-Ε από κύτταρα όγκου διεξήχθη επίσης. IFN-γ, ΙΡΝ-α και TNF-α βρέθηκαν να ρυθμίζουν προς τα πάνω την παραγωγή sHLA-Ε από τα καρκινικά κύτταρα.

Συμπεράσματα /σημαντικότητα

Λόγω της ευρείας απελευθέρωσης ιστό όγκου των HLA-E και πάνω ρύθμιση της από φλεγμονώδεις κυτοκίνες, sHLA-Ε θα πρέπει να μελετηθούν για την εμπλοκή της σε ανοσολογικές αποκρίσεις έναντι όγκων. Είναι ενδιαφέρον ότι, τα αποτελέσματά μας έδειξαν μια θετική συσχέτιση μεταξύ της παρουσίας του ορού sHLA-Ε και μελάνωμα. Ως εκ τούτου, ο προσδιορισμός των επιπέδων sHLA-Ε, χρησιμοποιώντας την προσέγγιση ELISA, μπορεί να διερευνηθεί ως κλινικός δείκτης σε ασθενείς με καρκίνο

Παράθεση:. Allard Μ, Oger R, Vignard V, Percier JM, Fregni G, Périer Α , et al. (2011) στον ορό Διαλυτό HLA-E στην Μελάνωμα: μια νέα πιθανή συνδέονται με το ανοσοποιητικό Marker στον Καρκίνο. PLoS ONE 6 (6): e21118. doi: 10.1371 /journal.pone.0021118

Επιμέλεια: Jacques Zimmer, Centre de Recherche Δημόσια de la Santé (CRP-Santé), το Λουξεμβούργο

Ελήφθη: May 10, 2011? Αποδεκτές: 19η Μάη 2011? Δημοσιεύθηκε: 21 Ιουνίου, 2011

Copyright: © 2011 Allard et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιδοτήσεις που χορηγούνται από το «Ligue Nationale contre le Cancer» (labellisation 2007). Ο χρηματοδότης δεν έχει κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή.

Αποδείξεις συσσωρευμένη αποδεικνύουν την ικανότητα του ανοσοποιητικού συστήματος να εντοπίσει και να καταστρέψει κακοήθη κύτταρα, προκειμένου να αποτραπεί η ανάπτυξη όγκων. Αυτή η διαδικασία ονομάζεται ανοσοεπιτήρηση καρκίνος, βασίζεται στην ενώνονται δράση των τελεστών της έμφυτης (ΝΚ, κύτταρα ΝΚΤ, γδ Τ κύτταρα, και δενδριτικά κύτταρα) και προσαρμοστική (αντιγόνο-ειδικών Τ και Β κύτταρα) ανοσία για να ανιχνεύει και να εξαλείψουν τη γενέσει-μετασχηματισμένα κύτταρα. Ωστόσο, παρά την ύπαρξη καλά καθορισμένων ανοσογόνα αντιγόνα όγκου, και ακόμη και με την παρουσία του όγκου αντιγόνου-ειδικών κυτταροτοξικών Τ κυττάρων, το ανοσοποιητικό σύστημα δεν φαίνεται να είναι πλήρως αποτελεσματική στην εξάλειψη όγκων [1].

Διάφοροι μηχανισμοί έχουν εμπλακεί στην ογκοάνοση διαφυγής, συμπεριλαμβανομένων των δομικών και λειτουργικών μεταβολών των Ανθρωπίνων λευκοκυττάρων αντιγόνα (HLA), που αντιπροσωπεύουν συχνές εκδηλώσεις σε καρκίνους. Αυτό περιλαμβάνει την κλασική HLA τάξης Ι αντιγόνο (HLA-Α, -Β, -C) απώλεια ή προς τα κάτω ρύθμιση και παρεκκλίνουσα έκφραση των μη κλασική αντιγόνων HLA τάξης Ι (HLA-E, -G), παρέχοντας μηχανισμούς που οδηγούν σε μείωση της αναγνώρισης και της καταστροφή των κυττάρων όγκου από το ανοσοποιητικό κυτταροτοξικά τελεστές (κυρίως CTL και ΝΚ κύτταρα) [2]. Το ενδιαφέρον για μη-κλασική μόρια HLA έχει διεγερθεί από τη διαδήλωση που μπορεί να συμβάλει στην καρκινικών κυττάρων διαφυγή των κυττάρων ΝΚ και Τ μέσω της αλληλεπίδρασής τους με ΝΚ ανασταλτικοί υποδοχείς [3] – [6]. Επιπλέον, η παραγωγή των μη-κυττάρων δεσμεύονται διαλυτά μόρια (sHLA) HLA έχει επίσης περιγραφεί και μπορεί να αντιπροσωπεύει μία εναλλακτική στρατηγική για τον καρκίνο του ανοσοποιητικού διαφυγή [7], [8]. Σε υποστήριξη αυτής της υπόθεσης, έχουν μόρια sHLA έχει αποδειχθεί ότι επάγουν

in vitro

αναστολή ή /και απόπτωση των CTL και ΝΚ [9], [10]. Επιπλέον, τα αυξημένα επίπεδα της κλασσικής και μη κλασσικής sHLA ορό έχουν περιγραφεί σε αρκετές κακοήθεις νόσους, και προγνωστική συνάφειά τους προτείνεται από στατιστικά σημαντική συσχέτιση με υψηλό στάδιο της νόσου ή με ιδιαίτερη κλινική πορεία σε διάφορες κακοήθειες [11].

Έχουμε ήδη παρατηρηθεί, σε συνεργασία με τους παθολόγους, μια συχνή έκφραση των HLA-E από μελανώματα και καρκινώματα του παχέος εντέρου [12]. Μελέτες από την ομάδα μας και τους άλλους υποστηρίζεται μια ενδεχόμενη ανοσοκατασταλτική δράση αυτής της έκφρασης, μέσα από την εμπλοκή του ανασταλτικού NKR CD94 /NKG2A για κυτταροτοξικά κύτταρα (ΝΚ και CD8 ΤΙΤ) από καρκινικών κυττάρων μεμβράνη HLA-E [13] – [16]. Μπορούμε επίσης αναφερθεί ότι κυτταρικές σειρές μελανώματος μπορεί να παράγει διαλυτές μορφές του HLA-E (sHLA-Ε)

in vitro

, με πρωτεάση εξαρτώμενη απόπτωση επιφανειακά μόρια, και ότι αυτή η παραγωγή αυξήθηκε κατά ΙΡΝ-γ [12] .

Ο σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν να αναπτυχθεί μια δοκιμασία ELISA για την ανίχνευση και την ποσοτικοποίηση των sHLA-Ε σε βιολογικά υγρά, να επικυρώσει την ιδιαιτερότητά του και, αν είναι κατάλληλα, για να αντιμετωπίσει την κλινική σημασία των sHLA- επίπεδα Ε στο αίμα των ασθενών με μελάνωμα.

Αποτελέσματα

Ανάπτυξη ενός HLA-E ειδική ELISA

Για την ανίχνευση και τον ποσοτικό προσδιορισμό sHLA-Ε σε βιολογικά δείγματα, έχουμε αναπτύξει μια σάντουιτς ELISA χρησιμοποιώντας μη ανταγωνιστικές στερεά σύλληψης και βιοτινυλιωμένο ανίχνευση αντι-HLA-E μονοκλωνικά αντισώματα ΜΕΜ-E /08 και ΜΕΜ-E /07 αντίστοιχα. Πρώτον, ένα εύρος συγκέντρωσης ενός καθαρισμένου ανασυνδυασμένου διαλυτού HLA-E (rsHLA-Ε) ελέγχθηκε. Α που φαίνεται στο σχήμα 1Α, rsHLA-Ε ανιχνεύθηκε σε ελάχιστη συγκέντρωση 5 pg /ml. Δεδομένης της αναφερόμενη διασταυρούμενη αντιδραστικότητα των δύο αντι-HLA-E Abs με τέσσερις HLA τάξης Ia μορφές αλληλικές: HLA-A23, -B7, -B8 και -B27, μπορούμε στη συνέχεια ελέγχονται ανίχνευση τους χρησιμοποιώντας προσδιορισμό ELISA σχεδιασμένο μας. Μεταξύ ανασυνδυασμένης διαλυτής HLA-A23, -B7, -B8 και -B27 καθώς rsHLA-A2 χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος, μόνο ένα ασθενές σήμα ελήφθη με rsHLA-B7 στη μέγιστη δόση των 20 ng /ml (Σχ. 1Β).

Α /Ανίχνευση sHLA-Ε χρησιμοποιώντας διαδοχικές αραιώσεις του ανασυνδυασμένου μονομερούς HLA-E. Η γκρίζα περιοχή δείχνει το εύρος των μετρήσιμα επίπεδα sHLA-E. Β /Καθορισμός της εξειδίκευσης δέσμευσης HLA-E. Διαδοχικές αραιώσεις του HLA-A2, -A23, -B7, -B8 και -B27 ανασυνδυασμένο διαλυτό μονομερή έχουν δοκιμαστεί σε σύγκριση με ανασυνδυασμένο μονομερές HLA-E.

Η

Αυτά τα αποτελέσματα οδήγησαν στο συμπέρασμα ότι η σάντουιτς ELISA που περιγράφεται εδώ είναι πολύ ειδικό και ευαίσθητο για HLA-E και θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως μέθοδος διαλογής για την ανίχνευση του sHLA-Ε σε βιολογικά δείγματα.

Αυξημένη διαλυτό HLA-E σε ορούς ασθενών με μελάνωμα

διαλογή ορών από 94 υγιείς δότες και 127 ασθενείς με μελάνωμα χωρίς τρέχουσα θεραπεία για την παρουσία του sHLA-Ε (Πίνακας 1). Διαπιστώσαμε sHLA-Ε σε δείγματα ορού τόσο από υγιείς δότες και ασθενείς σε μία αραίωση-εξαρτώμενο τρόπο (εικ. 2Α) που αποδεικνύουν ότι αυτή η ELISA θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για την ποσοτικοποίηση sHLA-Ε σε δείγματα ορών. Λαμβάνοντας υπόψη την πιθανή επίπτωση της ηλικίας και το φύλο, δεν υπάρχουν σημαντικές διαφορές στα επίπεδα sHLA-Ε παρατηρήθηκαν (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Οι επιμέρους τιμές του ορού sHLA-Ε παρουσιάζονται σε dot-plot χρησιμοποιώντας μια λογαριθμική κλίμακα (Εικ. 2Β) και τα μέσα, οι διάμεσοι και περιοχές που αναφέρονται στον Πίνακα 2.

Α /Ενδεικτικό ανίχνευση sHLA-Ε χρησιμοποιώντας σειριακές αραιώσεις δύο δείγματα ορού με ELISA. Β /διανομής διαλυτού συγκεντρώσεις HLA-E σε ορούς υγιών ελέγχων και ασθενείς με μελάνωμα. P-τιμή υποδεικνύει τη διαφορά μεταξύ των δύο ομάδων. C /Ποσοστά θετικών ορών sHLA-E (sHLA-E≥5 pg /ml) σε υγιείς δότες και ασθενείς με μελάνωμα. Δ /διανομή της διαλυτής συγκεντρώσεις HLA-Ε στον ορό των ασθενών με μελάνωμα σε σχέση με στάδια όγκου.

Η

Η

Σε ασθενείς με μελάνωμα, τα επίπεδα του sHLA-Ε (διάμεση [εύρος] του ορού ) ήταν σημαντικά αυξημένη σε σύγκριση με αυτά των υγιών μαρτύρων (9 pg /ml [0-2544] έναντι 0 pg /ml [0 – 1224], αντίστοιχα, ρ & lt? 0.001). Για την ποσοτικοποίηση της συχνότητας των sHLA-Ε-θετικούς ορούς, παίρνουμε ένα cut-off τιμή των 5 pg /ml. Αυτή η ανάλυση αποκάλυψε ότι στην ομάδα των 94 υγιών δοτών, sHLA-Ε θα μπορούσε να ανιχνευθεί σε 30 ορούς (31,9% του συνόλου). Αντίθετα, σε ασθενείς με μελάνωμα, 68 από 127 ορών (53,5% του συνόλου) που περιέχεται sHLA-Ε (Σχ. 2C). Ετσι, τα ποσοστά των θετικών ορών ήταν σημαντικά υψηλότερα σε ασθενείς με μελάνωμα σε σύγκριση με υγιείς δότες (ρ & lt? 0.001). Η ανάλυση των υποομάδων λαμβάνοντας υπόψη τα στάδια AJCC (αμερικανική μεικτής επιτροπής για τον Καρκίνο, https://www.cancerstaging.org/) Στη συνέχεια εκτελέστηκε. Καμία σχέση των επιπέδων sHLA-Ε στον ορό βρέθηκε σχετικά με τη διαβάθμιση των όγκων (Σχ. 2D). Ωστόσο, όπως φαίνεται στον Πίνακα 1, τα επίπεδα sHLA-Ε ήταν σημαντικά αυξημένα σε στάδιο III ασθενείς με μελάνωμα σε σύγκριση με υγιείς δότες (ρ & lt? 0,0001).

Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα επικυρώνονται μία ELISA για τον προσδιορισμό του sHLA-Ε σε ανθρώπινο ορό και απέδειξαν ότι sHLA-Ε είναι σημαντικά αυξημένη σε ορούς ασθενών με μελάνωμα.

παραγωγή διαλυτού HLA-E με ένα ευρύ πάνελ κυτταρικών γραμμών ανθρώπινου όγκου

Αναλύσαμε την παραγωγή του διαλυτό HLA-E με 98 διαφορετικούς καθιερωμένες κυτταρικές γραμμές όγκου του ανθρώπου, που αντιπροσωπεύουν συμπαγείς όγκους, όπως μελανώματα (n = 30), καρκινώματα (καρκίνοι του πνεύμονα (n = 5), colo-ορθού (n = 12), νεφρό (η = 10 ), ωοθήκη (n = 3), του μαστού (η = 11) και του προστάτη (3)), ο καρκίνος του θυρεοειδούς (n = 1), καρκίνος του τραχήλου (n = 1), σαρκώματα (οστεοσαρκώματα, n = 3), τα γλοιώματα (n = 2) και υγρών όγκων (μεσοθηλιωμάτων (n = 7), μυελώματα (n = 7) και λευχαιμίες (n = 3)). Όπως φαίνεται στα Σχήματα 3Α και 3Β (σε λευκό), sHLA-Ε ανιχνεύθηκε στα υπερκείμενα των κυτταρικών σειρών όγκων που προέρχονται από όλες τις προελεύσεις δοκιμάστηκαν, εξαιρούμενα στο υπερκείμενο των ωοθηκών όγκου, μυέλωμα, λευχαιμίες και γλοιώματος κυτταρικές σειρές (Σχ. 3 και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Σε συνθήκες καλλιέργειας μας (500 000 κύτταρα, σε 3 ml, κατά την διάρκεια 48 h), τα επίπεδα του sHLA-Ε που παράγεται φυσιολογικά από κυτταρικές σειρές όγκου κυμαίνονται από 5 έως 400 pg /ml. Υψηλότερη παραγωγές εντοπίστηκαν μεταξύ του μελανώματος, του παχέος εντέρου και των νεφρών καρκινικά κύτταρα γραμμές. Η ανάλυση της συχνότητας των κυτταρικών γραμμών όγκου σε θέση να παράγει sHLA-Ε (λαμβάνοντας μια cut-off τιμή των 5 pg /ml) αποκάλυψε ότι περίπου το ένα τρίτο των καρκινικών κυτταρικών σειρών που παράγονται sHLA-Ε (24,5%, 24 από 98) με υψηλότερα ποσοστά που ελήφθη στο μελάνωμα (40%, 12 από 30) και καρκίνωμα νεφρικών κυττάρων (40%, 4 στα 10) (Σχ. 3C).

Ανάλυση διαλυτού συγκεντρώσεις HLA-E σε υπερκείμενα κυτταρικές γραμμές όγκου αγωγή ή όχι με ΙΡΝ-γ σε σχέση με την καταγωγή του όγκου:. κατανομή των επιμέρους συγκεντρώσεις (Α), τα μέσα επίπεδα (Β) και τα ποσοστά των θετικών υπερκειμένων (sHLA-E≥5 pg /ml) (C)

Επιλεκτική ρύθμιση της παραγωγής sHLA-Ε από κυτοκίνες

Έχουμε προηγουμένως δείξει ότι η ΙΡΝ-γ αύξησε την επιφανειακή έκφραση των HLA-E και η κατάργηση του διαλυτού HLA-E από κύτταρα μελανώματος. Για να επιβεβαιωθεί αυτό το αποτέλεσμα και να διευρύνουν το πλαίσιο της δοκιμαστεί κυτοκινών, την επίδραση της IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15 , IL-23, ΙΡΝ-α2Α, IFN-γ, TNF-α και GM-CSF κατά την παραγωγή κυττάρων του όγκου γραμμές sHLA-Ε δοκιμάστηκε. Όπως ήταν αναμενόμενο, η απελευθέρωση sHLA-Ε προκλήθηκε ή σημαντικά αυξημένη σε υπερκείμενα κυττάρου όγκου μετά την ενεργοποίηση IFN-γ (ρ & lt? 0,0001). Η ανάλυση της συχνότητας των κυτταρικών γραμμών όγκου σε θέση να παράγει sHLA-Ε μετά την κατεργασία IFN-γ διπλασιάστηκαν (από 24,5% σε 49%, 48 από 98) (Σχ. 3C). Σε μικρότερο βαθμό, η έκθεση σε ΙΡΝ-α και TNF-α αύξησε σημαντικά την παραγωγή του sHLA-Ε από κυτταρικές γραμμές όγκου (ρ & lt? 0.001 και ρ & lt? 0,05 αντίστοιχα). Αυτά τα αποτελέσματα απεικονίζονται στην Εικόνα 4Α χρησιμοποιώντας δύο κυτταρικές γραμμές μελανώματος (M88 και M102) και μία κυτταρική σειρά αδενοκαρκινώματος κόλου (ΗΤ29). Άλλες δοκιμαστεί κυτοκίνες δεν έχουν καμία επίδραση σε αυτή την παραγωγή. Πειράματα κινητικής ανάλυσης και δόσης-απόκρισης διεξήχθησαν με IFN-γ, ΙΡΝ-α και TNF-α. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 4Β, η παραγωγή sHLA-Ε ήταν σημαντικά αυξημένη σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο με το μέγιστο αποτέλεσμα που παρατηρείται με 10 ng /ml για τις τρεις κυτοκίνες. Αυτή η παραγωγή ήταν ανιχνεύσιμη ήδη από την 1η ημέρα μετά κυτοκινών θεραπεία των καρκινικών κυττάρων και ήταν μέγιστη μετά από 48 ώρες (Σχ 4C.)

A ανίχνευση /sHLA-Ε σε υπερκείμενα κυτταρικών γραμμών τρία όγκου:. Κελί δύο μελανώματος γραμμές (M88 και M102) και μία colocarcinoma κυτταρική γραμμή (ΗΤ29), υποβλήθηκε σε επεξεργασία ή όχι με ΙΡΝ-α, ΙΡΝ-γ ή ΤΝΡ-α (10 ng /ml, 48 ώρες). Σημαντικές διαφορές μεταξύ των τιμών ελέγχου και θεραπείας υποδεικνύεται (* ρ & lt? 0,05, ** ρ & lt? 0,01, *** ρ & lt? 0.001). B /sHLA-Ε ανίχνευση σε υπερκείμενα καλλιέργειας του Μ102 σε επεξεργασία με σειριακές συγκεντρώσεις ΙΡΝ-α, ΙΡΝ-γ και ΤΝΡ-α για 48 ώρες. C /Ώρα διάρκεια της παραγωγής sHLA-Ε στο υπερκείμενο καλλιέργειας του M102 θεραπεία για μέχρι 6 ημέρες με 10 ng /ml IFN-γ.

Η

Συζήτηση

Αυτή η μελέτη αποδεικνύει ότι ορό sHLA-E είναι σημαντικά αυξημένη σε ασθενείς που πάσχουν από μελάνωμα σε σύγκριση με τα φυσιολογικά άτομα, ανεξάρτητα από την ηλικία και το φύλο. Πραγματοποιήσαμε αυτή την ανάλυση μέσω, χρησιμοποιώντας ένα ειδικό και ευαίσθητο ELISA ότι αναπτύξαμε και επικυρωθεί για τον προσδιορισμό των επιπέδων sHLA-Ε σε βιολογικά υγρά. Σε αυτή τη μεγάλη μελέτη, συμπεριλαμβανομένων 221 άτομα, παρατηρήσαμε αυξημένες συγκεντρώσεις ορού sHLA-Ε, καθώς και υψηλότερη συχνότητα sHLA-Ε θετικούς ορούς σε ασθενείς με μελάνωμα σε σύγκριση με υγιείς δότες. Λαμβάνοντας υπόψη τη διαβάθμιση του όγκου, ενώ τα επίπεδα sHLA-Ε φάνηκε να ανεβείτε με τα προχωρημένα στάδια της νόσου μέχρι το στάδιο ΙΙΙ, δεν βρήκαμε στατιστικά σημαντική συσχέτιση μεταξύ ορού επίπεδα sHLA-Ε και το στάδιο του μελανώματος, η οποία μπορεί να προκληθεί από την άνιση κατανομή των ασθενών ανά υποομάδα. Ωστόσο, σε σύγκριση με υγιείς δότες, οι ασθενείς με μελάνωμα σταδίου III εμφάνισαν υψηλά αυξημένο επίπεδο sHLA-Ε στον ορό από την άποψη τόσο της συγκέντρωσης και η συχνότητα των θετικών ορών. Από την άλλη πλευρά, οι ασθενείς με νόσο σταδίου IV εμφάνισαν χαμηλότερα επίπεδα sHLA-Ε, η οποία είναι σύμφωνη με τον εξασθενημένο αυθόρμητη έκφραση των HLA-E με μεταστατικό τομές όγκων που έχουν αναφερθεί στο παρελθόν με ανοσοϊστοχημεία [12].

Τα στοιχεία αυτά τόνισε το ενδιαφέρον για διαλυτά μόρια μη κλασσικής HLA-Ι σε κακοήθεις νόσους. Ένα άλλο μη-κλασική HLA-Ι μόριο, HLA-G, έχει ταυτοποιηθεί σε διάφορες κακοήθειες περιλαμβάνουν καρκίνους και έχει λάβει πολλή προσοχή σε πρόσφατες δημοσιεύσεις. Κλινικές μελέτες έδειξαν ότι τα επίπεδα sHLA-G ήταν σημαντικά αυξημένα σε ορούς ασθενών με κακοήθη μελανώματα, γλοιώματα, μαστού και των ωοθηκών, καρκίνους μη-μικρού κυττάρου-πνεύμονα (NSCLC), χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμίες, Β κυττάρων και Τ κυττάρων μη-Hodgkin λεμφώματα [17] – [21]. Επιπλέον, Zhu et al. έδειξαν ότι τα επίπεδα sHLA-G στον ορό θα μπορούσε να είναι ένας χρήσιμος δείκτης για τη διάκριση του παχέος εντέρου από καλοήθεις παχέος ασθένειες [22]. Τέλος, τα επίπεδα sHLA-G ήταν επίσης σημαντικά υψηλότερη σε κακοήθη ασκίτη των καρκινωμάτων των ωοθηκών και του μαστού σε σχέση με καλοήθη ελέγχου [23]. Παρομοίως, τα αυξημένα επίπεδα των στρες-επαγώγιμους MHC γλυκοπρωτεΐνες επιφανείας αλυσίδα που σχετίζονται με την κατηγορία Ι, MICA και MICB, έχουν βρεθεί να συσχετίζονται με τα στάδια του καρκίνου και μετάστασης σε διάφορα καρκινώματα [24] – [26]. Συνολικά, αυτές οι μελέτες αποκάλυψαν congruently αυξημένες ποσότητες μη κλασσικής μόρια HLA-Ι σε βιολογικά υγρά (αίμα και ασκίτη) των ασθενών που πάσχουν από διάφορες μορφές καρκίνου.

Δεδομένου ότι εμείς και άλλοι έχουν προηγουμένως εντοπιστεί sHLA-Ε υπερκείμενα του μελανώματος και του παχέος κυτταρικές σειρές με ανάλυση στυπώματος Western, ερευνήσαμε, χρησιμοποιώντας σχεδιασμένο ELISA μας, την παραγωγή sHLA-Ε από κυτταρικές γραμμές όγκων που προέρχονται από μεγάλες κατηγορίες όγκων, συμπεριλαμβανομένων στερεών όγκων όπως το μελάνωμα, καρκίνους του μαστού, του παχέος εντέρου και νεφρό και υγρών όγκων όπως μεσοθηλιώματα και μυελώματα [12], [27]. Δείξαμε ότι sHLA-Ε αυθόρμητα παράγεται από 25% των δοκιμαζόμενων κυτταρικών σειρών (24 από 98), που προέρχεται από διάφορους τύπους ανθρώπινων όγκων, ιδιαίτερα από καρκίνους μελανώματος, του παχέος εντέρου και του νεφρού. Έτσι, θα είναι ενδιαφέρον να αντιμετωπίσει το δυναμικό προγνωστική και προγνωστική αξία των επιπέδων sHLA-Ε στο αίμα των ασθενών που πάσχουν από αυτούς τους καρκίνους.

Εξετάσαμε επίσης την επίδραση διαφόρων κυτοκινών επί της παραγωγής ΗΕΑ-Ε με καρκινικές κυτταρικές σειρές. Σύμφωνα με τα προηγούμενα αποτελέσματα μας σε κυτταρικές σειρές μελανώματος [12], δείξαμε ότι η ΙΡΝ-γ που επάγεται ή αυξημένη παραγωγή sHLA-Ε, που οδηγεί στην παραγωγή του sHLA-Ε με το 50% των κυτταρικών γραμμών όγκου που δοκιμάστηκαν (48 από 98) . Επιπλέον, η απελευθέρωση του sHLA-Ε επίσης οδηγείται από ΙΡΝ-α και TNF-α σε μικρότερο βαθμό. Λαμβάνοντας υπόψη ότι η ΙΡΝ-γ και ΙΡΝ-α είναι υψηλές επαγωγείς του HLA-Ι μόρια έκφραση, οι επιπτώσεις τους επιδεικνύοντας sHLA-Ε πιθανόν αντανακλούν την αύξηση της έκφρασης HLA-E από κύτταρα όγκου. Από sHLA-Ε απελευθέρωσης με κύτταρα μελανώματος είναι κυρίως μεταλλοπρωτεϊνάσης-εξαρτώμενη, επίδραση ΤΝΡ-α επί της παραγωγής ΗΕΑ-Ε θα μπορούσε να οφείλεται στην ικανότητα του ΤΝΡ-α για την προώθηση της έκφρασης μεταλλοπρωτεϊνάσης μήτρας [12], [28]. Αυτά τα αποτελέσματα είναι συνεπή με εκείνα του Coupel

et al.

Δείχνει παραγωγή sHLA-Ε από τα ενδοθηλιακά κύτταρα μετά την επεξεργασία με IFN-γ και TNF-α [29]. Ωστόσο, σε αντίθεση με τη μελέτη τους, δεν παρατηρήσαμε οποιαδήποτε επίδραση της θεραπείας IL-1β στην παραγωγή sHLA-Ε από κύτταρα όγκου, πιθανώς λόγω της χαμηλής έκφρασης της IL-1 υποδοχέα (IL-1R1) από τις κυτταρικές γραμμές όγκου δοκιμάζονται στη μελέτη μας. Ωστόσο, όπως έχει αναφερθεί ότι κυτταρικές γραμμές όγκου, συμπεριλαμβανομένων κυτταρικές σειρές μελανώματος, μπορεί να εκφράσει την IL-1R1, μπορούμε να υποθέσουμε ότι η IL-1β, το οποίο είναι γνωστό ότι προάγει την έκφραση μεταλλοπρωτεϊνάσης μήτρας, θα μπορούσε να αυξήσει την παραγωγή του sHLA-Ε από την IL κύτταρα που εκφράζουν όγκου -1R1 [30], [31].

Λόγω της επίδρασης του επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων του όγκου, της αγγειογένεσης και ανοσοτροποποιητικές ικανότητές της, ΙΡΝ-α χρησιμοποιείται ως ανοσοθεραπεία για τη θεραπεία διαφόρων συμπαγών όγκων , όπως μελάνωμα και το νεφρικό καρκίνωμα [32]. Ως εκ τούτου, όπως έχουμε δείξει την ικανότητά του να ρυθμίζει αυξητικά την παραγωγή sHLA-Ε από κυτταρικές σειρές όγκων, η συστημική θεραπεία με IFN-α μπορεί να αυξήσει την παραγωγή sHLA-Ε σε ασθενείς με μελάνωμα. Σε αυτή την υποστήριξη, η θεραπεία με IFN-α σχετίζεται με αυξημένα επίπεδα ορού sHLA-G σε ασθενείς με μελάνωμα [33]. Επιπλέον, έχει αναφερθεί ότι η γ-ακτινοβολία ρυθμίζει προς τα κάτω την επιφανειακή έκφραση των HLA-G1 σε κύτταρα μελανώματος, με την ενίσχυση της πρωτεολυτική διάσπαση του μορίου αυτού [34]. Έτσι, θα είναι ενδιαφέρον να καθοριστεί εάν αυτός ο μηχανισμός παρατηρείται επίσης με HLA-E, η οποία στη συνέχεια θα κυκλοφορήσει μέσα στο μικροπεριβάλλον του όγκου και αποφασίζει να επηρεάσουν την τοπική ανοσολογική κατάσταση.

Ανεξάρτητα από την πιθανή μηχανισμό sHLA- παραγωγής Ε, είναι σημαντικό να τονίσουμε πως η γενιά των sHLA-Ε από τα καρκινικά κύτταρα θα μπορούσαν να συμβάλουν για τη διαφυγή ανοσολογικής. Δεδομένου ότι η αλληλεπίδραση του συνδεδεμένου με μεμβράνη HLA-E με τους ανασταλτικούς υποδοχείς CD94 /NKG2-Α που προκαλείται από την αναστολή των αποκρίσεων των κυττάρων ΝΚ και Τ, θα πρέπει να διερευνηθεί η δραστηριότητα του ανοσοκαταστολέας sHLA-Ε. Προς στήριξη μιας πιθανής fonction ανοσορυθμιστική, Coupel

et al.

Ανέφεραν ότι sHLA-Ε προστατεύουν τα ενδοθηλιακά κύτταρα από ΝΚ-μεσολαβητική κυτταρική λύση [29]. Επιπλέον, sHLA-G και sMICA έχουν δειχθεί ότι μειώνουν την ανοσολογική αναγνώριση και καταστροφή των καρκινικών κυττάρων. sHLA-G, μέσω της αλληλεπίδρασής της με αναστολέα υποδοχέων ΙΕΤ-2 και ITL-4, έχει δειχθεί ότι αναστέλλει λυτική δραστικότητα των ΝΚ κυττάρων, να επάγει απόπτωση των CD8

+ CTL, να επηρεάσει CD4

+ alloproliferation και να βλάψουν ΝΚ /DC στιχομυθία [35] – [38]. Επιπλέον, ο όγκος που προέρχεται από διαλυτά MICA επάγεται ενδοκύτωση και αποικοδόμηση του συγγενή υποδοχέα ενεργοποιητικού NKG2-D σε λεμφοκύτταρα που διηθούν όγκο, αλλοιώνοντας την ενεργοποίηση τους [29], [39]. Συνολικά, τα στοιχεία αυτά τόνισε τη σημασία των διαλυτών συνδετήρων νορβηγικές κορόνες που προέρχονται από όγκους στην παροχή μιας μικροπεριβάλλον του όγκου που ευνοούν το ανοσοποιητικό διαφυγής. Επιπλέον, έχει αναφερθεί ότι sHLA-G παράγονται

in vitro

ως μονομερών και πολυμερών μορφών και ότι sHLA-G διμερισμού αυξάνει ΙΕΤ-2-διαμεσολαβούμενη αναστολή της alloresponse Τ κυττάρου [40]. Έτσι, θα πρέπει επίσης να διερευνηθεί η ύπαρξη του sHLA-Ε πολυμερή.

Εν κατακλείδι, η παρούσα μελέτη παρέχει για πρώτη φορά στοιχεία για ένα υπερυψωμένο sHLA-Ε σε ορούς από ασθενείς με μελάνωμα, που δείχνει ότι το HLA-Ε θα μπορούσε χρησιμεύσει ως κλινικός δείκτης για την πρόγνωση ή πρόβλεψη των κλινικά αποτελέσματα αυτών των καρκίνων, ιδίως στο πλαίσιο της ανοσοθεραπείας. Επειδή ένα ευαίσθητο sHLA-Ε-ELISA έχει πρακτικά πλεονεκτήματα για τον έλεγχο μεγάλης κλίμακας, θα μπορούσε να εγκριθεί για χρήση ρουτίνας στην ανοσολογική παρακολούθηση των μελανωμάτων και άλλων ανθρώπινων καρκίνων. Αν και η λειτουργία του που προέρχεται από όγκο διαλυτού HLA-E παραμένει να οριστεί, μπορούμε να υποθέσουμε ότι αυτά τα μόρια θα μπορούσαν να ενισχύσουν ανοσοκαταστολής του ξενιστή μέσω της αναστολής των λειτουργιών των κυττάρων ΝΚ και Τ, και ως εκ τούτου ευνοεί την επιβίωση των κυττάρων του όγκου. Η κλινικά σημαντική λειτουργία αυτών των μορίων sHLA-Ε πρέπει να αναλυθούν προσεκτικά, προκειμένου να αναπτύξουν τις κατάλληλες ανοσοθεραπευτικές στρατηγικές.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντισώματα

ΜΕΜ-E /07 και ΜΕΜ-E /08 μονοκλωνικά αντισώματα (Exbio, Τσεχική Δημοκρατία), που συνδέεται με φυσικές πρωτεΐνες HLA-E χρησιμοποιήθηκαν για ELISA.

τα πεπτίδια και ανασυνδυασμένο διαλυτό HLA

τα πεπτίδια αγοράστηκαν από Eurogentec (Angers , Γαλλία). Καθαρότητα (& gt? 85%) ελέγχθηκε με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης ανάστροφης φάσης. Διαφορετικές HLA και β2-μικροσφαιρίνη ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες αναδιπλώθηκαν με το ακολουθούμενο ενδεικνυόμενη συνθετικά πεπτίδια. HLA-E * 0101 /VMAPRTLVL (HLA-A * 0201 πεπτίδιο σήμα) και HLA-A * 0201 /AAGIGILTV (Melan-Α

27-35) μονομερή που παράγεται από την ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη εγκατάσταση (IFR 26, Ναντ). HLA-A * 2301 /PYLFWLAAI, HLA-B * 0702 /GILGFVFTL, HLA-B * 0801 /QAKWRLQTL και HLA-B * 2705 μονομερή /HRCQAIRKK παρασχέθηκαν από την εγκατάσταση παραγωγής τετραμερούς (Ludwig Institute for Cancer Research, Λωζάνη, Ελβετία) .

ασθενείς και δείγματα

δείγματα

οι οροί συλλέχθηκαν από ασθενείς με μελάνωμα (n = 127), όλα με την επίσημη συγκατάθεση. Οι οροί από υγιείς δότες (n = 94) δόθηκαν από το Etablissement Français du Sang (EFS) (Νάντη, Γαλλία) και χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες.

Δήλωση Ηθικής

γραπτές συγκαταθέσεις ελήφθησαν από όλους ασθενείς και υγιείς δότες. Όλες αυτές οι μελέτες εγκρίθηκαν από τις τοπικές commmitees ηθική «Comité de Προστασίας des Άτομα Ouest IV-Nantes» και η «Agence Française de Sécurité Sanitaire des Produits de Santé».

Οι κυτταρικές σειρές πολιτισμό

κυτταρικές σειρές μελανώματος καθιερώθηκαν στη Μονάδα GMP κυτταρικής θεραπείας και στο εργαστήριο μας (UMR 892 INSERM /Université de Nantes, Γαλλία) και ανήκουν στην Biocollection PC-U892-NL (CHU Ναντ). Ορθοκολικού καρκινώματος κυτταρικές σειρές αγοράστηκαν από την ATCC ή είναι εγκατεστημένος στο εργαστήριο μας UMR 892 INSERM /Université de Nantes (Biocollection PC-U892-FJ, CHU Ναντ). Νεφρική κυτταρικές σειρές καρκινώματος ιδρύθηκαν το INSERM U1016 /CNRS UMR 8104, Παρίσι, Γαλλία) [41]. κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού αγοράστηκαν από την ATCC ή είναι εγκατεστημένος στο εργαστήριο μας UMR 892 INSERM /Université de Nantes (Biocollection PC-U892-NG, CHU Ναντ). κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα και το μεσοθηλίωμα κυτταρικές σειρές αγοράστηκαν από την ATCC ή δώρα από τους M. Grégoire (UMR 892 INSERM /Université de Nantes, Γαλλία, Biocollection PC-U892-MG, CHU Ναντ). κύτταρα μυελώματος γραμμές ήταν δώρα από τον C. Pellat (UMR 892 INSERM /Université de Nantes, Γαλλία, Biocollection PC-U892-ΜΑ, CHU Ναντ). Ωοθηκών καρκίνωμα, γλοίωμα, λευχαιμία, του θυρεοειδούς, του τραχήλου και του καρκίνου του προστάτη κυτταρικές γραμμές αγοράστηκαν από την ATCC και ευγενώς από τον C. SAI, F. Vallette και F. Παρίσι (UMR 892 INSERM /Université de Nantes, France). κύτταρα οστεοσαρκώματος γραμμές αγοράστηκαν από την ATCC και δώρα από Μ Padrines (EA3822, INSERM U957, Νάντη, Γαλλία). Όλες οι κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε RPMI ή ΡΜΕΜ με 10% ορού εμβρύου μόσχου (FCS, ΡΑΑ, Αυστρία).

υπερκείμενα Tumor παραγωγή

Για sHLA-Ε διαλογής παραγωγή, 500 000 κύτταρα όγκου καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία 6 φρεατίων σε 3 ml 10% FCS-RPMI, συμπληρωμένο ή όχι με ΙΡΝ-γ (20 ng /ml). Μετά από 48 ώρες, τα υπερκείμενα των όγκων συλλέχθηκαν, φυγοκεντρήθηκαν 5 λεπτά σε 2500 g και διατηρήθηκαν κατεψυγμένα πριν από τη δοκιμή σε ELISA.

Ο αντίκτυπος των άλλων κυτοκινών υπό παραγωγή sHLA-Ε, έχει αρχικά δοκιμάστηκε σε 20 ng /ml κατά τη διάρκεια της 48 ώρες με δύο μελανώματα κυτταρικές γραμμές (M88 και M102) και μία κυτταρική σειρά ορθοκολικού αδενοκαρκινώματος (ΗΤ29). εκτιμήσεις δόσης-απόκρισης και η κινητική της IFN-γ, ΙΡΝ-α2Α και ΤΝΡ-α ήταν δευτερογενώς πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφεται (συγκέντρωση που κυμαίνεται από 40 έως 0,02 ng /ml κατά την διάρκεια 1 έως 6 ημέρες) με αυτούς τους τρεις όγκους κυτταρικές σειρές.

Ανίχνευση sHLA-Ε με ELISA

πλάκες Nunc-Immuno MaxiSorp μικροτιτλοδότησης επικαλύφθηκαν (50 μί /φρεάτιο) με ΜΕΜ-E /08 mAb σε 1 μg /ml σε ανθρακικό /όξινο ανθρακικό ρυθμιστικό διάλυμα (CO

3HNa 35 mM, CO

3NA

2 15 mM, ρΗ 9,5) επί μία νύκτα στους 4 ° C. Μετά από τέσσερις εκπλύσεις με PBS-0.05% Tween 20 (200 μί /φρεάτιο), οι πλάκες κορέστηκαν με PBS που περιείχε 10% FCS για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου (200 μί /φρεάτιο). Μετά από τέσσερις πλύσεις, τα βιολογικά δείγματα (50 μΐ /φρεάτιο προαιρετικά αραιωμένο σε ρυθμιστικό κορεσμού) προστέθηκαν (εις τριπλούν) και επωάστηκαν για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Τα υπερκείμενα καλλιέργειας προσδιορίστηκαν χωρίς αραίωση, ενώ χρησιμοποιήθηκαν έξι διπλές αραιώσεις ορών. Η ανίχνευση βιοτινυλιωμένο ΜΕΜ-E /07 mAb αραιωμένο σε 1 μg /ml σε ρυθμιστικό κορεσμού προστέθηκε μετά από τέσσερις πλύσεις (50 μί /φρεάτιο) και επωάστηκαν πάλι για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Οι πλάκες πλύθηκαν τέσσερις φορές και επωάζονται με το αντιδραστήριο strepta-HRP (BD Pharmingen) αραιωμένο σε 1/1000 σε ρυθμιστικό κορεσμού για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Τέλος, οι πλάκες πλύθηκαν τέσσερεις φορές και επωάστηκαν με υπόστρωμα (3,3 ‘, 5,5’-τετραμεθυλβενζιδίνη υγρό, Sigma, ST Qentin Fallavier, Γαλλία) για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι (100 μL /φρεάτιο). Η αντίδραση διακόπηκε με την προσθήκη 100 μL /φρεάτιο 1 Μ Η

3PO

4. Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 450 nm με Thermo Scientific Multiskan EX. Ανάλυση της πρότυπης καμπύλης και παρεμβολή των συγκεντρώσεων δειγμάτων διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας Prism Software 5 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA).

Στατιστική ανάλυση

ορούς ασθενών με καρκίνο συγκρίθηκαν με ορούς από υγιείς δότες. Σύμφωνα με μη παραμετρική κατανομή των επιπέδων sHLA-Ε στον ορό, τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέσο, ​​διαμέσους, κλίμακες και τα ποσοστά των θετικών ορών sHLA-E. Για τη γενική σύγκριση των δύο ομάδων, στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με Mann-Whitney U test. Κατανομή των συγκεντρώσεων σε όλη στάδιο αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας το τεστ Kruskal-Wallis. Για να συγκριθεί η συχνότητα των θετικών ορών sHLA-Ε, χρησιμοποιήθηκε η δοκιμή Fisher. Η στατιστική ανάλυση των ρυθμιστική επίδραση των κυτοκινών επί της παραγωγής sHLA-Ε από κυτταρικές γραμμές όγκου έγινε με μονόδρομη ANOVA και ακολουθούνται από post hoc δοκιμασία Bonferroni. Μια τιμή Ρ & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση Prism 5 Λογισμικού (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA).

Ευχαριστίες

Ευχαριστούμε θερμά Pr Marie-Françoise Avril (APHP, Hôpital Cochin, υπηρεσία de dermatologie, Παρίσι, Γαλλία) για την παροχή δειγμάτων αίματος μελανώματος. Οι συγγραφείς επίσης να ευχαριστήσω Philippe Guillaume από την εγκατάσταση παραγωγής τετραμερούς του Ludwig Institute for Cancer Research (Λωζάνη, Ελβετία) για την παραγωγή των μονομερών HLA.