Αφηρημένο

όγκου κύτταρα σε ασκίτη είναι μια σημαντική πηγή της υποτροπής της νόσου σε ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών. Σε μια προσπάθεια να εντοπίσει και προφίλ του πληθυσμού των κυττάρων ασκίτη που λαμβάνονται από ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών, μια νέα μέθοδος αναπτύχθηκε για να ξεχωριστές προσκολλημένα (AD) και τα μη προσκολλημένα κύτταρα (NAD) σε καλλιέργεια. Είκοσι πέντε ασθενείς είχαν προσληφθεί με αυτή τη μελέτη? 11 είχαν λάβει προηγούμενη χημειοθεραπεία (ΣΟ) και 14 στη χημειοθεραπεία (CR). AD κύτταρα από δύο ασθενείς CN και CR εμφάνισαν μεσεγχυματικών μορφολογία με ένα προφίλ αντιγόνο μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων και των ινοβλαστών. Αντιστρόφως, τα κύτταρα NAD είχε μια επιθηλιακή μορφολογία με ενισχυμένη έκφραση του καρκινικού αντιγόνου 125 (CA125), μόριο κυτταρικής προσκόλλησης επιθηλιακών (EpCAM) και κυτοκερατίνη 7. κύτταρα NAD αναπτυχθεί διηθητικά όγκων και ασκιτών εντός 12-14 εβδομάδων μετά από ενδοπεριτοναϊκή (ip) ενέσεις σε γυμνά ποντίκια, ενώ τα κύτταρα Αϋ παρέμειναν μη ογκογόνων για μέχρι 20 εβδομάδες. Μετέπειτα σύγκριση της επιλεκτικής επιθηλιακών, μεσεγχυματικών και του καρκίνου των βλαστικών κυττάρων (CSC) δείκτες μεταξύ Αϋ και NAD πληθυσμούς CN και CR ασθενείς έδειξε μια ενισχυμένη τάση στην έκφραση του mRNA της Ε-καδερίνης, EpCAM, STAT3 και Oct4 στον πληθυσμό NAD ασθενών CR. Μια παρόμοια τάση της ενισχυμένης έκφρασης του mRNA του CD44, ΜΜΡ9 και Oct4 παρατηρήθηκε στον πληθυσμό των ασθενών AD CR. Ως εκ τούτου, χρησιμοποιώντας μία νέα μέθοδο καθαρισμού αποδεικνύουμε για πρώτη φορά μια ξεχωριστή διαχωρισμό των κυττάρων ασκίτη σε επιθηλιακά ογκογόνα και μεσεγχυματικά μη ογκογόνα πληθυσμούς. Μπορούμε επίσης να αποδείξει ότι τα κύτταρα από τους ασκίτες ασθενών CR ​​είναι κυρίως τα επιθηλιακά και δείχνουν μια τάση προς αυξημένη έκφραση mRNA γονιδίων που σχετίζονται με τα ΚΕΠ, σε σύγκριση με κύτταρα που απομονώνονται από τον ασκίτη των ασθενών CN. Καθώς τα καρκινικά κύτταρα στα ασκίτη των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών παίζουν κυρίαρχο ρόλο στην υποτροπή της νόσου, σε βάθος κατανόηση της βιολογίας του μικροπεριβάλλοντος ασκίτη από την ΚΟ και ΣΟ ασθενείς είναι απαραίτητη για την αποτελεσματική θεραπευτικές παρεμβάσεις

Παράθεση:. Λατίφι Α, Luwor RB, Bilandzic Μ, Nazaretian S, Stenvers Κ, Pyman J, et al. (2012) Απομόνωση και Χαρακτηρισμός καρκινικά κύτταρα από τους ασκίτες του καρκίνου των ωοθηκών Ασθενείς: Μοριακό Φαινότυπος των ωοθηκών στη χημειοθεραπεία όγκων. PLoS ONE 7 (10): e46858. doi: 10.1371 /journal.pone.0046858

Επιμέλεια: Shannon M. Hawkins, Baylor College of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 11 Ιουλίου 2012? Αποδεκτές: 10 Σεπ 2012? Δημοσιεύθηκε: 8 Οκτωβρίου 2012 |

Copyright: © Λατίφι et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό ήταν υποστηρίζεται από το Ίδρυμα της Γυναίκας Καρκίνος, Εθνικό Σύστημα Υγείας και Ιατρικής Έρευνας του Συμβουλίου της Αυστραλίας (JKF, RegKey # 441101), το Εθνικό μαστού Ίδρυμα Καρκίνου (EWT? ενσυναίσθηση του Καρκίνου του μαστού του δικτύου, Αυστραλία) και το Πρόγραμμα Ενίσχυσης υποδομής Επιχειρησιακό της βικτωριανής κυβέρνησης (Αυστραλία). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στην desugn μελέτη, συλλογή και ανάλυση δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν ανταγωνιστικά συμφέροντα υπάρχουν

Εισαγωγή

το 2009, η αμερικανική Ένωση για την Έρευνα του καρκίνου αναφερθεί καρκίνο των ωοθηκών ως γυναικολογική κακοήθεια με την υψηλότερη αναλογία περίπτωση-να-θνησιμότητας [1]. Αυτό το υψηλό ποσοστό θνησιμότητας αποτελέσματα από τη διάγνωση σε προχωρημένο στάδιο όταν ο καρκίνος έχει εξαπλωθεί μέσα στην περιτοναϊκή κοιλότητα και μετάσταση στα ζωτικά όργανα. Ωοθηκών μετάστασης του καρκίνου πραγματοποιείται είτε άμεσα από τα φλοιώδη κύστεις συμπερίληψη των ωοθηκών ή από το κροσσωτό άκρο της σάλπιγγας [2], και εξαπλώνεται με άμεση επέκταση σε γειτονικά όργανα (για παράδειγμα εξω-ωοθηκικά πυελικών οργάνων, του παχέος εντέρου, της ουροδόχου κύστης, του ήπατος, κλπ) , ή με την προσάρτηση της απολέπιση των ωοθηκών καρκινικά κύτταρα τα οποία επιβιώνουν ως κυτταρικά συσσωματώματα ή σφαιροειδή. Τα σφαιροειδή που μεταφέρονται από το περιτοναϊκό υγρό όγκου (ασκίτη) για να περιβάλλει τα όργανα στην περιτοναϊκή κοιλότητα. Εκτεταμένες σπορά αυτών των σφαιριδίων στη μήτρα, σιγμοειδές κόλον και επίπλουν συναντάται συχνά σε προχωρημένο στάδιο και υποτροπιάζουσα νόσο [3].

Η

Οι τρέχουσες στρατηγικές θεραπείας για τους ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών σε προχωρημένο στάδιο οδηγήσει στην αρχική ύφεση σε ποσοστό έως 80% των ασθενών [4]. Ωστόσο, μετά από μια σύντομη περίοδο ύφεσης (συνήθως 6-22 μήνες) υποτροπή συμβαίνει σχεδόν σε όλους τους ασθενείς [4]. Αυτό οφείλεται στην ικανότητα των καρκινικών κυττάρων να διαφεύγουν σχετιζόμενη με χημειοθεραπεία κυτταροτοξικότητα μέσω αποκτηθεί χημειοαντίσταση σε μεγάλο βαθμό. Πρόσφατα, χημειοαντίσταση έχει επίσης συνδεθεί με την απόκτηση των επιθηλιακών να μεσεγχυματικών μετάβαση (ΕΜΤ) σε καρκινικά κύτταρα [5] – [6]. Κλασικά, EMT επιτρέπει σταθερές επιθηλιακά κύτταρα για να γίνει κινητήριος και επεμβατική προκειμένου να διαδοθεί και επαναποικίζουν σε περιβάλλοντες ιστούς [7]. Αυτά τα χαρακτηριστικά του ΕΜΤ έχει αποδειχθεί ότι συσχετίζεται με μία CSC φαινότυπο [8] – [9], ενισχύεται πρόσφατα σε κλινικές περιπτώσεις από την μεσεγχυματικών και «όγκος έναρξη ‘φαινότυποι των υπολειμματικών καρκινικών κυττάρων σε ασθενείς με καρκίνο του μαστού που επιβίωσαν συμβατική θεραπεία [ ,,,0],10]. Ο φαινότυπος της CSC έχει αποδειχθεί να ρυθμίζεται δυναμικά από το μικροπεριβάλλον του όγκου [11], και το βασικό χαρακτηριστικό που απαιτείται για τις πολύ μικρές και μακρο-μεταστατικό αποικιοποίηση περιλαμβάνει όχι μόνο EMT, αλλά και μεσεγχυματικά σε επιθηλιακά μετάβασης (ΚΟΑ) [12] – [13 ]. Η συνέχεια της EMT και ΚΟΑ έχει περιγραφεί ως επιθηλιακά μεσεγχυματικά πλαστικότητα (EMP) [11]. Όπως μεταστατικό αποικιοποίηση καθορίζει την ικανότητα του EMP μετατραπεί διαδίδονται καρκινικά κύτταρα να αυτο-ανανέωση και διαφοροποίηση, οι καθορισμό κυτταρική γνωρίσματα των ΚΕΠ [14].

Η

Αν και η παρουσία ασκίτη έχει συσχετισθεί με κακή πρόγνωση, η προέλευση και φαινότυπος των καρκινικών κυττάρων σε ασκίτες, και η ένωσή του με χημειοαντίσταση και επανάληψης είναι ελάχιστα κατανοητή. Μικροσκοπική επιθεώρηση του ασκίτη έχει προηγουμένως αποκάλυψε ένα συγκρότημα ετερογενούς εικόνα που αποτελείται από μεμονωμένα κύτταρα και σφαιροειδή [15]. Μη καρκινικά κύτταρα εντός των ασκιτών περιλαμβάνουν φλεγμονώδη κύτταρα, ο καρκίνος σχετίζεται με ινοβλάστες, ανώριμα μυελοειδή κύτταρα και ενεργοποιημένα μεσοθηλιακών κυττάρων, τα οποία όλα επηρεάζουν τη συμπεριφορά των κυττάρων του όγκου και απόκριση στη χημειοθεραπεία [16]. Επίσης συμβάλλει στην ετερογένεια του ασκίτη είναι ένας πληθυσμός ΚΕΠ που μπορεί να αντισταθεί χημειοθεραπεία και δημιουργούν μια ιεραρχία των πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων όγκου με προοδευτική διαφοροποίηση δυναμικό [17], [18]. Αυτά τα ΚΕΠ, όταν καθαρίστηκε με διαλογή και ξενομοσχεύτηκε σε γυμνά ποντίκια, έχει αποδειχθεί ότι παράγει ένα σημαντικά μεγαλύτερο φορτίο όγκου σε σύγκριση με το μη ταξινομημένα κύτταρα όγκου [19], υποδηλώνοντας το μεγαλύτερο ογκογόνο δυναμικό του ΚΕΠ.

(Α) NAD σφαιροειδή και (Β) κύτταρα Αϋ σπάρθηκαν σε χαμηλή πλάκες στερεώσεως αμέσως μετά τη συλλογή. Μορφολογικά χαρακτηριστικά του (C) NAD σφαιροειδές και (D) κύτταρα Αϋ επί πλαστικών καλλιέργειας ιστού μετά από 24 ώρες μετά την σπορά. Εικόνες αξιολογήθηκαν με μικροσκοπία αντίθεσης φάσης. Μεγέθυνση ήταν 100 ×, γραμμή κλίμακας = 50 μm. Οι εικόνες είναι αντιπροσωπευτικές του (n = 25) δείγματα. (Ε) [

3Η] -θυμιδίνης στα κύτταρα Αϋ και σε κύτταρα διασπείρονται από σφαιροειδή εκτελέστηκε όπως περιγράφεται στις Μεθόδους και Υλικά. Το γράφημα είναι μία αναπαράσταση ενός δείγματος ασκίτη πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. (F) Επίδραση της σισπλατίνης επί του πολλαπλασιασμού {[

3Η] -θυμιδίνης} του NAD και τα κύτταρα Αϋ που λαμβάνονται από τους ασκίτες ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών. Το γράφημα είναι μία αναπαράσταση τριών ανεξάρτητων πειραμάτων, που διεξήχθη σε τρία ανεξάρτητα δείγματα NAD και AD εις τριπλούν. Διαφέρουν σημαντικά μεταξύ μ.Χ. έναντι κυττάρων NAD, ** p (Β) Η και Ε χρώση αγαρόζης ενσωματωμένων δείγματος του ασθενούς πριν από την ένεση? (Γ) εικόνα του συμπαγούς όγκου που λαμβάνεται από έναν ποντικό δεκατέσσερα εβδομάδες μετά ε.π. έγχυση των κυττάρων NAD (5 × 10

6)? (Δ) Η και Ε χρώση των κυττάρων NAD ασκίτη ποντικού ενσωματωμένα σε αγαρόζη? (Ε) κυτταρομετρίας ροής σύγκριση της έκφρασης του CA125, EpCAM και CD44 μεταξύ του ασθενούς και τα κύτταρα ασκίτη ποντικού. Τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά δύο ανεξάρτητων δειγμάτων. Το πληρωμένο ιστόγραμμα σε κάθε σχήμα αναπαριστά IgG ελέγχου, μαύρες γραμμές υποδεικνύουν την έκφραση της πρωτεΐνης σε ανθρώπινα κύτταρα, διακεκομμένες γραμμές υποδεικνύουν την έκφραση της πρωτεΐνης σε κύτταρα ασκίτη ποντικού.

Η

απαριθμήσεις κυττάρου και Δοκιμασία Πολλαπλασιασμού

κύτταρα Αϋ και NAD σφαιροειδή που συλλέγονται από 1 ml ασκίτη αφέθηκαν να προσκολληθούν σε πλάκες καλλιέργειας ιστού για 24 ώρες, μετά την οποία, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και μετρήθηκαν με τη μέθοδο αποκλεισμού του κυανού trypan. Ο αριθμός των κυττάρων Αϋ και κύτταρα εντός των σφαιροειδή NAD υπολογίστηκαν και το ποσοστό των βιώσιμων κυττάρων στους πληθυσμούς AD και NAD σφαιροειδές αξιολογήθηκε με τον υπολογισμό του συνολικού αριθμού των κυττάρων που υπάρχουν και στις δύο AD και NAD πληθυσμούς 1 ml ασκίτη εκάστου ασθενής.

Ιστολογική εικόνες των (Α) όγκος, (Β) του ήπατος, (Γ) GI οδού και (Δ) παγκρέατος από ένα ποντικό εγχύθηκαν ίρ με κύτταρα NAD (5 × 10

6). Τα βέλη στον όγκο (Α) δείχνουν τσέπες των καρκινικών κυττάρων που περιβάλλονται από συνδετικό ιστό. (Β-D) βέλη δείχνουν τα καρκινικά κύτταρα εισβάλλουν τα αντίστοιχα όργανα. Η και Ε χρώση (Ε) νεφρό και (F) ωοθήκη από έναν ποντικό ένεση με κύτταρα NAD (5 × 10

6). Τα βέλη δείχνουν τα καρκινικά κύτταρα που περιβάλλουν τα όργανα χωρίς εισβολή. Η μεγέθυνση ήταν 200 × για όλα, εκτός από ωοθήκη η οποία είχε μεγέθυνση 100 Χ, μπαρ κλίμακα = 50 μm.

Η

3 [Η] -θυμιδίνης δοκιμασία πρόσληψης διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [20] . Εν συντομία, 1 × 10

5 NAD ή AD κύτταρα σπάρθηκαν εις τριπλούν σε πλάκες 24 φρεατίων. Μετά από 2, 4 και 6 ημέρες, 0.5 μθί [

3Η] θυμιδίνης προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C για επιπλέον 16 ώρες. Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS, συλλέχθηκαν και υποβλήθηκαν σε λύση σε 1% Triton και ενσωμάτωση της [

3Η] θυμιδίνης μετρήθηκε με απαρίθμηση υγρού σπινθηρισμού (Hidex 300SL, LKB Instruments, Αυστραλία).

Ποσοστιαία κατανομή των συνολικών κυττάρων στις NAD και AD πληθυσμούς ασκίτη του CN (η = 5) και CR (n = 5) ασθενείς που προσδιορίστηκε με δοκιμασία αποκλεισμό trypan blue. Τα αποτελέσματα είναι μέσες ± SEM από πέντε ανεξάρτητα δείγματα αξιολογούνται εις τριπλούν. Διαφέρει σημαντικά σε σχέση με CR δείγματα ΣΟ, ** (p & lt? 0,01).

Η

Για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης αναστολής αύξησης (GI50), 1 × 10

5 NAD ή AD κύτταρα αφέθηκαν να προσκολλώνται στις 24 φρεατίων για 24 ώρες εις τριπλούν. Αμφότερα τα κύτταρα NAD και AD υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις σισπλατίνης (0,5 μg /ml-10 μg /ml) για 48 ώρες πριν από την προσθήκη 0.5 μCi [

3Η] θυμιδίνης για 16 ώρες. Το επίπεδο της [

3Η] θυμιδίνης προσδιορίστηκε όπως περιγράφεται παραπάνω.

qPCR διεξήχθη όπως περιγράφεται στις μεθόδους και υλικά για τα καθαρισμένα NAD και AD πληθυσμούς κυττάρων που απομονώθηκαν από τους ασκίτες του CN (n = 4) και CR (n = 4) δείγματα ασκίτη. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως περιγράφεται στο Σχήμα 5 για τέσσερα ανεξάρτητα δείγματα αξιολογούνται εις τριπλούν.

Η

qPCR διεξήχθη όπως περιγράφεται στην Εικόνα 9 σχετικά με τα καθαρισμένα NAD και AD πληθυσμούς κυττάρων που απομονώνονται από τα δείγματα ασκίτη CN και CR. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως περιγράφεται στο Σχήμα 9. Σημαντικά διαφορετική σε CR έναντι δείγματα CN, * (ρ & lt? 0,05).

Η

Ανάλυση Ανοσοφθορισμού

ανάλυση ανοσοφθορισμού διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [21 ]. Οι εικόνες ελήφθησαν με τη χρήση του λέιζερ SP2 Leica TCS, και να προβληθούν σε ένα σταθμό εργασίας HP με τη χρήση του λογισμικού Leica Microsystems TCS SP2.

qPCR διεξήχθη σε απομονωμένες NAD και AD κύτταρα όπως περιγράφεται στο Σχήμα 9. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως περιγράφεται στο σχήμα 9. σημαντικά διαφορετική σε σχέση με CR δείγματα ΣΟ, * (p & lt? 0,05).

η

Τα αντιγόνα έχουν βαθμολογηθεί ως υψηλή έκφραση (

+++), μέτρια έκφραση (

++), χαμηλή έκφραση (

+), και όχι έκφραση (

-.)

Η

Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής

Η κυτταρομετρία ροής μέθοδος έχει περιγραφεί στο παρελθόν [21]. Όλα τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό Cell Quest (Becton-Dickinson, Bedford, ΜΑ, USA). Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση ένταση φθορισμού (MIF).

RNA Εκχύλιση και ποσοτική πραγματικού χρόνου (Q-PCR)

RNA εκχυλίσεις, σύνθεση cDNA και τον ποσοτικό προσδιορισμό των επιπέδων mRNA διαφόρων γονιδίων ήταν πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [21]. Και αντιπληροφοριακοί εκκινητές σχεδιάστηκαν έναντι δημοσιεύτηκαν ανθρώπινες αλληλουχίες για Ε-καδερίνης, Ν-cadherin, βιμεντίνη, Oct4, ΜΜΡ2, ΜΜΡ9, EpCAM και CD44. εκχύλισης πηκτής των PCR προϊόντων διεξήχθη χρησιμοποιώντας το κιτ εκχύλισης πηκτής Qiaex II αγαρόζης (Qiagen Αυστραλία), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή και ποσοτικοποιείται με τη χρήση του ND-1000 Nanodrop φασματοφωτόμετρο (NanoDrop Technologies Inc Wilmington, DE, USA). Οι αλληλουχίες και τα προϊόντα επαληθεύθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [22]. Ζεύγη εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν περιλαμβάνουν 5-3 »: E cadherin (Εηίτεζ Gene ID 999, σύμβολο εγκεκριμένο Cdh1) προς τα εμπρός-GGCACAGATGGTGTGATTACAG? αντιστροφής GTCCCAGGCGTAGACCAAGAAA? Ν-cadherin (Εηίτεζ Gene ID 1000, ενέκρινε το σύμβολο CADH2) μακρόπνοη AAACAGCAAGCACGGGTTA? αντιστροφής CTTAGGATTGGGGGCAAAAT? vimentin (Εηίτεζ Gene ID 7431, ενέκρινε το σύμβολο VIM) μακρόπνοη CCTACAGGAAGCTGCTGGAA? αντιστροφής GGTCATCGTGATGCTGAGAA? ΜΜΡ2 (Εηίτεζ Gene ID 4313, ενέκρινε το σύμβολο ΜΜΡ2) μακρόπνοη AAGGGGATCCAGGAGCTCTA? αντιστροφής GCTTGTCACGTGGTGTCACT? ΜΜΡ9 (Εηίτεζ Gene ID 4318, ενέκρινε το σύμβολο ΜΜΡ9) μακρόπνοη TTGACAGCGACAAGAAGTGG? αντιστροφής GCCATTCAC GTCGTCCTTAT? EpCAM (Εηίτεζ Gene ID 4072, ενέκρινε το σύμβολο EpCAM) μακρόπνοη CGTCAATGCCAGTGTACTTCAGTT? αντιστροφής TCCAGTAGGTTCTCACTCGCTCAG? CD44 (Εηίτεζ Gene ID 960, σύμβολο εγκεκριμένο CD44) μακρόπνοη CCAATGCCTTTGATGGACCA? αντιστροφής TGTGAGTGTCCATCTGATTC? Oct4 Εηίτεζ Gene ID 5460, ενέκρινε το σύμβολο POU5F1): μακρόπνοη CTCCTGGAGGGCCAGGAATC? αντιστροφής CCACATCGGCCTGTGTATAT? 18S (Εηίτεζ Gene ID 100008588, εγκεκριμένο σύμβολο RN18S1) προς τα εμπρός-GTAACCCGTTGAACCCCATT? αντίστροφη CCATCCAATCGGTAGTAGCG. Η έκφραση του mRNA της STAT3 προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας STAT3 ανιχνευτή (Applied Biosystems, Βικτώρια, Αυστραλία). Real time PCR πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του μείγματος SYBR Applied Biosystems ΑΒΙ (Victoria, Australia) χρησιμοποιώντας Applied Biosystems ΑΒΙ 7900 ΗΤ Fast μηχανή σε πραγματικό χρόνο. Οι αποδόσεις μετατράπηκαν σε fg (femtograms) με βάση την πρότυπη καμπύλη για κάθε προϊόν και τα προκύπτοντα επίπεδα του mRNA ήταν κανονικοποιημένα προς το επίπεδο 18S mRNA ανά δείγμα. Κάθε πείραμα διεξήχθη ανεξάρτητα τουλάχιστον τρεις φορές.

ασθενών περισσότεροι καρκίνο των ωοθηκών κατά τη διάγνωση (στάδιο IIIc /IV) που υπάρχει με ασκίτη (ΣΟ), η οποία αποτελείται από τα στρωματικά κύτταρα ινοβλαστών-όπως και πολύ λίγα κύτταρα του όγκου. Η πλειονότητα αυτών των ασθενών (~ 80%) μετά από χειρουργική επέμβαση και την πρώτη γραμμή της επιστροφής χημειοθεραπείας με υποτροπιάζοντα καρκίνο που σχετίζεται με ασκίτη (CR). Κατά τη διάρκεια της χημειοθεραπείας και μετέπειτα υποτροπές, το ποσοστό των στρωματικών κυττάρων στο ασκιτικό μειώνεται σταδιακά και ο ασθενής με υποτροπιάζοντα καρκίνο παρουσιάζει με ασκίτη που αποτελείται κυρίως από CA125

+++ /EpCAM

+++ /STAT3

+++ χημειοθεραπεία επιθηλιακά κύτταρα NAD όγκου. Αυτά CA125

+++ /EpCAM

+++ /STAT3

+++ πλούσια καρκινικά κύτταρα είναι η ενδεχόμενη πηγή της εξω-ωοθηκικά το περιτόναιο. Αυτές οι συμφύσεις είναι η βασική αιτία θνησιμότητας των ασθενών.

Η

Μελέτες σε ζώα

δήλωση

ηθική των ζώων.

Αυτή η μελέτη πραγματοποιήθηκε σε αυστηρά σύμφωνα με τις συστάσεις του Οδηγός για τη Φροντίδα και Χρήση των ζώων Εργαστηρίου της Εθνικής Υγείας και Ιατρικής Έρευνας του Συμβουλίου της Αυστραλίας. Το πειραματικό πρωτόκολλο εγκρίθηκε από το Ludwig /Τμήμα Χειρουργικής, το Royal Melbourne Hospital και το Πανεπιστήμιο της Επιτροπής Δεοντολογίας Ζώων της Μελβούρνης (Έργο-006/11), και εγκρίθηκε από την Επιτροπή Ερευνών και Δεοντολογίας του Νοσοκομείου Royal Γυναικών Μελβούρνη της Αυστραλίας. Θηλυκά Balb /c ηυ /ηυ ποντίκια (ηλικίας 6-8 εβδομάδων) λήφθηκαν από το Κέντρο Ζώων Πόρων, Δυτική Αυστραλία. Τα ζώα στεγάστηκαν σε ένα πρότυπο χωρίς παθογόνα περιβάλλον με πρόσβαση σε τροφή και νερό.

NAD και τα κύτταρα Αϋ απομονώθηκαν από τους ασκίτες τριών CR ​​ασθενείς (Πίνακας 2). 5 × 10

6 κύτταρα ανά ομάδα ενέθηκαν ε.π. με βελόνα 26-gauge σε δέκα ποντίκια (έξι με NAD και τέσσερα με κύτταρα Αϋ). Οι ποντικοί επιθεωρούνται εβδομαδιαίως και την εξέλιξη του όγκου παρακολουθήθηκε με βάση την συνολική υγεία και το σωματικό βάρος έως ότου επιτεύχθηκε ένα προκαθορισμένο τελικό σημείο. κριτήρια Endpoint περιλαμβάνεται η απώλεια του σωματικού βάρους που υπερβαίνει το 20% του αρχικού σωματικού βάρους, ανορεξία, γενικά πρότυπα μειωμένη ευημερία, όπως η μειωμένη κίνηση και το λήθαργο που προκύπτουν από την έλλειψη ενδιαφέροντος για καθημερινές δραστηριότητες. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία και τα όργανα (όπως το ήπαρ, στομάχι, πνεύμονες, γαστρεντερικής οδού, του παγκρέατος, της μήτρας, των σκελετικών μυών, του παχέος εντέρου, του νεφρού, του περιτοναίου, των ωοθηκών και του σπλήνα), συμπαγείς όγκους και ασκιτικό υγρό συλλέχθηκαν για περαιτέρω εξέταση. Μεταστατικό ανάπτυξη τεκμηριώθηκε από παθολόγο ένα νοσοκομείο Royal Γυναικών σύμφωνα με την ιστολογική εξέταση (H & amp? Χρώση Ε) των οργάνων. Ασκίτης καρκινικά κύτταρα από ποντίκια διατηρήθηκαν σε χαμηλό πλάκες στερεώσεως και είχαν ενσωματωθεί σε 3% αγαρόζη (w /v) για την H & amp? Ε χρώση. Μετέπειτα χαρακτηρισμός του CA125, EpCAM και έκφραση CD44 σε κύτταρα που συλλέγονται από τον ασκίτη ποντικών πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται παραπάνω

Στατιστική Ανάλυση

Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση GraphPad Prism (Version 5?. GraphPad Software Inc., San Diego, CA) και Microsoft Excel. Εάν σε όλη την σειρά δείγμα, τα μέσα αποδείχθηκε ότι έχουν μια παραλλαγή σε ρ & lt? 0.05 με το F-test τότε ένα παραμετρικό t-test διεξήχθη για ασύζευκτα άνισες διακυμάνσεις. Τα δεδομένα θεωρούνται σημαντικά διαφορετικές αν p & lt?. 0.05

Αποτελέσματα

μορφολογία των κυττάρων Συνολικές από ασκίτη Καρκινοπαθών

κύτταρα ασκίτη που προέρχονται τόσο από CN (n = 11) και ασθενείς CR (n = 14) εκτιμήθηκαν με μικροσκοπία αντίθεσης φάσης μετά τη σπορά σε χαμηλή πλάκες στερεώσεως για 24 ώρες. Παρατηρήθηκαν δύο διακριτοί πληθυσμοί κυττάρων: (i) πολυκύτταρων συσσωματώματα (σφαιροειδή) που επέπλευσε ως τρισδιάστατες δομές στο μέσο ανάπτυξης χωρίς προσκόλληση (NAD) (Σχήμα 1Α), και (ii) ατρακτοειδή απλά κύτταρα ινοβλάστη, όπως ότι προσκολλάται στα χαμηλά πλάκες στερεώσεως (AD) (Σχήμα 1 Β).

Περαιτέρω μορφολογική εκτίμηση του πληθυσμού NAD αποκάλυψε πολυάριθμες τρισδιάστατη συστάδες χαλαρά συμπαγοποιημένου σφαιροειδή με ένα κεντρικό αυλό (Σχήμα 1Α). Υπήρξε μια σημαντική διακύμανση στη μορφολογία και το μέγεθος των σφαιροειδών από διαφορετικούς ασθενείς, καθώς και εντός των ασκιτών από τον ίδιο ασθενή. Σε ορισμένες περιπτώσεις, τα σφαιροειδή ήταν υπό τη μορφή σφιχτό μπάλες με μια καθορισμένη εξωτερική στεφάνη, ενώ άλλοι εμφανίζονται χαλαρά συσσωματώματα μικρών συστάδων κυττάρων (Σχήμα 1Α). Μετά από 24 ώρες καλλιέργειας σε πλαστικά καλλιέργειας ιστού, τα περισσότερα σφαιροειδή συνημμένο και ένα σαφές μετασχηματισμός από μία τρισδιάστατη δομή να ισοπεδωθεί κυτταρικά συμπλέγματα που περιέχουν πολλές στρώσεις προσκολλημένα κύτταρα αναπτύσσονται σε ένα πάνω στο άλλο παρατηρήθηκε (Σχήμα 1 C). Η περιφέρεια των σφαιροειδών εμφάνισε επιμήκη κύτταρα κινείται έξω από τα σφαιροειδή, ενώ τα κύτταρα προς το κέντρο ήταν πιο στρογγυλεμένη δομή. Καθώς τα κύτταρα μετακινούνται μακριά από τον κεντρικό πυρήνα, επαφής κυττάρου-κυττάρου μειώθηκε, με αποτέλεσμα την αποσυσσωμάτωση των σφαιροειδών (Σχήμα 1 C). Εναλλακτικά, κύτταρα AD συνδέονται με το πλαστικό ως επίμηκες ατρακτοειδόμορφα κύτταρα και την εμφάνιση μιας ινοβλάστη μορφολογία που μοιάζει (Σχήμα 1 D).

Αύξηση των AD και σφαιροειδή προερχόμενο NAD κύτταρα ως μονόφυλλο Καλλιέργειες

το πρότυπο ανάπτυξης των δύο κυττάρων μ.Χ. και NAD προσδιορίστηκε σε προσκολλημένες καλλιέργειες μονοστοιβάδας από

3 [η] δοκιμασία πρόσληψης θυμιδίνης. NAD σφαιροειδή διασπάρθηκαν με σιφώνιο και το πρότυπο ανάπτυξης συγκρίθηκε με κύτταρα AD. κύτταρα Αϋ είχε σχεδόν 2-φορές μεγαλύτερη απόκριση ανάπτυξης σε σύγκριση με τα κύτταρα διασπείρονται από NAD πληθυσμού (Σχήμα 1 Ε).

Cisplatin Ευαισθησία του NAD και AD Cells

Τα κύτταρα από σφαιροειδή NAD διασκορπίστηκαν με σιφώνιο και η τιμή GI50 σε ανταπόκριση στη σισπλατίνη, συγκρίθηκε με κύτταρα Αϋ που απομονώθηκαν από τους ασκίτες ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών (n = 3) (Σχήμα 1 F). Τα κύτταρα εντός των σφαιριδίων NAD ήταν σχεδόν 4 φορές πιο ανθεκτικά σε σισπλατίνη (n = 3, GI50 = 8.8 ± 0.72 μg /ml) σε σύγκριση με κύτταρα Αϋ (n = 3, GI50 = 2.4 ± 0.28 μg /ml) (Σχήμα 1 F ).

Αξιολόγηση των Μαρκαδόροι κυτταρικής επιφανείας από κυτταρομετρίας ροής

έκφραση κυτταρικής επιφάνειας της FSP, EpCAM, CA125, CD44 και cyt 7 προσδιορίστηκε σε μ.Χ. και NAD κύτταρα (διασκορπίζονται με θρυψινοποίηση) από τη ροή κυτταρομετρία. Παρατηρήθηκε ένα υψηλό επίπεδο έκφρασης του EpCAM, CA125 και cyt 7 στα κύτταρα διασπείρονται από τον πληθυσμό NAD, ενώ οι χαμηλές /όχι έκφραση του FSP ανιχνεύθηκε, και ένα σχετικά χαμηλό επίπεδο έκφρασης του CD44 ήταν εμφανής σε σφαιροειδή NAD (Σχήμα 2 ). Από την άλλη πλευρά, τα κύτταρα Αϋ ήταν θετικά για FSP και CD44, με χαμηλή /χωρίς ανιχνεύσιμη έκφραση του CA125 και κυτοκερατίνης 7 (Σχήμα 2). Τα χαμηλά επίπεδα της έκφρασης EpCAM ανιχνεύθηκαν στα κύτταρα AD. Αυτό το πρότυπο της έκφρασης δείκτη κυτταρικής επιφάνειας ήταν συνεπής σε όλα τα δείγματα ασκίτη (n = 25). Δεν έκφραση των CD34, CD31 και CD45 παρατηρήθηκε είτε NAD ή AD πληθυσμών με κυτταρομετρία ροής.

Ανάλυση του CA125, EpCAM, CD44 και μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων Μαρκαδόροι από ανοσοφθορισμού

επόμενο αναλύεται η έκφραση και ο εντοπισμός του CA125, EpCAM, CD44 και μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων δεικτών σε δείγματα ασκίτη με ανοσοφθορισμό. Συνεπής με τη ροή κυτταρομετρίας αποτελέσματα, CA125 ήταν απαρατήρητα στον πληθυσμό μ.Χ., ενώ τα κύτταρα μέσα στα σφαιροειδή NAD κατέδειξε ισχυρή τρισδιάστατη διάχυτη έκφραση του CA125 η οποία ήταν εμφανής σε περιφερικούς μεμβράνες ορισμένων κυττάρων (Σχήμα 3). Πολύ λίγες ΕρΟΑΜ-θετικών κυττάρων ήταν παρόντα στον πληθυσμό AD (Σχήμα 3). Σε αντίθεση, πυκνή χρώση περιφερειακή μεμβράνη για EpCAM παρατηρήθηκε σε όλες σχεδόν τις σφαιροειδή NAD. Διάχυτη κυτταροπλασματική χρώση ήταν παρούσα σε μερικά σφαιροειδή, αλλά η χρώση ήταν πολύ ισχυρότερη στα κύτταρα που ευθυγραμμίζουν την περιφέρεια των σφαιροειδών (Σχήμα 3). Από την άλλη πλευρά, η έκφραση του CD44 περιοριζόταν στην περιφέρεια των σφαιροειδών NAD και ανιχνεύθηκε σε κύτταρα που είχαν κινείται έξω από σφαιροειδή. Μια ισχυρή χρώση του CD44 ήταν εμφανής επί της μεμβράνης του σχεδόν όλα τα κύτταρα Αϋ (Σχήμα 3).

Καθώς οι ινοβλάστες του στρώματος και μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων (MSC) έχουν δειχθεί ότι μοιράζονται κοινές ιδιότητες [23], αξιολογήσαμε το έκφραση των κοινώς γνωστών δεικτών MSC (CD90, CD73 και CD105) τόσο NAD και πληθυσμούς AD δειγμάτων ασκίτη (Σχήμα 4). Διάσπαρτα διάχυτη χρώση FSP ήταν εμφανής στα κύτταρα Αϋ (Σχήμα 4). Λίγοι FSP-θετικά κύτταρα παρατηρήθηκαν σε σφαιροειδή NAD, και αυτά ήταν τα κύτταρα απομακρύνονται από τους σφαιροειδή. Ισχυρή έκφραση CD105 και CD90 ήταν παρούσα στα κύτταρα AD. Η έκφραση αυτών των πρωτεϊνών ανιχνεύθηκε σε όλο το κυτταρόπλασμα και στη μεμβράνη των κυττάρων του πλάσματος. Ασθενής έκφραση του CD73 ήταν παρούσα στα κύτταρα AD. Από την άλλη πλευρά, τα χαμηλά /όχι έκφραση του CD90 και CD73 παρατηρήθηκε σε σφαιροειδή NAD. Ωστόσο, χρώση CD105 ήταν εμφανής σε πολύ λίγα διάσπαρτα κύτταρα κινείται έξω από τα σφαιροειδή (Σχήμα 4).

Ποσοτική αξιολόγηση της επιλεκτικής Εκπρόσωπος Μαρκαδόροι στο επίπεδο του mRNA

Για να αξιολογηθεί περαιτέρω ποσοτικές διαφορές όσον αφορά το έκφραση των επιθηλιακών και μεσεγχυματικών δεικτών από το NAD και πληθυσμούς AD, συγκρίναμε τα επίπεδα έκφρασης του mRNA ορισμένων από τους δείκτες από την Q-PCR. Τα κύτταρα εντός των σφαιριδίων NAD επέδειξε ένα σημαντικά υψηλότερο επίπεδο έκφρασης της Ε-καδερίνης και ΕρΟΑΜ σε σύγκριση με κύτταρα Αϋ (ρ & lt? 0,01) (Σχήμα 5). Από την άλλη πλευρά, τα κύτταρα Αϋ έδειξε ένα επίπεδο σημαντικά υψηλό mRNA έκφραση του βιμεντίνη και ΜΜΡ9 σε σύγκριση με κύτταρα εντός των σφαιριδίων NAD (ρ & lt? 0,01, ρ & lt? 0,05) (Σχήμα 5). Η μέση έκφραση του Ν-καδερίνης, CD44 και ΜΜΡ2 εμφανίστηκε υψηλότερη από 2,5, 7 και 15 φορές αντίστοιχα στον πληθυσμό AD, αλλά δεν παρατηρήθηκε καμία σημασία (ρ & lt? 0,2, ρ & lt? 0,06, ρ & lt? 0,17). Η έκφραση των STAT3 και Oct4 ήταν σημαντικά υψηλότερη σε σύγκριση με το NAD πληθυσμός AD (ρ & lt? 0,05). (Εικόνα 5)

Αξιολόγηση πιθανής καρκινογένεσης του NAD και AD Πληθυσμοί με in vivo μοντέλο ποντικού

πειράματα ξενομοσχεύματος όγκου διεξήχθησαν για να προσδιοριστεί η ογκογόνο δυναμικό του NAD και πληθυσμών AD απομονώνονται από τον ασκίτη τριών ασθενών CR ​​με ip εμβολιασμό των 5 × 10

6 NAD ή AD κύτταρα ανά ποντίκι. Πέντε από τους έξι ποντικούς που έλαβαν ένεση με κύτταρα NAD (ως κυτταρικό εναιώρημα) (Σχήμα 6Α) ανέπτυξαν ασκίτη με συμπαγείς όγκους (& lt? 0,5 ​​cm

3) (n = 3) (Σχήμα 6C) ή μικρές βλάβες (n = 2) στο περιτόναιο. Παρατηρήθηκε μία όγκος λανθάνουσα περίοδο δώδεκα να δεκατέσσερα εβδομάδες μετά τη μεταμόσχευση. Όγκους βάρους 0,8 ± 0,2 g και ασκίτη (-0,5 ml) παρατηρήθηκαν σε όλες τις πέντε ποντίκια που ανέπτυξαν όγκους (Σχήμα 6C). Σε αντίθεση, δεν παρατηρήθηκαν όγκοι σε ποντίκια (η = 4) με ένεση με τον ίδιο αριθμό κυττάρων Αϋ ακόμη και είκοσι εβδομάδες μετά i.p.