Αφηρημένο

Ιστορικό

τα οιστρογόνα (Ε2) και της προγεστερόνης (P4) είναι βασικοί παίκτες στην ωρίμανση του ανθρώπινου ενδομητρίου. Οι αντίστοιχες στεροειδούς ορμόνης διαμορφωτές, ταμοξιφένη (ΤΑΜ) και μιφεπριστόνη (RU486) χρησιμοποιείται ευρέως στη θεραπεία του καρκίνου του μαστού και για σκοπούς αντισύλληψης, αντίστοιχα.

Μεθοδολογία /Κύριες διαπιστώσεις

προφίλ έκφρασης γονιδίου της ανθρώπινες ενδομήτριες Ishikawa καρκινική κυτταρική γραμμή κατεργάζεται με Ε2 και Ρ4 για 3 ώρες και 12 ώρες, και ΤΑΜ και RU486 για 12 ώρες, διεξήχθη χρησιμοποιώντας RNA αλληλουχίας. Τα υψηλά επίπεδα του mRNA ανιχνεύθηκαν για γονίδια, συμπεριλαμβανομένων των

PSAP, ATP5G2, ATP5H

, και

GNB2L1

μετά τη θεραπεία Ε2 ή Ρ4. Συνολικά 82 βιοδεικτών για ενδομητρίου βιολογίας εντοπίστηκαν μεταξύ Ε2 που προκαλείται από γονίδια, και 93 μεταξύ των Ρ4 ανταποκρίνεται γονίδια. Προσδιορίζονται βιοδείκτες περιλαμβάνονται:

ΕΖΗ2, MDK, MUC1, SLIT2,

και

IL6ST

, τα οποία είναι γονίδια προηγουμένως συνδέονται με ενδομητρίου. Επιπλέον, 98,8% και 98,6% των Ε2 και Ρ4 γονιδίων που αποκρίνονται σε κύτταρα Ishikawa, αντίστοιχα, ανιχνεύθηκαν επίσης σε δύο ανθρώπινες μέσα εκκριτική ενδομητρίου δείγματα βιοψίας. θεραπεία ΤΑΜ εμφάνισαν τόσο ανταγωνιστική και αγωνιστικά αποτελέσματα της Ε2, και επίσης ρυθμίζεται ένα υποσύνολο των γονιδίων ανεξάρτητα. Ο ρυθμιστής του κυτταρικού κύκλου κυκλίνης D1 (

CCND1

) έδειξαν σημαντική ρύθμιση προς τα πάνω μετά από θεραπεία με ΤΑΜ. RU486 δεν φαίνεται να δρα ως ένα καθαρό ανταγωνιστής του Ρ4 και λειτουργική ανάλυση του RU486 προσδιορίζονται απόκριση γονίδια που σχετίζονται με την προσκόλληση και την απόπτωση, συμπεριλαμβανομένων κάτω-ρυθμιζόμενα γονίδια που συνδέονται με επαφές κυττάρου-κυττάρου και προσκόλληση ως

CTNND1, JUP, CDH2, IQGAP1,

και

COL2A1.

η

Συμπεράσματα

Σημαντικές αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση από την κυτταρική σειρά Ishikawa εντοπίστηκαν μετά από θεραπείες με Ε2, P4, TAM, και RU486 . Αυτά τα δεδομένα μεταγραφικό παρέχουν πολύτιμες πληροφορίες για πιθανούς βιοδείκτες που σχετίζονται με ενδομήτρια δεκτικότητα, και επίσης να διευκολύνει την κατανόηση των μοριακών αλλαγών που λαμβάνουν χώρα στο ενδομήτριο κατά τα πρώτα στάδια της θεραπείας του καρκίνου του μαστού και τη χρήση αντισύλληψης

Παράθεση:. Tamm -Rosenstein Κ, Simm J, Suhorutshenko Μ, Salumets Α, Μέτσης Μ (2013) Αλλαγές στο μεταγραφικό της γραμμής ανθρώπινων κυττάρων του ενδομητρίου Ishikawa Καρκίνου Induced από τα οιστρογόνα, προγεστερόνη, Tamoxifen, και Mifepristone (RU486) όπως ανιχνεύεται από την RNA-αλληλουχίας. PLoS ONE 8 (7): e68907. doi: 10.1371 /journal.pone.0068907

Συντάκτης: John P. Lydon, Baylor College of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 3 Μαΐου του 2013? Δεκτές: 7 Ιουνίου 2013? Δημοσιεύθηκε: 16 του Ιούλη του 2013

Copyright: © 2013 Tamm-Rosenstein et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο έχει υποστηριχθεί από το Πανεπιστήμιο Τεχνολογίας του Ταλίν (. Στοχευμένες έργο δεν B611), Υπουργείο Παιδείας και Επιστημών εσθονική (Targeted έργο δεν SF0180044s09.) και Enterprise Εσθονία (Grant δεν EU30020.)

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Η συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα.

Εισαγωγή

Η ωοθηκών στεροειδών ορμονών, των οιστρογόνων (Ε2) και της προγεστερόνης (P4), παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση κανονικές λειτουργίες του ανθρώπινου ενδομητρίου. Για παράδειγμα, κατά τη διάρκεια ενός κανονικού εμμήνου κύκλου, πολλαπλασιασμό, διαφοροποίηση, και εκφυλισμό του ενδομητρίου συμβαίνουν σε απόκριση προς κυμαινόμενα επίπεδα Ε2 και Ρ4. Στην πολλαπλασιαστική φάση, Ε2 διεγείρει τον πολλαπλασιασμό των επιθηλιακών κυττάρων και στρωματικών συνιστωσών του ενδομητρίου. Στην εκκριτική φάση, Ρ4 διαμορφώνει αδενική διαφοροποίηση και αναστολή του πολλαπλασιασμού των οιστρογόνων μεσολάβηση [1]. Είναι κατά τα μέσα του εκκριτική φάση ότι το ενδομήτριο επιτυγχάνει ένα φαινότυπο συμβατό με την επιτυχή εμφύτευση του εμβρύου.

Μια καλύτερη κατανόηση της βιολογίας και της λειτουργίας του ανθρώπινου ενδομητρίου είναι ζωτικής σημασίας για τη βελτίωση των γνώσεών μας για τη γυναικεία υπογονιμότητα, καθώς και για ο σχεδιασμός των θεραπειών για αυτές τις συνθήκες. Αντίστοιχα, μια αναζήτηση για τους δείκτες του ενδομητρίου και νέες προσεγγίσεις για να βελτιώσει τα ποσοστά εμφύτευσης κατά τη διάρκεια της θεραπείας υπογονιμότητας έχουν διεξαχθεί. Τα τελευταία χρόνια, πολυάριθμες μελέτες που περιλαμβάνουν ανάλυση έκφρασης μικροσυστοιχιών έχουν εντοπίσει ένα ευρύ φάσμα των γονιδίων της επέκτασης ή υποβιβασμού ρυθμίζονται στο ανθρώπινο ενδομήτριο κατά τη διάρκεια της εμφύτευσης εμβρύου [2] – [10]. Κάθε μελέτη προσδιόρισε πολλά υποψήφια γονίδια που πιστεύεται ότι είναι κρίσιμης σημασίας για τη διαδικασία της εμφύτευσης του εμβρύου. Ωστόσο, λίγα γονίδια έχουν αναφερθεί με συνέπεια.

Οι γονιδιωματικής δραστηριότητες της Ε2 και Ρ4 διαμεσολαβείται κυρίως από πυρηνικούς υποδοχείς. Όταν Ε2 ή Ρ4 δεσμεύονται στους υποδοχείς τους, μπορούν να δεσμεύουν στοιχεία απόκρισης σε DNA με υψηλή συγγένεια και ρυθμίζουν τη μεταγραφή των γονιδίων στόχων. Στους ανθρώπους, υπάρχουν δύο τύποι υποδοχέων οιστρογόνων, ΕΚα και ΕΚβ, και αυτά που κωδικοποιούνται από ξεχωριστά γονίδια [11], [12]. Ετα και Ετβ εκφράζονται σε όλους τους τύπους κυττάρων του ενδομητρίου σε ολόκληρο τον εμμηνορροϊκό κύκλο, και υφίστανται αλλαγές στην έκφραση και τη δραστηριότητα. Για παράδειγμα, ΕΚα και ΕΚβ εκφράζονται σε υψηλότερα επίπεδα κατά την πολλαπλασιαστική φάση, ακόμη εμφανίζουν χαμηλότερη δραστικότητα κατά τη διάρκεια της εκκριτική φάση όταν υπόκεινται στις κατασταλτικές επιδράσεις του Ρ4. Είναι μετά την πολλαπλασιαστική φάση ότι Ρ4 μεσολαβεί E2-based εκκίνηση του ενδομητρίου προς μια κατάσταση δεκτικότητας.

Σε αντίθεση με ΕΚα και ΕΚβ, υποδοχείς προγεστερόνης (PRS), PRA και PRB, κωδικοποιούνται από το ίδιου γονιδίου (

PGR

), αλλά μεταγράφονται από διαφορετικούς υποκινητές. Ως αποτέλεσμα, PRB περιλαμβάνει ένα επιπλέον 164 αμινοξέα στο Ν-άκρο του [13], [14]. Και οι δύο ισομορφές εκφράζονται στο στρώμα και επιθήλιο του ενδομητρίου κατά τη διάρκεια της πολλαπλασιαστικής φάσης. Ωστόσο, η έκφραση και των δύο υποδοχέων μειώνεται απότομα στο επιθήλιο κατά τη διάρκεια της αρχές έως τα μέσα εκκριτική φάση [15]. Ενδομητρίου φαίνεται να σχετίζεται στενά με την προς τα κάτω ρύθμιση των επιθηλιακών της PRS, ενώ το στρώμα διατηρεί μόνο την έκφραση του κατά τη διάρκεια της PRA εκκριτική φάση [16]. Η έκφραση των γονιδίων PR στην ενδομητρίου αδενικό επιθήλιο ελέγχεται από Ε2 και Ρ4, με Ε2 επάγει την σύνθεση PR και Ρ4 κάτω-ρύθμιση της έκφρασης της δικής του υποδοχέα της [1].

εκλεκτικοί ρυθμιστές ER (SERMs) έχουν την ικανότητα να αλληλεπιδρούν με ΒΑ ως αγωνιστές ή ανταγωνιστές ανάλογα με τον ιστό στόχο και να διαμορφώνει οδούς μεταγωγής σήματος του E2-γονιδίων που αποκρίνονται [17]. Για παράδειγμα, ταμοξιφένη (ΤΑΜ) συνδέεται με υψηλή συνάφεια προς ERs, μπλοκάροντας έτσι τη δράση της φυσικής Ε2. Λόγω της ανταγωνιστικής δράσης της Ε2, ΤΑΜ έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως στη θεραπεία του καρκίνου του μαστού. Ωστόσο, ένα από τα πιο ενοχλητικές παρενέργειες των θεραπειών του καρκίνου του μαστού με ΤΑΜ φαίνεται να είναι πολλαπλασιαστική δράση του στο ενδομήτριο [18], [19]. Για παράδειγμα, ενδομητρίου παθολογίες που συνδέονται με τις θεραπείες ΤΑΜ περιλαμβάνουν υπερπλασία, πολύποδες, καρκινώματα, σαρκώματα και [20]. Παρόμοια με SERMs, εκλεκτικοί ρυθμιστές των υποδοχέων προγεστερόνης (SPRMs) έχουν αναπτυχθεί για να ανταγωνίζεται τις διαδικασίες που ενεργοποιούνται από Ρ4. Mifepristone (RU486) είναι ένας ανταγωνιστής P4 που ανταγωνίζεται με ενδογενή P4 για σύνδεση υποδοχέα [21] και χρησιμοποιείται για να τερματίσει μια πρόωρη εγκυμοσύνη. RU486 παρουσιάζει επίσης ένα 2-σε-10-φορές υψηλότερη συγγένεια προς PRs σύγκριση με P4 [22].

Η ακριβής βάση για τη διαφορική, ιστο-ειδική σηματοδότηση των Ε2 και Ρ4 δεν είναι ακόμη πλήρως κατανοητός, και μια καλύτερη κατανόηση των δράσεων Ε2 και Ρ4 είναι απαραίτητη για την αξιολόγηση των ρόλων τους στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης του ενδομητρίου. Σε αυτή τη μελέτη, ο μήτρας προερχόμενο επιθηλιακό καρκίνο ανθρώπινη κυτταρική σειρά, Ishikawa, χρησιμοποιήθηκε. Είναι ένα από τα πιο καλά χαρακτηριζόμενη ανθρώπινες κυτταρικές σειρές του ενδομητρίου που διατίθενται σήμερα. κύτταρα Ishikawa προήλθαν από ένα καλά διαφοροποιημένο αδενοκαρκίνωμα του ανθρώπινου ενδομητρίου επιθήλιο που εκφράζονται λειτουργικά υποδοχείς στεροειδών για την Ε2 και Ρ4 [23] – [25]. Ως αποτέλεσμα, αυτό κυτταρικές γραμμές αντιπροσωπεύει ένα ιδανικό μοντέλο για τη μελέτη της απόκρισης του ενδομητρίου επιθηλίου προς Ε2 και Ρ4. Σε αυτή τη μελέτη, υψηλής απόδοσης RNA-αλληλούχιση (RNA-Seq) εφαρμόσθηκε σε μελέτες Ε2- και Ρ4 εξαρτώμενη transcriptomes σε ένα ενδομητρίου πλαίσιο. Οι στεροειδείς διαμορφωτές υποδοχέα ορμόνης, ΤΑΜ και RU486, χρησιμοποιήθηκαν επίσης για τη μελέτη μεταγωγής σήματος υποδοχέα εξαρτώμενη, και για την αξιολόγηση αγωνιστική ή ανταγωνιστική δράση στην κυτταρική σειρά Ishikawa. Τέλος, η σημαντική Ε2- και Ρ4 εξαρτώμενη γονιδίων που εντοπίζονται στην κυτταρική σειρά Ishikawa δοκιμάστηκαν σε βιοψία του ενδομητρίου δείγματα που συλλέχθηκαν κατά τη δεκτική μέσα εκκριτική φάση.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταροκαλλιέργεια

Η κυτταρική σειρά Ishikawa είχε προβλεφθεί από τον καθηγητή Anneli Stavreus Λόγκαν (Uppsala University, Σουηδία). Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μέσο ϋΜΕΜ (ΡΑΑ, Pasching, Αυστρία), συμπληρωμένο με 5% ορό εμβρύου μόσχου (FBS? ΡΑΑ) και 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (ΡΑΑ), στους 37 ° C και 5% CO

2. Για ορμονικές θεραπείες, Ε2 (β-οιστραδιόλη) ή Ρ4 (4-πρεγνενο-3,20-διόνη) προστέθηκαν στο μέσο καλλιέργειας σε τελική συγκέντρωση 10

-8 Μ Οι στεροειδείς διαμορφωτές ορμόνη, ταμοξιφένη (ΤΑΜ , 4-υδροξυταμοξιφένης) και μιφεπριστόνη (RU486), προστέθηκαν σε μέσο καλλιέργειας σε τελική συγκέντρωση 1 μΜ. Όλες οι ορμόνες και ρυθμιστές παραγγέλθηκαν από την Sigma-Aldrich (Schnelldorf, Γερμανία), με Ε2 και Ρ4 διαλύονται σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) και ΤΑΜ και RU486 σε αιθανόλη (EtOH). Τα δείγματα ελέγχου υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με όχημα μόνο. Για καλλιέργειες με συμπληρώματα ορμονών, επικαλυμμένο με δεξτράνη, ξυλάνθρακα επεξεργασμένο FBS και μέσα χωρίς ερυθρό φαινόλης χρησιμοποιήθηκαν 48 ώρες πριν από τα πειράματα για να αποφευχθούν πιθανές ορμόνη-όπως δραστηριότητα του ερυθρού της φαινόλης.

RNA Extraction

Ολικό RNA εξήχθη από μη επεξεργασμένα κύτταρα και τα κύτταρα μετά από 3 ώρες και 12 ώρες της θεραπείας ορμονικής χρησιμοποιώντας RNeasy Mini Kits (Qiagen, Valencia, USA). Ενδομητρίου βιοψίες συλλέχθηκαν από δύο ασθενείς (ηλικίας 34 και 38 ετών) με ανεξήγητη υπογονιμότητα αντιμετωπίζεται στο Nova Vita Κλινική. Οι βιοψίες συλλέχθηκαν τις ημέρες LH + 7 έως LH + 9 σύμφωνα με τεστ ωορρηξίας ούρων. Τα δείγματα ιστού ομογενοποιούνται με Lyzer Tissue (Qiagen) και το ολικό RNA εκχυλίστηκε από προηγουμένως μονιμοποιηθεί με φορμαλίνη (3,7%) του ενδομητρίου βιοψίες χρησιμοποιώντας ένα κιτ RNeasy FFPE (Qiagen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η μελέτη πραγματοποιήθηκε σε συμφωνία με τις τοπικές ηθικά πρότυπα και εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας κριτική για τα Ανθρώπινα Ερευνών του Πανεπιστημίου του Tartu, με γραπτή συγκατάθεση από τους δύο συμμετέχοντες στη μελέτη.

RNA Βιβλιοθήκη Προετοιμασία

RNA βιβλιοθήκες για κυτταρική γραμμή και ενδομητρίου δείγματα παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας ένα κιτ Illumina TruSeq RNA Sample Prep (FC-122 έως 1.001, Illumina, San Diego, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για δείγματα κυτταρική γραμμή, το mRNA καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας επιλογή πολυΑ, και στη συνέχεια κατακερματισμένη χημικά. Για τα δείγματα ιστού, ολικό RNA συλλέχθηκε χωρίς επιλογή πολυΑ και το στάδιο του κατακερματισμού μειώθηκε με βάση την προηγούμενη θεραπεία με φορμαλίνη των δειγμάτων. Σε όλα τα δείγματα, τα RNA μετατράπηκαν σε μονόκλωνα cDNA χρησιμοποιώντας τυχαία έναρξη εξαμερούς. Πολυπλεξία με διαφορετικούς δείκτες προσαρμογέα έγινε και η ποιότητα της προκύπτουσας βιβλιοθήκης ελέγχθηκε χρησιμοποιώντας ένα Bioanalyzer (Agilent, Waldbronn, Γερμανία).

RNA-Seq και Ανάλυση Δεδομένων

Single-end (SE ) αλληλούχιση του 75 bp διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα Illumina Genome Analyzer II (Illumina, San Diego, USA). προγραμματισμού παπιγιόν χρησιμοποιήθηκε για την αρχική ευθυγράμμιση των αλληλουχιών με ανθρώπινο γονιδίωμα 19 (Hg19), με τις προεπιλεγμένες ρυθμίσεις που χρησιμοποιούνται για να βρείτε μόνο τέλεια αγώνες. Αλληλουχία θραύσματα ευθυγραμμίστηκαν με την

H. Sapiens

γονιδίωμα αναφοράς (Hg19) παρέχεται από το Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνια Σάντα Κρουζ (UCSC) του προγράμματος περιήγησης Γονιδιώματος χρησιμοποιώντας έναν αλγόριθμο ΤΟΡΗΑΤ C v1.2.0 με τις προεπιλεγμένες ρυθμίσεις [26]. Η ευθυγραμμισμένη διαβάζει στη συνέχεια μεταποιούνται σε μεταγραφές χρησιμοποιώντας Μανικετόκουμπα v1.1.0 [27], με αφθονίες υπολογίζεται και αναλύεται για να εξετάσει διαφορετικά πρότυπα έκφρασης μεταξύ των δειγμάτων κυτταρική σειρά. Μανικετόκουμπα κατασκεύασε ένα ελάχιστο σύνολο των μεταγραφών για να περιγράψει καλύτερα το διαβάζει στο σύνολο δεδομένων. Η διόρθωση Benjamin-Hochberg για πολλαπλές δοκιμές εφαρμόστηκε στις τιμές P σημαντικών γονιδίων με αξία ποσοστό εσφαλμένης ανακάλυψη (FDR) 0,05. χρησιμοποιήθηκαν κανονικοποιημένη RNA-Seq μετράει κομμάτι αναφέροντας τις σχετικές αφθονίες των μεταγραφών. Αφθονίες αναφέρθηκαν σε μονάδες FPKM (π.χ., θραύσματα Per κιλοβάσεων του μεταγραφήματος ανά εκατομμύριο θραυσμάτων χαρτογραφήθηκαν). Τα αρχεία εξόδου της Μανικετόκουμπα αναλύθηκαν με Cuffcompare μαζί με την αναφορά από τον πίνακα περιήγησης UCSC (Homo sapiens GRCh37 /Hg19) [28]. Cuffcompare κατατάσσει κάθε μεταγραφή, όπως είναι γνωστό ή μυθιστόρημα. Cuffdiff εκ νέου τις εκτιμήσεις της αφθονίας των μεταγραφών που αναφέρονται από Cuffcompare και δοκιμές για διαφορική έκφραση μεταξύ των επιλεγμένων πειραμάτων. Αν ένα από τα πειράματα (είτε ελέγχου ή θεραπείας) είχαν μηδέν FPKM, η μεταβολή log έγινε άπειρος. Εκφράσαμε την αλλαγή καταγραφής σε αυτές τις περιπτώσεις, όπως +14 για την ρύθμιση προς τα πάνω και -14 για την ρύθμιση προς τα κάτω.

Συναρτησιακή Ανάλυση

Για την λειτουργική ταξινόμηση των γονιδίων που παρουσίασαν σημαντική προφίλ διαφορική έκφραση σε χρησιμοποιήθηκε απάντηση σε διαφορετικές στεροειδών ορμονών και αναλογική θεραπείες τους, την εφευρετικότητα Διαδρομή Ανάλυση (IPA) 9,0 λογισμικό (Ingenuity Systems). Η μονάδα μεταγραφικός παράγοντας ΙΡΑ χρησιμοποιήθηκε για την πρόβλεψη των αλλαγών της γονιδιακής έκφρασης ανιχνεύεται σχετικά με το δυναμικό συνδέσεις της ΒΑ και PRS. Επιπλέον, IPA φίλτρα ανάλυση βιοδείκτη που προσδιορίζονται πιθανών βιοδεικτών σε επιλεγμένους ιστούς.

Οπτικοποίηση Δεδομένων

λογισμικό

στατιστικές Ε (έκδοση 2.14.0) (https://www.R-project.org/) χρησιμοποιήθηκε για την επεξεργασία και οπτικοποίηση των αποτελεσμάτων από Μανικετόκουμπα αναλύσεις. Υπολογισμός των γενικών στατιστικών, συμπεριλαμβανομένων των κοινών και μοναδικές κατηγορίες που επηρεάζονται σημαντικά γονίδια, έγιναν στην Ε χρησιμοποιώντας μια προσαρμοσμένη δέσμη ενεργειών. Για απεικονίσεις θερμικός χάρτης, χρησιμοποιήθηκαν τα gplots πακέτο R (έκδοση 2.10.1) (https://CRAN.R-project.org/package=gplots). Επιπλέον, οι διαφορές στις τιμές FPKM των επεξεργασμένων δειγμάτων έναντι των μη κατεργασμένων δειγμάτων υπολογίστηκαν στην θερμικούς χάρτες. Η μεγαλύτερη απόλυτη διαφορά FPKM για κάθε γονίδιο ταυτοποιήθηκε και χρησιμοποιήθηκε για την κανονικοποίηση των δεδομένων FPKM για κάθε γονίδιο. Έτσι, οι προκύπτουσες τιμές βρίσκονται μεταξύ -1 και 1, και μια τιμή 0 αντιστοιχεί σε απουσία μεταβολής σε σύγκριση με το μη επεξεργασμένο δείγμα. Με βάση αυτές τις κανονικοποιημένες τιμές έκφρασης, γονίδια τοποθετημένα στο heatmap με ιεραρχική συσταδοποίηση.

Αποτελέσματα

Το μεταγραφικό της κυτταρικής γραμμής Ishikawa Πριν και μετά τη θεραπεία με Ε2, Ρ4, και τις αντίστοιχες Ρυθμιστές

πολυ-Α-επιλεγμένο RNA από το ανθρώπινο ενδομητρίου κυτταρική γραμμή, Ishikawa, υποβλήθηκε σε SE-αλληλούχιση με 75 ζεύγη βάσεων μακρύ διαβάζει. μετρήσεις αναφοράς για κάθε δείγμα στη συνέχεια έκανε με βάση το 8-11 × 10

6 αναφέρει ότι ελήφθησαν. Ο στόχος αυτής της προσπάθειας προσδιορισμού αλληλουχίας ήταν να παράσχει ένα συνολικό προφίλ γονιδιακής έκφρασης της γραμμής κυττάρων Ishikawa, προκειμένου να προσδιοριστούν οι αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση που συμβαίνουν κατά την πρώιμη απόκριση αυτής της κυτταρικής γραμμής σε στεροειδείς ορμόνες και ρυθμιστές τους. Συνολικά, επτά δείγματα αναλύθηκαν, και αυτές περιλαμβάνονται μη-επεξεργασμένα κύτταρα, κύτταρα κατεργασμένα με Ε2 ή P4 για 3 και 12 ώρες, και τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με ΤΑΜ ή RU486 διαμορφωτές για 12 ώρες. Η πλειοψηφία των διαβάζει από κάθε δείγμα (π.χ., & gt? 70%) έχουν επιτυχώς ευθυγραμμισμένες με την ανθρώπινη εκδοχή γονιδιώματος 19 (Hg19). Οι στατιστικές τιμές αυτών των ευθυγραμμίσεις και τον αριθμό των γονιδίων που ταυτοποιούνται, συμπεριλαμβανομένων τόσο των γνωστών και άγνωστων γονιδίων, που αναφέρονται στον Πίνακα 1. Οι σχετικές ποσότητες θραυσμάτων υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας μανικετόκουμπα, και αναφέρθηκαν σε μονάδες FPKMs προκειμένου να περιγράψει εκφρασμένα γονίδια (π.χ. , θραύσματα) που παρατηρείται από τα πειράματα RNA-Seq. Στον Πίνακα 1, ο αριθμός των γονιδίων με διαφορετικά αφθονίες FPKM, καθώς και οι αριθμοί των γονιδίων τα οποία εμφάνισαν σημαντικές μεταβολές στην έκφραση μετά από θεραπεία ορμόνης /διαμορφωτή, συγκρίθηκαν με μη-κατεργασμένα κύτταρα. Επιπλέον, οι πιο δεκτικά γονίδια που ταυτοποιούνται από την κυτταρική σειρά Ishikawa συγκρίθηκαν με δείγματα βιοψίας ανθρώπινο ενδομήτριο (n = 2) που συλλέγονται κατά τη διάρκεια της εμφύτευσης εμβρύου. Ένας πλήρης κατάλογος των εκφρασμένων γονιδίων εντοπίζονται και αξίες FPKM τους είναι διαθέσιμα στον πίνακα S1.

Η

Ένα από τα πλεονεκτήματα μιας ανάλυσης RNA-Seq είναι η ικανότητα να ανιχνεύουν σχετικά υψηλά επίπεδα έκφρασης των γονιδίων. Ένα υποσύνολο των γονιδίων από την κυτταρική σειρά Ishikawa είχαν τιμές FPKM που ήταν μεγαλύτερες από 1000 μετά ορμονικές θεραπείες /διαμορφωτή (Πίνακας 2). Αυτά περιλαμβάνονται γονίδια που κωδικοποιούν προσαποσίνη (

PSAP

), συνθάσες ΑΤΡ,

ATP5G2

και

ATP5H

, και πρωτεΐνη δέσμευσης νουκλεοτιδίου γουανίνης (

GNB2L1

). Αυτά τα γονίδια ήταν πολύ υψηλή έκφραση σε απόκριση σε θεραπεία Ε2 ή Ρ4. Οι εκφράσεις του

ATP5G2

,

ATP5H

και

GNB2L1

δεν έχει αποδειχθεί ότι σχετίζεται με ενδομητρίου πριν. Εναλλακτικά, τα γονίδια που κωδικοποιούν τις πρωτεΐνες σύνδεσης Α2 ασβεστίου S100 (

S100A2

) και Α6 (

S100A6

), πρωτεΐνη θερμικού σοκ 90 kDa άλφα (

HSP90AA1

), και HSPA8, καθώς και πυροσταφυλική κινάση σε μυ (

PKM2

), εμφάνισαν υψηλά επίπεδα έκφρασης 12 ώρες μετά τη θεραπεία με ΤΑΜ. Μεταξύ αυτών των γονιδίων μόνο η έκφραση

S100A2

έχει συσχετισθεί με τη θεραπεία ΤΑΜ στον ιστό του καρκίνου του μαστού, αλλά όχι σε ενδομήτριο [29]. Επιπλέον, το γονίδιο για φερριτίνη φως πολυπεπτίδιο (

FTL

), επίσης δεν ανιχνεύτηκε σε ενδομήτριο σε προηγούμενες μελέτες, βρέθηκε ότι είναι άκρως εκφραζόμενη 12 ώρες μετά την αγωγή με Ε2, Ρ4, και ΤΑΜ (Πίνακας 2).

η

Σημαντικές αλλαγές γονιδιακής έκφρασης στην κυτταρική σειρά Ishikawa Μετά Ε2 και Ρ4 Θεραπείες

Σχετικά επίπεδα έκφρασης του mRNA (σε μονάδες FPKM) για Ε2- και P4 επεξεργασμένα κύτταρα σε σύγκριση με μη-κατεργασμένα κύτταρα χρησιμοποιώντας λογισμικό Cuffdiff (έκδοση 1.1.0) και ένα 5% FDR. Ο αριθμός των γονιδίων που παρουσίασαν σημαντικές μεταβολές στην έκφραση μετά τις αντίστοιχες θεραπείες παρατίθενται στον Πίνακα 1. Επιπλέον, μόνο γνωστά γονίδια περιελήφθησαν στις επόμενες αναλύσεις των δεδομένων γονιδιακής έκφρασης.

Ένα σύνολο 1.691 γνωστών γονιδίων (Πίνακας S2 ) βρέθηκαν να επηρεάζονται σημαντικά σε κύτταρα Ishikawa ακόλουθες επεξεργασίες με Ε2 για 3 h (n = 1.084) και 12 h (n = 1.121) σε σύγκριση με μη-κατεργασμένα κύτταρα. Από αυτά τα γονίδια, 614 ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα, και 470 ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα κάτω μετά από 3 ώρες αγωγής Ε2. Όταν η αγωγή με Ε2 επεκτάθηκε σε 12 ώρες, η επαγωγή 715 γονιδίων και καταστολή των 406 γονιδίων, ανιχνεύθηκε.

πλειονότητα των γονιδίων 12 ώρες θεραπείας ΤΑΜ έδειξε ανταγωνιστική δράση της Ε2. Δώδεκα ώρες της θεραπείας με ΤΑΜ οδήγησε σε χαμηλά ή μη ανιχνεύσιμα επίπεδα mRNA για 654 γονίδια (91,5%) των 715 γονιδίων που εμφάνισαν υψηλότερα επίπεδα mRNA μετά από αγωγή με Ε2 για 12 ώρες. Ένα επιπλέον 406 γονίδια βρέθηκαν να ρυθμίζεται προς τα κάτω μετά από αγωγή με Ε2 για 12 ώρες, και 75,1% (n = 305) από αυτά τα γονίδια εμφάνισαν μόνο μικρές αλλαγές στη δραστηριότητα του γονιδίου, ή συνδέθηκαν με την απουσία ρύθμισης, 12 ώρες μετά θεραπεία με ΤΑΜ.

με βάση τα δεδομένα που έχουν ληφθεί, TAM δεν ενήργησε ως καθαρός ανταγωνιστής της Ε2 στην κυτταρική σειρά Ishikawa. Για παράδειγμα, από τα 715 ​​γονίδια ρυθμισμένα προς τα πάνω μετά την αγωγή με Ε2 για 12 ώρες, 61 (8,5%) ήταν επίσης σημαντικά πάνω ρυθμισμένα μετά από θεραπεία με ΤΑΜ. Επιπλέον, μεταξύ των 406 γονίδια που βρέθηκαν να είναι κάτω ρυθμισμένα μετά από αγωγή με Ε2 για 12 ώρες, 101 (24,9%) ήταν ομοίως κάτω-ρυθμίζονται μετά από θεραπεία με ΤΑΜ. Σε συνδυασμό, αυτά τα δεδομένα αποδεικνύουν ότι η ΤΑΜ είναι τόσο ανταγωνιστική και αγωνιστική για Ε2 στην κυτταρική σειρά Ishikawa (Σχήμα S1).

Μετά από θεραπεία με P4, συνολικά 1.692 γνωστά γονίδια εμφάνισαν σημαντικές διαφορές στην έκφραση (Πίνακας S3 ). Από αυτά τα γονίδια, 1082 εμφάνισαν αλλαγές μετά από 3 ώρες αγωγής, και 1097 ανιχνεύθηκαν μετά από 12 ώρες θεραπείας, τόσο σε σύγκριση με κύτταρα μη επεξεργασμένα Ishikawa. Από αυτά τα γονίδια, 592 (54,7%) ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα, και 490 (45,3%) ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω 3 ώρες μετά την αγωγή με P4, ενώ 631 (57,5%) ήταν πάνω ρυθμισμένα και 466 (42,5%) ήταν κάτω -regulated 12 ώρες μετά τη θεραπεία με P4.

Όταν τα κύτταρα Ishikawa υποβλήθηκαν σε αγωγή με RU486 για 12 ώρες, χαμηλά ή μη ανιχνεύσιμα επίπεδα mRNA ανιχνεύθηκαν για 84,0% (n = 530) των γονιδίων τα οποία ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα μετά από θεραπεία με P4 για 12 h (n = 631). Ένα άλλο 466 γονίδια βρέθηκαν να ρυθμίζεται προς τα κάτω μετά από θεραπεία με P4 για 12 ώρες, και από αυτά, το 88,2% (n = 411) εμφάνισαν ελάσσονα ρύθμιση προς τα κάτω, ή δεν έδειξε ρύθμιση, μετά από αγωγή με RU486 για 12 ώρες.

από τα 631 γονίδια που ρυθμίστηκαν προς τα πάνω σε απόκριση σε θεραπεία 12 ώρες Ρ4, 101 (16,0%) αυτών των γονιδίων ήταν επίσης σημαντικά πάνω ρυθμισμένα μετά από αγωγή με RU486. Εναλλακτικά, τα 466 γονίδια ρυθμισμένα προς τα κάτω σε απόκριση σε θεραπεία με P4 για 12 ώρες, 55 (11.8%) εμφάνισαν μια παρόμοια ρύθμιση προς τα κάτω μετά από αγωγή με RU486. Επιπλέον, παρόμοια με TAM, RU486 εκτίθενται τόσο αγωνιστική και ανταγωνιστική δράση της Ρ4 στα κύτταρα Ishikawa (Εικόνα S2).

Από τα 1691 γονίδια σημαντικά ανταποκρίνεται στις Ε2, και τα 1692 γονίδια σημαντικά ανταποκρίνεται σε Ρ4, 1051 ήταν κοινές για τις δύο ομάδες, γεγονός που υποδηλώνει ότι ρυθμίζονται από τις δύο ορμόνες. Σχετική πλειοψηφία των γονιδίων που ταυτοποιούνται με σημαντικές αλλαγές μετά την θεραπεία Ε2 και Ρ4, δεν έχουν αναφερθεί στο ενδομήτριο πλαίσιο πριν.

Δυναμικό ER και PR Στόχοι Μεταξύ των γονιδίων Ε2 και Ρ4 Σημαντικές Προσδιόρισε

Ένα ανάλυση IPA γονιδίων βρέθηκε να ανταποκρίνεται στις Ε2 αποκάλυψε 20 πιθανά γονίδια-στόχους για τον υποδοχέα Ε2, ΕΡα (

ESR1

), βασίζεται σε μια βάση δεδομένων του πειραματικά παρατηρηθεί αλληλεπιδράσεις υποδοχέα. Για παράδειγμα,

ABCA3, CELSR2, CYP1A1, DDX17, EFEMP1, ΕΝΟ1, FOSL2, GREB1, KCNK6, MAPK12, MYC, PDCD4, PGR, SHANK3, TGFa,

και

TPM1

ήταν σημαντικά μέχρι -regulated μετά από αγωγή με Ε2 για 12 ώρες. Αντίθετα,

CCNG2, KCTD6, LDLR,

και

ΡΡΙ_Ρ

ήταν κάτω-ρυθμίζονται. Από αυτά τα γονιδιακά προϊόντα, PGR και MAPK12 συμμετέχουν σε γλυκοκορτικοειδών σηματοδότηση του υποδοχέα, ενώ MYC και CYP1A1 εμπλέκονται σε υποδοχέα αρυλ υδρογονάνθρακα (AHR) σηματοδότησης (Σχήμα S3).

Μετά από 12 ώρες θεραπείας με P4, η έκφραση του

CDKN1C, F3, FKBP5, GAS6, IL1R1, την NOQ2, PFKP, TSC22D3

και

PGR

βρέθηκαν να είναι up-ρύθμιση, ενώ το

EZR

,

ACSL1, AKAP13, CCNB2, GLUL, MYCN, PPIF,

και

SNTB2

βρέθηκαν να είναι κάτω-ρυθμίζονται. Από αυτά, CDKN1C, FKBP5 και PGR συμβάλλουν στην γλυκοκορτικοειδών σηματοδότηση του υποδοχέα, ενώ ACSL1 και PFKP έχουν ρόλους στη γλυκονεογένεση (Σχήμα S4).

βιοδεικτών Ανάλυση της Ε2 και Ρ4 Σημαντικές γονίδια από το Ishikawa Κυτταρική Γραμμή

Στη συνέχεια, το δυναμικό βιοδείκτες μεταξύ των Ε2 (n = 1.691) και Ρ4 (n = 1.692) που αποκρίνονται γονίδια εξετάστηκαν. Μόνο μόρια προηγουμένως ανιχνευθεί στο ανθρώπινο ενδομήτριο θεωρήθηκαν για την ανάλυση IPA βιοδεικτών εκτελεστούν, και μόρια περαιτέρω διηθήθηκαν να συμπεριλάβουν εκείνες που σχετίζονται με ασθένειες αναπαραγωγικό σύστημα ή διαταραχών ενδοκρινούς συστήματος.

ανάλυση ΙΡΑ βιοδείκτη προσδιορίζονται 82 δυνητικούς βιοδείκτες μεταξύ E2 σημαντικά γονίδια και 93 πιθανούς βιοδείκτες μεταξύ P4 σημαντικά γονίδια. Υπήρχαν 62 δυνητικών μορίων βιοδείκτη κοινά για τις δύο ομάδες. Ένας πλήρης κατάλογος των βιοδεικτών που εκφράζονται στην ανθρώπινη μήτρα συγκρίνεται με βιοδείκτες πιστοποιήθηκε σε κύτταρα Ishikawa 3 ώρες και 12 ώρες μετά την Ε2, Ρ4, και τις αντίστοιχες θεραπείες διαμορφωτή (Πίνακας S4). Επιλογή των μοναδικών Ε2 και Ρ4 εξαρτώμενη βιοδείκτες που έχουν σχέση με ενδομήτρια δεκτικότητα και εμφύτευση του εμβρύου παρατίθενται στον Πίνακα 3. Όσον αφορά το πρώτο, αυτά συμπεριλαμβάνονται τα ακόλουθα γονίδια που σχετίζονται με το ενδομήτριο και την εμφύτευση εμβρύου:

MUC1, ΕΖΗ2, HMGCR, MDK, PRDM2, ΡΧΝ,

και

SLIT2

(Πίνακας 3). Για τα γονίδια που είναι κοινές στα δύο Ε2 και Ρ4 ανταποκρίνεται γονίδια, δυναμικό βιοδείκτες εντοπίστηκαν που σχετίζονταν με ενδομητρίου ή ενδομητρίωση, και αυτά περιλαμβάνονται:

ARG2, ANXA1, AR, BMPR2, CDKN1C, CXCL16, EGFR, FGFR1, HMGA1, IGFR2 , IL1R1, JAG1, ας-7, MCAM, NCOA3, Notch1, PDCD4, PGR, RACGAP1, TMSB10,

και

TNC

(Πίνακας S4).

Η

Ομοίως, μεταξύ P4 ανταποκρίνεται γονίδια, δυναμικό βιοδείκτες εντοπίστηκαν που είχαν σχέση με την ανάπτυξη του ενδομητρίου ή στις αρχές της εγκυμοσύνης:

CTNNA1, ErbB3, FGFR2, ΙΟΡΒΡ5, IKBKB, IL6ST, KCNMA1, NOTCH3, S100A4, STAT3, TCF7L2, TGFB1,

και

TGFBR3

(Πίνακας 3).

μια σύγκριση των σημαντικών Ε2 και Ρ4 Responsive γονίδια που ταυτοποιήθηκαν στην κυτταρική σειρά Ishikawa με ανθρώπινο ενδομητρίου μεταγραφικό

Για την πρόβλεψη αν οι Ε2 και Ρ4 αποκρίνονται γονίδια που ταυτοποιήθηκαν σε κύτταρα Ishikawa εκφράστηκαν επίσης σε ένα ανθρώπινο ενδομήτριο, ή /και να έχουν ρόλους στην διαδικασία εμφύτευσης για τα έμβρυα, η έκφραση αυτών των γονιδίων αναλύθηκαν σε δύο δείγματα ανθρώπινου ενδομήτριου ιστού που συλλέγονται από τα μέσα εκκριτικό ενδομήτριο. Σύμφωνα με τα στοιχεία του RNA-Seq, 1671 (98,8%) της Ε2 γονιδίων που αποκρίνονται, και 1.668 (98.6%) του Ρ4 αποκριτικών γονιδίων, τα οποία προσδιορίζονται στην κυτταρική σειρά Ishikawa βρέθηκαν επίσης να εκφράζεται σε ανθρώπινο ενδομήτριο δείγματα που ελήφθησαν από δύο ασθενείς που υποβλήθηκαν σε βιοψία του ενδομητρίου. Αυτά ανθρώπινο ενδομήτριο τα δείγματα χρησιμοποιήθηκαν μόνο για συγκριτικούς σκοπούς. Στον Πίνακα 1, οι εκφραστική αφθονία (π.χ., FPKMs) της Ε2 και Ρ4 βιοδεικτών ανιχνεύεται σε ανθρώπινα δείγματα βιοψίας του ενδομητρίου σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα κύτταρα Ishikawa. Μεταξύ των ΙΡΑ-προσδιορίζονται βιοδείκτες Ε2 και Ρ4 παρούσα σε κύτταρα Ishikawa,

ΕΖΗ2, MDK, MUC1, SLIT2,

και

IL6ST

βρέθηκαν επίσης να είναι παρούσα στο ανθρώπινο ενδομήτριο transcriptomes (Σχήμα 1) .

Red γονίδια ρυθμισμένα προς τα πάνω σε Ε2 και Ρ4 κατεργασμένα κύτταρα Ishikawa σύγκριση με μη επεξεργασμένα κύτταρα? πράσινο γονίδια κάτω-ρυθμίζονται. Τα γονίδια που βρίσκεται στην αριστερή πλευρά της διαγώνιας γραμμής δείχνουν υψηλότερη σχετική αφθονία (FPKM) στα ανθρώπινα ενδομητρίου δείγμα βιοψίας σε σύγκριση με κύτταρα μη επεξεργασμένα Ishikawa. Τα γονίδια που βρίσκεται στη δεξιά πλευρά της διαγώνιας γραμμής δείχνουν χαμηλότερη σχετική αφθονία (FPKM) στο ανθρώπινο ενδομήτριο δείγμα βιοψίας σε σύγκριση με κύτταρα μη επεξεργασμένα Ishikawa.

Η

TAM γονιδίων που αποκρίνονται στην γραμμή κυττάρων Ishikawa που σχετίζονται σε ασθένειες του αναπαραγωγικού συστήματος

Μετά την κατεργασία των κυττάρων με Ishikawa ΤΑΜ για 12 ώρες, η έκφραση των γονιδίων 1013 βρέθηκαν να αλλάξει σημαντικά σε σύγκριση με κύτταρα μη επεξεργασμένα Ishikawa. Από αυτά τα γονίδια, 432 ρυθμίστηκαν προς τα πάνω και 581 είχαν ρυθμισμένα προς τα κάτω (Πίνακας S5). Αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι ΤΑΜ έχει τόσο ανταγωνιστική και αγωνιστική δραστικότητα προς Ε2 σε κύτταρα Ishikawa. Επιπλέον, εκτός από την επηρεασμό Ε2 ρυθμιζόμενα γονίδια, ΤΑΜ μετέβαλε σημαντικά την έκφραση των γονιδίων 789 ανεξάρτητα από Ε2 (Σχήμα 2Α).

Μία μοναδική και κοινά γονίδια μετά από 12 ώρες Ε2 και θεραπεία ΤΑΜ. Β Μοναδική και κοινά γονίδια μετά από 12 ώρες Ρ4 και θεραπεία RU486. Οι αριθμοί δίνονται σε κάθε μία από τις κύκλοι αντιπροσωπεύουν τον αριθμό των μεταβλήθηκαν σημαντικά γονίδια μοναδική για θεραπεία, και τα βέλη δείχνουν τον τρόπο ρυθμίζονται (ανάντη ή προς τα κάτω ρύθμιση σε σύγκριση με κύτταρα μη επεξεργασμένα Ishikawa). Αλληλεπικαλύψεις δείχνουν τον αριθμό των συνήθως αλλάζει τα γονίδια.

Η

Χρησιμοποιώντας έναν πυρήνα ανάλυσης ΙΡΑ, ελήφθη η προβλεπόμενη λειτουργία TAM ανταποκρίνεται γονιδίων. Ένα σύνολο 168 γονιδίων βρέθηκαν να σχετίζονται με διαφορετικές ασθένειες αναπαραγωγικό σύστημα, συμπεριλαμβανομένων της μήτρας, των ωοθηκών, του τραχήλου της μήτρας και καρκίνους, καθώς επίσης και των γεννητικών όγκων, αμηνόρροια, μητρορραγία, και το σύνδρομο πολυκυστικών ωοθηκών (Πίνακας 4).

Η

Ένα από τα κύρια μονοπάτια σηματοδότησης που προσδιορίζονται από ΤΑΜ γονιδίων που αποκρίνονται συνδέθηκε με ρύθμιση της αντιγραφής του DNA, ανασυνδυασμός, και την επισκευή, καθώς και την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου και κυτταρικό συναρμολόγηση και την οργάνωση. Επιπλέον, TAM ανταποκρίνεται γονίδια κωδικοποιούνται μόρια που άμεσα ή έμμεσα, συνδέθηκαν με τον ρυθμιστή του κυτταρικού κύκλου, η κυκλίνη D1 (

CCND1

). Αντίστοιχα,

CCND1

βρέθηκε να είναι σημαντικά πάνω ρυθμισμένα 12 ώρες μετά τη θεραπεία με TAM (Σχήμα 3).

Red μόρια αντιπροσωπεύουν up-ρυθμίζεται και το πράσινο κάτω-ρυθμιζόμενα γονίδια μεταξύ TAM 12 ώρες σημαντική γονιδίων σε κύτταρα Ishikawa. Τα δίκτυα δημιουργήθηκαν με τη χρήση του ΜΠΒ (Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com).

Η

Τα RU486 Σημαντικές Γονίδια στην γραμμή κυττάρων Ishikawa Σχετικά με Παθήσεις του αναπαραγωγικού συστήματος

η επεξεργασία των κυττάρων Ishikawa με τον ανταγωνιστή Ρ4, RU486, για 12 ώρες είχε ως αποτέλεσμα σημαντικές αλλαγές στην έκφραση των γονιδίων 546 σε σχέση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα, με 255 γονίδια ρυθμισμένα προς τα πάνω και 291 γονίδια ρυθμισμένα προς τα κάτω (Πίνακας S6). Παρόμοια με την TAM, RU486 εκθέματα τόσο αγωνιστική και ανταγωνιστική δράση για P4 στα κύτταρα Ishikawa. Για παράδειγμα, 377 γονίδια αποκρίνεται σε RU486 μετά από 12 ώρες δεν έδειξαν σημαντικές μεταβολές στην έκφραση μετά την αγωγή με P4 για 12 ώρες. Επομένως, αυτά τα γονίδια που ρυθμίζονται ανεξάρτητα, από RU486 και απουσία Ρ4 σε κύτταρα Ishikawa (Σχήμα 2Β).

Από τα 546 γονίδια βρέθηκαν να αποκρίνονται στην αγωγή με RU486, 86 κωδικοποιείται μόρια που συνδέονται με ασθένειες του αναπαραγωγικό σύστημα. Για παράδειγμα, μόρια που σχετίζονται με την αδενομύωση, γονάδων όγκους, μητρορραγία, και λειομύωμα μήτρας προσδιορίστηκαν (Πίνακας 4). Με βάση τα γονίδια που ανταποκρίθηκαν στη θεραπεία με RU486, ενός μονοπατιού σηματοδότησης που σχετίζονται με την έκφραση του γονιδίου, κυττάρου-προς-κύτταρο σηματοδότηση και τις αλληλεπιδράσεις, και την ανάπτυξη των ιστών ταυτοποιήθηκε. Οι κεντρικές μόρια σε αυτό το δίκτυο, συμπεριλαμβανομένων καντερίνη 2 (CDH2) και ένα σύμπλοκο μεταξύ AR και ΝΡκΒ, μεσολαβούν άμεσες και έμμεσες αλληλεπιδράσεις με RU486 αποκρίνονται γονίδια (Σχήμα 4). Για παράδειγμα, η μεταγραφική γονίδιο συν-καταστολέα,

NCOR2

, ήταν ρυθμισμένη όπως ήταν η υποδοχέα ανδρογόνων (

AR

) γονίδιο. Ωστόσο, μεταγραφικού παράγοντα, FOXA1, ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω. Γονίδια που σχετίζονται με το κύτταρο σε επαφή και προσκόλληση κυττάρου ήταν επίσης κάτω-ρυθμίζονται και περιλαμβάνονται:

CTNND1, JUP, CDH2, IQGAP1,

και

COL2A1

Εναλλακτικά,

ΡϋΚ1

και

ADAM15

ήταν επάνω ρυθμισμένη, και έχουν ρόλους στην επαγωγή βλάβης ιστού. Τα περισσότερα από τα μόρια σε αυτό το δίκτυο επίσης σχετίζεται με κυτταρικό θάνατο και την απόπτωση.

Τα κεντρικά μόρια στο δίκτυο ήταν καντερίνη 2 (CDH2), AR και ΝΡκΒ συγκρότημα. Τα δίκτυα δημιουργήθηκαν με τη χρήση του ΜΠΒ (Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com).

Η

Συζήτηση

Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν να καθορίσει την μεταγραφική απόκριση ενός ενδομητρίου μοντέλο στη θεραπεία με Ε2, Ρ4, Tam, και RU486. Απ ‘όσο γνωρίζουμε, αυτή είναι η πρώτη έκθεση της εφαρμογής του RNA-Seq στη μελέτη της πρώιμης γονιδιώματος σε επίπεδο αποτελέσματα σε μια ανθρώπινη κυτταρική γραμμή του ενδομητρίου. Επιπλέον, η πλειοψηφία των γονιδίων που βρέθηκαν να είναι σημαντικά αποκρίνεται σε Ε2 και Ρ4 στην κυτταρική σειρά Ishikawa επίσης ανιχνεύθηκαν σε ανθρώπινο ενδομητρίου βιοψίες που συλλέγονται κατά την εμφύτευση του εμβρύου.

Κατά τη διάρκεια της τελευταίας δεκαετίας, μικροσυστοιχίες έχουν την πιο