Αφηρημένο

Ο αποκλεισμός του υποδοχέα ανδρογόνων (AR) δραστηριότητα είναι ο κύριος στόχος της θεραπείας για προχωρημένο καρκίνο του προστάτη (PCA). Ωστόσο, υποτροπών, με μια πιο επιθετική, ορμονοάντοχο προστάτη προκύπτει, το οποίο φιλοξενεί αποκατασταθεί δραστηριότητα AR. Ένας μηχανισμός αυτής της επανενεργοποίησης συμβαίνει μέσω απόκτησης AR μεταλλάξεων που επιτρέπουν την ενεργοποίηση του από διάφορες στεροειδείς και μη-στεροειδείς δομές. Έτσι, φυσικών και χημικών ενώσεων που συμβάλλουν στην ακατάλληλη (ανδρογόνα-ανεξάρτητο) η ενεργοποίηση του AR αποτελέσει ένα χώρο εντατικής έρευνας. Εδώ, έχουμε αποδείξει ότι genistein, ένα φυτοοιστρογόνα σόγιας συνδέεται τόσο με την άγρια ​​και η Thr877Ala (T877A) μεταλλαγμένα είδη του AR ανταγωνιστικά με ανδρογόνων, παρ ‘όλα αυτά, ασκεί μια πλειοτροπική επίδραση στον πολλαπλασιασμό του προστάτη των κυττάρων και τη δραστηριότητα AR ανάλογα με την κατάστασης μεταλλάξεων του AR. Η γενιστεΐνη αναστέλλεται, με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και AR πυρηνικό εντοπισμό και την έκφραση σε LAPC-4 κύτταρα που έχουν άγριου AR. Ωστόσο, σε LNCaP κύτταρα που εκφράζουν το AR T877A μεταλλαγμένο, genistein προκάλεσε μία διφασική επίδραση όπου φυσιολογικές δόσεις (0.5-5 μmol /L) διεγείρεται ανάπτυξη των κυττάρων και αυξημένη έκφραση AR και μεταγραφική δραστικότητα, και υψηλότερες δόσεις που προκαλείται ανασταλτικά αποτελέσματα. Παρόμοια διφασικά αποτελέσματα επιτεύχθηκαν σε PC-3 κύτταρα επιμολυσμένα με AR μεταλλάκτες? T877A, W741C και H874Y. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η γενιστεΐνη, σε φυσιολογικές συγκεντρώσεις, πιθανώς δρα ως αγωνιστής και να ενεργοποιήσετε το μεταλλαγμένο AR που μπορεί να υπάρχουν σε προχωρημένο προστάτη μετά την θεραπεία ανδρογόνων

Παράθεση:. Μαχμούντ AM, Zhu Τ, Parray Α, Siddique ΥΕ, Yang W, Saleem M, et al. (2013) Διαφορικές Επιδράσεις της Γενιστεΐνη σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη Βασιστείτε σε κατάστασης μεταλλάξεων του υποδοχέα ανδρογόνων. PLoS ONE 8 (10): e78479. doi: 10.1371 /journal.pone.0078479

Επιμέλεια: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Αυστρία

Ελήφθη: 1, Ιούλη του 2013? Αποδεκτές: 12 Σεπτεμβρίου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 22 Οκτώβρη του 2013

Copyright: © 2013 Μαχμούντ κ.ά.. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. 1. Grant Νο GM 842 από το Υπουργείο Ανώτατης Εκπαίδευσης αιγυπτιακή. 2. ΝΙΗ Grant Νο CA 116195. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν αντικρουόμενα συμφέροντα υπάρχει.

Εισαγωγή

Καρκίνος του προστάτη (PCA) είναι η πιο συχνή κακοήθεια και η δεύτερη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο μεταξύ των ανδρών στις Ηνωμένες Πολιτείες [1]. Στις ασιατικές πληθυσμούς, η συχνότητα εμφάνισης της PCA είναι χαμηλότερο σε σύγκριση με εκείνη στις ΗΠΑ και οι ευρωπαϊκές χώρες [2]. Οι περισσότερες επιδημιολογικές μελέτες έχουν δείξει συσχέτιση μεταξύ της διατροφικής κατανάλωσης σόγιας και μειωμένο κίνδυνο PCA σε Ασιάτες, για πολλούς από τους οποίους τα τρόφιμα σόγιας είναι η κύρια πηγή πρωτεϊνών [3-5]. Μετα-αναλύσεις των επιδημιολογικών μελετών υποστηρίζουν μια προστατευτική επίδραση της σόγιας [5,6]. Διαιτητικά σόγια είναι πλούσια σε ισοφλαβόνες, συμπεριλαμβανομένου του κεφαλαίου ενώσεων ισοφλαβόνης genistein και daidzein, καθώς και λιγότερο άφθονα ενώσεις όπως γλυκιτεΐνη [7,8]. Η γενιστεΐνη είναι το πιο άφθονο και βιολογικά δραστικά ισοφλαβονών σε σόγια. Οι συγκεντρώσεις σταθερής κατάστασης στο πλάσμα genistein των ιαπωνικών κατανάλωση σόγιας πλούσια σε δίαιτες είναι τόσο υψηλές όσο 2,4 mmol /L, που είναι αρκετές φορές μεγαλύτερη από εκείνη των Ευρωπαίων [9,10].

Υπάρχει ένα αυξανόμενο σώμα της στοιχεία που αποδεικνύουν ότι η γενιστεΐνη έχει αντικαρκινικές επιδράσεις στην προστάτη [3,11]. Είναι ρυθμίζει την έκφραση ορισμένων γονιδίων που ελέγχουν την κυτταρική επιβίωση, του κυτταρικού κύκλου, και την απόπτωση [12], αναστέλλει την δραστικότητα κινάσης τυροσίνης [13], και NF-κΒ [14], ρυθμίζει τις οδούς Akt και ΜΑΡΚ σηματοδότηση [15], και αναστέλλει αγγειογένεση και μετάσταση [16-21]. Η genistein επίσης έχει αντιοξειδωτικές ιδιότητες [22] και σε μερικές

in vitro μελέτες

genistein μειωμένη έκφραση και μεταγραφική δραστικότητα του υποδοχέα ανδρογόνων (AR) [23-29].

PCA είναι ένα ανδρογόνο-εξαρτώμενη ασθένεια και διάφορες θεραπευτικές μεθόδους που κατευθύνεται προς ανδρογόνων κατάλυσης για τοπικά προχωρημένο ή μεταστατικό ΣΕΣΣ. Οι περισσότεροι ασθενείς που λαμβάνουν ανδρογόνων θεραπείες εκτομής αρχικά παρουσιάζουν κλινικά και βιοχημική ανταπόκριση (μειωμένα επίπεδα του ειδικού προστατικού αντιγόνου [PSA] ορού). Ωστόσο, σχεδόν όλοι οι ασθενείς υποτροπιάζουν αυτών με μια πιο επιθετική μορφή, ορμονοάντοχο (ευνουχισμός ανθεκτικά) του προστάτη η οποία δεν απαιτεί κυκλοφορούντων ανδρογόνων, αλλά εξακολουθεί να εξαρτάται από λειτουργικές AR για την ανάπτυξη και την εξέλιξη. Υπάρχουν διάφοροι προτεινόμενοι μηχανισμοί για το μοριακό διακόπτη του προστάτη από μια ανδρογόνο-εξαρτώμενη σε μια ανδρογόνο ανεξάρτητο κράτος, συμπεριλαμβανομένων των αποδεικτικών στοιχείων που να δείχνουν ότι η ανάπτυξη των πιο επαναλαμβανόμενη προστάτη οδηγείται από ακατάλληλη ενεργοποίηση του AR [30-32]. δραστικότητα AR απουσία ορχικής ανδρογόνων μπορεί να συμβεί μέσω διαφόρων μηχανισμών, συμπεριλαμβανομένης ενίσχυσης AR, η απορρύθμιση του αυξητικούς παράγοντες ή κυτοκίνες, αλλοίωση του συνενεργοποιητές, και την τοπική παραγωγή ανδρογόνων εντός του προστάτη [33-38]. Ένας άλλος μηχανισμός είναι η απόκτηση του AR μεταλλάξεις που προκαλούν τον υποδοχέα είτε να είναι υπερευαίσθητοι σε χαμηλές συγκεντρώσεις ανδρογόνων ή να επεκτείνει ειδικότητα συνδετήρα της όταν εμφανίζονται στο πεδίο σύνδεσης συνδετήρα (LBD) [39,40]. Οι τελευταίοι τύποι των μεταλλάξεων επιτρέπει ο υποδοχέας να ενεργοποιείται από ένα ευρύ φάσμα των στεροειδών όπως οιστρογόνα, προγεστίνες, επινεφριδιακά στεροειδή, ή ακόμη και αντι-ανδρογόνα [41,42]. Για παράδειγμα, μια θρεονίνη σε μετάλλαξη αλανίνης στην AR κωδικόνιο 877 (T877A) υφίστανται σε ποσοστό έως 12,5% ορμονικά ανθεκτικών PCa και επιτρέπει το AR να ενεργοποιούνται από 17β-οιστραδιόλη, προγεστερόνη, και μερικά αντιανδρογόνα [42]. Αυτή η ακατάλληλη ετερόκλητη δέσμευση της μη-ανδρογόνων συνδέτες πιθανώς συμβάλλει στην αντίσταση της θεραπείας σε ασθενείς με προχωρημένο προστάτη [43].

Η γενιστεΐνη έχει μία δομή 17β-οιστραδιόλη που μοιάζει και έχει οιστρογονική δραστικότητα σε κύτταρα καρκίνου του μαστού [44]. Παρά το γεγονός ότι σε έναν αριθμό

in vitro μελέτες

genistein μειωτικά μεταγραφή AR και η έκφραση πρωτεΐνης PSA σε κύτταρα προστάτη και ανέστειλε την ανάπτυξη τους [24,26,27], διεγερτικά αποτελέσματα έχουν επίσης αναφερθεί [45-47]. Ωστόσο, οι περισσότερες από αυτές τις μελέτες έχουν κάποια μεθοδολογικών περιορισμών. Πρώτον, έχουν φαρμακολογικές ή ακόμη και κυτταροτοξικές συγκεντρώσεις της γενιστεΐνης που δεν αντικατοπτρίζουν τι μπορεί να επιτευχθεί από τον άνθρωπο που καταναλώνει σόγιας έχουν χρησιμοποιηθεί σε πολλές από αυτές τις μελέτες. Δεύτερον, στις περισσότερες μελέτες που εξετάζουν τα αποτελέσματα της γενιστεΐνης σε προστάτη, LNCaP κύτταρα έχουν χρησιμοποιηθεί. Αυτή η κυτταρική γραμμή έχει μια μετάλλαξη T877A στην LBD του AR που εκτείνεται ειδικότητα σύνδεσης του, που επιτρέπει την ενεργοποίηση από άλλα στεροειδή ή στεροειδή μόρια παρόμοια [48]. Υποθέτουμε ότι genistein με οιστραδιόλη-όπως η δομή του θα μπορούσε να είναι ένας πιθανός συνδέτης για αυτό το μεταλλαγμένο AR, το οποίο εξηγεί ενδεχομένως τις διεγερτικές επιδράσεις που έχουν ληφθεί χρησιμοποιώντας LNCaP κύτταρα σε μερικές μελέτες. Παρ ‘όλα αυτά, δεν υπάρχουν μελέτες σχετικά με τις διαφορετικές επιδράσεις της genistein σε φυσιολογικές

έναντι

φαρμακολογικές δόσεις επί των κυττάρων του προστάτη με ΑΕ άγριου τύπου (WT-ΑΕ) και τα κύτταρα με μεταλλαγμένα ΑΕ. Στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιήσαμε δύο κυτταρικές σειρές προστάτη? LAPC-4 κύτταρα τα οποία έχουν WT-ΑΕ [49] και τα κύτταρα LNCaP με T877A μεταλλαγμένο ΑΕ [48]. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία των κυττάρων με ένα ευρύ φάσμα δόσεων genistein, συμπεριλαμβανομένων φυσιολογικώς εφικτός συγκεντρώσεις, να καθοριστεί ο ρόλος της μετάλλαξης T877A AR και συγκέντρωση γενιστεΐνη σε genistein αποτελέσματα επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, την απόπτωση, και AR και έκφραση PSA.

Υλικά και Μέθοδοι

Χημικά και αντιδραστήρια

Γενιστεΐνη και Casodex αγοράστηκαν από την Sigma Aldrich (St. Louis, ΜΟ). Μεθυλοτριενολόνη (R1881) αγοράστηκε από Perkin Elmer (Downers Grove, IL).

Πολιτισμού προστάτη κυτταρικών γραμμών

LAPC-4 κύτταρα ελήφθησαν από τον Dr. R. Reiter μέσω Δρ Karen Knudsen (UCLA), η οποία αναπτύχθηκε αρχικά από τον Δρ Charles Sawyers [49]. LNCaP και PC-3 κυτταρικές γραμμές ελήφθησαν από την ATCC (Rockville, MD). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε άνευ ερυθρού φαινόλης μέσου RPMI με L-γλουταμίνη, συμπληρωμένο με 10% FBS, 100 IU /ml πενικιλίνη, και 100 μg /mL στρεπτομυκίνη. Media αντικαταστάθηκαν με RPMI που περιέχει 10% απογυμνωμένο από ξυλάνθρακα εμβρυϊκό βόειο ορό 24 ώρες πριν την αγωγή κυττάρων με 1 μL /mL DMSO όχημα στο οποίο genistein διαλύθηκε σε συγκεντρώσεις 0.5, 1, 5, 10, 25, και 50 μmol /L, με ή χωρίς 100nmol /L Casodex (Sigma, St. Louis, ΜΟ), και /ή 1 nmol /L μεθυλοτριενολόνη (R1881) (Perkin Elmer, Downers Grove, IL).

προσδιορισμό κυτταρικού πολλαπλασιασμού

η επιβίωση των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας την κυτταρική Titer 96 AQ

Δοκιμασία Πολλαπλασιασμού ueous μη ραδιενεργού Κυττάρου (MTS) (Promega, Madison, WI). Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων (3000 κύτταρα /φρεάτιο). Είκοσι μί MTS αντιδραστήριο /100 μL μέσου προστέθηκαν και στη συνέχεια αφήνεται για 4 ώρες σε υγρό επωαστήρα στους 37 ° C. Η απορρόφηση καταγράφηκε στα 570 nm χρησιμοποιώντας αναγνώστη μικροπλάκας (Synergy 2, Biotek, Highland Park, VT). Ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός και η κυτταρική βιωσιμότητα μετρήθηκε επίσης με καταμέτρηση αιμοκυτταρόμετρο? κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες κυτταρικής καλλιέργειας 24 φρεατίων σε 5000 κύτταρα /φρεάτιο σε 1 ml μέσου καλλιέργειας με FBS. Στις 24, 48, και 72 ώρες μετά την αγωγή, τα κύτταρα συλλέχθηκαν με διάλυμα τρυψίνης. Οι μετρήσεις κυττάρων εκτελέστηκαν εις τριπλούν χρησιμοποιώντας αιμοκυτόμετρο με trypan blue (0.2%) αποκλεισμός για τον προσδιορισμό βιώσιμων κυττάρων. Ο συνολικός αριθμός των βιώσιμων και βαφής-χρωματισμένα κύτταρα σε κάθε πείραμα συγκρίθηκαν με εκείνες των αντίστοιχων αριθμών των κυττάρων χωρίς αγωγή ελέγχου εκτελούνται ταυτόχρονα σε τρία ανεξάρτητα πειράματα.

κυτταροτοξικότητα κυττάρων δοκιμασία

κυτταροτοξικότητα κυττάρων αναλύθηκε χρησιμοποιώντας την Vybrant κυτταροτοξικότητας Assay Kit (G6PD Δοκιμασία απελευθέρωσης) (Invitrogen, Grand Island, ΝΥ). Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων (5000 κύτταρα /φρεάτιο) σε 50 media μL. Μετά από 48 ώρες αγωγής, 50 μL του προπαρασκευασμένων 2X μίγμα ρεζαζουρίνης /αντίδρασης προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο και επωάζονται στους 37 ° C για 30 λεπτά. Ο φθορισμός καταγράφηκε χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας φθορισμού που συστάθηκε με φίλτρα διέγερσης και εκπομπής κατάλληλο για ρεσορουφίνη (διέγερση 530-560 nm, εκπομπή 580-600 nm).

Η επιμόλυνση των PC-3 κύτταρα

PC-3 κύτταρα, 5000 κύτταρα /φρεάτιο, επιμολύνθηκαν παροδικά σε πλάκες 24 φρεατίων με 0.5 μg του WT-AR, T877A-AR, W741C-AR, H874Y-AR, ή pSG5 άδειο φορέα χρησιμοποιώντας Lipofectamine

TM LTX (Invitrogen Grand Island, Νέα Υόρκη). Πλασμίδια γενναιόδωρα από τον Dr. Karen Knudsen (Kimmel Κέντρο Καρκίνου, Πανεπιστήμιο Τόμας Τζέφερσον, Philadelphia, PA). Οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με όχημα (αιθανόλη ή /και DMSO) ή genistein.

Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε φιάλες Τ-25 σε μια συγκέντρωση μεταξύ 5 χ 10

μέσα 5 – 10

6 κύτταρα και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με γενιστεΐνη για 48 ώρες. Τα επεξεργασμένα κύτταρα συλλέχθηκαν, πλύθηκαν σε ψυχρό αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) και χρωματίστηκαν για Annexin V για την αξιολόγηση της απόπτωσης χρησιμοποιώντας το Alexa Fluor 488 αννεξίνης V /Dead κυτταρικής απόπτωσης Kit (Invitrogen). Για την ανάλυση του κυτταρικού κύκλου, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 70% αιθυλική αλκοόλη για τουλάχιστον 15 λεπτά και χρωματίστηκαν με διάλυμα ιωδιούχου προπιδίου (/mL ιωδιούχο προπίδιο 50 μg, 0,1 mg /ml ΚΝάση Α, και 0,05% Triton Χ-100). Τα κύτταρα επωάστηκαν για 40 λεπτά στους 37 ° C και στη συνέχεια αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το κανάλι ροής κυανό ADP τρία κυτταρόμετρο και λογισμικό Summit3 (Beckman Coulter, Brea, CA).

Ανάλυση Western Blot

Η ολική πρωτεΐνη απομονώθηκε από κατεργασμένα κύτταρα και για ημιποσοτική ανάλυση των πυρηνικών AR, πυρηνικά και κυτταροπλασματικά εκχυλίσματα απομονώθηκε χρησιμοποιώντας Nuclear Kit Extract (Active Motif, Carlsbad, CA). Η συγκέντρωση πρωτεΐνης μετρήθηκε στα 595 nm με αναγνώστη μικροπλάκας χρησιμοποιώντας το κιτ Δοκιμασίας Πρωτεΐνης Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Είκοσι πέντε μg πρωτεΐνη /λωρίδα επιλύθηκε με NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen) και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF. Το ανοσοστύπωμα επωάσθηκε με πρωτεύοντα αντισώματα σε αραιώσεις 1: 500 αραιωμένο πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού για AR (Ν-20), 1: 500 κατσίκα πολυκλωνικό αντίσωμα προς το PSA (C-19) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) ή 1: 1000 μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού για φωσφοτυροσίνη (4G10) (Invitrogen) όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Δευτερεύουσα αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση αρμορακίας χρησιμοποιήθηκαν (Promega). αντιδραστήρια ανίχνευσης ECL κηλίδωση Western (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό των ζωνών πρωτεΐνης αντίσωμα δεσμευμένο. Πρωτεΐνη β-τουμπουλίνης και Tata Binding (ΤΒΡ) (Cell Signaling, Danvers, ΜΑ) χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχοι φόρτωσης για ολική πρωτεΐνη και πυρηνική πρωτεΐνη, αντίστοιχα. Εικόνα J λογισμικό που χρησιμοποιείται για τον υπολογισμό της έντασης των AR και PSA ζώνες σε σχέση με το γονίδιο της καθαριότητας σε τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Real-Time PCR

Το συνολικό RNA εξήχθη χρησιμοποιώντας το κιτ RNeasy μίνι (Qiagen, Germantown, MD). RNA ποσότητες και ποιότητες προσδιορίστηκαν με μέτρηση της απορρόφησης στα 260 και 280 nm με φασματοφωτομετρία. Πέντε μg ολικού RNA μεταγράφηκαν αντίστροφα σε cDNA χρησιμοποιώντας SuperScript RT III (Invitrogen). AR και mRNA PSA έκφραση προσδιορίστηκαν με πραγματικού χρόνου RT-PCR χρησιμοποιώντας το πρότυπο πρωτόκολλο Πράσινο SYBR Δοκιμασία, και το στάδιο ένα συν PCR σε πραγματικό χρόνο σύστημα (Applied Biosystems, Foster City, CA) χρησιμοποιήθηκε. Ειδικοί εκκινητές για κάθε γονίδιο σχεδιάστηκαν. Για AR, ο εμπρόσθιος εκκινητής ήταν 5′-3’TTGTGTCAAAAGCGAAATGG-, και ο αντίστροφος εκκινητής ήταν 5′- CAATGGGCAAAACATGGTC-3′. Για PSA, η προς τα εμπρός ήταν 5′-3’CTTGTAGCCTCTCGTGGCAG, και ο αντίστροφος εκκινητής ήταν 5′-3’GACCTTCATAGCATCCGTGAG-. Η γλυκεραλδεΰδη 3- φωσφορική αφυδρογονάση (GAPDH) χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος για την κανονικοποίηση των δεδομένων εκφράσεως. GAPDH προς τα εμπρός εκκινητής ήταν 5′-3’GCCTCAAGATCATCAGCAATGCCT, και ο αντίστροφος εκκινητής ήταν 5′- TGTGGTCATGAGTCCTTCCACGAT- 3′. αριθμοί κύκλος κατωφλίου (Ct) που παράγεται από τον πραγματικό χρόνο RT-PCR χρησιμοποιήθηκαν για τον υπολογισμό του κανονικοποιημένου λόγου έκφραση των γονιδίων στόχων χρησιμοποιώντας τη μέθοδο 2

-ΔΔCt (Livak). Οι αντιδράσεις διεξήχθησαν εις τριπλούν, και τα αποτελέσματα δείχνουν τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Λουσιφεράσης Δοκιμασία

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 24 φρεατίων πλάκες σε πυκνότητα 5000 κύτταρα /φρεάτιο σε πρότυπο μέσο χωρίς αντιβιοτικά . Τα κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν παροδικώς με PSA πλασμιδίου λουσιφεράσης πυγολαμπίδας προαγωγέα και

Renilla

λουσιφεράσης φορέα έκφρασης όπως ένας έλεγχος για αποτελεσματικότητα μορφομετατροπής χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen). Και τα δύο πλασμίδια γενναιόδωρα από τον Dr. Λάρισα Nonn (UIC, Chicago, IL). Οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με όχημα (αιθανόλη ή /και DMSO) ή genistein. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα συλλέχθηκαν, και ρεπόρτερ και

Renilla

λουσιφεράσης δραστηριότητες προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα δοκιμασίας Dual-Luciferase (Promega).

πυρηνικού εντοπισμού Μελέτες

Cells απλώθηκαν σε πλάκες 16-καλά θάλαμο (Lab-Tek σύστημα ολίσθησης του θαλάμου, Nalge Nunc, Naperville, IL). Τριάντα λεπτά – 4 ώρες μετά την αγωγή, τα κύτταρα ξεπλύθηκαν με 1 χ PBS, μονιμοποιήθηκαν με 4% φορμαλδεΰδη /1xPBS για 20 λεπτά και κατέστησαν διαπερατά με 0,1% Triton Χ-100/1 χ PBS επί 10 λεπτά. Τα κύτταρα επωάστηκαν πρώτα με 5% ελεύθερο μπλοκ πρωτεΐνη ορού για 60 λεπτά και στη συνέχεια με AR πρωτογενές αντίσωμα (Ν-20 από την Santa Cruz Biotechnology) σε αραίωση 1: 200 όλη την νύκτα στους 4 ° C σε υγροποιημένο θάλαμο. Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα πλύθηκαν και επωάστηκαν με το συζευγμένο με FITC αντι-κουνελιού δευτερογενές αντίσωμα (Santa Cruz Biotechnology) για 1 ώρα και στη συνέχεια επωάστηκαν με 1: 500 Hoechst αντιχρωματισμός για 20 λεπτά στο σκοτάδι. Διαφάνειες εξετάστηκαν σύμφωνα με ανεστραμμένο μικροσκόπιο φθορισμού (Eclipse ΤΕ 2000, Nikon, Ιαπωνία) είναι εξοπλισμένα με ένα ψυχόμενο CCD κάμερα (Φωτομετρική Cascade II, Tucson, AZ) υπό τον έλεγχο του λογισμικού απεικόνισης MetaMorph (Molecular Devices, Πλήρως Vale, CA).

3 [Η] -R1881Competitive Δοκιμασία Σύνδεσης

Αυτή η ανάλυση έγινε με τη χρήση της μεθόδου που περιγράφεται από Siddique et al. [50]. Εν συντομία, LAPC4 και LNCaP κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 12-φρεατίων σε άνευ ερυθρού φαινόλης μέσο που περιείχε 5% FBS απογυμνωμένο από ξυλάνθρακα για 3 ημέρες μετά από το οποίο, τα μέσα αντικαταστάθηκαν με μέσα άνευ ορού που περιέχει 1 ηΜ

3 [Η] -R1881 με ή χωρίς 0,1-1.000-πλάσια μοριακή περίσσεια μη επισημασμένου συνδετήρων ανταγωνιστή (R1881, Casodex ή genistein) για 90 λεπτά στους 37 ° C. Τα κύτταρα πλύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών, και το δεσμευμένο

3 [Η] -R1881 εκχυλίζεται σε αιθανόλη για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και ανιχνεύεται με μέτρηση σπινθηρισμών.

Γενιστεΐνη Βιβλιοδεσία με AR in silico

Η κρυσταλλική δομή ακτίνων Χ του άγριου τύπου υποδοχέα ανδρογόνων (κωδικός ΠΣΠ 1I37) και T877A μεταλλαγμένων (κωδικός ΠΣΠ 1I38) σε συνδυασμό με διυδροτεστοστερόνη (DHT) παρασκευάσθηκαν μέσω της πρωτεΐνης Wizard Προετοιμασία του Schrodinger Suite 2011. γενιστεΐνη κατασκευή παρασκευάστηκε χρησιμοποιώντας LigPrep [51]. OPLS2005 πεδίο δύναμης χρησιμοποιήθηκε για γεωμετρική βελτιστοποίηση, και την πιθανή ιονισμού και ταυτομερείς μορφές δημιουργήθηκαν για genistein σε ρΗ 7,5 ± 0,5 με τη χρήση Epik [52]. Μοριακή βάση σύνδεσης έγινε με το χρυσό v5.0.1 [53]. Ο δεσμευτικός σφαίρα θέση ορίστηκε με ακτίνα 10 Α γύρω από τον συνδετήρα που υπάρχει στην κρυσταλλική δομή, και 100 τρεξίματα σύνδεσης διεξήχθησαν για κάθε συνδετήρα. Προεπιλεγμένες τιμές χρησιμοποιήθηκαν για άλλες παραμέτρους γενετικό αλγόριθμο. Όλοι οι υπολογισμοί έγιναν με το Amber 11 σουίτα προγραμμάτων [https://ambermd.org/], συμπεριλαμβανομένου του τομέα ff99SB δύναμη για την πρωτεΐνη AR, το πεδίο ισχύος καμάκι για το συνδετήρα, και MM /PBSA για τον υπολογισμό δεσμευτικές ελεύθερες ενέργειες [ ,,,0],54]. Κάθε σύμπλοκο πρωτεΐνης-συνδέτη επιδιαλυτωμένες σε ένα κουτί οκταεδρική των μορίων του νερού TIP3P εκτείνεται 10 A ° εκτός της πρωτεΐνης σε όλες τις πλευρές. Οι ηλεκτροστατική υποβλήθηκαν σε θεραπεία με το σωματίδιο-mesh μέθοδος Ewald [55]. Οι προσομοιώσεις χρησιμοποίησαν ένα κατάλοιπο που βασίζεται αποκοπής του 8 Α, ένα χρονικό βήμα 2 fs και εμποδίζει μηκών δεσμού που περιλαμβάνουν άτομα υδρογόνου χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο κούνημα. Οι διαλυμένες συγκροτήματα ελαχιστοποιήθηκαν με 10000 βήματα της ελαχιστοποίησης των συζυγών, εξισορροπείται με MD στους 300 K με 50ps θέρμανσης και 50 ps της εξισορρόπησης πυκνότητας με 2 kcal mol

-1 α

-2 περιορισμούς για το συγκρότημα και ακολούθησε από 500 πικο-δευτερόλεπτα της συνεχούς εξισορρόπησης πίεσης με 0,5 kcal mol

-1 α

-2 περιορισμούς σχετικά με το συγκρότημα σε 300Κ. Μετά την εξισορρόπηση, 20 ns κύκλο παραγωγής διεξήχθη για να εκτιμήσει ελεύθερη ενέργεια σύγκλισης και συντεταγμένες εξήχθησαν κάθε 2 ps. Ρίζα του μέσου τετραγωνικού απόκλιση (RMSD) αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση της μονάδας ptraj της Amber 11. MM /PBSA είναι μια καθιερωμένη μέθοδος για τον υπολογισμό της δέσμευσης ελεύθερες ενέργειες [56]. Η δέσμευση ελεύθερη ενέργεια υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας ένα απλό θερμοδυναμικό κύκλο από την ενεργειακή διαφορά μεταξύ του συμπλέγματος και των μη δεσμευμένων μορφών. Οι τιμές της ελεύθερης ενέργειας της πρόσδεσης της κάθε ένωσης υπολογίστηκαν σύμφωνα με την εξίσωση Δ

G

δεσμεύουν =

G

πολύπλοκες –

G

υποδοχέα –

G

συνδέτη. Η ελεύθερη ενέργεια του καθενός από αυτά υπολογίστηκε ως άθροισμα των τεσσάρων όρων

G

=

E

MM +

G

psolv +

G

npsolv –

TS

lnmode, όπου Ε

MM είναι το μοριακό μηχανική ενέργεια του μορίου που εκφράζεται ως το άθροισμα της εσωτερικής ενέργειας του μορίου συν το ηλεκτροστατική και νβη der Waals αλληλεπιδράσεις, Gpsolv είναι η πολική συμβολή στην επιδιαλύτωση ενέργεια του μορίου, Gnpsolv είναι η μη πολική ενέργεια ενυδάτωσης, Τ είναι η απόλυτη θερμοκρασία, και S είναι η εντροπία του μορίου εκτιμήθηκε με κανονική ανάλυση αναμονής. Τα στιγμιότυπα για ΜΜ /PBSA λήφθηκαν κάθε 20 ps των τελευταίων 2 ns MD τρεξίματα παραγωγής, με αποτέλεσμα ένα σύνολο εκατό στιγμιότυπα ανά περίοδο. Ανάλυση Κανονική-mode χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό της δόνησης, περιστροφής, και μεταφραστική εντροπία. Λόγω του υψηλού κόστους και της υπολογιστικής η απόκλιση της εντροπίας που είναι σχετικά μικρό για διαφορετικές διαμορφώσεις [57], επιλέξαμε μόνο 12 τακτικά διαστήματα κατά μήκος στιγμιότυπα των τελευταίων 2 ns τροχιά παραγωγή για τους υπολογισμούς της εντροπίας.

Στατιστική Ανάλυση

Τα δεδομένα αναλύθηκαν με τη χρήση του Student t-test, ή μονόδρομη ANOVA που ακολουθείται από μια δοκιμασία post-hoc ανάλογα με την περίπτωση και σ τιμές των & lt? 0,05 θεωρήθηκαν σημαντικές.

Αποτελέσματα

φυσιολογικές συγκεντρώσεις της Γενιστεΐνη Σαθεροποιημένο LAPC-4 της κυτταρικής ανάπτυξης, αλλά δίνει ώθηση στην ανάπτυξη των LNCaP κύτταρα

Για να καθοριστεί αν η T877A μετάλλαξη του AR επηρεάζει τα αποτελέσματα της genistein στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό PCa, εφαρμόσαμε δύο προσεγγίσεις, (α) χρησιμοποιώντας κυτταρικές σειρές που έχουν φυσικά WT AR (LAPC-4 κύτταρα) ή AR T877A μεταλλάκτη (κύτταρα LNCaP) και (β) τη χρήση ενός AR-null κυτταρική γραμμή (PC-3 ) επιμολυσμένα με εξωγενές παροδικά WT ή T877A AR μεταλλαγμένο έτσι ώστε να ξεπεραστούν τα βιολογικά αποκλίσεις από τη χρήση δύο διαφορετικών κυτταρικών γραμμών. Επίσης, προκειμένου να αποφευχθεί η διακύμανση των επιπέδων έκφρασης AR μεταξύ PC-3 κύτταρα επιμολυσμένα με διαφορετικά κατασκευάσματα AR και κυττάρων LNCaP, μία περιοχή συγκεντρώσεων DNA (0.5-5μg) δοκιμάστηκε και η βέλτιστη δόση που οδήγησε σε ένα τελικό επίπεδο έκφρασης AR κοντά σε ότι σε κύτταρα LNCaP χρησιμοποιήθηκε (0,5 μg).

κύτταρα προστάτη υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ένα εύρος συγκεντρώσεων γενιστεΐνης (0.5-50 mmol /L) για 24 έως 72 ώρες, μετά την οποία την κυτταρική ανάπτυξη και η βιωσιμότητα αξιολογήθηκε με τόσο μια δοκιμασία πολλαπλασιασμού των κυττάρων MTS και κύτταρο αιματοκυτταρόμετρο καταμέτρηση με κυανού αποκλεισμού. Η γενιστεΐνη αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό LAPC-4 κυττάρων σημαντικά σε όλες τις συγκεντρώσεις δοκιμάστηκαν σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 1Α). Σε αντίθεση, οι φυσιολογικές συγκεντρώσεις των 0,5, 1,0, και 5,0 μmol /L γενιστεΐνη πολλαπλασιασμού κυττάρων που διεγείρεται LNCaP κατά 13%, 35%, και 27% σε σχέση με τους ελέγχους, αντίστοιχα, ενώ υψηλότερες συγκεντρώσεις της γενιστεΐνης (25 και 50 μmοl /L) προκάλεσε αναστολή του πολλαπλασιασμού κατά 38% και 50% (Σχήμα 1 Β). Σε LAPC-4 κύτταρα, η θεραπεία με 1 nmol /L κατήργησε R1881 τα ανασταλτικά αποτελέσματα της genistein, εκτός σε υψηλή συγκέντρωση (50 μmοl /L) (Σχήμα 1 C). Ενώ σε κύτταρα LNCaP, συνδυασμένη θεραπεία με χαμηλή γενιστεΐνη δόση (1 mmol /L) και συνθετικό ανδρογόνο (1 nmol /L R1881) προσθετικά αυξημένο πολλαπλασιασμό των κυττάρων κατά 134%, το οποίο ήταν περισσότερο από εκείνη που προκαλείται είτε από genistein ή ανδρογόνων μόνο (35% και 90% σε σχέση με τον έλεγχο, αντίστοιχα) (Σχήμα 1 D). Αιμοκυτταρόμετρο μετρώντας με trypan αποκλεισμού μπλε χρωστική έδειξαν μία συγκρίσιμη πρότυπο με εκείνο που λαμβάνεται με την δοκιμασία πολλαπλασιασμού MTS και η έλλειψη κυτταροτοξικότητας (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD (τυπική απόκλιση) τριών πειραμάτων κάθε εις τριπλούν. Α και Β: Γραφική παρουσίαση των αποτελεσμάτων των διαφορετικών συγκεντρώσεων genistein σε LAPC-4 (Α) και LNCaP (Β) την ανάπτυξη των κυττάρων. Γ και Δ: Η επίδραση της συνδυασμένης θεραπείας με genistein και R1881 σε LAPC-4 (C) και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων LNCaP (D). Ε: Η επίδραση της θεραπείας genistein για 24 ώρες για την ανάπτυξη των μη επιμολυσμένα κύτταρα PC-3 ή PC-3 κύτταρα επιμολυσμένα με είτε WT-AR ή το AR T877A μεταλλαγμένο. OD? οπτική πυκνότητα. * P & lt? 0.05, ** ρ & lt?. 0.01 για συγκρίσεις με τις ομάδες ελέγχου

Η

Στα 10 μmol /L ή περισσότερο, genistein θεραπεία για 48 ώρες προκάλεσε μια σημαντική αναστολή του πολλαπλασιασμού των PC-3 κύτταρα που στερούνται AR έκφρασης (Σχήμα 1 Ε). Είναι ενδιαφέρον ότι, οι ίδιες συγκεντρώσεις της γενιστεΐνης προκάλεσε μια σημαντική διέγερση του πολλαπλασιασμού των PC-3 κύτταρα που εκφράζουν την T877A-μεταλλαγμένο AR (Σχήμα 1 Ε), σύμφωνα με τα ευρήματά μας σε κύτταρα LNCaP που εκφράζουν ενδογενώς το ίδιο μεταλλαγμένο AR. Ο πολλαπλασιασμός των PC-3 κύτταρα επιμολυσμένα με WT-AR ανεστάλη σημαντικά σε συγκεντρώσεις 10 μmol /L ή περισσότερο (Σχήμα 1 Ε).

Εν περιλήψει (βλέπε Πίνακα 1), τα κύτταρα του προστάτη που εκφράζουν WT-AR είτε ενδογενώς (LAPC-4 κύτταρα) ή εξωγενώς (WT-AR επιμολυσμένα κύτταρα PC-3) δεν παρουσιάζει καμία αύξηση διεγερτική απόκριση σε γενιστεΐνη . Ωστόσο, τα κύτταρα του προστάτη που εκφράζουν το μεταλλαγμένο AR, είτε ενδογενώς (κύτταρα LNCaP) ή εξωγενώς (επιμολυσμένα κύτταρα PC-3), έδειξε μια σημαντική βελτίωση όσον αφορά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε απόκριση σε χαμηλότερες μικρομοριακές συγκεντρώσεις της γενιστεΐνης.

Γενιστεΐνη (μmol /L )

ανάπτυξη κυττάρων

απόπτωση

AR πυρηνικού εντοπισμού

AR πρωτεΐνη και η έκφραση του mRNA

πρωτεΐνης PSA και η έκφραση του mRNA

λουσιφεράσης PSA activity

LAPC-40.5↓↑↓↓↓↓1↓↑↓↓↓↓↓↓↓↓5↓↓N/AN/A↓↓↓↓↓↓↓↓10↓↓↑↑↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓25↓↓↓↑↑↑↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓50↓↓↓↑↑↑↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓LNCaP0.5↑↔↑↑↑↑1↑↑↔↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑5↑↑N/AN/A↑↑↑10↔↔↔↔↓↓↓25↓↓↑↑↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓50↓↓↓↑↑↑↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓Table . 1. Περίληψη των συνολικών αποτελεσμάτων της genistein σε LAPC-4 και LNCaP κύτταρα

Συντομογραφίες έχουν ως εξής: ↑ αυξήθηκε ελαφρά? ↑ ↑ μετρίως αυξημένη? ↑ ↑ ↑ αυξήθηκαν σημαντικά? ↔ καμία αλλαγή, ↓ ελαφρώς ανέστειλε? ↓ ↓ μέτρια αναστέλλεται? ↓ ↓ ↓ αναστέλλεται σημαντικά. CSV Λήψη CSV

Χαμηλή Δόσεις Γενιστεΐνη επαγόμενη απόπτωση και κύκλου κυττάρου σε LAPC-4 κύτταρα, αλλά όχι σε LNCaP κύτταρα

σύγκριση LAPC-4 και LNCaP κύτταρα από τις επιδράσεις των αυξημένων συγκεντρώσεων genistein θεραπείας για 48 ώρες στην απόπτωση και την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, και οι δύο αξιολογήθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Η απόπτωση επαυξημένη σε εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο με LAPC-4 κύτταρα, ξεκινώντας από μια δόση τόσο χαμηλή όσο 0,5 μmol /L (Σχήματα 2Α). Σε αντίθεση, οι συγκεντρώσεις genistein μεταξύ 0,5 και 10 mmol /L δεν προκάλεσε σημαντική αλλαγή στην απόπτωση σε κύτταρα LNCaP? απόπτωση αυξήθηκε μόνο κατά genistein συγκεντρώσεις 25 μmol /L ή υψηλότερη (Σχήματα 2Β). Σε συμφωνία με αυτά τα ευρήματα, η genistein προκάλεσε μια αύξηση του LAPC-4 κύτταρα σε υπο-G1 σε συγκεντρώσεις ίσες ή μεγαλύτερες από 10 mmol /L, ενώ αυτό δεν παρατηρήθηκε σε κύτταρα LNCaP μόνο στο ή πάνω από 25 μmol /L (Πίνακας 2).

τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με γενιστεΐνη (0,5- 50 μmol /L) για 48 ώρες, στη συνέχεια απόπτωση εξετάστηκε σε LAPC-4 (Α) και κύτταρα LNCaP (Β) με κυτταρομετρία ροής μετά από χρώση με Annexin-V απόπτωση κιτ ανίχνευσης. Κύτταρα κατεργασμένα με genistein για 72 ώρες ελέγχθηκαν για ενδείξεις κυτταροτοξικότητας χρησιμοποιώντας τη γαλακτική αφυδρογονάση δοκιμασία απελευθέρωσης. Τα αποτελέσματα στο γράφημα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD τριών πειραμάτων. * P & lt? 0.05, ** ρ & lt? 0,01, για συγκρίσεις με τις ομάδες ελέγχου.

Η LAPC-4 κύτταρα

LNCaP κύτταρα

δόση Γενιστεΐνη

Υπο G

G0 /G1

S

G2 /M

Sub G

G0 /G1

S

G2 /M

Control9.46 (3.8) 71.98 (5,1) 6,38 (3,3) 12.25 (2,8) 7,06 (1,5) 73.85 (2,5) 8,04 (2,1) 11.05 ( 2.8) 0,5 μmol /L 13,63 (1,5) 62.69 (9,4) 6.12 (4,9) 17.66 (2,6) 7.00 (1,5) 74.96 (5,4) 8.02 (2,9) 10.02 (4,6) 1,0 μmol /L18.37 (6,2) 59,58 * ( 4.1) 4.18 (0,8) 17.78 (5,6) 4,44 * (0,9) 82.12 * (4.3) 9.09 (2,4) 4,42 * (2,4) 10 μmol /L25.1 ** (2,6) 52,3 ** (2.9) 3.30 (0,9) 19.31 * (2,8) 7,08 (1,5) 72.81 (4,8) 7,80 (1,8) 12.31 (2,6) 25 μmol /L34.2 ** (4.2) 40.8 ** (4.3) 3.84 (4,1) 21.19 * (3,5) 13,0 ** (2.5) 61.78 ** (3,2) 5,84 (2,1) 19,4 * (3,6) 50 μmol /L40.4 ** (0.8) 31.2 ** (3,0) 2,30 (0,9) 26,1 ** (2.0) 9,37 ** (1,6 ) 43.03 ** (3,4) 3,30 * (1,1) 34,3 ** (3.9) Πίνακας 2. Τα αποτελέσματα της γενιστεΐνης στην κατανομή του κυτταρικού κύκλου του LAPC-4 και LNCaP κύτταρα.

προπιδίου κύτταρα ιωδιούχο χρώση αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μια ροή κυτταρόμετρο. Τα αποτελέσματα στον πίνακα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD τριών πειραμάτων * ρ & lt?. 0.05, ** ρ & lt? 0,01, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου φορέα. Οι αριθμοί εντός παρενθέσεων είναι για τυπικές αποκλίσεις. CSV Λήψη CSV

Όσον αφορά την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, 1 μmοl /L genistein σημαντικά μειωμένη LNCaP κύτταρα σε υπο-G1 και G2 /M και αυξημένη κυττάρων στην φάση G0 /G1 του κυτταρικού κύκλου (Πίνακας 2). Αντίθετα, σε LAPC-4 κύτταρα, χαμηλές δόσεις γενιστεΐνης επαγόμενη διακοπή αύξησης εμφανές από μείωση του αριθμού των κυττάρων σε G0 /G1 και συσσώρευση των κυττάρων στο G2 /M η οποία είναι χαρακτηριστική ενός μπλοκ S-φάση ή S /G

μπλοκ μετάβασης 2 φάσεων (Πίνακας 2). Ωστόσο, στο supraphysiological συγκεντρώσεις (25μmol /L και υψηλότερα), genistein προκαλεί μια G2 /M σύλληψη και απόπτωση σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές, LAPC-4 κύτταρα είναι πιο ευαίσθητα από τα κύτταρα LNCaP. Αυτά τα ευρήματα είναι συνεπή με αυτά που αναφέρθηκαν πιο πάνω στον προσδιορισμό του κυτταρικού πολλαπλασιασμού MTS. Για να εξαλειφθεί η επίδραση της άμεσης κυτοτοξικότητας των genistein, μπορούμε τότε εκτελείται το γαλακτικής αφυδρογονάσης δοκιμασία απελευθέρωσης και στις δύο LAPC-4 και LNCaP κύτταρα σε όλο το φάσμα της γενιστεΐνης δόσεων που έχουν χρησιμοποιηθεί. Δεν υπήρχε ανιχνεύσιμη κυτταροτοξικότητα σε οποιαδήποτε δόση της γενιστεΐνης έως 50 μmol /L για 72 ώρες είτε σε κυτταρικές σειρές (Σχήμα 2C).

Η διεγερτική δράση της γενιστεΐνης σε LNCaP κύτταρα έγινε μέσω της

Mutant AR

Εξετάσαμε αν η μεταλλαγμένη AR-T877A απαιτείται για genistein για την ενίσχυση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων LNCaP απουσία ανδρογόνου (Σχήμα 3Α). LNCaP κύτταρα επωάστηκαν είτε με 1 μπιοί γενιστεΐνη ή 1 nmol /L R1881 απουσία ή παρουσία 100 ηΜ του ανταγωνιστού AR, Casodex. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α, Casodex μόνη της δεν επηρέασε την ανάπτυξη των κυττάρων LNCaP, αλλά κατήργησε το διεγερτικό αποτέλεσμα του 1 nmol /L R1881 επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, συνεπές με την έννοια ότι το Ar ενεργοποίηση μεσολαβεί πολλαπλασιασμός PCa κυττάρων (36,38). Η προσθήκη 1 μmοl /L γενιστεΐνης στο μέσο ενισχυμένο πολλαπλασιασμό των κυττάρων LNCaP κατά 49% και το αποτέλεσμα αυτό επίσης εξαλείφεται με 100ηΜ Casodex. Αυτά τα ευρήματα δείχνουν ότι η διεγερτική δράση της γενιστεΐνης στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων LNCaP διαμεσολαβείται κυρίως από τον AR T877A μεταλλαγμένο.

Α: Γραφική παρουσίαση της επίδρασης της συνδυασμένης θεραπείας με R1881 (1 nmol /L) και Casodex (100nmol /L) ή genistein (1 μmοl /L) και Casodex (100nmol /L) επί της κυτταρικής ανάπτυξης μετρήθηκε με LNCaP MTS δοκιμασία. Τα αποτελέσματα στο γράφημα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD τριών πειραμάτων κάθε εις τριπλούν. * P & lt? 0.05, ** ρ & lt? 0,01, για συγκρίσεις με τις ομάδες που έλαβαν θεραπεία με R1881 ή genistein, μόνο. Β: Αξιολόγηση των genistein-AR δεσμευτική

στο

silico

. Αντιπροσωπευτική εικόνα δείχνει αλλαγές διαμόρφωσης του WT-AR και το AR T877A μεταλλαγμένο μετά μοριακή βάση σύνδεσης με genistein

στο

silico

χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα GOLD v5.0.1 μοντελοποίησης. Διαφορετικές περιοχές του AR παρουσιάζονται σε διάφορα χρώματα. Ένθετο, genistein συνδεδεμένη με την περιοχή δέσμευσης συνδέτη (LBD) του AR-υποδοχέα. Τα βέλη δείχνουν διαφορετικές δομικές αλλαγές και κινήσεις θηλιά στο WT-AR και T877A μεταλλαγμένο AR σε απάντηση genistein σύνδεσης. C: Γεωμετρική βελτιστοποίηση, και ταυτομερείς μορφές της γενιστεΐνης που δημιουργούνται σε ρΗ 7,5 ± 0,5 με τη χρήση Epik. Το κίτρινο είναι για το WT-AR, και το πράσινο είναι το AR T877A μεταλλαγμένο. Δ και Ε: Αξιολόγηση των genistein-AR δεσμευτική χρησιμοποιώντας

3 [R1881] ανταγωνιστική δοκιμασία σύνδεσης. Ιστόγραμμα δείχνει την πρόσδεση της γενιστεΐνης με AR σε LAPC4 (WT-AR) και LNCaP (μεταλλαγμένο AR) κύτταρα όπως εκτιμήθηκε με ραδιοεπισημασμένο δοκιμασία ανταγωνιστικής πρόσδεσης με βάση κύτταρα όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Τα αποτελέσματα στο γράφημα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD τριών πειραμάτων. * P & lt? 0.05, ** ρ & lt?. 0,01, σε σύγκριση με τον έλεγχο

Η

Η ικανότητα της γενιστεΐνης να ενισχύσει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων LNCaP, αλλά όχι σε LAPC-4 κύτταρα, μπορεί να οφείλεται σε διαφορετική χημική συγγένεια με την οποία genistein συνδέεται με το μεταλλαγμένο AR και του WT-AR. Για να διερευνήσουν αυτή την υπόθεση, δύο προσεγγίσεις που χρησιμοποιούνται,

in silico

μοριακής μοντελοποίησης και

3 [Η] -R1881 δοκιμασία ανταγωνιστικής δέσμευσης.

Σε silico

μοντελοποίηση έδειξε ότι genistein δεσμεύεται στον θύλακα σύνδεσης AR χωρίς επικάλυψη με την DHT θέση σύνδεσης (Σχήματα 3Β και 3C). * P & lt? * P & lt? * P & lt?