Αφηρημένο

Ιστορικό

έκφραση microRNA σοβαρά διαταραχθεί στην καρκινογένεση, ωστόσο περιορισμένα στοιχεία είναι διαθέσιμα επικύρωση αποτελέσματα από τα μοντέλα κυτταρικής γραμμής σε ανθρώπινα κλινικά δείγματα καρκίνου. MicroRNA-21 (MIR-21) και microRNA-143 (MIR-143) έχουν προηγουμένως ταυτοποιηθεί ως απορυθμισμένη σημαντικά σε μια σειρά από καρκίνους συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας. Ο στόχος μας ήταν να διερευνήσουμε τα πρότυπα έκφρασης πολλών καλά μελετημένο είδος microRNA στην αυχενική δείγματα και να συγκρίνουν τα αποτελέσματα με τα δείγματα κυτταρική σειρά.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Εμείς μετράται η έκφραση του ΜΙΚ 21 και mir-143 σε 142, τομές παραφίνης (FFPE) του τραχήλου της μήτρας μπλοκ βιοψία ιστού φορμόλη-σταθερό, που συλλέγονται από Dantec Ογκολογικής Κλινικής, Ντακάρ, Σενεγάλη. ανάλυση έκφρασης microRNA πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας PCR δοκιμασίες σε πραγματικό χρόνο Taqman που βασίζονται. ανοσοϊστοχημική χρώση πρωτεΐνης πραγματοποιήθηκε επίσης να διερευνηθεί η έκφραση της πρωτεΐνης-στόχου σε 72 δείγματα. Βρήκαμε ότι mir-21 έκφρασης αυξήθηκε με επιδείνωση κλινική διάγνωση αλλά ότι mir-143 δεν συσχετιζόταν με ιστολογία. Αυτές οι παρατηρήσεις ήταν σε πλήρη αντίθεση με προηγούμενες αναφορές που αφορούν καρκίνο του τραχήλου κυτταρικές σειρές στις οποίες Mir-143 ήταν σταθερά κάτω ρυθμισμένα αλλά mir-21 σε μεγάλο βαθμό ανεπηρέαστη. Μπορούμε επίσης ταυτοποιηθεί, για πρώτη φορά, ότι η κυτταροπλασματική έκφραση πρωτεΐνης προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο 4 PDCD4? ένας γνωστός στόχος του mir-21) ήταν σημαντικά μικρότερη στις γυναίκες με διηθητικό καρκίνωμα του τραχήλου της μήτρας (ICC) σε σύγκριση με εκείνους με τραχηλική ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία (2-3) ή καρκινώματος

in situ

(CIN2-3 /CIS) , αν και δεν υπήρχε σημαντική συσχέτιση μεταξύ mir-21 και της έκφρασης PDCD4, παρά τις προηγούμενες μελέτες εντοπισμό PDCD4 μεταγραφή ως γνωστό στόχο mir-21.

Συμπεράσματα

Ενώ microRNA βιοδείκτες έχουν μια σειρά από πολλά υποσχόμενες χαρακτηριστικά, οι περισσότερες μελέτες σχετικά με τα επίπεδα έκφρασης σε κλινικά δείγματα ιστολογικά ορίζεται για τη διερεύνηση κλινική σημασία των μελετών που βασίζονται σε ανακάλυψη. Mir-21 μπορεί να έχει κάποια χρησιμότητα σε πρόβλεψης ελέγχου, δεδομένου ότι παρατηρείται μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ mir-21 επίπεδο έκφρασης και επιδείνωση ιστολογική διάγνωση του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας

Παράθεση:. Δευτεραίος G, Corrie SR, Feng Q, Morihara J, Stern J, Hawes SE, et al. (2011) Έκφραση του Mir-21 και Mir-143 σε δείγματα του τραχήλου της μήτρας κυμαίνονται από ιστολογικά φυσιολογικό μέσα σε διηθητικό καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. PLoS ONE 6 (12): e28423. doi: 10.1371 /journal.pone.0028423

Επιμέλεια: Alfons Navarro, Πανεπιστήμιο της Βαρκελώνης, Ισπανία

Ελήφθη: 22 του Απρίλη 2011? Αποδεκτές: 8, Νοεμβρίου του 2011? Δημοσιεύθηκε: 14 Δεκεμβρίου, 2011

Copyright: © 2011 Δευτεραίος et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς Αναγνωρίζετε τις συνεισφορές χρηματοδότηση από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας /Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου (ΝΙΗ /NCI) (R01 CA75920 και R01 CA115713? Δρ Kiviat) και η αμερικανική Αυστραλιανή Ένωση (Merck Company Foundation μεταδιδακτορικής έρευνας? Δρ Corrie). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή οι

στρατηγικές ανίχνευση πρώιμου καρκίνου βασίζεται στον προσδιορισμό και την επικύρωση των βιοδεικτών που είναι ιδιαίτερα ενδεικτικά της εξέλιξης της νόσου από φυσιολογικά ή προκαρκινικά ιστού σε πρώιμο διηθητικό καρκίνο. Τα microRNAs είναι μια ομάδα πρόσφατα ανακάλυψε σύντομο είδος RNA (-21 nt) που εμπλέκονται στην ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης σε έναν ιστό-ειδικό τρόπο, που επηρεάζουν πολυάριθμες κυτταρικές οδούς, συμπεριλαμβανομένων πολλαπλασιασμού, διαφοροποίησης και απόπτωσης [1]. Έχει δειχθεί ότι οι microRNAs παρεκκλίνοντα ρυθμίζονται σε διηθητικό καρκίνο, και μπορούν να ενεργούν ως καταστολείς όγκων ή ενισχυτές σε διαφορετικούς ιστούς και τα περιβάλλοντα [2]. πρόσφατη ανακάλυψη τους έχει οδηγήσει σε μια σειρά μελετών που αποσκοπούν στην ανακάλυψη νέων βιοδεικτών του καρκίνου (που επισκοπείται στο [3] – [5])., όμως λίγα έχουν επικυρωθεί σε κλινικά δείγματα, ιδιαίτερα εκείνες εκπρόσωπος της προ-καρκινική νόσο

τα microRNAs είναι αυξανόμενο ενδιαφέρον για τη διάγνωση του καρκίνου οφείλεται στην παρατήρηση ότι μια εκπληκτικά μικρή οικογένεια μορίων που μπορεί να προσφέρει εξαιρετική εξειδίκευση στην ταξινόμηση των τύπων ιστών, γεγονός που αντικατοπτρίζει την αναπτυξιακή καταγωγή και την κατάσταση διαφοροποίησης. Lu

et al.

Αξιοποιηθεί αυτό, χρησιμοποιώντας ένα πάνελ microRNA από 217 είδη για να ταξινομήσει καλά διαφοροποιημένο όγκους με υψηλά συμφωνία, ενώ σε συγκρίσιμη πίνακα mRNA που περιέχει ~16,000 είδη απέτυχε [6]. Περαιτέρω μελέτες έχουν δείξει τις δυνατότητες για microRNAs να γίνει διάκριση μεταξύ των υποτύπων καρκίνου όπου ιστολογική διάγνωση είναι πολύπλοκη ή αδύνατη, για τη διάγνωση όγκων άγνωστης προέλευσης και στη διάγνωση προδιάθεσης καρκίνου [4].

Οι έρευνες για τη χρήση των microRNAs ως βιοδείκτες για την έγκαιρη ανίχνευση του καρκίνου έχουν εντοπίσει έκπληξη αίματος και τη σταθερότητα των ιστών σε αντίθεση με mRNA [7], [8], και η ανάπτυξη των ιδιαίτερα ευαίσθητη και ειδική διαδικασίες qPCR είναι ενθαρρυντική. Ωστόσο, σε όλες τις περιπτώσεις μέχρι σήμερα, τα δείγματα εκχυλίζονται από ασθενείς που είχαν ήδη αναπτύξει καρκίνο [4], έτσι ώστε η χρησιμότητα του microRNA ως δείκτης της εξέλιξης του καρκίνου από προκαρκινικές μέχρι τις αρχές επεμβατική καρκινικές βλάβες παραμένει άγνωστη. Διερεύνηση της έκφρασης microRNA σε δείγματα που εκτείνονται σε όλο το φάσμα των ιστολογικά ορίζεται τύπους δειγμάτων, από την κανονική σε διηθητικό καρκίνο, είναι σαφές ότι απαιτείται να προσδιοριστεί σωστά τη χρησιμότητα των επιπέδων έκφρασης microRNA ως βιοδείκτες του καρκίνου.

Ο καρκίνος του τραχήλου είναι μια ασθένεια για την η οποία διαστρωμάτωση των ιστολογικών τύπων από το φυσιολογικό μέσα σε διηθητικό καρκίνωμα είναι καλά χαρακτηρίζεται και υποστηρίζεται από μοριακές τεχνικές που βασίζονται σε HPV γονότυπου. Ωστόσο, με δεδομένη την τεράστια επιτυχία των προγραμμάτων του τραχήλου της μήτρας, μόνο 35-65% CIN-3 /CIS, 12-20% CIN-2 και & lt? 5% των περιπτώσεων CIN-1 αναμένεται να προχωρήσουν σε πιο σοβαρές μορφές δυσπλασίας ή επεμβατικές καρκίνος – γεγονός που υποδηλώνει ότι οι δείκτες με υψηλότερη προγνωστική αξία για την εξέλιξη θα ήταν ιδιαίτερα επιθυμητό [9], [10]. Ως εκ τούτου, εντοπίστηκαν τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας ως ιδανική περίπτωση δοκιμής για την οποία θα ακολουθήσει τις αλλαγές σε συγκεκριμένα επίπεδα εκφράσεις microRNA από την κανονική μέσω προκαρκινικών και καρκινικών ιστών. Προηγούμενες μελέτες έχουν εντοπίσει μια σειρά από ρυθμιζόμενα με αποκλίνοντα microRNAs στον καρκίνο του τραχήλου κυτταρικές σειρές, με Mirs-127, 9, 203, 199α, 218, 21, 143, 205, 214,126, 15β, 16, 146α και 155 από τα πιο κοινά [3 ], [11] – [17]. Ωστόσο, μόνο μία από αυτές τις μελέτες που περιλαμβάνονται προκαρκινικών κολπικών δειγμάτων (CIN1-3), όπου η υψηλή βιολογική μεταβλητότητα παρατηρήθηκε στα επίπεδα έκφρασης microRNA, ειδικά σε φυσιολογικά δείγματα (έστω και με μικρά μεγέθη δείγματος) [16].

σε αυτή τη μελέτη ερευνήσαμε τα προφίλ έκφραση δύο microRNAs (MIR-21 και Mir-143) και έχουν επικυρωθεί προηγουμένως πρωτεΐνες-στόχους τους σε κλινικά δείγματα από γυναίκες με λοίμωξη HPV χωρίς αλλοιώσεις, με ιστολογικά διάγνωση προκαρκινικών αλλοιώσεων, ή με διηθητικό καρκίνο ( ICC), καθώς και φυσιολογικούς ελέγχους χωρίς λοίμωξη HPV. Οι αλληλουχίες επιλέχθηκαν με βάση τα προηγούμενα ευρήματα από άλλες ομάδες εντοπισμού σημαντικών απορρύθμισης σε ένα αριθμό του τραχήλου της μήτρας καρκινικών κυτταρικών σειρών και κάποιες περιορισμένες κατεψυγμένα δείγματα [12]. Πρωταρχικός στόχος μας ήταν να προσδιοριστεί αν υπήρχαν σημαντικές συσχετίσεις ανάμεσα στην έκφραση microRNA και ιστολογικό τύπο που θα μπορούσε να δείχνουν πιθανό ρόλο για microRNA ως πρώιμο δείκτη της ογκογόνο δυναμικό των προ-αλλοιωμένου HPV μόλυνσης και /ή της προόδου της προκαρκίνου σε καρκίνο. Δεύτερον, σε σύγκριση έκφραση microRNA σε κλινικά δείγματα και καρκινικές κυτταρικές γραμμές για να προσδιοριστεί εάν κυτταρικές σειρές θα πρέπει να εξακολουθήσουν να χρησιμοποιούνται ως βάση για κλινικές έρευνες. Εντοπίσαμε μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης mir-21 και ιστολογική διάγνωση, αλλά καμία συσχέτιση με mir-143. Ερευνήσαμε επίσης την έκφραση των γνωστών πρωτεϊνών mir-21-στόχου (PDCD4, PTEN (φωσφατάση και tensin ομόλογο), TPM1 (tropomyosin 1)), με ανάλυση ανοσοϊστοχημείας και προσδιόρισε μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ της κυτταροπλασματικής έκφρασης PDCD4 και ιστολογική διάγνωση. Εντοπίσαμε διαφορές μεταξύ των κλινικών δειγμάτων και του τραχήλου της μήτρας καρκινικές κυτταρικές σειρές, γεγονός που υποδηλώνει ότι κλινικά δείγματα πρέπει να διερευνηθεί για σκοπούς επικύρωσης μετά την ανακάλυψη των υποψηφίων βιοδεικτών σε μελέτες ανακάλυψη εστιασμένη κυτταρική σειρά.

Αποτελέσματα

microRNA έκφραση σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του τραχήλου της μήτρας

Ερευνήσαμε την έκφραση του mir-21 και Mir-143 σε καρκίνο του τραχήλου κυτταρικές γραμμές σε σχέση με το (Normal (HRHPV-), προκειμένου να επιβεβαιώσει τις προηγούμενες παρατηρήσεις. το Σχήμα 1 δείχνει ότι για και οι τρεις καρκινικές κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν (SiHa, CaSki, HeLa), δεν υπήρχε σταθερή διαφορά μεταξύ mir-21 έκφρασης και εκείνη των κανονικών δειγμάτων. Ωστόσο, Mir-143 έκφραση και των τριών καρκινικών κυτταρικών γραμμών μειώθηκε ουσιαστικά σε σχέση με κλινικά δείγματα Ωστόσο, δεν έχουμε επισυνάπτεται στατιστική ανάλυση για τις συγκρίσεις αυτές, λόγω των διαφορετικών κατανομών σφάλμα μεταξύ κλινικών δειγμάτων και κυτταρικών σειρών, και επειδή θα είχαμε μόνο

n

= 3 στην περίπτωση των κυτταρικών γραμμών για σύγκριση.

Mir-143 ήταν σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται και στις τρεις καρκίνο του τραχήλου κυτταρικές σειρές, σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες. Ωστόσο, mir-21 δεν ήταν σημαντικά διαφορετική από τις συνήθεις δείγματα, αν και σε προηγούμενες μελέτες mir-21 έχει παρατηρηθεί ότι είναι σημαντικά επάνω ρυθμισμένη στις ίδιες κυτταρικές σειρές.

Η

έκφραση microRNA σε κλινικές δείγματα

σε αντίθεση με τα δεδομένα κυτταρική γραμμή, παρατηρήσαμε μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ mir-21 έκφρασης και ιστολογικός τύπος σε κλινικά δείγματα, αλλά καμία συσχέτιση για Mir-143 (Σχήμα 2 και Πίνακας 1). Οι γυναίκες με ICC έδειξαν σημαντικά αυξημένα επίπεδα έκφρασης mir-21 σε σύγκριση με τις γυναίκες με CIS /CIN2-3, CIN1, κανονική (HRHPV +) και φυσιολογικά (HRHPV-) (ANOVA,

σ

& lt? 0,0001). Επιπλέον, οι γυναίκες με CIS /CIN2-3 είχαν οριακά αυξημένα επίπεδα έκφρασης mir-21 σε σύγκριση με τις γυναίκες με CIN1 (

p

u

= 0,14 και

p

ένα

= 0,24 ) και φυσιολογικά (HRHPV +) (

p

u

= 0,07 και

p

ένα

= 0,14). Βρήκαμε καμία συσχέτιση μεταξύ της ηλικίας ή κατάστασης HRHPV και ιστολογικού τύπου (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Μια αποκοπής 5,06 καλύτερες πληθυσμοί διακρίνονται ICC /Κανονική (HPV-) (που προσδιορίζεται από την καμπύλη ROC) και ήταν 91% ευαισθησία και 87% ειδικά. Το Σχήμα 2 δείχνει πως ότι αποκοπής πήγαν για τις άλλες δύο ομάδες ιστολογία. Μόνο το 5% των δειγμάτων από γυναίκες που είναι Normal (HPV +), το 7% των CIN 1, και 24% των δειγμάτων CIN 2-3 /CIS είχε MIR-21 τιμές μεγαλύτερες από 5,06. Είναι ενδιαφέρον ότι, το 13% των δειγμάτων από γυναίκες με φυσιολογική (HPV-) ιστολογία έδειξε mir-21 επίπεδο έκφρασης μεγαλύτερο από 5,06.

Σε αντίθεση με τα στοιχεία κυτταρική σειρά που παρουσιάζονται στο Σχήμα 1, παρατηρήσαμε μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ αυξημένο mir-21 έκφρασης μια επιδείνωση ιστολογική διάγνωση, ωστόσο υπάρχουν σημαντικές ενώσεις για mir-143. Υπήρξε μια σημαντική διαφορά μεταξύ όλων των ιστολογικών ομάδων (ANOVA,

σ

-τιμή & lt? 0.0001) και επιπλέον, οι γυναίκες με CIS /CIN2-3 είχε οριακά υψηλότερα επίπεδα έκφρασης mir-21 σε σύγκριση με εκείνους που έχουν ταξινομηθεί ως Κανονικό /HRHPV + (

p

u

= 0.0375

p

ένα

= 0,0563).

η

PDCD4, PTEN και TPM1

έκφρασης

προκειμένου να διερευνηθεί η επίδραση της mir-21 απορρύθμιση επί της έκφρασης πρωτεΐνης-στόχου ιστο-ειδική σε κλινικά δείγματα, μετρήθηκε επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης PDCD4 και ΡΤΕΝ με ανοσοϊστοχημεία (IHC) σε 72 από τα δείγματα δοκιμάζονται για mir-21 έκφραση . έκφραση TPM1 αξιολογήθηκε σε ένα υποσύνολο των δειγμάτων, όμως το επίπεδο της έκφρασης TPM1 σε τραχηλικό επιθήλιο βρέθηκε να είναι κάτω από το όριο ανίχνευσης με ανοσοϊστοχημεία. Παρατηρήσαμε μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ κυτταροπλασματικής PDCD4 (cPDCD4) έκφραση και δείγμα ιστολογία (Πίνακας 2, Σχήμα 3 και Σχήμα 4). Τα δείγματα από τις γυναίκες με ΔΠΔ είχαν σημαντικά χαμηλότερη έκφραση cPDCD4 σε σύγκριση με εκείνους με CIN2-3 /CIS (pu = 0,0005 ή pa = 0,003) και οριακά χαμηλότερη έκφραση σε σύγκριση με το (HRHPV +) (

p

u

= 0.03 ή

p

ένα

= 0,11). Οι γυναίκες στην ομάδα με φυσιολογική (HRHPV-) είχαν σημαντικά χαμηλότερη έκφραση cPDCD4 σε σύγκριση με το CIS /CIN2-3 (

p

u

= 0.005 ή

p

ένα

= 0,02) . Υπάρχουν επίσης φαινόταν να είναι μια οριακή μείωση στην πυρηνική PDCD4 (nPDCD4) σε γυναίκες με ΔΠΔ σε σύγκριση με εκείνους με CIN2-3 /CIS. Δεν υπήρχε σημαντική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης PDCD4 (πυρηνική ή κυτταροπλασματική) και mir-21 έκφραση σε αυτά τα δείγματα, όμως παρατηρήσαμε μια γενική ομαδοποίηση των ICC με υψηλή mir-21 αλλά όχι PDCD4, και CIN-2,3 /CIS με υψηλότερες PDCD4 αλλά μη-αυξημένα mir-21 (Σχήμα 4). Επίσης δεν υπήρχε συσχέτιση ανάμεσα στην έκφραση της πρωτεΐνης PTEN και ιστολογία του δείγματος ή έκφραση microRNA. Θεωρήσαμε ανάλυση IHC τόσο από την συχνότητα της μέγιστης βαθμολογίας ένταση και τη συχνότητα του κυρίαρχο βαθμολογίας ένταση. Ωστόσο, παρατηρήσαμε παρόμοια αποτελέσματα σε σχέση με την ανάλυση σύνθετη βαθμολογία και αποφασιστική, δεν υπάρχει πλεονέκτημα για τη χρήση της συχνότητας των βαθμολογιών έντασης πάνω από τα σύνθετα αποτελέσματα.

Η

Εδώ παρατηρήσαμε μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ της κυτταροπλασματικής έκφρασης PDCD4 και ιστολογία δείγμα.

η

Συζήτηση

Ενώ microRNA προφίλ έκφρασης έχει αποδειχθεί ότι είναι εξαιρετικά ειδικό για την πληκτρολόγηση του καρκίνου, η διάγνωση των όγκων και τον εντοπισμό όγκων άγνωστης προέλευσης, δεν είναι ακόμη σαφές εάν microRNAs μπορεί να εκτελέσει ως δείκτες της εξέλιξης της νόσου – μια κρίσιμη απαίτηση για προσδιορισμό εκείνων των συνθηκών που απαιτούν θεραπεία. Στην ιδανική περίπτωση, τέτοιες δείκτες προόδου θα δείξει συστηματικές μεταβολές στην έκφραση σε προκαρκινικές ιστούς, οι οποίοι συσχετίζονται με την εξέλιξη της νόσου σε διηθητικό καρκίνο. Σαφώς, αυτό απαιτεί πρόσβαση σε μεγάλο αριθμό κλινικών δειγμάτων που καλύπτουν το φάσμα των ιστολογικά καθορισμένων τύπων ιστών που εμπλέκονται στην εξέλιξη της νόσου. Σε αυτή τη μελέτη ερευνήσαμε τα επίπεδα έκφρασης των δύο βασικών Τα microRNAs εντοπίστηκαν στη βιβλιογραφία (και επικυρωμένες στόχους τους σε πρωτεΐνες) σε τραχηλικού ιστού στρωματοποιημένη με ιστολογική διάγνωση, προκειμένου να καθοριστεί η χρησιμότητά τους ως βιοδείκτες για την έγκαιρη διάγνωση του καρκίνου. Βρήκαμε ότι mir-21 έκφραση αυξήθηκε σημαντικά μόνο σε ICC σε σχέση με άλλα κλινικά δείγματα και ότι η έκφραση mir-143 δεν συσχετίζονται με ιστολογία καθόλου. Ο καρκίνος του τραχήλου κυτταρική γραμμή έχει ως αποτέλεσμα, ενώ συνεπής με προηγούμενες μελέτες στις ίδιες κυτταρικές σειρές, φάνηκε να δώσει ασύμφωνα αποτελέσματα έκφραση microRNA σε σύγκριση με κλινικά δείγματα. Είναι ενδιαφέρον ότι, η έκφραση της πρωτεΐνης PDCD4 αυξήθηκε σε προκαρκινικές αλλοιώσεις τότε μειώθηκε σημαντικά το ICC, πιθανώς ως αποτέλεσμα της mir-21-επαγόμενη σίγηση. Τα αποτελέσματα αυτά υπογραμμίζουν την ανάγκη για περαιτέρω μελέτες με επίκεντρο προφίλ ιστού κατά προτίμηση σε κυτταρικές σειρές, όπου τα επίπεδα έκφρασης των υποψηφίων microRNA βιοδεικτών μπορεί να εκτιμηθεί σε προ-καρκινική νόσο, όπου η χρησιμότητά τους στη διάγνωση του καρκίνου θα αποδειχθεί πιο επωφελής. Εμείς εντοπίστηκαν σημαντικές αντιφάσεις στο προφίλ έκφρασης microRNA σε κλινικά δείγματα μας σε σύγκριση με καρκίνο του τραχήλου κυτταρικές σειρές. Ωστόσο, πρόσφατες έρευνες δείχνουν σημαντικές διαφορές στην έκφραση microRNA με βάση τις συνθήκες καλλιέργειας κυττάρων που υποδηλώνει ότι τα πειράματα κυτταρική γραμμή δεν μπορεί να είναι ιδιαίτερα κατατοπιστική, όταν ψάχνουν για κλινικά σχετική microRNAs [12]. Cheng

et al.

2005 [18] έδειξε σημαντική αύξηση στην ανάπτυξη HeLa κυττάρων και τον πολλαπλασιασμό σε απόκριση προς την αναστολή της mir-21, ενώ Yao

κ.ά.

2009 [14] έδειξε σημαντική μείωση στην κυτταρική ανάπτυξη και πολλαπλασιασμό για την ίδια θεραπεία. Wang

et al

2008 [12] έδειξε περαιτέρω ότι η αλλαγή των συνθηκών καλλιέργειας από την μονοκαλλιέργεια σε έναν πολιτισμό σχεδία αναστολή οδήγησε σε ένα εντελώς διαφορετικό σύνολο σημαντικά απελευθερωμένης microRNAs. Παρόμοια αντικρουόμενα αποτελέσματα έχουν παρατηρηθεί σε άλλες μελέτες που διερευνούν τη σημασία των προτύπων καλλιέργειας κυττάρων σε σύγκριση με το

in vivo

ιστό των πολιτισμών σφαιροειδή [19], [20]. Επίσης, άλλες διαφορές έκφρασης γονιδίου /πρωτεΐνης έχουν πρόσφατα ταυτοποιηθεί, συμπεριλαμβανομένης της παρουσίας έκφρασης WNT5A σε γαστρικών καρκίνων (δεν εκφράζεται σε κυτταρικές γραμμές) [21] και οι διαφορές στην μεθυλίωση του DNA [22] και την γονιδιακή έκφραση [23] υπογραφών μεταξύ ορθοκολικά καρκινώματα και του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές. Σαφώς, ένα βασικό πρόβλημα με την προσέγγιση κυτταρική γραμμή είναι ότι οι πιθανοί βιοδείκτες πιστοποιήθηκε σε κύτταρα αθανατοποιημένα από διηθητικό καρκίνο – είναι συχνά εντελώς άγνωστο αν αυτές οι βιοδείκτες μπορούν να ανιχνευθούν σε προκαρκινική ασθένεια, η οποία απαιτεί την ανάλυση κλινικών δειγμάτων. Μια περαιτέρω επιπλοκή στην παρούσα μελέτη μπορεί να είναι η φυλετική φόντο (Δυτικής Αφρικής), σε σύγκριση με καρκινικές κυτταρικές σειρές οι οποίες είναι Καυκάσου – όμως ελάχιστα στοιχεία είναι γνωστά για αυτή τη μεταβολή

Η αυξημένη έκφραση mir-21 έχει ταυτοποιηθεί σε. ένας μεγάλος αριθμός τύπων όγκων [24] – [29] και σε αυτή τη μελέτη έδειξε σημαντική συσχέτιση με την ανάπτυξη ιστολογικά καθορισμένες ICC. Επιπλέον, τα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι η mir-21 μπορεί να έχει κάποια χρησιμότητα στην πρόβλεψη της εξέλιξης της προ-καρκινικές βλάβες σε ICC, οι γυναίκες με υψηλή mir-21 τιμές μπορεί να αναμένεται για την πρόοδο. Ωστόσο, απαιτούνται περαιτέρω μελέτες που περιλαμβάνουν μεγαλύτερα μεγέθη δειγμάτων και παρακολούθηση των ασθενών απαιτείται να ερευνήσει αυτό το θέμα, καθώς υπάρχουν σαφώς ανεπαρκή στοιχεία για την ορθή διεξαγωγή των δοκιμών αυτής της υπόθεσης από τη διάσπαση στην εκπαίδευση και σύνολα δοκιμών. Επιπλέον, ενώ τα επίπεδα έκφρασης mir-21 των γυναικών με φυσιολογική παθολογία με και χωρίς λοίμωξη HRHPV δεν είναι στατιστικά διαφορετικά, η ομάδα HRHPV- έδειξε περίπου το διπλάσιο του αριθμού των δειγμάτων πάνω από την βέλτιστη cut-off σε σύγκριση με την HRHPV + ομάδα. Η σημασία αυτού του αποτελέσματος είναι και πάλι δύσκολο να ποσοτικοποιηθεί λόγω των σχετικά χαμηλών μεγέθη δειγμάτων που εμπλέκονται, αλλά μπορεί να υποδεικνύουν ότι ένα πάνελ βιοδεικτών μπορεί να είναι αναγκαία για να βοηθήσουν τη μείωση των ψευδών θετικών αποτελεσμάτων.

Ένας αριθμός μελετών έχουν προσδιορίσει mir -143 υποεκφράζεται ως σημαντικά στον καρκίνο, συμπεριλαμβανομένου του μαστού και του τραχήλου της μήτρας [12], [17], [30]. Ενώ παρατηρήθηκε επίσης σημαντική υποέκφραση στον καρκίνο του τραχήλου κυτταρικές σειρές σε σχέση με την κανονική (HRHPV-) δείγματα, δεν βρήκαμε καμία στατιστικά σημαντική συσχέτιση σε σχέση με κλινικά δείγματα από τις γυναίκες σε ένα ευρύ φάσμα της νεοπλασματικής νόσου. Προηγούμενες μελέτες που διερευνούν την έκφραση microRNA στην αυχενική δείγματα δείχνουν και πάλι αντικρουόμενα αποτελέσματα. Lee

et al

2008 [11] δεν περιλαμβάνουν ούτε mir-21 ή mir-143 στην αρχική πειράματα ελέγχου τους και ως εκ τούτου δεν προσδιόρισε τα είδη αυτά, ως εμπλεκόμενο στην ανάπτυξη του καρκίνου? Αυτό αναδεικνύει μια σαφή πρόκληση για τον εντοπισμό πιθανών βιοδεικτών, στις περιπτώσεις που αγνοούνται κορυφαίους υποψηφίους. Ωστόσο, ο Wang

et al

2008 [12] πρότεινε ότι η μείωση του mir-143 που απαιτούνται για την ανάπτυξη των όγκων, ενώ Lui

et al

2007 [17] έδειξαν μικτά αποτελέσματα για mir-143, κυρίως λόγω του χαμηλού επιπέδου έκφρασης ανιχνεύθηκε στα φυσιολογικά ή καρκινικά δείγματα. Ασυνέπειες μπορεί να οφείλεται στο σχετικά χαμηλό επίπεδο έκφρασης mir-143 στην αυχενική ιστούς, που μπορεί να απαιτήσει μια πιο ακριβή μέθοδο εκχύλισης (

π.χ.

μικροδιατομής λέιζερ) για την εξόρυξη του όγκου – καμία από τις μελέτες που αναφέρονται εδώ χρησιμοποιούνται τέτοιες μέθοδοι.

Προηγούμενες μελέτες αποκάλυψαν ότι PDCD4, PTEN και TPM1 είναι όλες οι μεταγραφές στόχαστρο mir-21 σε διάφορους ιστούς [14], [17], [24], [26], [31], [32] και ότι ΡΤΕΝ προοδευτικά υποεκφράζεται από φυσιολογικό ιστό μέσω σε καρκίνο του τραχήλου [33] – [35]. Μία πρόσφατη μελέτη ανέφερε επίσης μειωμένη έκφραση PDCD4 σε καρκίνο του τραχήλου κυτταρικές γραμμές [14], η οποία βρίσκεται σε συμφωνία με τα ευρήματά μας στα κλινικά δείγματα που εξετάστηκαν σε αυτή τη μελέτη. Στην πραγματικότητα, πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει όχι μόνο μια άμεση σχέση μεταξύ της έκφρασης PDCD4 και την εξέλιξη του όγκου (Wei

et al

, 2009 [36]), αλλά και το βασικό ρόλο της PDCD4 και mir-21 σε αποπτωτικά φλεγμονώδη απόκριση (Sheedy

et al

, 2009 [37]). Επιπλέον, πρόσφατες μελέτες μοντέλο κύτταρο υποστηρίζουν προτείνουν ένα ρόλο για την απώλεια της έκφρασης PDCD4 σε αυξημένη ευαισθησία των κυττάρων σε παράγοντες που προκαλούν βλάβη του DNA (Singh

κ.ά.

, 2009 [38]), τα οποία θα αναμένεται να παρέχουν ευνοϊκές συνθήκες για την ανάπτυξη του όγκου. Ποντίκια που εκφράζουν υψηλά επίπεδα PDCD4 είναι επίσης πιο ανθεκτικά στην ανάπτυξη του όγκου σε σύγκριση με φυσιολογικούς μάρτυρες. Υποθέτουμε ότι η έκφραση cPDCD4 (και, σε μικρότερο βαθμό, έκφραση nPDCD4) είναι αυξημένη σε προκαρκινικές δείγματα λόγω της αυξημένης απόπτωσης, ακολουθούμενη από μία απότομη μείωση στην έκφραση για δείγματα ICC, όπου ανατρέπονται αποπτωτικών μηχανισμών. Παρόμοιες τάσεις παρατηρήθηκαν για άλλα γονίδια καταστολέα όγκου σε σχέση με ογκογένεση και την απόπτωση [39], [40]. Είναι ενδιαφέρον, δεν εντόπισε οποιαδήποτε συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης ΡΤΕΝ και ιστολογική διάγνωση? απώλεια έκφρασης έχει παρατηρηθεί προηγουμένως, και έχουμε παρατηρήσει χαμηλότερη έκφραση σε μια μελέτη του καρκίνου του μαστού χρησιμοποιώντας τις ίδιες μεθόδους (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Σε αυτή τη μελέτη έχουμε βρει ότι το επίπεδο έκφρασης της mir-21 είναι συσχετίστηκε σημαντικά με ιστολογική διάγνωση του ΔΠΔ. Ένα γνωστό στόχος της mir-21, PDCD4 επίσης ρυθμίζεται προς τα κάτω, αλλά δεν συσχετιζόταν σημαντικά με mir-21 έκφρασης. Έκφραση mir-143 δεν συσχετιζόταν με ιστολογική διάγνωση κλινικών δειγμάτων, ωστόσο ήταν σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται σε καρκίνο του τραχήλου κυτταρικές σειρές. Τα ευρήματα αυτά είναι σημαντικά για την αναζήτηση για να μετρηθεί η χρησιμότητα των microRNA βιοδεικτών για διαγνωστικές εφαρμογές, ένα βασικό συστατικό της οποίας είναι να μετρήσει τα επίπεδα έκφρασης σε προκαρκινικές ιστούς καθώς και κανονική και διηθητικού καρκίνου. Σαφώς, το μελλοντικό έργο πρέπει να επικεντρωθεί σε κλινικά σχετικών δειγμάτων, στην οποία μπορεί να προσδιοριστεί πρόβλεψης δείκτες εκφράζονται σε προ-καρκινικό ιστό για περαιτέρω επικύρωση.

Υλικά και Μέθοδοι

Η επιλογή των microRNAs

Mirs διερευνήθηκαν σε αυτή τη μελέτη επιλέχθηκαν με βάση τις προηγούμενες παρατηρήσεις στη βιβλιογραφία (Πίνακας 3). Εμείς διευκρινίζεται ότι κάθε microRNA θα πρέπει επίσης να έχουν πειραματικά επαληθευτεί στόχο mRNA ή το σύνολο των γονιδίων στόχων και τουλάχιστον μία από τις προβλεπόμενες στόχους έπρεπε να αναφέρονται ως εμπλέκεται στην ογκογένεση και την εξέλιξη σε αυχενικό ή άλλα νεοπλάσματα (με βάση τις αλληλουχίες στη βάση δεδομένων miRBase [ ,,,0],41] – [43]). MiR-21 έχει αναφερθεί ότι υπερεκφράζεται σε έναν αριθμό καρκίνων [29], [44] και τους στόχους μεταγραφές του

ΡΤΕΝ

[24],

TPM1

[26] και

PDCD4

[14], [31], [32] τα γονίδια, ενώ miR-143 υποεκφράζεται σε πολλούς καρκίνους και στόχων

ERK5

μεταγραφές [17], [29], [30]. Τόσο mir-21 υπερέκφραση και Mir-143 υποέκφραση έχουν παρατηρηθεί σε καρκίνο του τραχήλου κυτταρικές γραμμές και κλινικών δειγμάτων [12], [17].

Η

Δείγματα

Κλινικά δείγματα συλλέχθηκαν από η Dantec Ογκολογικής Κλινικής, Ντακάρ της Σενεγάλης από τις μελέτες του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας [45]? όλες οι διαδικασίες μελέτης εγκρίθηκε από τα θεσμικά συμβούλια αναθεώρηση του Πανεπιστημίου της Ουάσιγκτον (Σιάτλ, WA) και το Πανεπιστήμιο του Ντακάρ (Ντακάρ, Σενεγάλη) και ενημέρωσε γραπτή συγκατάθεση δόθηκε από τους συμμετέχοντες της μελέτης. Οι ιστολογικές διαγνώσεις παρήχθησαν στο Πανεπιστήμιο της Ουάσιγκτον, Τμήμα Παθολογίας, Harborview Ιατρικό Κέντρο, Seattle, WA από έναν παθολόγο (NBK). Δείγματα που συλλέγονται περιλαμβάνονται 142 του τραχήλου της μήτρας βιοψίες διατηρηθεί ως μπλοκ ιστού FFPE. HPV γονοτυπική διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [46], με υψηλού κινδύνου HPV (HRHPV) υποτύπους HPV16 /18/26/31/33/35/39/45/51/52/53/56/58/59/66 /67/68/73/82 όπως ορίζεται από Munoz

et. al.

2006 [47]. Κλινικά δείγματα ομαδοποιούνται σύμφωνα με ιστολογική διάγνωση, με ομάδες που ορίζονται από τα θεραπευτικά σχήματα ανά ισχύουσες κατευθυντήριες γραμμές [48]. Κανονική (HRHPV-) προσδιόρισε αυτές τις γυναίκες με φυσιολογική ιστολογία και ένα αρνητικό αποτέλεσμα της δοκιμής για HRHPV (

n

= 23). Κανονική (HRHPV +) έδειξε αυτές τις γυναίκες με φυσιολογική ιστολογία και ένα θετικό τεστ για HRHPV (

n

= 21). Ήπια δυσπλαστικών βλαβών CIN 1 (

n

= 15) συνήθως αυθόρμητα υποχωρούν και οι γυναίκες με αυτές τις αλλοιώσεις που συνήθως ακολουθείται με επανάληψη τεστ Παπανικολάου. Οι γυναίκες με προκαρκινικές CIN2-3 /βλάβες CIS (

n

= 51), όλοι θα πρέπει να παραπέμπονται για θεραπεία για την πρόληψη της ανάπτυξης της διεισδυτικής νόσου ΔΠΔ (

n

= 23). Αυτές οι ομάδες μας επέτρεψε να καθοριστεί εάν οι βιοδείκτες microRNA υπό έρευνα θα μπορούσε να εντοπίσει διάφορα στάδια της νεοπλασματικής νόσου που απαιτούν διαφορετική κλινική διαχείριση. Ο μέσος όρος ηλικίας των 133 ατόμων από την οποία χρησιμοποιήθηκαν κλινικά δείγματα ήταν 44, από 29 έως 72 χρόνια. Όλες οι τέσσερις ιστολογική ομάδες ήταν η συχνότητα συμφωνημένα στην ηλικία προκειμένου να επιτευχθούν παρόμοιες κατανομές ηλικίας και μέσα, τα οποία κυμάνθηκαν μεταξύ 43 και 45 ετών. Οι κυτταρικές σειρές και τα μέσα καλλιέργειας αγοράσθηκαν από την ATCC και Gibco (Invitrogen, Carlsbad, CA).

microRNA qPCR έκφραση ανάλυση

Άντληση microRNA από μπλοκ διεξήχθη χρησιμοποιώντας το RecoverAll Σύνολο Nucleic Acid Kit Απομόνωση (Applied Biosystems, Foster City, CA), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η μόνη αλλαγή ήταν ότι για την εξαγωγή κυτταρική σειρά, τα βήματα αποπαραφίνωση παραλείφθηκαν με τη συμβουλή του προσωπικού Applied Biosystems. Αντιδράσεις αντίστροφης μεταγραφής (RT) και ποσοτικές αντιδράσεις αλυσίδας πολυμεράσης (qPCR) διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας το microRNA TaqMan Reverse Transcription Kit και το TaqMan microRNA δοκιμασίες (Applied Biosystems) για mir-21, mir-143 και ελέγχου RNU6B shRNA. RT και qPCR για την ανάλυση RNU6B ελέγχου shRNA διεξήχθη side-by-side με ΜΙΚ-21 και Mir-143 αντιδράσεις για κάθε δείγμα. Μία πρότυπη καμπύλη που δημιουργείται από την εκχύλιση του ολικού RNA από κύτταρα VK2 και εκτελώντας αντιδράσεις RT επί 10-φορές αραιώσεις, ακολούθως συμπεριλαμβανομένης κάθε σειριακή αραίωση σε κάθε πείραμα qPCR, καθ ‘όλη τη μελέτη.

Ανοσοϊστοχημεία

PDCD4 πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού και TPM1 μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού αγοράστηκε από Abcam (Abcam Inc., Cambridge ΜΑ, ab51495, ab17784 αντίστοιχα), ΡΤΕΝ μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού αγοράστηκε από την Dako (Dako Corporation? Carpinteria, CA, κλώνος 6H2.1) Τέσσερα τμήματα micron από σταθεροποιημένο με φορμαλίνη εγκλεισμένο σε παραφίνη ιστό κόπηκαν και τοποθετήθηκαν σε πλακίδια μικροσκοπίου Superfrost Plus. Οι τομές ιστού αποπαραφινοποιήθηκαν και επανυδατώθηκαν μέσα από μια σειρά βαθμονομημένων αλκοολών. Το αντιγόνο ανάκτηση διεξήχθη με Tris /EDTA ρΗ 9.0 ρυθμιστικό σε αυτόκλειστο επιτραπέζια. Η ενδογενής δραστικότητα υπεροξειδάσης αποκλείστηκε με 3% Η

2O

2. Πρωτογενή αντισώματα μεταβάλλονται για να προσδιοριστεί η βέλτιστη συγκέντρωση του αντισώματος με αποτέλεσμα την πιο έντονη χρώση χωρίς φόντο. Αντισώματα για PDCD4 αραιώθηκαν 1:2000 και ΡΤΕΝ αντίσωμα αραιώθηκε σε 1:500 και εφαρμόστηκε σε κάθε διαφάνεια. TPM1 αντίσωμα αραιώθηκε σε 1:100.The πλακίδια πλύθηκαν σε ImmPRESS (Vector Laboratories? Burlingame, CA), εφαρμόστηκε στη συνέχεια ένα αντι-ποντικού (για ΡΤΕΝ και TPM1) και ένα αντι-κουνελιού (για PDCD4) IgG πολυμερισμένο ένζυμο ανταποκριτή σε κάθε ιστό. Η ανάπτυξη χρώματος επιτεύχθηκε με επώαση σε διαμινοβενζιδίνη (Dako). Τα πλακίδια αντιχρωματίστηκαν σε αιματοξυλίνη (Dako), αφυδατώθηκαν μέσω βαθμιδωτών αλκοολών, καθαρίστηκαν σε ξυλόλιο και καλύφθηκαν με μόνιμα μέσα στερέωσης. Ένας αρνητικός μάρτυρας ιστός τρέχει σε κάθε ιστό, όπου ρυθμιστικό αραιωτικό αντισώματος υποκαταστάθηκε για το πρωτογενές αντίσωμα. Επιπλέον, θετική ιστούς έλεγχος που είναι γνωστό ότι εκφράζουν το αντιγόνο υπό εξέταση διεξήχθησαν σε συνδυασμό με κάθε παρτίδα διαφάνειες. PDCD4 και χρώση PTEN αξιολογήθηκε ημι-ποσοτικά χρησιμοποιώντας τη μέθοδο βαθμολόγησης H-score [49]. Αυτή η μέθοδος ποσοτικού προσδιορισμού λαμβάνει υπόψη την ένταση χρώσης και το ποσοστό των κυττάρων που χρωματίζονται σε μια συγκεκριμένη ένταση. Χρώση ένταση βαθμολογήθηκε ως 0 (καθόλου χρώση), 1 (ασθενής χρώση), 2 (μέτρια χρώση), 3 (έντονη χρώση). Κάθε όρος της έντασης πολλαπλασιάστηκε με το ποσοστό των κυττάρων που χρωματίζονται σε αυτό το επίπεδο. Οι προκύπτουσες τιμές αθροίζονται για να δώσουν ένα σύνθετη βαθμολογία που κυμαίνεται από 0 έως 300. PDCD4 και ΡΤΕΝ έκφραση αξιολογήθηκε τόσο στα πυρηνικά και κυτταροπλασματικά τμήματα.

Στατιστικές Μέθοδοι

αντιδράσεις Taqman qPCR πραγματοποιήθηκαν σε τριπλούν πλεονασμός και οι τιμές Ct μετατρέπεται σε μία αναλογία σε σχέση με τον έλεγχο RNU6B. έλεγχοι μη-καρκίνου ήταν ίδιας ηλικίας σε περιπτώσεις με διηθητικό καρκίνο του συχνότητα. Τιμές των δύο microRNAs ήταν log

10-μετασχηματιστεί ώστε να ομαλοποιηθεί η κατανομή αυτών των μετρήσεων για όλες τις στατιστικές αναλύσεις. ANOVA χρησιμοποιήθηκε για να συγκρίνει όλες τις ιστολογικές ομάδες σε σχέση με τις συνεχείς παράγοντες ενδιαφέροντος. Οι Ρ-τιμές αναφέρονται ως αδιόρθωτη (

p

u

) και προσαρμόζεται για πολλαπλές συγκρίσεις χρησιμοποιώντας ψευδή ποσοστά ανακάλυψης (

p

α

). Χαρακτηριστικό λειτουργίας λήπτη (ROC) καμπύλες χρησιμοποιήθηκαν για να αξιολογηθεί η προβλεψιμότητα της εξέλιξης του τραχήλου της νόσου. Βέλτιστη αποκοπές ήταν αποφασισμένοι να διακρίνουν καλύτερα Normal (HPV-) γυναίκες από γυναίκες με το ΔΠΔ. Ένα δύο όψεων 0,05 επιπέδου δοκιμής προσδιορίζεται η στατιστική σημαντικότητα για όλες τις αναλύσεις. Όλες οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση SAS έκδοση 9.2 (SAS Institute Inc., Cary, NC).

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς θα ήθελαν να αναγνωρίσουν Pap Τουρέ, Παπά Salif Sow, και ο Αμαντού Dembele για τους κλινική εργασία, πρόσληψη και διαχείριση των ασθενών της μελέτης, και η συλλογή των δειγμάτων στη Σενεγάλη. Επιπλέον, θα θέλαμε να ευχαριστήσουμε Donna Kenney και Λιμένα Χου για τεχνική βοήθεια τους στην αποθήκευση, την προετοιμασία και την κοπή μπλοκ δείγματος.