Αφηρημένο

Η χρήση των κυτταρικών σειρών ή ζωικά μοντέλα έχει σημαντικά μειονεκτήματα όταν ασχολείται με ένα σύνολο ετερογενών ασθενειών, όπως επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών. Αυτό έχει κλινική σημασία σε αυτό το βιοδείκτες αναπτυχθεί χρησιμοποιώντας κυτταρική σειρά ή ζωικά μοντέλα συχνά δεν είναι μεταβιβάσιμα σε κλινικό περιβάλλον. Σε αυτή τη μελέτη, περιγράφουμε την ανάπτυξη ενός ισχυρού πρωτοκόλλου για την ανάπτυξη πρωτογενείς καλλιέργειες καρκίνου των ωοθηκών το οποίο θα ξεπεραστούν μερικά από αυτά τα προβλήματα. Οι γυναίκες που υποβάλλονται σε χειρουργική επέμβαση για καρκίνο των ωοθηκών είχαν προσληφθεί και τα δείγματα των ασκίτη και των καταθέσεων των στερεών όγκων χρησιμοποιήθηκαν για την ανάπτυξη πρωτογενείς καλλιέργειες. Τα κύτταρα που χαρακτηρίζεται από τη χρήση μίας ομάδος αντισωμάτων ανοσοφθορισμού πριν από τη χρήση σε μια ποικιλία δοκιμασιών περιλαμβανομένων λειτουργική εκτίμηση των οδών επιδιόρθωσης του DNA. Κατά τη διάρκεια της περιόδου της μελέτης τέσσερα χρόνια, βιώσιμων καλλιεργειών, επιβεβαίωσε ότι είναι επιθηλιακής προέλευσης παρήχθησαν από 156 από 172 (91%) περιπτώσεις προσλαμβάνονται. Χαρακτηρισμός διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα πάνελ αντισωμάτων συμπεριλαμβανομένων pancytokeratin, CA125, EpCAM, MOC-31, D2-40 και βιμεντίνη. Γήρανση συνέβη μεταξύ του 2

ου και 8

ου χωρία σε όλες τις καλλιέργειες, εκτός από εκείνο στο οποίο συνέβη αυθόρμητη αθανατοποίηση. Τα κύτταρα θα μπορούσαν να καλλιεργηθούν επιτυχώς ακόμη και μετά από μία περίοδο αποθήκευσης στους 4 ° C και καλλιεργημένα κύτταρα που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για μια ποικιλία εφαρμογών, συμπεριλαμβανομένων λειτουργικών προσδιορισμών. Κατά την αξιολόγηση της λειτουργικής υπήρχε ελάχιστη ετερογένεια ενδο-όγκου. Συνεπώς, είναι δυνατόν να παραχθεί βιώσιμων καλλιεργειών καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών, στην πλειονότητα των ασθενών που υποβάλλονται σε χειρουργική επέμβαση. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν απευθείας από τους καρκίνους του ασθενούς παρέχει μια ακριβή και πολυποίκιλες μοντέλο

Παράθεση:. O’Donnell RL, McCormick Α, Mukhopadhyay Α, Woodhouse LC, Τάφρου Μ, Grundy A, et al. (2014) Η χρήση των κυττάρων του καρκίνου των ωοθηκών από ασθενείς που υποβάλλονται σε χειρουργική επέμβαση για να δημιουργήσει πρωτογενή Πολιτισμών ικανό να υποστεί λειτουργική ανάλυση. PLoS ONE 9 (3): e90604. doi: 10.1371 /journal.pone.0090604

Επιμέλεια: Srikumar Π Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center & amp? Research Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 13 Νοεμβρίου, 2013? Αποδεκτές: 2 Φλεβάρη 2014? Δημοσιεύθηκε: 6 Μαρτίου 2014

Copyright: © 2014 O’Donnell et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος των ωοθηκών είναι η κύρια αιτία των γυναικολογικών θνησιμότητας από καρκίνο. παγκοσμίως [1] και παρά πολύ έρευνα για την θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών η συνολική θνησιμότητα έχει αλλάξει ελάχιστα κατά τα τελευταία 20 χρόνια με μια 5-ετή συνολική επιβίωση από 30-39% [2]. Έχει από καιρό αναγνωριστεί από τους κλινικούς ιατρούς ότι ο καρκίνος των ωοθηκών είναι ένα σύνολο ετερογενών ασθενειών, αλλά παρά αυτό το καρκίνωμα των ωοθηκών εξακολουθεί να αντιμετωπίζεται κλινικά ως μία ασθένεια χρησιμοποιώντας ένα συνδυασμό χειρουργικής επέμβασης debulking και με βάση την πλατίνα χημειοθεραπεία. Η παρατηρούμενη διακύμανση στην κλινική συμπεριφορά του καρκίνου των ωοθηκών, παράλληλα με τις αυξανόμενες δεδομένα αναφοράς μοριακό ετερογένεια υποδηλώνει ότι ένα ετερογενές μοντέλο για τη μελέτη του καρκίνου των ωοθηκών έχει καθυστερήσει πολύ. Η αναδυόμενη έννοια της εξατομικευμένης ιατρικής βασίζονται σε βιοδείκτες της ανταπόκρισης σε νέες θεραπείες που στοχεύουν ειδικά ελαττώματα στην επιδιόρθωση του DNA των όγκων είναι δυνατή μόνο εάν βιοδείκτες μπορεί να ελεγχθεί χρησιμοποιώντας ένα ρεαλιστικό μοντέλο.

Ιδρύθηκε κυτταρικές σειρές παρέχουν ένα πολύτιμο εργαλείο για τη μελέτη βιολογικών λειτουργίες σε μοριακό και κυτταρικό επίπεδο. Οι υπάρχουσες ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές των ωοθηκών έχουν το πλεονέκτημα της υψηλής πολλαπλασιαστική ικανότητα, κλωνογονίας και επεκτάθηκε διάρκεια ζωής σε καλλιέργεια. Ωστόσο, οι περισσότεροι έχουν αποκτήσει σημαντικές γενετικές αλλαγές από τα κύτταρα καταγωγής τους, συμπεριλαμβανομένης της διαγραφής των σημαντικών ρυθμιστικών γονιδίων του κυτταρικού κύκλου που υποστηρίζουν την αθανασία. Επιπλέον, υπάρχουν στοιχεία που να δείχνουν ότι πολλές κυτταρικές σειρές περιέχουν σημαντικές πλαστοπροσωπίας, επικάλυψη, και απώλεια της ακεραιότητας [3].

Πρωτογενή κύτταρα που απομονώθηκαν από ασθενείς είναι συχνά πολύ διαφορετική από τις καθιερωμένες κυτταρικές σειρές παρόμοιας προέλευσης. Η ικανότητα καλλιέργειας και να χαρακτηρίσει πρόσφατα απομονωμένα ΟΣΕ (επιθήλιο επιφάνεια των ωοθηκών) και EOC (επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών) κύτταρα από ασθενείς παρέχει ένα σημαντικό πειραματικό σύστημα που έχει τη δυνατότητα να μοιάζει με την κατάσταση του ασθενούς με μεγαλύτερη ακρίβεια [4], [5].

υπάρχουν δύο πηγές του κλινικού υλικού τα οποία έχουν χρησιμοποιηθεί για τη δημιουργία πρωτογενών καλλιεργειών σε καρκίνο των ωοθηκών: ασκητικό υγρό και στερεό καρκινικό ιστό. μελέτες έκφρασης γονιδίων έχουν δείξει διαφορετικές βιολογικές προφίλ στα καρκινικά κύτταρα που προέρχονται από αυτές τις δύο πηγές από τον ίδιο ασθενή από την άποψη της μετάστασης, εισβολή και την αγγειογένεση [6]. Ασκιτικό υγρό έχει αρκετά πλεονεκτήματα έναντι στερεό ιστό όγκου στην παραγωγή πρωτογενείς καλλιέργειες. Ασκιτικό υγρό είναι σχετικά εύκολο να επιτευχθεί και καλλιέργεια των κυττάρων αναστέλλεται είναι τεχνικά ευθεία προς τα εμπρός. Οι καλλιέργειες ασκίτου δειχθεί να παράγει ένα ομοιογενές επιθηλιακών κυττάρων πλούσιος πληθυσμού σε σύγκριση με εκείνα που λαμβάνονται από στερεά ιστούς. Σημαντικά ποσοστά των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών παρόν σε προχωρημένο στάδιο και έχουν μεγάλους όγκους ασκητικού υγρού που μπορεί να ληφθεί κατά τη διάρκεια χειρουργικής επέμβασης ή παρακέντηση. Ωστόσο, δεδομένου ότι η πλειοψηφία των ασθενών με μεγάλα ασκίτη όγκου έχουν όγκους υψηλού βαθμού ορώδες ιστολογικό υπότυπο, μόνο δειγματοληψία ασκίτη θα underrepresent τις άλλες ιστολογικές υποτύπους. Πολιτισμός των στερεών όγκων, ιδιαίτερα στην απουσία ασκίτη Ως εκ τούτου, απαιτείται επίσης να συλλάβει μια αντιπροσωπευτική ομάδα των δειγμάτων.

κυτταρικής καλλιέργειας Πρωτοβάθμια είτε από πηγή θα μπορούσε να παρέχει έναν πόρο για τον έλεγχο του μοριακού προφίλ και να εκτελούν λειτουργικές μελέτες των επιμέρους καρκίνους. Τα τελευταία χρόνια, η σχέση μεταξύ του όγκου μοριακή ετερογένεια, την επιβίωση ή /και την ανταπόκριση στη θεραπεία έχει αναγνωριστεί [7] και έχει τροφοδοτήσει την αναζήτηση για βιοδείκτες για την πρόβλεψη ανταπόκριση σε νέες θεραπείες που στοχεύουν μονοπάτια επιδιόρθωσης του DNA απελευθερωθεί στον καρκίνο των ωοθηκών.

Διάφορες μέθοδοι για την καλλιέργεια των πρωτογενών καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών έχει απομονωθεί από ασκίτη έχουν περιγραφεί [8]. Αυτές οι μέθοδοι ωστόσο απαιτούν πολύπλοκες διαδικασίες πολλαπλών βημάτων. Dunfield

et al

και Shepherd

et al

περιγράψει μια πιο απλή και αξιόπιστη μέθοδος καλλιέργειας που περιλαμβάνει ανάμειξη ασκίτη απευθείας με μέσο το οποίο έχει ως αποτέλεσμα επιθηλιακών κυττάρων πολιτισμού [4], [9]. Η τεχνική αυτή έχει προσαρμοστεί από την ομάδα μας για χρήση στην έρευνα της λειτουργικής κατάστασης των μηχανισμών επιδιόρθωσης του DNA και εδώ αναφέρουμε την εμπειρία μας από αυτήν την τεχνική.

Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Η μελέτη εγκρίθηκε από την τοπική επιτροπή δεοντολογίας (επιτροπή του Ηνωμένου Βασιλείου IRAS North West ηθικής – 12 /NW /0202). και όλοι οι ασθενείς έδωσαν γραπτή συγκατάθεση

Αντιδραστήρια

Rucaparib ήταν ένα δώρο από τον Clovis (ΗΠΑ) και είναι ένας ισχυρός αναστολέας της PARP-1 και -2 πρωτεΐνες (με σταθερά αναστολής της & lt? 5 ηΜ). Όλα τα άλλα χημικά και τα αντιδραστήρια καλλιέργειας ιστών ήταν από Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich, UK), εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά.

Cell Culture

Η συλλογή των δειγμάτων.

ασκίτη και στερεά ιστός συλλέχθηκε από συναινέσει ασθενείς που υποβάλλονται σε χειρουργική επέμβαση για τον καρκίνο των ωοθηκών στο Queen Elizabeth Hospital, Γκέιτσχεντ, Ηνωμένο Βασίλειο. Κλινική λεπτομέρειες καταγράφηκαν και δείγματα καταχωρηθεί και αντιμετωπίζονται σύμφωνα με το ανθρώπινο νόμο ιστών. Τα δείγματα αποδίδεται PCO (Primary Πολιτισμού ωοθήκης) Αριθμός αναφοράς που χρησιμοποιεί για να διατηρήσει την ανωνυμία.

μεταφοράς δειγμάτων και προετοιμασία.

ασκίτης αναρροφάται απευθείας από τον ασθενή σε μια αποστειρωμένη φιάλη αναρρόφησης. Στερεά όγκου τοποθετήθηκε σε ένα αποστειρωμένο καθολική περιέχει μέσο καλλιέργειας (RPMI 1640 μέσο συμπληρωμένο με 20% FCS, 20 mM Ε-γλουταμίνη και 1% πενικιλλίνη και στρεπτομυκίνη) προ-θερμάνθηκαν στους 37 ° C. Τα δείγματα μεταφέρθηκαν από το νοσοκομείο στο εργαστήριο αμέσως σε συμμόρφωση με τους κανονισμούς του Ηνωμένου Βασιλείου Κατηγορία Β UN3373.

Πρωτοβάθμια Πολιτισμικά από ασκίτη.

Κυτταρική καλλιέργεια πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας άσηπτη τεχνική σε μια στρωτή επίπεδο περιορισμού II ρέουν μικροβιολογική υπουργικό συμβούλιο ασφαλείας. 20 ml ασκίτη προσετέθη σε 20 ml θερμού μέσου καλλιέργειας (RPMI με 20% FCS, όπως παραπάνω) σε φιάλες Τ75 (Corning, USA) και επωάστηκαν στους 37 ° C, 5% CO

2, 95% υγροποιημένο αέρα . Το μέσο αναρροφήθηκε και 13 ml θερμαίνεται φρέσκο ​​μέσο αντικαταστάθηκε την ημέρα 3 έως 5. Το μέσο αντικαταστάθηκε κάθε 4 έως 5 ημέρες έως ότου τα κύτταρα προσέγγισαν συρροή. Τα κύτταρα περάστηκαν, καταψύχθηκαν και αποψύχθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [10]. καλλιέργειες κυττάρων τέθηκαν σε καραντίνα σε ένα δημοτικό φυτώριο για να περιμένουν την επίσημη αποτελέσματα παθολογική εξέταση και να διασφαλίσει ότι τα μολυσμένα δείγματα δεν εισήχθησαν σε γενική παιδεία.

Πρωτοβάθμια κουλτούρα από συμπαγή όγκο.

Μόλις στο εργαστήριο, ο συμπαγής όγκος αποκόπηκε σε ~ 3 mm

3 κομμάτια χρησιμοποιώντας ένα αποστειρωμένο νυστέρι και μεταφέρθηκαν σε φιάλες Τ25 που περιέχουν διάλυμα επαρκής κολλαγενάσης /δισπάση (Roche, UK) (1 mg /1 ml σε πλήρες μέσο) για να βυθίσει πλήρως το δείγμα. Τα κύτταρα επωάστηκαν για 2 ώρες στους 37 ° C πάνω σε περιστροφικό αναδευτήρα (ΙΚΑ-Vibrax-VKR) σε 2 × G. Το κυτταρικό εναιώρημα μεταφέρθηκε σε ένα καθολικό δοχείο, φυγοκεντρήθηκε στα 400 χ g για 5 λεπτά, πλύθηκαν PBS, επαναιωρήθηκε σε πλήρες μέσο και τοποθετήθηκαν σε μία φιάλη Τ25 επί 30 λεπτά για να επιτραπεί ινοβλαστών σπορά. Το επιθηλιακό κυτταρικό εναιώρημα μεταφέρθηκε σε μία φιάλη Τ25 για τη συνεχή καλλιέργεια κυττάρων.

βελτιστοποίηση Πολιτισμού

Άμεσες καλλιέργεια σε καλυπτρίδες.

Ο χρόνος από τη συλλογή με τη λειτουργική αξιολόγηση μπορεί να είναι μέχρι και 14 ημέρες. Για να μειωθεί το μήκος του πολιτισμού και χειρισμού πριν από τη χρήση, τα μέσα ενημέρωσης και ασκητικό υγρό (1:01 v:v) προστέθηκε απευθείας σε στείρα καλυπτρίδες για άμεση ανάλυση.

κυτταροπεριστροφή.

ασκητικό υγρό κυτταρόνημα απευθείας πάνω πλάκες μικροσκοπίου μετά τη βελτιστοποίηση της ταχύτητας φυγοκέντρησης, ο όγκος του δείγματος και τον εμπλουτισμό του ασκητικού υγρού με τη χρήση της προσθήκης του κόκκινου ρυθμιστικού λύσης κυττάρου. Μετά cytospining, τα πλακίδια ξηράνθηκαν στον αέρα, σταθεροποιήθηκαν με 100% μεθανόλη και αποθηκεύτηκε στους -20 ° C για μεταγενέστερη χαρακτηρισμό.

Χαρακτηρισμός

Ο καρκίνος των ωοθηκών είναι ένα σύνολο ετερογενών ασθενειών. Επιπλέον, ασκητικό υγρό περιέχει μια ποικιλία κυτταρικών τύπων και ένα ενιαίο δείκτης είναι επομένως ανεπαρκές, δεδομένου ότι διαφοροποιούνται αξιόπιστα επιθηλιακά ωοθηκών καρκινικά κύτταρα από άλλους τύπους κυττάρων. Μια ομάδα χαρακτηρισμός που αποτελείται από τη μορφολογία της κυτταρικής καλλιέργειας, ανοσοφθορισμού χρώση των σταθερών κυττάρων, καθώς και πρότυπο παθολογική και ανοσοϊστοχημεία εξέταση συνδυάζονται για να εξασφαλίζεται η ακριβής επιθηλιακά χαρακτηρισμό του κάθε πολιτισμού.

Μορφολογία.

Μορφολογικά χαρακτηριστικά μελετήθηκαν κάτω από τον Όλυμπο CK40 ανεστραμμένο μικροσκόπιο σε 20 × μεγέθυνση. Οι εικόνες ελήφθησαν χρησιμοποιώντας λογισμικό VisiCam (VWR, USA).

ανοσοφθορισμού.

πρότυπες τεχνικές για ανοσοφθορισμού χρησιμοποιήθηκαν για τη χρώση για pancytokeratin, μόριο κυτταρικής προσκόλλησης επιθηλιακών (EpCAM), καρκινικό αντιγόνο 125 (ΟΑ125 ), που σχετίζονται με το αντιγόνο του επιθηλίου (MOC-31), D2-40 και βιμεντίνης, Πίνακας 1. Καμία από τις θετικές δείκτες είναι ομοιόμορφα εκφράζονται σε όλα τα ΕΓΚ κύτταρα, αλλά ερμηνεύονται σε συνδυασμό επιτρέπουν την επιλογή των κατάλληλων καλλιεργειών.

η

Τυπική ιστοπαθολογική

η επίσημη παθολογικά και κυτταρολογική εξέταση του ασκιτικού και στερεά δείγματα όγκων από ασθενείς που δίνουν δείγματα PCO πραγματοποιήθηκε και χρησιμοποιείται για να χαρακτηρίσει περαιτέρω τις κουλτούρες.

Όταν όλες οι χαρακτηρισμοί ήταν σύμφωνη με τα επιθηλιακά ωοθηκών καταγωγή, τα δείγματα στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκαν σε επόμενα πειράματα. Σε περίπτωση που τα αποτελέσματα ήταν ασυνεπής με επιθηλιακής προέλευσης, οι καλλιέργειες απορρίπτεται.

IMAGESTREAM

X χαρακτηρισμό

Ιδρύθηκε πολιτισμών PCO και φρέσκα ασκίτη.

κύτταρα PCO, καλλιεργήθηκαν χρησιμοποιώντας τις μεθόδους ανωτέρω, τρυψινοποιήθηκαν, μονιμοποιήθηκαν με 0,4% παραφορμαλδεΰδη για 20 λεπτά στους 4 ° C, και περατά με BD Phosflow Perm /πλύση Ι (BD Biosciences, USA? 1:10 v:v απεσταγμένο νερό).

για φρέσκο ​​ασκίτη, δέκα ml του ασκιτικού υγρού διηθήθηκε για να αποκλείσει μεγάλο συντρίμμια (180 μm πόρου φίλτρο νάιλον, Millipore, Ηνωμένο Βασίλειο). Όπως ασκιτικό υγρό συχνά μολυσμένα με αίμα, η προσθήκη ενός στερεωτικού περιέχει ρυθμιστικό ερυθροκυττάρων λύσης (1:05 ​​v:v BD Phosflow Lyse /Fix κόκκινο ρυθμιστικό κυτταρικής λύσης, BD Biosciences, USA) επέτρεψε εξάντληση των ερυθρών αιμοσφαιρίων. Τα κύτταρα περατά με BD Phosflow Perm /πλύση Ι και το δείγμα περαιτέρω εμπλουτισμένη με εξάντληση των λευκών κυττάρων του αίματος χρησιμοποιώντας EasySep Ανθρώπινο CD45 εξάντληση Kit (τεχνολογίες StemCell, Γαλλία), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Όλα τα δείγματα στη συνέχεια επωάστηκαν με immunoflourescent-επισημασμένα αντισώματα για 12 ώρες στους 4 ° C συμπεριλαμβανομένων pancytokeratin, EpCAM, CA125, DRAQ5 πυρηνική χρώση και αντιγόνο κοινό leucicytoe (CD45) για την ταυτοποίηση των λευκών αιμοσφαιρίων. Τα δείγματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τη χρήση IMAGESTREAM

X (Amnis, USA) με τις ιδέες λογισμικό που χρησιμοποιείται για την ποσοτικοποίηση της αναλογίας των κυττάρων που εκφράζουν τις τρεις επιθηλιακών δεικτών, καθώς και την παροχή αξιολόγηση της συν-έκφρασης.

Ανάπτυξη και κυτταροτοξικότητα δοκιμασίες

SRB.

Μια ρουτίνα σουλφοροδαμίνης Β (SRB) δοκιμασία χρησιμοποιήθηκε για την εκτίμηση της κυτταροτοξικότητας και την ανάπτυξη των κυττάρων, όπως περιγράφεται προηγουμένως [11]. Εν συντομία, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε μια συγκέντρωση 1000 κύτταρα /φρεάτιο και μετά προσκόλληση, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις rucaparib για 10 ημέρες πριν από την στερέωση, χρώση και την αξιολόγηση φασματοφωτόμετρο.

κλωνογενείς δοκιμασίες.

Κλωνογόνος οι προσδιορισμοί θεωρούνται χρυσό πρότυπο για την αξιολόγηση της κυτταροτοξικότητας. 50000 κύτταρα /φρεάτιο σπάρθηκαν σε πλάκα 6 φρεατίων για 24 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν για 24 ώρες με διάφορες συγκεντρώσεις του κυτταροτοξικού παράγοντα πριν επανασπορά σε συγκεντρώσεις 2500, 5000 και 10.000 κύτταρα για κάθε φαρμακευτική αγωγή. Τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C για 14 ημέρες. Το μέσο αναρροφήθηκε, οι πλάκες πλύθηκαν σε PBS και στη συνέχεια στερεώνονται με στερεωτικό του Carnoy του (οξικό οξύ: μεθανόλη 1:03 ν /ν).. Που ακολουθείται από χρώση με 1% κρυσταλλικό ιώδες

Άγαρ clonogenics

50.000 κύτταρα σπάρθηκαν σε φρεάτια που περιέχουν μέσα και υποβλήθηκε σε επεξεργασία όπως παραπάνω για 24 ώρες σε θρεπτικό μέσο αγαρόζης. Τα κύτταρα στη συνέχεια trysinised, πλύθηκαν και επανα-εμβολιάστηκαν σε ημιστερεά αγαρόζη (Promega, UK) μέσα ενημέρωσης, σε μια ποικιλία συγκεντρώσεων, και επωάστηκαν για 14 ημέρες. Οι αποικίες κηλιδώθηκαν με τη χρήση 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου (ΜΤΤ).

διαμόλυνσης κυττάρων

λουσιφεράσης που εκφράζουν το πλασμίδιο pGL2 (Promega, USA ) επιμολύνθηκε χρησιμοποιώντας δύο μεθόδους. Πρώτον, το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Invitrogen, USA) για την επιμόλυνση κυττάρων με λιποφεκταμίνη ΤΜ LTX με Plus αντιδραστήριο χρησιμοποιήθηκε για την επιμόλυνση PCO καλλιέργειες με 1-6 μα DNA ανά φρεάτιο. Δεύτερον, 250 μΙ κυτταρικού εναιωρήματος PCO περιείχε 1 × 10

6 κύτταρα /ml αναμίχθηκαν με 1-5 μα pGL2 πλασμιδίου σε 4 κυψελίδες mm ηλεκτροδιάτρηση (Eurogentec, Βέλγιο). Η ηλεκτροδιάτρηση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας έναν ηλεκτροδιατρητή ΕΡΙ-2500 σε 100-500 βολτ. Οι επιμολύνσεις και από τις δύο μεθόδους συλλέχθηκαν 48 ώρες μετά την επιμόλυνση και εξετάστηκαν για δραστικότητα λουσιφεράσης.

Επιπλέον PCO καλλιέργειες επιμολύνθηκαν χρησιμοποιώντας MISSION ™ shRNA σωματίδια βραδέος ιού μεταγωγής (Sigma-Aldrich, USA), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

Ο ομόλογος ανασυνδυασμός

δοκιμασία

τα κύτταρα σπάρθηκαν επί γυάλινων καλυπτρίδων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 2Gy ιοντίζουσα ακτινοβολία και rucaparib σε συγκέντρωση 10 μΜ για 24 ώρες για να διεγερθεί θραύσεων διπλής έλικος (DSB). Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν μαζί με χωρίς θεραπεία ελέγχους με ισοδύναμο 0,1% DMSO. Τα κύτταρα στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν και επανυδατώνονται πριν την χρώση με μονοκλωνικά 1:100 ποντικού αντι-γH2AX (Upstate, Millipore Corp., USA) και 1:100 κατσίκα πολυκλωνικό αντι-Rad51 (Calbiochem, EMD Biosciences, Inc., USA) αντισώματα με κατάλληλες δευτεροβάθμιας φθορόχρωμα συζευγμένα αντισώματα, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [5].

λογισμικό Image J μέτρησης [12], [13] χρησιμοποιήθηκε για να μετρήσει γH2AX και Rad51 νουκλεϊκών εστίες. Τα κύτταρα χαρακτηρίζονται ως ομόλογος ανασυνδυασμός (HR) αρμόδια αν υπήρχε κάτι περισσότερο από μια αύξηση κατά 2 φορές σε Rad51 εστίες μετά από βλάβη του DNA, επιβεβαίωσε από την αύξηση κατά 2 φορές σε γH2AX.

Αποτελέσματα

Δημιουργία πρωτογενείς καλλιέργειες από ασκίτη

ασκίτης συνελέγη από 172 ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών που υποβάλλονται σε πρωτογενή (67%) ή να καθυστερήσει πρωτογενή χειρουργική επέμβαση (μετά από τέσσερις παρα τρία κύκλους με βάση την πλατίνα νεο-επικουρική χημειοθεραπεία? 33%) μεταξύ του 2008 και του 2013 . βιώσιμα καλλιέργειες που παράγονται σε 166/172 (97%) περιπτώσεις. Ερυθροκύτταρα και κυτταρικών υπολειμμάτων από ασκίτη δεν τηρούν την φιάλη καλλιέργειας και απομακρύνθηκαν μετά από την αλλαγή των μέσων ενημέρωσης. Σε γενικές γραμμές η εμφάνιση του κάθε καλλιέργειας ήταν εκείνη ενός προτύπου λιθόστρωτα μονοστιβάδα, Σχήμα 1 (Α), όπως περιγράφεται από τους Dunfield

κ.ά.

[4]. Ασκιτικό υγρό αποτελείται από πολλά κυτταρικά συστατικά και, προκειμένου να επιβεβαιωθεί αποκλειστική ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων χαρακτηρισμός των καλλιεργημένων κυττάρων είναι απαραίτητη. Immunoflourescent χαρακτηρισμός των καλλιεργειών διεξήχθη χρησιμοποιώντας τον πίνακα αντισωμάτων για detetct έκφραση του CA125 pancytokeratin, EpCAM, MOC-31, D2-40 και βιμεντίνης, Σχήμα 1 (Β-Ρ). 10/166 (6%) απορρίφθηκαν καθώς δεν κατάφεραν να αποδείξουν μεγαλύτερη από 95% κυτοκερατίνης θετικότητα. Το συνολικό ποσοστό επιτυχίας, ως εκ τούτου για τη δημιουργία ασκητικό επιθηλιακά πρωτογενείς καλλιέργειες από ασθενείς που υποβάλλονται σε χειρουργική επέμβαση ήταν 156/172 (91%). Ρουτίνας ιστοπαθολογική εξέταση των FFPE ιστό από κάθε ασθενή πραγματοποιήθηκε, Πίνακας 2. Η πιο κυρίαρχη ιστολογική υπότυπο ήταν υψηλής ποιότητας υδαρής καρκίνου

Α:. Φωτεινού αποδεικνύοντας πλακόστρωτα μονοστρωματική? immunoflourescent εικόνες με αντισώματα που στοχεύουν ενάντια: Β: FITC-αντι-pancytokeratin? C: Alexafluor 596 αντι-CA125? D: Alexflour 488 αντι-ΕρΟΑΜ? Ε: Alexafluor 596 αντι-MOC 31? F: Alexaflour 596 αντι-βιμεντίνης

Η

Σε ένα υποσύνολο δειγμάτων, immunoflourescent εκτίμηση της έκφρασης CA125 στο δείγμα PCO συγκρίθηκε με την έκφραση CA125 για ανοσοϊστοχημική ανάλυση του FFPE ιστού από τον ίδιο ασθενή Σχήμα 2. Συσχέτιση των αποτελεσμάτων από τις δύο αξιολογήσεις παρατηρήθηκε σε 8/11 (72%) περιπτώσεις. Στις υπόλοιπες τρεις περιπτώσεις, δύο έδειξαν IHC έκφραση του CA125 μόνο, ενώ ένας έδειξε Εάν η έκφραση μόνο

PCO 158 Α:. Ανοσοϊστοχημική ανίχνευση του CA125 σε FFPE ιστούς? Β: Immunofluourescent ανίχνευση του CA125 με Alexaflour596 από τα αντίστοιχα πρωτογενή καλλιέργεια

Η

κυτταρική μορφολογία μελετήθηκε σε βάθος χρόνου και θεωρήθηκε ότι η πλειοψηφία των πολιτισμών ήταν λιθόστρωτα μορφολογίας, αλλά αργά κύτταρα πέρασμα (συνήθως μετά από πέρασμα 4 /5) ανέπτυξαν μία πιο μεσεγχυματικά φαινότυπο, να γίνει επιμήκη και παρουσιάζουν μια σημαντικά μειωμένη ρυθμό ανάπτυξης. Γήρανση συνέβη μεταξύ του 2ου και του 8ου περάσματα, πιο συχνά μεταξύ του 4ου και 5

ου, καθιστώντας έτσι τον περαιτέρω χαρακτηρισμό στο τέλος του περάσματος αδύνατη. Οι καλλιέργειες θεωρείται επιτυχής όταν δεν ανάπτυξη παρατηρήθηκε μετά από 28 ημέρες. Ένας πολιτισμός αυθόρμητα απαθανάτισε και έχει αυξηθεί σε πάνω από 20 περάσματα. Δεν είναι σαφές γιατί ο πολιτισμός από ασκίτη είναι ανεπιτυχής σε ένα ποσοστό των περιπτώσεων, γιατί το γήρας εμφανίζεται σε μεταβλητό περάσματα ή γιατί μόνο ένας πολιτισμός έχει απαθανάτισε. Είναι πιθανό, ωστόσο, ότι αυτό αποτελεί συνέπεια της έλλειψης ουσιωδών παραγόντων που απαιτούνται για την ανάπτυξη, οι οποίες παρέχονται

in vivo

από τις πολύπλοκες αλληλεπιδράσεις εντός μικροπεριβάλλον του όγκου και τα οποία λείπουν στο τεχνητό περιβάλλον καλλιέργειας.

ανάπτυξη Culture

οι ρυθμοί ανάπτυξης των 30 καλλιεργειών PCO, αναπτύχθηκαν σε RPMI μέσα συμπληρωμένα με 20% FCS, μετρήθηκαν με δοκιμασίες SRB χρησιμοποιώντας νωρίς κύτταρα πέρασμα για να δημιουργήσει χρόνους διπλασιασμού. Διπλασιασμός φορές μεταξύ PCO καλλιέργειες εξαιρετικά μεταβλητή με μέσο χρόνο 100 ώρες (εύρος 79-195 ώρες), Σχήμα 3. Ωστόσο διπλασιασμό, κύτταρα από τον ίδιο τον πολιτισμό δοκιμαστεί σε διαφορετικές πέρασμα έδειξε ελάχιστη διακύμανση στο χρόνο διπλασιασμού (μέση διαφορά 0,9 ωρών ? SEM 4.8). Καμία συσχέτιση φάνηκε ανάμεσα ρυθμό ανάπτυξης, ιστολογική υπότυπο ή το στάδιο της νόσου κατά την παρουσίαση. Ο σχετικά αργός ρυθμός ανάπτυξης παρατηρήθηκε μπορεί επίσης να είναι μια συνέπεια της articial περιβάλλοντος culturee και η έλλειψη των παραγόντων από την micronvironment όγκο.

Ο μέσος όρος και SD των 6 επαναλήψεις για κάθε χρονικό σημείο σχεδιάζεται, κανονικοποιημένη σε μέρα 1.

η

Πρωτοβάθμια πολιτισμού από συμπαγή όγκο

παράλληλα με ασκίτη, στερεό ιστό συλλέχθηκε από 11 ασθενείς και επεξεργασία όπως περιγράφεται. Δημιουργία κυτταρικών καλλιεργειών από μοσχεύματα ιστού επιτεύχθηκε στο 100% των περιπτώσεων. Η μορφολογία έκφυτο χάθηκε 72 ώρες μετά την σπορά ως κύτταρα αποκτήσει εμφάνιση λιθόστρωτα μονοστιβάδας με το χρόνο και πέρασμα. Οι καλλιέργειες έδειξαν παρόμοια μορφολογική εμφάνιση με εκείνα που προέρχονται από καλλιέργεια κυττάρων ασκητικό, Σχήμα 4. μόλυνση ινοβλαστών ελαχιστοποιήθηκε με επίστρωση των κυττάρων για επώαση 30 λεπτών πριν από την αφαίρεση της πλούσιας επιθηλιακών υπερκειμένου και επαναφόρτωση Εικόνα 5.

Α: Πέρασμα 0 σε 48 ώρες? Β: Πέρασμα 0 σε 72 ώρες? C: Πέρασμα 1 στις 14 ημέρες

Η

Α: ανάπτυξη επιθηλιακών κυττάρων από το υπερκείμενο απομακρύνεται 30 λεπτά μετά την αρχική επένδυση (× 20 μεγέθυνση)? Β: Τα κύτταρα προσκολλώνται κατά την αρχική επώαση 30 λεπτών ήταν σχεδόν εξ ολοκλήρου fibroblastic (× 10 μεγέθυνση)

Η

μεταφοράς δείγματος

βελτιστοποίηση των μεταφορών

Τόπος συλλογής δειγμάτων.. είναι συχνά μακριά από εργαστηριακές εγκαταστάσεις. Για να χρησιμοποιήσετε αυτό το μοντέλο συνεργασίας μεταφραστική εργασία επιτυχή δημιουργία του πολιτισμού παρακάτω μεταφοράς πρέπει να εξεταστεί. Ως εκ τούτου, σε σύγκριση με την επιτυχία του χαρακτηρισμού του πολιτισμού και λειτουργικές δοκιμασίες μετά από διάφορες μεθόδους μεταφοράς

Ομάδα 1 – Φρέσκα ασκίτη (n = 10):. Μεταφορά στο εργαστήριο με τη μεταποίηση εντός 6 ωρών από τη συλλογή, χρησιμοποιώντας τη μέθοδο που περιγράφεται παραπάνω .

Ομάδα 2 – δείγματα σε θερμοκρασία δωματίου (n = 7):. ασκίτη αποθηκεύτηκε σε θερμοκρασία δωματίου σε ένα αποστειρωμένο δοχείο για 24 ώρες πριν από την ανάμιξη 1:01 με μέσο σε μια φιάλη όπως παραπάνω

Ομάδα 3 – ψυγεία δείγματα (n = 10): ασκίτη αποθηκεύθηκε στους 4 ° C για 24 ώρες πριν από την ανάμιξη 1:01 με μέσο όπως παραπάνω

Ομάδα 4 – κατεψυγμένα δείγματα (η = 6):. ζευγαρωμένα σύνολα 50 ml υποπολλαπλάσια του ασκιτικού υγρού φυγοκεντρήθηκαν στα 400G για 5 λεπτά. Τα προκύπτοντα σφαιρίδια κυττάρου καταψύχθηκαν, αποθηκεύθηκαν στους -80 ° C και -120 ° C και αποψύχθηκε σε 6 εβδομάδες και 6 μήνες.

Επιτυχής καλλιέργειες επιτεύχθηκαν από όλες τις ομάδες των μεταφορών Ωστόσο, σε περιπτώσεις με καθυστερημένη καλλιέργεια ήταν προτιμότερο να διατηρήσει καλλιέργειες στους 4 ° C. Δεν υπήρχε διαφορά στην μορφολογία των καλλιεργειών που αναπτύχθηκαν από κάθε ομάδα, Πίνακα 3.

Η

Ασκιτικό σφαιρίδια κυττάρου (Ομάδα 4) αποθηκεύονται στους -80 ° C και -120 ° C αποψύχθηκαν σε 6 εβδομάδες και 6 μήνες. Οι καλλιέργειες αναπτύχθηκαν με επιτυχία από τις δύο συνθήκες αποθήκευσης μετά από 6 εβδομάδες χωρίς να παρατηρηθεί σε μορφολογία, ρυθμό ανάπτυξης ή λειτουργική εκτίμηση διαφορά. Ωστόσο, μετά από 6 μήνες αποθήκευσης, παρατηρήθηκε μία σημαντική διαφορά στην επιτυχία των επόμενων πολιτισμού από τις δύο προϋποθέσεις. σφαιρίδια ασκίτου αποθηκεύονται στους -120 ° C ήταν επιτυχώς καλλιεργήθηκαν σε 83% των περιπτώσεων. Δεν καλλιέργειες αποθηκεύονται στους -80 ° C θα μπορούσε να αναπτυχθεί με επιτυχία.

πολιτισμών Coverslip

Η μορφολογική εμφάνιση των κυτταρικών καλλιεργειών επικάλυμμα ήταν παρόμοια με παράλληλες καλλιέργειες σε επεξεργασία με τη σταθερή μέθοδο. Immunoflourescent χαρακτηρισμός ήταν συνεπής σε όλες τις περιπτώσεις PCO μεταξύ καλυπτρίδα και παραδοσιακών πολιτισμών μέθοδο. Η βέλτιστη χρώση immunoflourescent για το χαρακτηρισμό λήφθηκε αν πραγματοποιηθεί περισσότερες από 24 ώρες μετά την σπορά.

κυτταροπεριστροφή

Οι βέλτιστες παράμετροι για την εξισορρόπηση μέγιστη προσκόλληση των κυττάρων με τη διατήρηση της πυρηνικής μορφολογίας ήταν 200 μl του ασκητικού υγρού (συγκέντρωση 10 × 10

4 κύτταρα ανά ml) κυτταρόνημα σε 80 χ g για 5 λεπτά. Παρά μέτρα που έχουν ληφθεί για να καταστρέφουν το δείγμα ασκιτικού υγρού ανεπιθύμητων μη επιθηλιακά κύτταρα και τα συντρίμμια, διαφάνειες παρέμεινε μολυνθεί σε μεγάλο βαθμό, επιβεβαιώθηκε από υπο-βέλτιστη χρώση κυτοκερατίνη και η κακή έκφραση CA125. Η μόλυνση γίνεται εκτίμηση της μορφολογίας, immunoflourescent χαρακτηρισμός και λειτουργική αξιολόγηση της κατάστασης HR ανεπιτυχής.

IMAGESTREAM

X αξιολόγηση των πολιτισμών PCO

Η εισαγωγή IMAGESTREAM

τεχνολογία X με την ικανότητά του να συνδυάζουν κυτταρομετρία ροής με μικροσκοπία immunoflourescent υψηλή ανάλυση επέτρεψε την εκτίμηση της έκφρασης ενός αριθμού ανοσοφθορισμού-επισημασμένου δεικτών εντός μεμονωμένων κυττάρων ταυτοχρόνως με υψηλή ταχύτητα και υψηλή ανάλυση. Immunoflourescent ανίχνευση των τριών επιθηλιακών δεικτών των ωοθηκών (pancytokeratin, EpCAM και CA125), αξιολογούνται με τη χρήση τυποποιημένων σταθερό ανοσοφθορισμό και IMAGESTREAM

τεχνολογία X ήταν συνεπής στις 13/15 περιπτώσεις (87%), Πίνακας 4. Επιπλέον IMAGESTREAM

X επέτρεψε την ποσοτικοποίηση του ποσοστού έκφρασης και την αξιολόγηση των συν-έκφρασης.

η

IMAGESTREAM

X αξιολόγηση των φρέσκων δειγμάτων ασκίτη

Δέκα ml φρέσκου ασκίτη συλλέχθηκε και αναλύθηκε από επτά ωοθηκών ασθενείς με καρκίνο, χρησιμοποιώντας IMAGESTREAM

Χ. Τα κύτταρα που ταξινομούνται ως επιθηλιακά αν είχαν πυρήνες, αρνητικά για CD45 και θετικά για EpCAM, CK ή CA125. Το επιθηλιακό κυτταρικό πληθυσμό σε κάθε δείγμα ασκίτη μπορεί να διαιρεθεί σε έναν αριθμό υποπληθυσμών με βάση το πρότυπο επισήμανσης αντισώματος, σχήμα 6α και β, και όπως αποδείχθηκε μεγάλη ετερογένεια μεταξύ των όγκων. Η αναλογία των κυττάρων που χρωματίζονται θετικά για EpCAM ήταν εξαιρετικά μεταβλητή με ένα μέσο όρο 52% (0-98%). Δεν υπήρχε συσχέτιση μεταξύ της IMAGESTREAM

X καθορίζεται έκφραση των επιθηλιακών δεικτών και της κατάστασης όπως προσδιορίζεται από σταθερό ανοσοφθορισμού (καμπύλη ROC, δεν φαίνεται, AUC 0,5). Είναι πιθανό ότι ορισμένες από αυτές τις υποπληθυσμών μπορεί να αντιπροσωπεύουν μη-επιθηλιακών κυττάρων (δηλαδή μεσοθηλιακών κυττάρων), αλλά επίσης πιθανό ότι βρίσκονται σε επιθηλιακά κύτταρα πραγματικότητα και υφίστανται φαινοτυπική αλλαγή ως αποτέλεσμα της μεθόδου καλλιέργειας? ή ότι η μέθοδος καλλιέργειας επιλέγει θετικά έξω υποπληθυσμών. Διαλογή κυττάρων με επακόλουθη μοριακό προφίλ του καθενός από τα υποπληθυσμών θα αποσαφηνίσει αυτό και θα επιτρέψει την περαιτέρω μοριακές διαφορές στα υποσύνολα του ΕΓΚ που πρέπει να διερευνηθούν

Α:. Οικόπεδο κυττάρων ImagestreamX των αντιπροσωπευτικών κυττάρων επίδειξη των τριών μεγάλων κυτταρικών υποπληθυσμών μέσα ασκητικό υγρό,? i) CK θετικά μόνο, ii) CK και CA125 θετική και iii) EpCAM, CK και CA125 θετική. Β: Υπο-πληθυσμοί που προσδιορίζονται στον πληθυσμό επιθηλιακών κυττάρων σε EOC ασκιτικό υγρό (n = ο συνολικός αριθμός των επιθηλιακών κυττάρων που ταυτοποιούνται στα 10 ml ασκίτη)

Η

διαμόλυνσης κυττάρων

A. αριθμός λειτουργικών δοκιμασιών απαιτούν επιμόλυνση των φορέων εντός κυττάρων [14], [15]. Παρά βελτιστοποίηση, και οι δύο μέθοδοι επιμόλυνσης Lipofectamine και ηλεκτροδιάτρηση απέτυχε να δώσει ένα αρκετά υψηλό αποτελεσματικότητα επιμόλυνσης για λειτουργικές δοκιμασίες.

Ωστόσο, τα κύτταρα συνέχισαν να αναπτύσσονται σε μέσα πουρομυκίνη μετά την επιμόλυνση με χρήση MISSION ™ shRNA σωματίδια λεντοϊού μεταγωγή υποδηλώνοντας επιτυχής διαμόλυνση. Μακροπρόθεσμες επιμόλυνση δεν μπορούσε να εκτιμηθεί λόγω της βραχυπρόθεσμη διάρκεια ζωής των πολιτισμών PCO.

Λειτουργική ομόλογο ανασυνδυασμό δοκιμασίες και κυτταροτοξικότητα

Ο προσδιορισμός RAD51 για την κατάσταση της επισκευής HR DNA πραγματοποιήθηκε με επιτυχία στο όλες οι πρωτογενείς καλλιέργειες που αναπτύχθηκαν με επιτυχία από όλες τις ομάδες των μεταφορών. κατάσταση HR για καλλιέργειες από τον ίδιο δότη PCO, χρησιμοποιώντας την άμεση επένδυση σε καλυπτρίδες και πολιτισμών ασκητικό ήταν όλοι συνεπείς. Η καλλιέργεια απευθείας σε καλυπτρίδες μειωθεί ο χρόνος που απαιτείται από τη συλλογή για να καθορίσει την κατάσταση HR από περίπου 14 έως 5 ημέρες.

Όπως ήταν αναμενόμενο η GI

50 τιμές μετά από θεραπεία με rucaparib για κάθε πολιτισμό PCO ήταν μεταβλητή, ωστόσο, μια σαφής διαφοροποίηση των ευαίσθητων και ανθεκτικών δείγματα παρατηρήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [5]. Στην πλειονότητα των περιπτώσεων, όπως αναμενόταν, τα δείγματα PCO με ελαττωματική κατάσταση HR ήταν ευαίσθητα σε rucaparib, ενώ αυτά με τις αρμόδιες κατάσταση HR ήταν ανθεκτικά, πίνακα 5.

Η

Παρά βελτιστοποίηση από τις αρκετές τυπικές κλωνογονική τεχνικές, αποικία σχηματισμός δεν είχε δει και ως εκ τούτου κλωνογενείς δοκιμασίες εγκαταλείφθηκε PCO πολιτισμούς. το έργο γραμμή κυττάρων έχει αποδείξει στο παρελθόν μια γραμμική σχέση μεταξύ των αποτελεσμάτων που λαμβάνονται από SRB και clonogenics και ως εκ τούτου SRB υιοθετήθηκε ως τυποποιημένη τεχνική σε αυτή τη μελέτη [16].

Συζήτηση

Η ικανότητα να δημιουργήσουν και να χρησιμοποιούν πρωτογενείς καλλιέργειες καρκίνου των ωοθηκών έχει πολλά πλεονεκτήματα σε σχέση με άλλα μοντέλα, συμπεριλαμβανομένων καθιερωμένες κυτταρικές σειρές και ζωικά μοντέλα. Αναγνωρίζεται τώρα ότι πολλές κυτταρικές σειρές σε μακροχρόνια καλλιέργεια θα υποβληθεί σε περαιτέρω γενετικών ανωμαλιών που τα καθιστά ανόμοια από ιστό προέλευσής τους. Επιπλέον ακόμα και ένα μεγάλο πάνελ των κυτταρικών γραμμών δεν μπορεί να ανακεφαλαιώσουμε την τεράστια ετερογένεια που παρατηρείται σε επιθηλιακού καρκίνου των ωοθηκών. Πολλά ζωικά μοντέλα απλώς ξενομοσχεύματα που χρησιμοποιούν αυτές τις κυτταρικές σειρές και ως εκ τούτου διατηρούν το ίδιο σύνολο των προβλημάτων. Διαγονιδιακά μοντέλα ποντικών έχουν την τάση να έχουν παραχθεί με την ενσωμάτωση ένα μικρό αριθμό των μεταλλάξεων [17] και ως εκ τούτου δεν εμφανίζουν τη μαζική χρωμοσωμική αστάθεια που είναι ένα αναγνωρισμένο σήμα κατατεθέν του καρκίνου των ωοθηκών [18].

Εδώ έχουμε περιγράψει μας δική ευρήματα για την παραγωγή πρωτογενών καλλιεργειών του καρκίνου των ωοθηκών, χρησιμοποιώντας κύτταρα που προέρχονται από τις δύο ασκίτη και στερεά καταθέσεις της νόσου. Η ικανότητα να καλλιέργειας από τα δύο αυτά υλικά είναι σημαντική καθώς, εξαρτάται από το κλινικό περιβάλλον, μόνο ένα από αυτά τα υλικά μπορεί να είναι διαθέσιμες. Για παράδειγμα, στην υποτροπή της νόσου που δεν είναι ασυνήθιστο να δει ασκίτη σε απουσία μεγάλων στερεών καταθέσεων σε αντίθεση με την αρχική ρύθμιση παρουσίαση όπου μόνο στερεό νόσος μπορεί να είναι παρόν. Έχουμε αναφερθεί μια διαδοχική σειρά δειγμάτων για να αποδείξουν το ποσοστό επιτυχίας για τη δημιουργία των πολιτισμών. 156/172 (91%) δείγματα που συλλέγονται ως αποτέλεσμα μια βιώσιμη καλλιέργεια επιθηλιακών κυττάρων. Το ποσοστό αυτό είναι αρκετά υψηλό για να δικαιολογήσει τη εφικτή τη χρήση αυτών των τεχνικών στην καθημερινή κλινική πρακτική, εάν είχαν αναπτυχθεί διαγνωστικές εξετάσεις για χρήση με αυτό το υλικό.

Συχνά, και μάλιστα στη δική μας περίπτωση, μπορεί να υπάρχουν σημαντικές γεωγραφικό διαχωρισμό μεταξύ το χειρουργείο και το διαγνωστικό εργαστήριο. Η ικανότητα να μεταφέρει δείγματα χωρίς απώλεια της ακεραιότητας Είναι συνεπώς απαραίτητο και έχουμε περιγράψει τις τεχνικές που αποδεικνύει ότι αυτά τα δείγματα μπορεί με ασφάλεια να διατηρηθεί σε είτε 4 ° C ή -20 ° C για έως και 24 ώρες πριν από την καλλιέργεια. Επιπλέον, η ικανότητα να αποθηκεύουν πολιτισμούς μακροπρόθεσμα σε υγρό άζωτο επιτρέπει τη δυνατότητα συνεργασίας για την έρευνα ή

post hoc

διαγνωστική ανάλυση.

Ιδιαίτερα σε υψηλές στάδιο, όταν οι όγκοι διαδοθούν σε ολόκληρη την κοιλιακή κοιλότητα και πέρα, πολλοί όγκοι θα καταδείξει σημαντική ετερογένεια ενδοογκική [19], [20] αν και συχνά αυτές οι αλλαγές είναι πιο σχετικές με τοπική αντίδραση στρωματικά παρά την παρουσία ή απουσία βασικών μεταλλάξεων οδηγού [21].