Αφηρημένο

Η αυξημένη έκφραση των υποδοχέων τύπου 2 της αγγειοτασίνης ΙΙ (ΑΤ2Κ) επάγει την απόπτωση σε πολλές κυτταρικές σειρές όγκων, είτε με αγγειοτενσίνη ΙΙ-εξαρτώμενη ή αγγειοτενσίνη ΙΙ-ανεξάρτητη ρύθμιση, αλλά μοριακός μηχανισμός της παραμένει ελάχιστα κατανοητή. Εδώ, χρησιμοποιήσαμε ανάλυση Array PCR για τον προσδιορισμό των προφίλ γονιδιακής έκφρασης και microRNA σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη σε μεταγωγή με ανασυνδυασμένο αδενοϊό AT2R. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι AT2R υπερέκφραση οδηγεί σε αυξητική ρύθμιση των 6 γονιδίων απόπτωσης που σχετίζονται με (TRAIL-R2, BAG3, BNIPI, HRK, Gadd45a, TP53BP2), 2 γονίδια κυτοκίνης (IL6 και IL8) και 1 microRNA, και προς τα κάτω ρύθμιση 1 απόπτωση που σχετίζονται με το γονίδιο TNFSF10 και 2 γονίδια κυτοκίνης (ΒΜΡ6, BMP7) σε μεταχθέντα κύτταρα DU145. HRK ταυτοποιήθηκε ως up-ρυθμιζόμενο γονίδιο σε AT2R-μεταδιηγερμένα κύτταρα PC-3 με πραγματικού χρόνου RT-PCR. Στη συνέχεια, θα χρησιμοποιηθούν τα siRNA να φιμώσουν τις up-ρυθμιζόμενα γονίδια για να καθορίσει περαιτέρω τους ρόλους τους στην ΑΤ2Κ υπερέκφραση απόπτωση. Τα αποτελέσματα έδειξαν αρνητική ρύθμιση της Gadd45a μείωσε την αποπτωτική δράση κατά ~ 30% σε κύτταρα DU145, ρύθμιση προς τα κάτω του HRK μειωμένη AT2R απόπτωση που διαμεσολαβείται κατά περισσότερο από 50% σε κύτταρα PC-3, ενώ ρύθμιση προς τα κάτω του TRAIL-R2 ενισχυμένη AT2R απόπτωση που διαμεσολαβείται περισσότερο από 4 φορές σε κύτταρα DU145. Βρήκαμε επίσης ότι οι επιπτώσεις στην ΑΤ2Κ-απόπτωση που προκαλείται από ρύθμιση προς τα κάτω της Gadd45a, TRAIL-R2 και HRK ήταν ανεξάρτητη στην ενεργοποίηση της p38 MAPK, ρ44 /42 ΜΑΡΚ και p53. Λαμβανόμενα μαζί, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι TRAIL-R2, Gadd45a και HRK μπορεί να είναι νέα γονίδια-στόχους για περαιτέρω μελέτη του μηχανισμού του AT2R μεσολάβηση απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα προστάτη

Παράθεση:. Pei Ν, Jie F, Luo J, Wan R, Zhang Υ, Chen X, et al. (2014) Gene Expression προφίλ Associated με αγγειοτασίνης II τύπου 2 υποδοχέα απόπτωση σε κύτταρα ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη. PLoS ONE 9 (3): e92253. doi: 10.1371 /journal.pone.0092253

Επιμέλεια: Gangjian Τσιν, το Πανεπιστήμιο Northwestern, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 6 Δεκ 2013? Αποδεκτές: 19 Φεβρουαρίου 2014? Δημοσιεύθηκε: 21, Μαρ του 2014

Copyright: © 2014 Pei et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας Grant 81072113 (HL), Εθνική 863 υψηλής Τεχνική Ανάπτυξη Έργα της Κίνας Grant 2012AA02A403 (HL), μέλος Βασικά Εργαστήριο παθογόνων και τη βιοασφάλεια Πρόγραμμα SKLPBS1103 (HL), καθώς και από τα βραβεία 2011A091000022, 2010B060500001 , 2011B060300028 και 2011B060300014 να WG από την κινεζική κυβέρνηση. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος

προστάτη είναι η πιο κοινή μορφή καρκίνου της Βόρειας Αμερικής άνδρες και είναι η δεύτερη κύρια αιτία νοσηρότητας και θνησιμότητας του καρκίνου στις ΗΠΑ [1], αν και πρόγνωση του έχει βελτιωθεί λόγω των χορηγήσεων σε διαγνωστικές και χειρουργικές τεχνικές . Μέχρι σήμερα, έχουν διάφορα είδη θεραπειών για τους ασθενείς με ορμονο-ανθεκτικό καρκίνο έχουν μελετηθεί, αλλά καμία αποτελεσματική θεραπεία έχει αναφερθεί. Ως εκ τούτου, νέες στρατηγικές θεραπείας για τον καρκίνο του προστάτη χρειάζονται επειγόντως.

Η αγγειοτενσίνη II (Ang II) είναι το κλειδί τελεστής στο σύστημα ρενίνης-αγγειοτασίνης. Ang II έχει δύο υποδοχείς: Ang II τύπου 1 και τύπου 2 υποδοχείς (ΑΤ2Κ) [2]. AT2R, η δεύτερη σημαντική ισομορφή του υποδοχέα, εκφράζεται κυρίως στο μεσέγχυμα του εμβρύου και σε περιορισμένο βαθμό σε ενήλικες ιστούς [3]. Είναι καλά καθιερωμένο ότι η αυξημένη έκφραση του AT2R επάγει απόπτωση σε πολυάριθμες κυτταρικές γραμμές, όπως το φαιοχρωμοκύτωμα, ινοβλάστες, κύτταρα λείου μυός, και τα ενδοθηλιακά κύτταρα μέσω είτε Ang II-εξαρτώμενη ή Ang II-ανεξάρτητη ρύθμιση [4] – [11]. Οι προηγούμενες μελέτες μας αποκάλυψαν ότι AT2R πάνω έκφραση επάγεται σημαντικά απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη [12]. Μια πρόσφατη μελέτη δείχνει ότι η ενδοτραχειακή χορήγηση μιας θεραπείας νανοσωματίδιο με βάση με το γονίδιο AT2R εξασθενίζει την ανάπτυξη του καρκίνου του πνεύμονα, και το αποτέλεσμα είναι καλύτερο από το TRAIL [13]. Παρά την επιτυχία στη σκιαγράφηση του φυσιολογικού ρόλου, των μοριακών και κυτταρικών δράσεις του ΑΤ2Κ-μεσολαβούν απόπτωση παραμένουν απροσδιόριστες. Εδώ, χρησιμοποιήσαμε ανάλυση σε πραγματικό χρόνο συστοιχία PCR στο προφίλ ενός μεγάλου αριθμού γονιδίων και microRNAs που εμπλέκονται στην απόπτωση που επάγεται AT2R σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη.

Στην έκθεση αυτή, μεταξύ γονίδια που μπορεί να σχετίζονται σε μονοπάτι απόπτωσης, υπάρχουν 7 απόπτωση που σχετίζονται με το γονίδιο, 4 κυτοκίνες και 1 εκφράσεις microRNA που άλλαξαν σε AT2R υπερεκφράζεται κύτταρα καρκίνου προστάτη σε σύγκριση με τον έλεγχο. AT2R επαγόμενη απόπτωση σε κύτταρα DU145 ενισχύθηκε όταν TRAIL-R2 χτυπήθηκε κάτω. Ωστόσο, τα αποπτωτικά αποτελέσματα που προκαλούνται από ΑΤ2Κ μειώθηκαν στα κύτταρα DU145 όταν Gadd45a σίγησε. Είναι ενδιαφέρον ότι, όταν HRK σίγησε, η απόπτωση που επάγεται από AT2R μειώθηκε σε PC-3 κύτταρα. Η μελέτη μας έδειξε επίσης ότι τα αποτελέσματα επί AT2R απόπτωση που διαμεσολαβείται που προκαλείται από τα κάτω ρύθμιση του TRAIL-R2 και HRK ήταν ανεξάρτητα στην ενεργοποίηση της ρ38 ΜΑΡΚ, ρ44 /42 ΜΑΡΚ και ρ53. Η μελέτη μας θα πρέπει να συμβάλει στον εντοπισμό των ΑΤ2Κ-ανίχνευσης παραγόντων που εμπλέκονται στα μονοπάτια της απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη, και να μας βοηθήσει να κατανοήσουμε ΑΤ2Κ με γνώμονα την απόπτωση καλύτερα με την παροχή υποτιθέμενο γονιδίων στόχων για περαιτέρω μελέτες.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture

ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές προστάτη (PC-3 και DU145 κύτταρα) ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Rockville, MD). PC-3 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο F-12 και τα κύτταρα DU145 καλλιεργήθηκαν σε μέσο ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% FBS κάτω από 5,0% CO

2. Οι οροί και τα μέσα ενημέρωσης αγοράστηκαν από την Invitrogen και American Type Culture Collection

ανασυνδυασμένου αδενοϊού Κατασκευές και Παρασκευή

Ανασυνδυασμένοι φορείς αδενοϊών δομήθηκαν, παρασκευάστηκαν, και τιτλοποιηθεί όπως περιγράφηκε προηγουμένως [14]:. Ένας αδενοϊικός φορέας που περιέχουν το ενισχυμένο γονίδιο πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης ελέγχεται από έναν υποκινητή του κυτταρομεγαλοϊού (Ad-CMV-EGFP) και ένας αδενοϊικός φορέας που περιέχει γονιδιωματικό AT2R (G-AT2R) DNA με ιντρόνια 1 και 2 και την περιοχή που κωδικοποιεί και την ενισχυμένη γονίδιο πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης ελέγχεται από κυτταρομεγαλοϊό προωθητές (Ad-G-ΑΤ2Κ-EGFP).

κυττάρων Θεραπεία

Για την ιογενή μεταγωγή, κύτταρα καρκίνου του προστάτη (4 × 10

5) σπάρθηκαν σε έξι-καλά καλλιέργειας ιστού Corning πλακών. Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα μεταδιεγείρονται με Ad-G-AT2R-EGFP ή τον φορέα ελέγχου Ad-CMV-EGFP και αλλαγές στην κυτταρική μορφολογία παρατηρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φθορισμού της Olympus BX41. Τα μετατραπέντα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν 24 έως 48 ώρες αργότερα, ανάλογα με το συγκεκριμένο πρωτόκολλο.

Για το μικρό παρεμβαλλόμενο RNA μελέτες (siRNA), DU145 και PC-3 κύτταρα επιμολύνθηκαν με είτε TRAIL-R2, GADD45A, TP53BP2, HRK ή siRNA ελέγχου χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Lipofectamine (Invitrogen) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Όλα τα siRNAs αγοράστηκαν από την Qiagen. Αυτές οι κατεργασίες που ακολουθείται 24 ώρες αργότερα από μεταγωγή με Ad-G-AT2R-EGFP (200 IFU /κύτταρο) και, στη συνέχεια, 48 ώρες αργότερα, /εξετάστηκαν πρωτεΐνες ο αριθμός των αποπτωτικών κυττάρων ή γονιδίων που σχετίζονται με την απόπτωση.

Απομόνωση RNA και Real-Time ΚΤ-ΡΟΚ

Ολικό RNA απομονώθηκε από τα επεξεργασμένα DU145 και PC3 κύτταρα χρησιμοποιώντας RNeasy Mini-Kit (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Απομονωμένο RNA υποβλήθηκαν ϋΝάσης Ι (OMEGA Biotek, Norcross, ΗΠΑ) επεξεργασία για την απομάκρυνση γονιδιακό DNA. Η συγκέντρωση του RNA προσδιορίστηκε με ND-1000 φασματοφωτόμετρο (Nanodrop, Rockland, DE, USA), και η καθαρότητα του RNA επιβεβαιώθηκε με 260/280 τιμή οπτικής πυκνότητας των 1.8-2.0. Τα δείγματα RNA αξιολογήθηκαν για την κατάσταση της υποβάθμισης με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης. Το απομονωμένο RNA μετά μετατράπηκε σε cDNA με ολίγο dT και PrimeScript ανάστροφης μεταγραφάσης (TAKARA, Dalian, Κίνα) Regents. Φθορισμού ποσοτική PCR πραγματοποιήθηκε με την προϋπόθεση θερμο-ποδηλασία: 95 ° C για 30s, που ακολουθείται από 40 κύκλους των 5s στους 95 ° C και 34s στους 60 ° C. Τα δείγματα αναλύθηκαν με το σύστημα PCR πραγματικού χρόνου ΑΒΙ 7500 (Applied Biosystems) και υποβλήθηκε σε συγκριτική △△ μέθοδος C

T χρησιμοποιώντας ανθρώπινα GAPDH ως το εσωτερικό πρότυπο. Πραγματικού χρόνου PCR προϊόντα (8 μΙ) φορτώθηκαν σε 2.5% πήκτωμα αγαρόζης που περιέχει βρωμιούχο αιθίδιο.

αποπτωτικά Gene Expression Ανάλυση Χρησιμοποιώντας PCR Πραγματικού χρόνου Array

Η σύνθεση του πρώτου κλώνου cDNA-εκτελέστηκε με το RT

2 κιτ First Strand (C-03), σύμφωνα με το πρωτόκολλο που παρέχεται από τον κατασκευαστή (SABiosciences, Frederick, MD, USA) τα δείγματα .Η cDNA μετά υποβλήθηκαν σε διαλογή για την έκφραση της 84 βασικά γονίδια που εμπλέκονται στην απόπτωση με μέσω του Ανθρώπου απόπτωση RT

2 Profiler PCR Array (PAH-012A? SuperArray, Frederick, MD, USA) σε 7500 πραγματικού χρόνου PCR σύστημα ΑΒΙ (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA), σύμφωνα με τον κατασκευαστή του πρωτόκολλα. Για να αποκτήσετε στατιστικώς δεδομένα, αναλύσαμε ελέγχου και τα πειραματικά δείγματα σε καθένα από τα δύο χρονικά διαστήματα εις τριπλούν. Οι εκφράσεις των γονιδίων στόχων μετρήθηκαν σε σχέση με τον κύκλο μέσο κατώφλι (C

T) τιμές του πέντε διαφορετικά γονίδια βαθμονομητή (Β2Μ, GAPDH, HPRT1, RPL13A και ACTB). Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως η σχετική μεταβολή πλάσια της γονιδιακής έκφρασης στο διεξάγεται ομάδα AT2R σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Γονίδια με σχετική φορές αλλάζει μεγαλύτερη από ± 2 θεωρήθηκαν ως ανάντη ή προς τα κάτω ρυθμισμένη σε έκφραση. Γονίδια που απέδωσε μια τιμή p & lt? 0,05 θεωρήθηκαν για να εμφανίσετε στατιστική σημασία για τη μελέτη

Ανάλυση Ανθρωπίνων κυτοκίνες Χρησιμοποιώντας Real-Time PCR Array και Real-Time RT-PCR

Η. δείγματα cDNA επίσης σε διαλογή για την έκφραση του 84 μονοπατιού εστιασμένη κυτοκίνες και μέσω RT

2 Profiler PCR Array Ανθρώπου κοινής κυτοκίνες (PAHs-021A? SuperArray, Frederick, MD, USA) σε έναν ΑΒΙ 7500 πραγματικού χρόνου PCR σύστημα (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA), σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή. Τα πειράματα διεξήχθησαν μία φορά μεταξύ των Ad-G-AT2R-EGFP-μεταδιηγερμένα κύτταρα και Ad-CMV-EGFP-επαγόμενα κύτταρα για διαλογή κυτοκίνες γενικά.

σε πραγματικό χρόνο RT-PCR χρησιμοποιήθηκε για την επικύρωση της προφίλ έκφρασης. Γονίδια επιλέχθηκαν με βάση την πιθανή φυσιολογικούς ρόλους τους και το βαθμό στον οποίο ρυθμίζονταν από την υπερέκφραση του AT2R. Ολιγονουκλεοτιδικοί εκκινητές και Taqman ανιχνευτές ειδικούς για Bcl-2, IL6 και IL8 ελήφθησαν από την Applied Biosystems. Απομόνωση ολικού RNA έγινε όπως περιγράφεται παραπάνω. Το καθαρισμένο RNA (25 ng) χρησιμοποιείται για να κάνει RT-PCR σε ένα Applied Biosystems Prism 7000 Σύστημα Ανίχνευσης Αλληλουχίας, με τη χρήση του One-Step RT-PCR Master Mix Αντιδραστήρια. Η έκφραση του γονιδίου GAPDH οικοκυρικής χρησιμοποιήθηκε για να ομαλοποιήσει την έκφραση του mRNA. Ποσοτικοποίηση και ανάλυση της έκφρασης του γονιδίου προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το κατώφλι συγκριτική κύκλου της μεθόδου (C

Τ), όπως περιγράφεται στο Applied Biosystems User Bulletin # 2. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση των επιπέδων άλλων κυτοκινών που φαίνονται στον Πίνακα 1 και σε πραγματικό χρόνο PCR χρησιμοποιώντας SYBR Πρόμιγμα Εχ Taq (TAKARA) Regents όπως περιγράφεται παραπάνω.

Η

Ανθρώπινο Τα microRNAs Ανάλυση Χρησιμοποιώντας Real-Time Array PCR και Real-Time RT-PCR

Για την ποσοτικοποίηση της έκφρασης των miRNAs, το συνολικό RNA εξήχθη από Ad-G-ΑΤ2Κ-EGFP-μετάγονται και Ad-CMV-EGFP προκαλείται από κύτταρα με RNeasy Mini-Kit (Invitrogen ). Το απομονωμένο ολικό RNA μεταγράφηκε αντίστροφα με τη χρήση του OneStep PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit (Takara, Japan) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα δείγματα cDNA ελέγχθηκαν για την έκφραση 88 μονοπατιού εστιασμένη miRNAs miScript miRNA PCR Array Human Cancer PathwayFinder (MIHS-102Z? Frederick, MD, USA). Σε 7500 πραγματικού χρόνου PCR σύστημα ΑΒΙ

microRNAs αναλύθηκαν περαιτέρω με βάση την πιθανή τους ρόλους τους στον καρκίνο και την έκφραση που ήταν σημαντικά ρυθμίζονται στο σύστημα Array miRNA PCR. Αυτό το όριο επελέγη για να μειωθεί ο αριθμός των γονιδίων σε έναν πιο εφαρμόσιμο αριθμό και να επικεντρωθεί σε αυτά τα γονίδια των οποίων η έκφραση άλλαξε σημαντικά. Χρησιμοποιώντας αυτά τα κριτήρια, ήμασταν σε θέση να περιορίσετε την εστίασή μας σε 14 παρακάτω miRNAs: HSA-miR-let7c? HSA-miR-let7e? HSA-miR-21? HSA-miR-125? HSA-miR-126? HSA-miR-146? HSA-miR-150? HSA-miR-182? HSA-miR-183? HSA-miR-193? HSA-miR-767? HSA-miR-149? HSA-miR-100? HSA-miR-32. Σχετική έκφραση υπολογίστηκε μέσω της μεθόδου συγκριτική κατώφλι κύκλου (C

T) χρησιμοποιώντας την έκφραση του U6 μικρού πυρηνικού RNA ως αναφορά. Η Uni-miR qPCR Primer συμπεριλήφθηκε στο κιτ. Το ποσό των miRNA παρακολουθήθηκε με SYBR Προμίγματα Ex Taq II (Perfect Real Time) (Takara, Ιαπωνία). Οι συνθήκες PCR ήταν 30s στους 95 ° C, ακολουθούμενη από 40 κύκλους στους 95 ° C για 5 s και 60 ° C για 30s.

Η απόπτωση Εκτίμηση

Ο αριθμός των πράσινων φθοριζόντων κυττάρων που εμφανίζουν αποπτωτική μορφολογία παρόμοια επάγεται από AT2R απόπτωση μετά την επιμόλυνση siRNAs αξιολογήθηκε με μέτρηση των κυττάρων από 10 τυχαία πεδία ανά φρεάτιο. Μετρήσεις έγιναν από ένα άτομο που είχε τυφλωθεί ως προς τη θεραπεία.

Western Blot Ανάλυση

Δυτική ανοσοαποτυπώματα έτρεξαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15]. Πρωτογενή αντισώματα και οι πηγές τους έχουν ως εξής. Αντι-ολική ΜΑΡΚ p38, αντι-ολική ρ53, αντι-ολική ρ44 /42 ΜΑΡΚ, αντι-φωσφορυλιωμένη ρ44 /42 (pp44 /42) ΜΑΡΚ, και αντι-φωσφορυλιωμένη p53 (pp53) ήταν από την Cell Signaling Technology. Anti-φωσφορυλιωμένη p38 (ρρ38) ΜΑΡΚ ήταν από την Millipore. Αντι-β-ακτίνης και το δευτερεύον αντισώματα κοχλιαρίας συζευγμένη με υπεροξειδάση IgG αντι-κουνελιού και αντι-κουνελιού IgG ήταν από την Sigma-Aldrich. Αντι-κατσίκα IgG ήταν από την Santa Cruz Biotechnology.

Στατιστική Ανάλυση

Για όλα τα πειράματα, ιογενή μεταγωγή έγινε σε φρεάτια εις τριπλούν και επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± τυπική απόκλιση (SD) από 3 έως 5 ανεξάρτητα πειράματα. Η στατιστική ανάλυση έγινε με SPSS 13.0 λογισμικό. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση Τ-δοκιμή όταν συγκρίθηκαν μόνο 2 ομάδες, και με ANOVA όταν συγκρίθηκαν 3 ή περισσότερες ομάδες. P & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

αδενοϊό-έκφραση που διαμεσολαβείται από ΑΤ2Κ σε κύτταρα του προστάτη Καρκίνος

Στην παρούσα μελέτη μας, τα κύτταρα DU145 μολυνθεί με Ad-G-. AT2R-EGFP (100 IFU /κύτταρο, 2 ημέρες) επέδειξαν μεγάλο αριθμό των αποπτωτικών κυττάρων σε σύγκριση με τον φορέα ελέγχου (Εικ. 1Α, Β, C, D), σε συμφωνία με προηγούμενη αναφορά μας [12]. Στη συνέχεια, σε πραγματικό χρόνο PCR χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η σχετική έκφραση του AT2R. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι ήταν σημαντικά AT2R υπερεκφράζεται σε Ad-G-AT2R-EGFP-μετάγονται DU145 ή PC-3 κύτταρα με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Πίνακας 2 και Εικ. 1 Ε, F).

DU145 κύτταρα ήταν μεταγωγή με Ad-G-AT2R-EGFP (Β και D) και Ad-CMV-EGFP (Α και C) (100 IFU /κύτταρο) επί 2 ημέρες, και η μορφολογία των κυττάρων εξετάστηκε κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού. Κλίμακα μπαρ, 50μm. Ολικό RNA εκχυλίστηκε από μεταχθέντα κύτταρα DU145 και AT2Rs ανιχνεύθηκαν με πραγματικού χρόνου RT-PCR. Αιθίδιο πηκτές βρωμιούχο χρώση δείχνουν AT2R (Ε) και GAPDH (F) μεταγραφές σε μεταχθέντα κύτταρα. Μ, DL 2.000 DNA τσάι (Takara)? 1, 3, 5, 7, 9: μεταγωγή με 10, 20, 50, 100, 200 IFU /κύτταρο χωριστά από Ad-G-AT2R-EGFP? 2, 4, 6, 8, 10:. Μεταγωγή με 10, 20, 50, 100, 200 IFU /κύτταρο χωριστά από Ad-CMV-EGFP

Η

TRAIL-R2 και Gadd45a Συμβολή να ΑΤ2Κ απόπτωση σε κύτταρα DU145

ανάλυση Array

PCR πραγματοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των μοριακών επιδράσεις της έκφρασης AT2R σε κύτταρα DU145. Από τα 84 γονίδια που εκπροσωπούνται στο Ανθρώπινο απόπτωση RT

2 προφίλ Array Profiler PCR, τα επίπεδα έκφρασης των 6 γονιδίων (TRAIL-R2, BAG3, BNIPI, HRK, Gadd45a, TP53BP2) ήταν μέχρι ρυθμιζόμενα και ένα γονίδιο (TNFSF10) ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω σε κύτταρα DU145 μεταγωγή με Ad-G-AT2R-EGFP (Πίνακας 3, Εικ. 2). Αυτά τα διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια μπορούν να διατεθούν για γονίδια που κωδικοποιούν τον παράγοντα νέκρωσης όγκου (TNF) συνδέτη οικογένειας (TNFSF10), η οικογένεια υποδοχέων TNF (TNFRSF10B), το Bcl-2 οικογένειας (BAG3, BNIP1, HRK) καθώς και πρωτεΐνη όγκου ρ53 δέσμευσης πρωτεΐνη 2 (TP53BP2) και την ανάπτυξη σύλληψη και βλάβη του DNA επαγόμενο, άλφα (Gadd45a). Είναι ενδιαφέρον ότι, Bcl-2 δεν ρυθμιζόταν σημαντικά σε ανάλυση Array PCR. Real-time PCR χρησιμοποιήθηκε περαιτέρω το κύρος της έκφρασής του. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι δεν υπήρξε σημαντική μεταβολή στην έκφραση Bcl-2 σε Ad-G-AT2R-EGFP-μεταδιηγερμένα κύτταρα DU145 σε σύγκριση με Ad-CMV-EGFP-μεταχθέντα κύτταρα (Σχ. 3).

Κύτταρα κατεργασμένα με Ad-CMV-EGFP (200ifu /κύτταρο) χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας.

η

κύτταρα DU145 μετήχθησαν είτε με Ad-G-ΑΤ2Κ-EGFP (ΑΤ2Κ) ή Ad-CMV-EGFP (EGFP ) για 2d σε 200 IFU /κύτταρο. Αυτές οι κατεργασίες να ακολουθεί το συνολικό RNA απομόνωση και, στη συνέχεια, σε πραγματικό χρόνο RT-PCR ανάλυση χρησιμοποιώντας ειδικούς ολιγονουκλεοτιδικούς εκκινητές και ανιχνευτές Taqman. Όλα τα δεδομένα κανονικοποιήθηκαν έναντι των επιπέδων έκφρασης mRNA GAPDH εντός του ίδιου δείγματος. Στήλες, σημαίνει από τρία ξεχωριστά πειράματα.

Η

τεχνολογία παρεμβολής siRNA χρησιμοποιήθηκε για να καθοριστεί περαιτέρω ο ρόλος των τεσσάρων up-ρυθμιζόμενα γονίδια, συμπεριλαμβανομένων TRAIL-R2, Gadd45a, TP53BP2 και HRK, σε ΑΤ2Κ επαγόμενη απόπτωση σε μεταχθέντα κύτταρα DU145. Η επιμόλυνση αυτών των siRNAs στα κύτταρα DU145 μειωμένη έκφραση mRNA τους (Σχ. 4Α). Κατεργασία DU145 κυττάρων με το Gadd45a siRNA μείωσε την αποπτωτικό αποτέλεσμα σε περίπου 30%, ενώ TP53BP2 siRNA και HRK siRNA δεν προκάλεσε σημαντική διαφορά επί AT2R απόπτωση που διαμεσολαβείται σε σύγκριση με τους μάρτυρες. Είναι ενδιαφέρον ότι, η επεξεργασία των DU145 κυττάρων με το TRAIL-2 siRNA αύξησε σημαντικά τον AT2R επαγόμενη απόπτωση πάνω από 4 φορές σε σχέση με το siRNA ελέγχου επιμολυσμένα κύτταρα (Σχ. 4Β). Επιπλέον, η αυξημένη απόπτωση δεν οφειλόταν στην άμεση επίδραση του TRAIL-R2 siRNA, αφού TRAIL-R2 siRNA μόνη προκάλεσε κανένα αποπτωτικό αποτέλεσμα (τα δεδομένα δεν είχαν φαίνονται).

κύτταρα DU145 επιμολύνθηκαν με TRAIL-R2, Gadd45a, TP53BP2 ή HRK siRNA (20 nmol /L) ή τον έλεγχο siRNA (20 nmol /L) που ακολουθείται από μεταγωγή με Ad-G-AT2R-EGFP (100 IFU /κύτταρο) για 2 d. (Α) siRNAs μεσολάβηση-μείωση της έκφρασης mRNA σε μεταγωγή κύτταρα DU145? (Β) Πράσινη φθορίζουσα κύτταρα που εμφανίζουν αποπτωτική μορφολογία, οι οποίες μετρήθηκαν από 10 πεδία ανά πηγάδι .. Στήλες, σημαίνει τριών πειραμάτων? μπαρ, SE. *, P & lt?. 0.05

Η

Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η απόπτωση που επάγεται από ΑΤ2Κ υπερέκφραση εξαρτάται εν μέρει από Gadd45a στα κύτταρα DU145. TRAIL-R2 μπορεί να είναι ένας αρνητικός ρυθμιστής σε AT2R επαγόμενη απόπτωση σε κύτταρα DU145.

HRK συμβάλλει στην ΑΤ2Κ απόπτωση σε κύτταρα PC-3

Λαμβάνοντας υπόψη τα αυξητικά γονίδια που παράγονται από υπερέκφραση AT2R σε κύτταρα DU145, διερευνήσαμε την επόμενη τις επιδράσεις της υπερέκφρασης AT2R επί των γονιδίων σε κύτταρα PC-3 με πραγματικού χρόνου RT-PCR. Δείξαμε ότι τα επίπεδα έκφρασης του HRK (ένα προ-αποπτωτικό γονίδιο) αυξήθηκαν σε PC-3 κύτταρα σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο και έφθασε σε πολύ υψηλό επίπεδο 100ifu /κύτταρο (Σχ. 5Α).

Α, η έκφραση HRK mRNA σε κύτταρα PC3 μεταγωγή με τις υποδεικνυόμενες δόσεις. Β και C, τα κύτταρα PC3 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 20 nmol /L HRK siRNA ή ελέγχουν siRNA και Ad-G-AT2R-EGFP (200 IFU /κύτταρο) όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι που ακολουθείται 48 ώρες αργότερα με πραγματικού χρόνου RT-PCR ανάλυση (Β) είτε HRK mRNA ή εκτίμηση των κυττάρων με αποπτωτική μορφολογία παρόμοια (C). Στήλες, σημαίνει από τρία ξεχωριστά πειράματα σε κάθε περίπτωση? μπαρ, SE. *, P & lt? 0,05 έναντι κυττάρων ελέγχου

Η

Για να διερευνήσουν το ρόλο της HRK στην ΑΤ2Κ απόπτωση στα κύτταρα PC3, HRK siRNA μετήχθη στο PC 3-κύτταρα για να μειώσετε στην έκφραση HRK (Εικ. . 5Β). Το αποτέλεσμα έδειξε προς τα κάτω ρύθμιση των HRK σε κύτταρα PC-3 μείωσε σημαντικά την AT2R επαγόμενη απόπτωση με -45% (Σχ. 5C).

Η συμμετοχή των Gadd45a, TRAIL-R2 και HRK σε AT2R απόπτωση Ανεξάρτητοι της p38 MAPK, ρ44 /42 ΜΑΡΚ και p53

Ερευνήσαμε περαιτέρω την κατάντη της οδού σηματοδότησης που προκαλείται από ΑΤ2Κ υπερ-έκφραση στην κυτταρική απόπτωση. προηγούμενη μελέτη μας έδειξε ότι η αυξημένη έκφραση του AT2R διεγείρουν απόπτωση μέσω της ενεργοποίησης του μονοπατιού ρ38 ΜΑΡΚ [14]. Αλλά στην παρούσα μελέτη, η ενεργοποίηση της ρ38 ΜΑΡΚ, ρ53 και ρ44 /42MAPK είχαν δεν παρατηρήθηκαν σε ρύθμιση προς τα κάτω του Gadd45a και TRAIL-R2 διαμεσολαβείται AT2R επαγόμενη απόπτωση σε κύτταρα DU145 (Σχ. 6Α, 6Β, 6C). Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν επίσης σε κύτταρα PC3 (Σχ. 7Α, 7Β, 7C). Αυτά δείχνουν ότι η συμμετοχή των Gadd45a, TRAIL-R2 και HRK σε ΑΤ2Κ-απόπτωση ήταν ανεξάρτητη στην ενεργοποίηση της p38 MAPK, ρ53 και ρ44 /42 ΜΑΡΚ.

κύτταρα DU145 επιμολύνονται με TRAIL-R2 siRNA

(Λωρίδα 1),

Gadd45a

siRNA (Λωρίδα 2)

, TP53BP2 siRNA

(Λωρίδα 3)

, HRK siRNA

(Λωρίδα 4)

, έλεγχος

siRNA (λωρίδα 5)

ή ψευδο

(λωρίδα 6)

ακολουθείται 24 ώρες αργότερα από μεταγωγή με Ad-G-AT2R-EGFP (200 IFU /κύτταρο). Μετά από 2 d επώασης, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και υποβλήθηκαν σε αναλύσεις Western blot (αντιπροσωπευτικά τριών διαφορετικών πειραμάτων). επίπεδα (Α) έκφραση του συνόλου των ρ44 /42, pp44 /42 και β-ακτίνης ζώνες πρωτεΐνης. επίπεδα (Β) έκφραση του συνόλου των p38, ρρ38 και β-ακτίνης ζώνες πρωτεΐνης. (Γ) τα επίπεδα έκφρασης του συνόλου των p53, pp53 και β-ακτίνη πρωτεϊνικές ζώνες.

Η

κύτταρα PC-3 επιμολύνονται με HRK siRNA

(Λωρίδα 1)

, ελέγχου

siRNA (Λωρίδα 2)

ή εικονικές

(Λωρίδα 3)

ακολουθείται 24 ώρες αργότερα από μεταγωγή με Ad-G-ΑΤ2Κ-EGFP (200 IFU /κύτταρο). Μετά από 2 d επώασης, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και υποβλήθηκαν σε αναλύσεις Western blot (αντιπροσωπευτικά τριών διαφορετικών πειραμάτων). (Α) τα επίπεδα έκφρασης του συνόλου των ρ44 /42, pp44 /42 andβ-ακτίνη πρωτεΐνη ζώνες. επίπεδα (Β) έκφραση του συνόλου των p38, ρρ38 andβ-ακτίνης ζώνες πρωτεΐνης. (Γ) τα επίπεδα έκφρασης του συνόλου των p53, pp53 και β-ακτίνη πρωτεϊνικές ζώνες.

Η

κυτοκίνες και Τα microRNAs Έκφραση Επικύρωση

Πάνω και κάτω-ρυθμίζονται κυτοκινών και microRNAs σαρώθηκαν από Σε πραγματικό Array time PCR σε μεταγωγή κύτταρα DU145 (σχήμα 8Α, 9Α). Real-time RT-PCR χρησιμοποιήθηκε για την επικύρωση της έκφρασης κυτοκίνης και microRNA διαμόρφωση της γενικής εικόνας που παράγεται από AT2R υπερέκφραση σε κύτταρα DU145. Τα γονίδια και microRNAs επιλέχθηκαν με βάση τις αλλαγές τους έκφρασης, οι οποίες ελήφθησαν από την ανάλυση της σειράς PCR, και την πιθανή φυσιολογικοί ρόλοι στην απόπτωση και τον πολλαπλασιασμό. Τα επίπεδα mRNA της IL8 και IL6 αυξήθηκαν περισσότερο από 2 φορές και 40% αντίστοιχα σε κύτταρα DU145 μεταγωγή με Ad-G-AT2R-EGFP σε σύγκριση με το Ad-CMV-EGFP-μεταχθέντα κύτταρα (Σχ 8Β & amp?. C), ενώ ΒΜΡ6 ( Σχ. 8D), BMP7 (Εικ. 8Ε) μειώθηκαν κατά 50% και 45%, αντίστοιχα, και την έκφραση του BmP1, ΒΜΡ4, BMP8B, TGFB1, TGFB2 και TGFB3 (Fig.8F, 8G, 8Η, 8J) δεν είχαν μεταβληθεί σημαντικά . Όσον αφορά την microRNAs, το αποτέλεσμα έδειξε ότι microRNA 150 αυξήθηκε περισσότερο από 5 φορές σε κύτταρα DU145 μεταγωγή με Ad-G-AT2R-EGFP σε σύγκριση με το Ad-CMV-EGFP-μεταδιηγερμένα κύτταρα, ενώ άλλες microRNAs δεν ήταν σημαντικά αλλάξει (Σχ. 9Β). Αυτά τα αποτελέσματα ήταν σύμφωνα με τα στοιχεία μας Array miScript miRNA PCR.

κύτταρα DU145 μετήχθησαν είτε με Ad-G-ΑΤ2Κ-EGFP (ΑΤ2Κ) ή Ad-CMV-EGFP (EGFP) για 2 ημέρες σε 200 IFU /κύτταρο. Άλλες ομάδες των κυττάρων ήταν παρωδία μεταγωγή. Α Πάνω και κάτω ρυθμισμένα κυτοκίνες υποβλήθηκαν σε διαλογή με PCR πραγματικού χρόνου Array σε κύτταρα DU145. Σε πραγματικό χρόνο ανάλυση RT-PCR του είτε IL8 (Β), IL6 (C), ΒΜΡ6 (D), BMP7 (Ε), BmP1 (F), ΒΜΡ4 (G), BMP8B (H), TGFB1 (J), TGFB2 (J) και TGFB3 (J). Όλα τα δεδομένα κανονικοποιήθηκαν έναντι των επιπέδων έκφρασης mRNA GAPDH εντός του ίδιου δείγματος. Στήλες, σημαίνει από τρία ξεχωριστά πειράματα? μπαρ, SE. *, P & lt? 0.05.

Η

κύτταρα DU145 μετήχθησαν είτε με Ad-G-ΑΤ2Κ-EGFP (ΑΤ2Κ) ή Ad-CMV-EGFP (EGFP) για 2 ημέρες σε 200 IFU /κύτταρο. Αυτές οι κατεργασίες που ακολουθείται από απομόνωση του mRNA και, στη συνέχεια, σε πραγματικό χρόνο RT-PCR ανάλυση των επιλεγμένων microRNA. Όλα τα δεδομένα ομαλοποιήθηκαν έναντι έκφραση επίπεδα U6 εντός του ίδιου δείγματος. Στήλες, σημαίνει από τρία ξεχωριστά πειράματα? μπαρ, SE. *, P & lt? 0,05 έναντι του Ad-CMV-EGFP μεταγωγή. Α Πάνω και κάτω-ρυθμίζονται microRNAs σαρώθηκαν από την Real-time PCR Array στα κύτταρα DU145. Β Επικύρωση της έκφρασης microRNA, χρησιμοποιώντας σε πραγματικό χρόνο PCR.

Η

Συζήτηση

Για το καλύτερο της γνώσης μας, αυτή είναι η πρώτη μελέτη που αξιολογεί σαφώς το γονίδιο σχετίζονται με την απόπτωση, κυτταροκίνες προφίλ γονιδιακής έκφρασης και microRNA που συνδέονται με AT2R επαγόμενη απόπτωση σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Είναι επίσης η πρώτη μελέτη για να αναφέρουν τις άμεσες επιδράσεις της επιλεκτικής Gadd45a, TRAIL-R2 και HRK στην απόπτωση που επάγεται από την υπερβολική έκφραση των AT2R σε DU145 ή κύτταρα PC-3. Αυτά τα αποτελέσματα παρέχουν σημαντικές πληροφορίες προς μια καλύτερη κατανόηση της μοριακής μηχανισμού στις AT2R μεσολάβηση απόπτωση σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη.

Σε αυτή τη μελέτη, παρατηρήσαμε ότι η αναγκαστική υπερέκφραση του AT2R οδήγησε σε σημαντικές αλλαγές σε ένα μεγάλο αριθμό γονιδίων και microRNA εκφράσεις μέσω της ανάλυσης Array PCR. Στη συνέχεια, έχουμε αποδείξει ότι το TRAIL-R2 και Gadd45a εμπλέκονται στην απόπτωση που επάγεται από AT2R σε κύτταρα DU145 και HRK έπαιξε σημαντικό ρόλο στην AT2R απόπτωση που διαμεσολαβείται σε PC-3 κύτταρα. Τέλος, TRAIL-R2, Gadd45a και HRK εμπλοκής στην απόπτωση που επάγεται από AT2R ήταν ανεξάρτητα στην ενεργοποίηση της ρ38 ΜΑΡΚ, ρ44 /42 ΜΑΡΚ και ρ53 σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη.

Gadd45a ήταν ρυθμισμένα προς τα πάνω σε AT2R-υπερεκφράζεται DU145 κύτταρα παρούσα μελέτη μας. Gadd45a, ένα ρ53-ρυθμιζόμενη και DNA γονίδιο βλάβη που επάγεται, είναι ένα μέλος της οικογένειας GADD45 των γονιδίων που είναι γνωστά αισθητήρες πίεσης, η οποία ρυθμίζει την κυτταρική απόκριση σε μια ποικιλία συνθηκών στρες, συμπεριλαμβανομένων γονιδιοτοξικές και ογκογόνο στρες [16] – [ ,,,0],19]. Άλλες μελέτες έχουν δείξει ότι Gadd45a αναστέλλει την αγγειογένεση των όγκων μέσω μπλοκαρίσματος του μονοπατιού mTOR /STAT3 [20]. Gadd45a είναι ένας μεταγραφικός στόχος για ογκοκατασταλτικό ρ53 και BRCA 1, του οποίου η απώλεια του παιχνιδιού λειτουργίας βασικούς ρόλους στην ανάπτυξη του καρκίνου [21]. Επιπλέον, Ζερμπίνη L, et al [22] έχουν δείξει ότι JunD, Gadd45a και Gadd45g ως θεραπευτικοί στόχοι στην Caner προστάτη. Σύμφωνα με αυτή τη μελέτη, τα δεδομένα μας έδειξαν ότι AT2R απόπτωση που διαμεσολαβείται ήταν εν μέρει εξαρτάται από Gadd45a σε κύτταρα DU145.

Τα δεδομένα που παρουσιάζονται εδώ δείχνουν ότι TRAIL-R2 εμπλέκεται στην AT2R-μεσολαβούμενη απόπτωση κυττάρων DU145. Ένας μεγάλος αριθμός από ισχυρές ενδείξεις ότι TRAIL, μια επαγωγής απόπτωσης συνδέτη, πυροδοτεί απόπτωση σε πολλαπλές κυτταρικές γραμμές καρκίνου χωρίς τοξικότητα για τα φυσιολογικά κύτταρα [23]. TRAIL έχει τουλάχιστον τέσσερις υποδοχείς κυτταρικής επιφάνειας, και επάγει την απόπτωση μέσω δύο στενά συνδεδεμένα υποδοχείς, TRAIL-R1 και TRAIL-R2 [24]. TRAIL-R1 και TRAIL-R2 επάγουν εξαρτώμενη από FADD απόπτωση και την ενεργοποίηση του μονοπατιού NF-κΒ [25]. υποδοχείς TRAIL /του μεμβρανικές εκφράζονται συστατικά σε υψηλά επίπεδα σε πρωτογενή και μεταστατικά καρκινώματα σε σχεδόν όλους τους ασθενείς [26]. Η μελέτη μας παρουσιάζονται εδώ έδειξαν ότι TNFSF10 (TRAIL) ήταν κάτω-ρυθμίζονται ενώ TRAIL-R2 ήταν ρυθμισμένα προς τα πάνω σε κύτταρα DU145 AT2R-υπερεκφράζεται. Είναι ενδιαφέρον ότι, ρύθμιση προς τα κάτω του TRAIL-R2 ενίσχυσε σημαντικά την αποπτωτική επίδραση που προκαλείται από υπερέκφραση AT2R. Τα στοιχεία μας έδειξαν επίσης ότι η απόπτωση ήταν μη ανιχνεύσιμη όταν TRAIL-R2 χτυπήθηκε κάτω μόνο. Ως εκ τούτου, τα πειράματα μας δείχνουν ότι το TRAIL και TRAIL-R2 μπορεί να είναι αρνητικοί ρυθμιστές σε AT2R μεσολάβηση απόπτωση σε κύτταρα DU145, και η συνδυασμένη θεραπεία με AT2R υπερέκφραση και TRAIL-R2 προς τα κάτω ρύθμιση μπορεί να είναι πολλά υποσχόμενη ως μια νέα γονιδιακή θεραπεία κατά του ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη.

Μερικά καρκινικά κύτταρα είναι ανθεκτικά σε TRAIL-επαγόμενης κυτταροτοξικότητας, αν και TRAIL έχει αναφερθεί ότι επάγουν απόπτωση μιας ποικιλίας τύπων κυττάρου όγκου [27], [28]. Η αποτυχία να υποστούν απόπτωση έχει εμπλακεί στην αντίσταση των καρκινικών κυττάρων σε επιτήρηση TRAIL και ως εκ τούτου στην ανάπτυξη του όγκου. Τα μοριακά καθοριστικούς παράγοντες του TRAIL-επαγώμενη απόπτωση δεν έχουν πλήρως εξετασθεί σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του προστάτη. LNCaP και του καρκίνου του προστάτη DU145 κύτταρα είναι ανθεκτικά σε TRAIL απόπτωση, και TRAIL ήταν λιγότερο δραστική εναντίον τους συγκρίνει με PC-3 καρκίνου του προστάτη κύτταρα [29], [30]. Η ευαισθησία για TRAIL επαγόμενη απόπτωση θα μπορούσαν να συσχετιστούν με τις σχετικές εκφράσεις του TRAIL-R1 και TRAIL-R2 έναντι DcR1 και DcR2 ή τα ενδοκυτταρικά επίπεδα Φλόγας-1 [31], [32]. Ωστόσο, σε σύγκριση με κύτταρα LNCaP, τα οποία έχουν τη χαμηλότερη ευαισθησία σε TRAIL απόπτωση, ιδιαίτερα ευαίσθητα κύτταρα PC-3 που εμφανίζεται παρόμοια ή χαμηλότερα επίπεδα πρωτεΐνης TRAIL-R1 και TRAIL-R2 και υψηλότερα επίπεδα DcR2 [30]. Είναι, επίσης, βρεθεί ότι η έκφραση του TRAIL-R1 και TRAIL-R2 στον TRAIL-ευαίσθητη ΜΟΡ10Α κυτταρική γραμμή δεν ήταν διαφορετική από ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές, π.χ., 184B5 [33]. Αυτό καθιστά απίθανο ότι η ευαισθησία για TRAIL επαγόμενη απόπτωση είναι πλήρως ελεγχόμενη από τις σχετικές ποσότητες των TRAIL-R1 και TRAIL-R2. Προτείνει ότι άλλοι παράγοντες ή άλλοι μηχανισμοί μπορεί να είναι σημαντικοί ρυθμιστές της ευαισθησίας στην TRAIL επαγόμενη απόπτωση σε αυτά τα καρκινικά κύτταρα. Πιθανώς, σε αυτή τη μελέτη TRAIL-R2 που ρυθμίζουν αρνητικά AT2R μεσολάβηση απόπτωση σε κύτταρα DU145 θα μας βοηθήσει να διερευνήσει τους μηχανισμούς της ευαισθησίας στην TRAIL επαγόμενη απόπτωση σε διαφορετικά κύτταρα.

Μια πολύ πρόσφατη παρατήρηση ότι TRAIL-R2, σκέψης μόνο πράξη όταν διεγείρεται από TRAIL στην κυτταρική επιφάνεια, εκπληρώνει μια ξεχωριστή λειτουργία στον πυρήνα όπου αυτή προάγει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε ένα TRAIL-ανεξάρτητο τρόπο υποδηλώνει ένα συγκεκριμένο, πολλαπλασιασμός που σχετίζεται με τη λειτουργία των πυρηνικών TRAIL-R2 [34]. Πυρηνική TRAIL-R2 αναστέλλει την ωρίμανση των microRNA ας-7 σε παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές και αυξάνει τον πολλαπλασιασμό τους. Παγκρέατος δείγματα όγκων έχουν αυξημένα επίπεδα πυρηνικής TRAIL-R2, τα οποία συσχετίζονται με την κακή έκβαση των ασθενών [34]. Αυτά τα ευρήματα δείχνουν ότι στον πυρήνα, υποδοχέων θανάτου μπορούν να λειτουργήσουν ως υποκινητές όγκων και μπορεί να είναι θεραπευτικοί στόχοι, και ο άνθρωπος να μας βοηθήσει να μελετήσουμε περαιτέρω τη σχέση μεταξύ AT2R και TRAIL-R2.

Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι HRK (pro -apoptotic ΒΗ3-μόνο Bcl-2 μέλος της οικογένειας, χαρακίρι) είναι ένα προ-αποπτωτικό γονίδιο σε διάφορα κύτταρα [35] – [41]. HRK αδρανοποίηση σχετίζεται με ένα χαμηλό δείκτη αποπτωτικών στη δευτεροβάθμια γλοιοβλαστώματα [42]. Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι HRK ήταν up-ρυθμίζεται AT2R-υπερεκφράζεται DU145 και PC-3 κύτταρα, και όταν HRK σίγησε, AT2R απόπτωση που διαμεσολαβείται ήταν σημαντικά μειωμένες σε PC-3 αλλά δεν DU145 κύτταρα. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η απόπτωση που επάγεται από AT2R υπερ-έκφραση είναι τουλάχιστον εν μέρει εξαρτάται από HRK σε PC-3 κύτταρα. Είναι, επίσης, αποδειχθεί ότι τα επίπεδα έκφρασης του HRK αυξήθηκαν σε κύτταρα PC-3, αντίστοιχα με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Συλλογικά, τα ευρήματά μας έδειξαν ότι η απόπτωση που επάγεται από την υπερέκφραση του AT2R μπορεί να εξαρτάται από την HRK προ-αποπτωτική παθολογική οδό σε κύτταρα PC-3. Ωστόσο, υπάρχουν μερικές ερωτήσεις που πρέπει να απαντηθούν, όπως ο μηχανισμός του αποπτωτικού μονοπατιού από AT2R προς HRK δεν απεικονίζεται και κατά πόσον η HRK μπορούσε πυροδοτεί απόπτωση σε άλλα κύτταρα καρκίνου του προστάτη ή όχι.

προηγούμενα πειράματα μας δείχνουν ότι επάγεται AT2R απόπτωση είναι συνδέτης (Ang II) ανεξάρτητα, με τη μεσολάβηση ρ38 ΜΑΡΚ και κασπάσης-3, και λαμβάνει χώρα μέσω ενός μονοπατιού σηματοδότησης εξωγενές κυτταρικό θάνατο [12].