Abstract

Apo2 συνδέτη (Apo2L) /παράγοντα νέκρωσης όγκων που σχετίζονται με συνδέτη που επάγει απόπτωση (TRAIL) είναι ένα πολλά υποσχόμενο θεραπευτικό του καρκίνου παράγοντα. Η ανασυνδυασμένη ανθρώπινη Apo2L /TRAIL έχει υπό κλινικές δοκιμές, ενώ διάφορα είδη των κακοηθών όγκων έχουν αντοχή σε Apo2L /TRAIL. Εμείς και άλλοι έχουν δείξει ότι αρκετές αντικαρκινικών παραγόντων και φλαβονοειδή ξεπεράσει την αντίσταση στην Apo2L /TRAIL με προς τα πάνω ρύθμιση του υποδοχέα θανάτου 5 (DR5) σε κακοήθη καρκινικά κύτταρα. Πάντως, οι μηχανισμοί με τους οποίους αυτές οι ενώσεις επάγουν την έκφραση του DR5 παραμένουν άγνωστα. Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι η διαιτητική φλαβονοειδών απιγενίνη δεσμεύει και αναστέλλει αδενίνη νουκλεοτιδίου μεταθετάσης-2 (ANT2), με αποτέλεσμα την ενίσχυση του Apo2L /TRAIL-επαγόμενης απόπτωσης με ρύθμιση προς τα πάνω του DR5. Απιγενίνη και genistein, που είναι μεγάλοι φλαβονοειδή, ενισχυμένη Apo2L /TRAIL-επαγόμενης απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα. Απιγενίνη επαγόμενη έκφραση του DR5, αλλά genistein δεν το έκανε. Χρησιμοποιώντας τη μέθοδο μας προσδιορισμό των άμεσων στόχων των φλαβονοειδών, συγκρίναμε τις δεσμευτικές πρωτεΐνες του απιγενίνη με εκείνα της genistein. Ανακαλύψαμε ότι ANT2 ήταν ένας στόχος της απιγενίνη, αλλά όχι genistein. Ομοίως με απιγενίνη, knockdown του ANT2 ενισχυμένης Apo2L /TRAIL απόπτωση που επάγεται με προς τα πάνω ρύθμιση έκφρασης DR5 στο μετα-μεταγραφικό επίπεδο. Επιπλέον, αποσιώπηση ANT2 εξασθένησε την ενίσχυση της Apo2L /TRAIL-επαγώμενη απόπτωση με απιγενίνη. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι απιγενίνη απορυθμίζει DR5 και ενισχύει Apo2L /TRAIL επαγόμενη απόπτωση με δέσμευση και την αναστολή της ANT2. Προτείνουμε ότι οι αναστολείς ANT2 μπορεί να συμβάλει στη θεραπεία Apo2L /TRAIL

Παράθεση:. Oishi Μ, Iizumi Υ, Taniguchi Τ, Goi W, Miki T, Sakai Τ (2013) Κύτταρα απιγενίνη ευαισθητοποιεί τον καρκίνο του προστάτη σε Apo2L /TRAIL από Στόχευση αδενίνη νουκλεοτιδικές μεταθετάσης-2. PLoS ONE 8 (2): e55922. doi: 10.1371 /journal.pone.0055922

Επιμέλεια: Ιωσήφ Alan Bauer, Ίδρυμα Bauer Έρευνας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 9 του Οκτωβρίου του 2012? Αποδεκτές: 3 Ιαν. 2013? Δημοσιεύθηκε: 19 Φεβρουαρίου, 2013

Copyright: © 2013 Oishi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από μια επιχορήγηση-in-ενισχύσεις για Νέους επιστήμονες (Start-up, 21890223) και (α, 20533178) από την Ιαπωνία Εταιρείας για την Προώθηση της Επιστήμης (JSPs). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη είναι η δεύτερη συνήθως διαγιγνώσκεται καρκίνος και η έκτη κύρια αιτία της ανδρικής θανάτου από καρκίνο που σχετίζονται με τον κόσμο [1]. Αν και ανδρογόνου θεραπεία στέρησης είναι αποτελεσματική στη θεραπεία προχωρημένου καρκίνου του προστάτη, οι περισσότεροι ασθενείς παρουσιάζουν αντίσταση σε αυτή τη θεραπεία. [2] Έχει αναφερθεί ότι η docetaxel συν πρεδνιζόνη ήταν αποτελεσματικό για ορμόνη-ανθεκτικό καρκίνο του προστάτη [3]. Ωστόσο, το αποτέλεσμα αυτής της επεξεργασίας εξακολουθεί να είναι ανεπαρκής [4]. Ως εκ τούτου, οι νέες στρατηγικές για την αντιμετώπιση ορμονο-ανθεκτικό καρκίνο προστάτη.

νέκρωση συνδέτη Apo2 (Apo2L) /όγκου παράγοντα που σχετίζονται με συνδέτη που επάγει απόπτωση (TRAIL) είναι μία κυτοκίνη η οποία ανήκει στην οικογένεια παράγοντα νέκρωσης όγκου. Apo2L /TRAIL δεσμεύεται στον υποδοχέα θανάτου 4 (DR4) και στον υποδοχέα θανάτου 5 (DR5) και επιλεκτικά επάγει απόπτωση σε διάφορα κακοήθεις όγκους, αλλά όχι σε φυσιολογικά κύτταρα [5], [6]. Πρόσφατα, αρκετές ανασυνδυασμένη ανθρώπινη Apo2L /TRAIL και αγωνιστικά αντισώματα αντι-DR5 αναπτύχθηκαν, και οι κλινικές φάσης Ι /ΙΙ δοκιμές έχουν διεξαχθεί σε ασθενείς με πολλά είδη κακοηθών όγκων [7]. Ωστόσο, ένας αριθμός των όγκων επιδεικνύουν αντοχή σε Apo2L /TRAIL και την υπερνίκηση της αντίστασης αυτής είναι απαραίτητη για τη χημειοθεραπεία με τη χρήση της οδού Apo2L /TRAIL [8]. Εμείς και άλλοι έχουν προβληθεί διαιτητικές ενώσεις ευαισθητοποίηση των καρκινικών κυττάρων σε Apo2L /TRAIL και προσδιόρισε διάφορες πολυφαινόλες ως DR5 επαγωγείς [9] – [14]. Πάντως, οι μηχανισμοί με τους οποίους αυτές οι πολυφαινόλες upregulate DR5 είναι άγνωστες.

Η αδενίνη τρανσλοκασών νουκλεοτιδίων (μυρμήγκια) είναι σημαντικά μεταφορείς στην εσωτερική μιτοχονδριακή μεμβράνη και παίζει ένα ρόλο στην ανταλλαγή μεταξύ της ADP και ΑΤΡ [15]. Τα μυρμήγκια έχουν τέσσερα ισόμορφα στον άνθρωπο και κάθε ισομορφή παρουσιάζει μια διαφορετική κατανομή ιστού. ANT2 υπερεκφράζεται σε πολλά κακοήθη καρκινικά κύτταρα και έχει αντι-αποπτωτική ιδιότητες [16], [17]. Για παράδειγμα, knockdown του ANT2 έχει αποδειχθεί ότι ενισχύει την απόπτωση με λονιδαμίνη, ένας αντικαρκινικός παράγοντας που στοχεύει τα μιτοχόνδρια [17], και επάγουν απόπτωση σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του μαστού με την αναστολή της ανάπτυξης του όγκου

in vivo

[18]. Επιπλέον, knockdown του ANT2 ευαισθητοποιεί κύτταρα καρκίνου μαστού σε Apo2L /TRAIL μέσω προς τα πάνω ρύθμιση του DR5 [19]. Κατά συνέπεια, ANT2 θεωρείται ότι είναι μια πολλά υποσχόμενη αντικαρκινική στόχο [20], [21].

Για να φωτιστούν οι ακριβείς μηχανισμοί μέσω των οποίων τα φλαβονοειδή επάγουν την έκφραση του DR5, χρησιμοποιήσαμε μαγνητικά σφαιρίδια FG, η οποία αποκάλυψε πρόσφατα το στόχο της θαλιδομίδης και ο μηχανισμός της θαλιδομίδης τερατογένεσης [22], [23]. Εντοπίσαμε ANT2 ως δεσμευτική πρωτεΐνη της διαιτητικής φλαβονοειδές απιγενίνη η οποία ρυθμίζεται προς τα πάνω DR5. Όπως και με την αγωγή του απιγενίνη, knockdown του ANT2 ενισχυμένης Apo2L /TRAIL απόπτωση που επάγεται με προς τα πάνω ρύθμιση DR5. Επιπλέον, knockdown του ANT2 εξασθένησε την ενίσχυση της Apo2L /TRAIL-μεσολαβούμενη απόπτωση με απιγενίνη. Στην παρούσα μελέτη, δείχνουμε πρώτα ότι ANT2 είναι ένας στόχος της απιγενίνη η οποία απορυθμίζει DR5 και ευαισθητοποιεί τα κακοήθη κύτταρα του όγκου να Apo2L /TRAIL.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture

ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη κυτταρική γραμμή DU145 ελήφθη ως κυτταρική σειρά της NCI-60 από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου (MD, USA) Developmental Therapeutics Program (NCI DTP). Ανθρώπινα προστάτη καρκινική κυτταρική γραμμή LNCaP ελήφθη από την American Type Culture Collection. Έχουμε επιβεβαιώσει ότι αυτές οι καρκίνο του προστάτη κυτταρικές γραμμές είναι αρνητικές για μυκόπλασμα, χρησιμοποιώντας MycoAlert ™ Mycoplasma Detection Kit (Lonza, Rockland, ΜΕ, USA). κύτταρα DU145 διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 μέσο συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου, 2 mmol /L γλουταμίνη, 50 μονάδες /ml πενικιλίνη, και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη σε 37 ° C σε 5% CO

2. LNCaP κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου, 4 mmol /L γλουταμίνη, 50 μονάδες /ml πενικιλίνη, και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη σε 37 ° C σε 5% CO

2.

Αντιδραστήρια

απιγενίνη (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan) και genistein (Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA) αγοράστηκαν και διαλύθηκε σε DMSO. Ανθρώπινη ανασυνδυασμένη Apo2L /TRAIL αγοράστηκε από Pepro Tech (London, UK)

RNAi

Το ακόλουθο siRNAs (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) χρησιμοποιήθηκαν:. SiANT2 # 1, 5 ‘ -AGAACAUUGGACCAUGCACCCUUGA-3 ‘? siANT2 # 2, 5’-UGUAUUGCUUAUCUGCAGUGAUCUG-3 ‘, και Stealth RNAi αρνητικού ελέγχου υψηλής GC. Μόνο οι κλώνοι με νόημα δείξει. DU145 ή LNCaP κύτταρα επιμολύνθηκαν με τα siRNA χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη RNAiMAX (Invitrogen).

Ανίχνευση απόπτωσης

DU145 ή LNCaP κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις κάθε φλαβονοειδών για 24 ώρες ή επιμολυσμένα με τα siRNA. Ανθρώπινη ανασυνδυασμένη Apo2L /TRAIL (50 ng /ml) προστέθηκε στη συνέχεια στα κύτταρα. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και εναιωρήθηκαν σε PBS που περιέχει 0.1% Triton Χ-100, /ml ιωδιούχου προπιδίου 50 μg και 100 μg /ml RNase Α (Sigma, St. Louis, ΜΟ, USA). Το ποσοστό των υποδιπλοειδή DNA (υπο-G1) προσδιορίστηκε ποσοτικά με FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA). Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό Cell Quest (Becton, Dickinson and Company).

Ανάλυση Western Blot

DU145 ή LNCaP κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις κάθε φλαβονοειδών ή επιμολυσμένα με τα siRNA. Τα κύτταρα λύθηκαν με ρυθμιστικό RIPA (50 mmol /L Tris-HCI [ρΗ 8,0], 150 mmol /L NaCl, 1% ΝΡ-40, 0.5% δεοξυχολικό οξύ, 0.1% SDS, 1 mmol /L ϋΤΤ, 0.5 mmol /L PMSF) στους 4 ° C για 30 λεπτά και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν. Τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν και διαχωρίστηκαν με 10.0% SDS-PAGE και μετά μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες Immobilon-Ρ (Millipore, Billerica, ΜΑ, USA) με τη χρήση υγρής μεθόδου. Οι μεμβράνες εμποτισμένο με 5% γάλα σε TBS στους 4 ° C όλη τη νύκτα και επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα σε θερμοκρασία δωματίου για 60 λεπτά. Πρωτογενή αντισώματα ήταν ένα πολυκλωνικό κουνελιού αντι-DR5 αντίσωμα (Prosci, Poway, CA, USA) σε αραίωση 1:500 σε 5% γάλα εντός TBS και ένα μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού αντι-β-ακτίνης αντίσωμα (Sigma) σε αραίωση 1:2,000 σε 5 % γάλα σε TBS. Οι μεμβράνες στη συνέχεια επωάστηκαν με δευτερεύοντα αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση ραδικιού στο 1:2,000 αραίωση σε TBS-Tween 20 για 60 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Οι ζώνες πρωτεΐνης έγιναν ορατές σε BioMax XAR φιλμ (Carestream Health, Inc., Rochester, ΝΥ, USA) χρησιμοποιώντας Chemi-Lumi One L (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan).

ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR ανάλυση

DU145 ή LNCaP κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις κάθε φλαβονοειδών ή επιμολυσμένα με τα siRNA. Το συνολικό RNA εκχυλίστηκε από τα κύτταρα με Sepasol-RNA Ι σούπερ (Nacalai Tesque). Συμπληρωματικό DNA συντέθηκε από ολικό RNA με τη χρήση υψηλής χωρητικότητας cDNA Αντίστροφη Κιτ Μεταγραφής (Applied Biosystems, Μελβούρνη, Αυστραλία). Συμπληρωματικά DNA ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας ανιχνευτές TaqMan για ANT2, DR5, και GAPDH (Applied Biosystems), και ένα ΑΒΙ 7300 Real-time PCR System (Applied Biosystems).

Παρασκευή φλαβονοειδή σταθερών Χάντρες

μαγνητικά σφαιρίδια FG με μία εποξική συνδετήρα αγοράστηκαν από Tamagawa Seiki (Nagano, Ιαπωνία). Καθήλωση των απιγενίνη και genistein πάνω στα σφαιρίδια πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται (Iizumi et al., Μη δημοσιευμένα δεδομένα). Εν συντομία, τα σφαιρίδια αναμίχθηκαν με απιγενίνη σε DMF που περιέχει ανθρακικό κάλιο στους 37 ° C για 24 ώρες ώστε να γενιστεΐνη στους 60 ° C για 24 ώρες, πλύθηκαν δύο φορές με DMF και στην συνέχεια δύο φορές με απιονισμένο νερό. Τα προκύπτοντα σφαιρίδια φυλάχθηκαν στους 4 ° C.

Καθαρισμός και ταυτοποίηση της φλαβονοειδή συνδετικές πρωτεΐνες

φλαβονοειδή σταθερά σφαιρίδια ή κενά σφαιρίδια επωάστηκαν με DU145 ολικού κυττάρου εκχυλίσματα στους 4 ° C για 4 hr. Οι πρωτεΐνες σύνδεσης εκλούστηκαν με Laemmli βαφή, υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE, και ανιχνεύονται με χρώση αργύρου. Οι πρωτεΐνες σύνδεσης στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε πέψη σε πήκτωμα χρησιμοποιώντας Sequencing Grade Τροποποιημένο θρυψίνη (Promega, Madison, WI, USA). Τα πεπτιδικά θραύσματα αναλύθηκαν με ένα φασματογράφο μάζας Autoflex II (Burker Daltonics, Billerica, ΜΑ, USA).

Αποτελέσματα

απιγενίνη Βελτιώνει Apo2L /TRAIL απόπτωση που επάγεται μέσω Προς τα πάνω ρύθμιση DR5 στο Post -transcriptional Επίπεδο

Μεταξύ των πλέον κοινών φλαβονοειδή, απιγενίνη είναι γνωστό ότι αυξάνουν Apo2L /TRAIL απόπτωση που επάγεται μέσω προς τα πάνω ρύθμιση του DR5, ενώ γενιστεΐνη αυξάνει Apo2L /TRAIL-επαγώμενη απόπτωση χωρίς ρύθμιση προς τα πάνω του DR5 [9], [24 ], [25]. Στην παρούσα μελέτη, ο συνδυασμός αυτών των φλαβονοειδών και 50 ng /ml Apo2L /TRAIL σημαντικά απόπτωση, ενώ κάθε φλαβονοειδών από μόνη της δεν το έκανε σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του προστάτη DU145 (Εικ. 1Α, S1, και S2). Απιγενίνη προκαλούμενη έκφραση πρωτεΐνης DR5 αλλά όχι genistein (Εικ. 1Β) έκανε, ενώ απιγενίνη δεν ρυθμίζουν προς τα πάνω DR5 mRNA (Σχ. 1C και S3). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η απιγενίνη ενισχύει Apo2L /TRAIL-επαγόμενης απόπτωσης με μετα-μεταγραφικά προς τα πάνω ρύθμιση DR5.

Α, τα κύτταρα DU145 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις κάθε φλαβονοειδών για 24 ώρες, ακολουθούμενη από επεξεργασία με ή χωρίς 50 ng /ml Apo2L /TRAIL. Μετά από 24 ώρες, ο πληθυσμός sub-G1 των κυττάρων μετρήθηκε μέσω κυτταρομετρίας ροής. Β, τα κύτταρα DU145 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις κάθε φλαβονοειδών για 24 ώρες και συλλέχθηκαν. Τα λύματα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας κηλίδωση Western με ένα αντίσωμα αντι-DR5. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. C, DR5 mRNA ποσοτικοποιήθηκε με πραγματικού χρόνου RT-PCR και κανονικοποιήθηκαν με GAPDH. Στήλες, σημαίνει? μπαρ, SD (η = 3). **

P

& lt?. 0.01 σε σχέση με τον έλεγχο

Η

ANT2 αναγνωρίζεται ως σύνδεση με τις πρωτεΐνες του απιγενίνη, αλλά δεν Γενιστεΐνη

Για να διευκρινιστεί ο μηχανισμός με τον οποίο απιγενίνη επάγει έκφραση DR5, διερευνήσαμε τις πρωτεΐνες δέσμευσης για απιγενίνη, αλλά όχι genistein, χρησιμοποιώντας σφαιρίδια FG με μία εποξική συνδετήρα. Απιγενίνη και genistein μονιμοποιήθηκαν σε αυτά τα σφαιρίδια (Εικ. 2Α). Οι πρωτεΐνες δέσμευσης του απιγενίνη και γενιστεΐνης καθαρίστηκαν από τα εκχυλίσματα ολόκληρων κυττάρων DU145 και ταυτοποιήθηκαν με ανάλυση MALDI-TOF MS. Αδενίνη νουκλεοτιδίων μεταθετάσης-2 (ANT2) αναγνωρίστηκε ως δεσμευτική πρωτεΐνη απιγενίνη, αλλά όχι genistein. Από την άλλη πλευρά, ριβοσωμική πρωτεΐνη S9 (RPS9) αναγνωρίστηκε ως μια πρωτεΐνη δέσμευσης αυτών των φλαβονοειδών (Εικ. 2Β). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι ANT2 είναι μια πρωτεΐνη δέσμευσης της απιγενίνη η οποία επάγει την έκφραση του DR5.

Α, καθήλωση των απιγενίνη και genistein σε μαγνητικά σφαιρίδια FG. Β, Apigenin- και πρωτεΐνες genistein δέσμευσης καθαρίστηκαν από ολόκληρων κυττάρων εκχυλίσματα κυττάρων DU145 με κάθε φλαβονοειδή σταθερό ή όχι (-) FG χάντρες και αναλύθηκαν με χρώση αργύρου. Οι πρωτεΐνες δέσμευσης ταυτοποιήθηκαν από ένα φασματογράφο μάζας.

Η

Νοκ ντάουν της ANT2 Ενισχύει Apo2L /TRAIL επαγόμενη απόπτωση μέσω Η αναβάθμιση του DR5 στο μετα-μεταγραφικό επίπεδο

Έχει αναφερθεί ότι knockdown του ANT2 ενισχύει Apo2L /TRAIL απόπτωση που επάγεται μέσω αυξητική ρύθμιση του DR5 σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του μαστού [19]. Συνεπώς, διερευνήσαμε αν knockdown του ANT2 ενισχυμένης Apo2L /TRAIL επαγόμενη απόπτωση σε ανθρώπινα κύτταρα προστάτη καρκίνο DU145. ANT2 siRNAs κατασταλεί ισχυρά την έκφραση του mRNA ANT2 (Σχ. 3Α και S4). Όπως φαίνεται στο Σχ. 3Β και S5, ANT2 siRNAs προφανώς αυξημένη Apo2L /TRAIL-μεσολαβούμενη απόπτωση. Είμαστε δίπλα εξέτασε κατά πόσον ANT2 νοκ ντάουν που προκαλείται από την έκφραση του DR5. έκφραση DR5 προκλήθηκε με ANT2 siRNAs στα κύτταρα DU145 (Σχ. 3C), ενώ DR5 mRNA δεν επάχθηκε (Σχ. 3D και S6). Λαμβανόμενα μαζί αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι knockdown του ANT2, καθώς και απιγενίνη, ενισχύει Apo2L /TRAIL-επαγόμενης απόπτωσης με μετα-μεταγραφικά προς τα πάνω ρύθμιση DR5.

κύτταρα DU145 επιμολύνθηκαν με δύο διαφορετικά siRNAs ANT2 (siANT2 # 1 και # 2) ή ένα μη-στόχευσης siRNA (siCtrl) και επωάστηκαν για 48 ώρες. Α, ANT2 mRNA ποσοτικοποιήθηκε με πραγματικού χρόνου RT-PCR και κανονικοποιήθηκαν με GAPDH. Β, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς 50 ng /ml Apo2L /TRAIL. Μετά από 24 ώρες, ο πληθυσμός sub-G1 των κυττάρων μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής. C, τα επίπεδα πρωτεΐνης του DR5 και β-ακτίνης αναλύθηκαν με κηλίδωση Western. Α, τα επίπεδα mRNA του DR5 μετρήθηκαν με πραγματικού χρόνου RT-PCR και κανονικοποιήθηκαν με GAPDH. Στήλες, σημαίνει? μπαρ, SD (η = 3). *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt?. 0.01 σε σχέση με τον έλεγχο

Η

Νοκ ντάουν της ANT2 εξασθενίζει Apo2L /TRAIL επαγόμενη απόπτωση ενισχύεται από απιγενίνη

για να διαλευκανθεί ο ρόλος της ANT2 στην ενίσχυση της Apo2L ευαισθησίας /TRAIL από απιγενίνη, εξετάσαμε αν νοκ ντάουν της ANT2 επηρέασε αυτό το εξάρτημα, όπως έγινε στο παρελθόν και με άλλες πρωτεΐνες-στόχους [26], [27]. Απιγενίνη (20 μmol /L) ενισχυμένη 50 ng /ml Apo2L /TRAIL-μεσολαβούμενη απόπτωση σε κύτταρα DU145 εισήγαγε ελέγχου siRNA, αλλά όχι σε κύτταρα DU145 εισήγαγε ANT2 siRNA (Σχ. 4Α και S7). Αποσιώπηση του ANT2 μείωσε την ενίσχυση της έκφρασης DR5 με 20 μmol /L απιγενίνη (Εικ. 4Β). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η αναστολή ANT2 απαιτείται για απιγενίνη να ενισχυθεί η έκφραση του DR5 και Apo2L /TRAIL-επαγόμενης απόπτωσης.

κύτταρα DU145 επιμολύνθηκαν με siANT2 # 1 ή siCtrl. Μετά από 48 ώρες, τα κύτταρα επωάστηκαν με 20 μmol /L απιγενίνη για 24 ώρες. Α, Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς 50 ng /ml Apo2L /TRAIL. Μετά από 24 ώρες, ο πληθυσμός sub-G1 των κυττάρων μετρήθηκε μέσω κυτταρομετρίας ροής. Η διαφορά των πληθυσμών sub-G1 με και χωρίς Apo2L /TRAIL ορίστηκε ως δραστικότητα Apo2L /TRAIL. Η δραστηριότητα Apo2L /TRAIL σε δείγματα χωρίς απιγενίνη κανονικοποιήθηκε προς 1. Β, τα επίπεδα πρωτεΐνης του DR5 και β-ακτίνης αναλύθηκαν με κηλίδωση Western. Στήλες, σημαίνει? μπαρ, SD (η = 3). **

P

& lt?. 0.01 σε σχέση με τον έλεγχο

Η

Είμαστε δίπλα διερευνηθεί ο ρόλος των ANT2 σε άλλη κυτταρική σειρά καρκίνου, εξαρτώνται από τις ορμόνες του ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη LNCaP. ANT2 mRNA ήταν αποτελεσματικότερα σιγήσει ANT2 siRNAs (Σχ. 5Α και S8), και knockdown του ANT2 επάγεται επίσης έκφραση DR5 (εικ. 5Β) και την ενισχυμένη 50 ng /ml Apo2L /TRAIL-επαγώμενη απόπτωση (Σχ. 5C και S9). Επιπλέον, knockdown του ANT2 εξασθένησε την ενίσχυση της Apo2L /TRAIL ευαισθησία και έκφραση DR5 κατά 20 μmol /L απιγενίνη (Εικ. 5D, Ε, και S10).

LNCaP κύτταρα επιμολύνθηκαν με siANT2 ή siCtrl και ήταν επωάστηκαν για 48 ώρες. Α, ANT2 mRNA ποσοτικοποιήθηκε με πραγματικού χρόνου RT-PCR και κανονικοποιήθηκαν με GAPDH. Β, τα επίπεδα πρωτεΐνης του DR5 και β-ακτίνης αναλύθηκαν με κηλίδωση Western. C, τα κύτταρα επωάστηκαν με ή χωρίς 50 ng /ml Apo2L /TRAIL. Μετά από 24 ώρες, ο πληθυσμός sub-G1 των κυττάρων μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής. D, τα κύτταρα επωάστηκαν με 20 μmol /L απιγενίνη για 24 ώρες, ακολουθούμενη από επεξεργασία με ή χωρίς 50 ng /ml Apo2L /TRAIL. Η δραστηριότητα Apo2L /TRAIL σε δείγματα χωρίς απιγενίνη κανονικοποιήθηκε προς 1. Ε, τα κύτταρα επωάστηκαν με 20 μmol /L απιγενίνη για 24 ώρες. Τα επίπεδα πρωτεΐνης του DR5 και β-ακτίνης αναλύθηκαν με κηλίδωση Western. Στήλες, σημαίνει? μπαρ, SD (η = 3). *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0,01 σε σχέση με τον έλεγχο

Η

Συζήτηση

Στην παρούσα μελέτη, εμείς. προσδιορίζονται ANT2 ως δεσμευτική πρωτεΐνη του απιγενίνη οποία ρυθμίζεται αυξητικά DR5 χρήση μαγνητικών σφαιριδίων FG (Εικ. 2). Εξόντωση ANT2 ενισχυμένης Apo2L /TRAIL απόπτωση που επάγεται με προς τα πάνω ρύθμιση DR5 (Εικ. 3), παρόμοια με τη θεραπεία με απιγενίνη (Εικ. 1). Επιπλέον, knockdown του ANT2 εξασθένησε την ενίσχυση της έκφρασης DR5 και Apo2L /TRAIL απόπτωση που επάγεται από απιγενίνη (Σχ. 4 και 5). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι δεσμεύεται απιγενίνη και αναστέλλει ANT2, η οποία επάγει την έκφραση του DR5 και ενισχύει Apo2L /TRAIL ευαισθησία (Εικ. 6). Η παρούσα μελέτη δείχνει επίσης ότι η απιγενίνη επάγει μετα-μεταγραφικά DR5 με αναστολή ANT2 (Σχ. 1 Β και C). Υποθέτουμε ότι πολλά μέσα, τα οποία έχουν αναφερθεί ότι απορυθμίζει DR5 στο μεταγραφικό επίπεδο [10] – [13], θα μπορούσε επίσης να επάγει την έκφραση του DR5 στο μετα-μεταγραφικό επίπεδο με αναστολή ANT2

απιγενίνη δεσμεύει και αναστέλλει. ANT2. Αναστολή της ANT2 αυξάνει την ευαισθησία Apo2L /TRAIL με ρύθμιση προς τα πάνω του DR5.

Η

Έχει αναφερθεί ότι νοκ ντάουν της ANT2 ανεβάζει τα επίπεδα ROS [17] και ενεργοποιεί JNK και p53 [19], σύμφωνα με την εν λόγω απιγενίνη, επίσης, αυξάνει τα επίπεδα ROS [25], [28] και ενεργοποιεί την JNK [29] και p53 [30]. Επιπλέον, η παρούσα μελέτη έδειξε ότι η απιγενίνη δεσμεύεται να ANT2 και υπερεκφράζεται DR5 παρόμοια με νοκ ντάουν της ANT2. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν έντονα ότι απιγενίνη λειτουργικά αναστέλλει ANT2.

Αρκετές πολυφαινόλες, όπως η απιγενίνη, έχουν αναφερθεί για την ενίσχυση της ευαισθησίας Apo2L /TRAIL μέσω διαφόρων οδών [25], [31]. Ωστόσο, οι λεπτομερείς μηχανισμοί μέσω των οποίων κάθε πολυφαινόλης αυξάνει Apo2L ευαισθησία /TRAIL παραμένουν άγνωστα. Η μέθοδος μας εντοπισμό των στόχων των πολυφαινολών μπορεί να είναι χρήσιμη για την κατανόηση των μηχανισμών αυτών.

διευκρινιστεί ο μηχανισμός μέσω του οποίου απιγενίνη απορυθμίζεται DR5 συγκρίνοντας τις δεσμευτικές πρωτεΐνες του απιγενίνη που ρυθμίζεται προς τα πάνω DR5 και genistein που δεν το έκανε (Σχ. 2) . Η στρατηγική που συγκρίνει τα άμεσης δέσμευσης πρωτεϊνών των διαφόρων παραγόντων είναι ευεργετική. Για παράδειγμα, έχει διευκρινιστεί ότι οι συνδέτες των πρωτεϊνών VDAC επάγουν επιλεκτικά μη αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο σε καρκινικά κύτταρα που φέρουν μεταλλάξεις στα ογκογονίδια

HRAS

,

KRAS

, ή

BRAF

συγκρίνοντας τις πρωτεΐνες δέσμευσης του erastin Α6 και erastin Β2, ένα ανάλογο erastin που στερείται της δραστηριότητα [32]. Σύγκριση των πρωτεϊνών δέσμευσης των διαφόρων παραγόντων μπορεί να αποκαλύψει τις πρωτεΐνες που προκαλούν τα κύρια ή αρνητικές επιδράσεις αυτών των παραγόντων. Επιπλέον, φαρμακολογικές έλεγχος αυτών των πρωτεϊνών δέσμευσης μπορεί να αναπτυχθεί τρέχουσα χημειοθεραπεία.

Μέχρι σήμερα, αρκετές αγωνιστικά αντισώματα αντι-DR5 και ανθρώπινη ανασυνδυασμένη Apo2L /TRAIL έχουν αναπτυχθεί και είναι υπό κλινικές δοκιμές, ενώ ορισμένοι καρκίνοι έχουν επιδείξει ανθεκτικότητα σε αυτοί οι παράγοντες [7]. Στην παρούσα μελέτη, knockdown του ANT2 ευαισθητοποιημένων καρκινικών κυττάρων να Apo2L /TRAIL με προς τα πάνω ρύθμιση DR5. Αυτή η μελέτη δείχνει επίσης ότι η απιγενίνη μπορεί να είναι ένας αναστολέας ANT2. Κατά συνέπεια, οι αναστολείς απιγενίνη και τα νέα ANT2 μπορεί να ενισχύσει τις επιδράσεις αυτών των παραγόντων, ξεπερνώντας την αντίσταση στην Apo2L /TRAIL.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

Τα ιστογράμματα του Σχήματος 1Α ως προς απιγενίνη.

doi: 10.1371 /journal.pone.0055922.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2.

Τα ιστογράμματα του Σχήματος 1Α ως προς γενιστεΐνη.

doi: 10.1371 /journal.pone.0055922.s002

(ΔΕΘ)

Εικόνα S3.

Οι καμπύλες ενίσχυση της Εικόνας 1Γ.

doi: 10.1371 /journal.pone.0055922.s003

(ΔΕΘ)

Εικόνα S4.

Οι καμπύλες ενίσχυση της Εικόνας 3Α.

doi: 10.1371 /journal.pone.0055922.s004

(ΔΕΘ)

Εικόνα S5.

Τα ιστογράμματα του Σχήματος 3Β.

doi: 10.1371 /journal.pone.0055922.s005

(ΔΕΘ)

Εικόνα S6.

Οι καμπύλες ενίσχυση της Εικόνας 3D.

doi: 10.1371 /journal.pone.0055922.s006

(ΔΕΘ)

Εικόνα S7.

Τα ιστογράμματα του Σχήματος 4Α.

doi: 10.1371 /journal.pone.0055922.s007

(ΔΕΘ)

Εικόνα S8.

Οι καμπύλες ενίσχυση του Σχήματος 5Α.

doi: 10.1371 /journal.pone.0055922.s008

(ΔΕΘ)

Εικόνα S9.

Τα ιστογράμματα του Σχήματος 5C.

doi: 10.1371 /journal.pone.0055922.s009

(ΔΕΘ)

Εικόνα S10.

Τα ιστογράμματα του Σχήματος 5ϋ.

doi:. 10.1371 /journal.pone.0055922.s010

(ΔΕΘ)

Ευχαριστίες

Είμαστε ευγνώμονες στον Μ Horinaka και Y. Sowa για τη χρήσιμη συζήτηση