Αφηρημένο

Η συνοδός ΚΔ μοριακή /TRIC διαδραματίζει κεντρικό ρόλο στη διατήρηση της κυτταρικής proteostasis καθώς μεσολαβεί η αναδίπλωση από τις κύριες πρωτεΐνες του κυτταροσκελετού τουμπουλίνες και actins . ΚΔ /TRIC συμμετέχει επίσης στην ογκοπρωτεΐνη κυκλίνης Ε, η Von Hippel-Lindau ογκοκατασταλτικό πρωτεΐνη, η κυκλίνη Β και p21

ras αναδίπλωση που υποδηλώνει έντονα ότι εμπλέκεται στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την καρκινογένεση. Για να αξιολογηθεί η συμμετοχή του ΚΔ /TRIC σε γένεση όγκων, μπορούμε ποσοτικοποιηθεί επίπεδα έκφρασης της και δραστηριότητα σε 18 καρκίνο, ένας ανθρώπινες κυτταρικές σειρές μη καρκινικών και μη ανθρώπινου καρκίνου του ήπατος. Δείχνουμε ότι τα επίπεδα έκφρασης του ΚΔ /TRIC σε καρκινικές κυτταρικές σειρές είναι υψηλότερα από ότι σε φυσιολογικά κύτταρα. Ωστόσο, ΚΔ δραστηριότητα /TRIC δεν συσχετίζονται πάντα με τα επίπεδα έκφρασης της. Ως εκ τούτου, τεκμηριωμένες τα επίπεδα έκφρασης της ΚΔ /TRIC ρυθμιστές και τους συνεργάτες PhLP3, Hop /P60, prefoldin και Hsc /Hsp70. Η ανάλυσή μας αποκαλύπτει μια λειτουργική αλληλεπίδραση μεταξύ των μοριακών συνοδών που θα μπορούσαν να ευθύνονται για την ακριβή ρύθμιση της δραστηριότητας /TRIC ΚΔ στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων μέσω αλλαγών στα κυτταρικά επίπεδα prefoldin ή /και της HSC /P70 και ΚΔ /TRIC διαθεσιμότητα πρωτεΐνη πελάτη. παρατήρηση και προσεγγίσεις μας φέρει νέες ιδέες στο ρόλο της ΚΔ /TRIC μεσολάβηση αναδίπλωση μηχανήματα πρωτεΐνης στην ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων

Παράθεση:. Boudiaf-Benmammar C, Cresteil T, Melki Ε (2013) Η Κυτοσολικά Χαπερονίνης ΚΔ /TRIC και Cancer Cell διάδοσης. PLoS ONE 8 (4): e60895. doi: 10.1371 /journal.pone.0060895

Επιμέλεια: Άννα Alisi, Νοσοκομείο Bambino Gesù Παίδων, Ιταλία

Ελήφθη: 22 του Νοέμβρη του 2012? Αποδεκτές: 4, Μαρτίου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 16 Απρίλη του 2013

Copyright: © 2013 Boudiaf-Benmammar et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το γαλλικό Υπουργείο Παιδείας, Έρευνας και Τεχνολογίας, του Υπουργείου Αλγερίας της Τριτοβάθμιας Εκπαίδευσης και Έρευνας, το Centre National de la Recherche Scientifique και το Πανεπιστήμιο Paris Sud. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Για να εξασφαλιστεί η αποτελεσματική αναδίπλωση της εν τω γεννάσθαι πολυπεπτιδικές αλυσίδες σε ένα εξαιρετικά συνωστισμό περιβάλλον κύτταρα έχουν σχεδιάσει μια κατηγορία πρωτεϊνών που είναι γνωστές ως μοριακοί συνοδοί [1], [2]. Αυτές οι πρωτεΐνες δεσμεύονται, κατά τη διάρκεια ή μετά την μετάφραση, χωρίς να διπλωθεί, μερικώς διπλωμένα και κακώς-αναδιπλωμένη πολυπεπτιδικές αλυσίδες, συχνά μέσω εκτεθειμένα υδρόφοβα τμήματα [3]. Η σύνδεση του μοριακοί συνοδοί στους πελάτες τους εξουδετερώνει την εγγενή ροπή ομαδοποίησή τους και επιτρέπει μια πολυπεπτιδική αλυσίδα για να αναζητήσετε την αναδίπλωση τοπίο και να φτάσει μητρική, λειτουργική του κατάσταση [4]. Μοριακοί συνοδοί ελέγχουν επίσης ομοιόσταση πρωτεΐνη υπό κανονικές συνθήκες και το άγχος. Αποτελούν, συνεπώς, ένα σύστημα ελέγχου ποιότητας για την διατήρηση της φυσικής πρωτεΐνης διαμόρφωση, μετατόπιση των πρωτεϊνών κατά μήκος των μεμβρανών και φυσιολογική κύκλος εργασιών πρωτεΐνη [2].

Η συμμετοχή των μοριακών συνοδών στην ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου υπόκειται σε ενεργό συζήτηση. Αρκετές μελέτες αναφέρουν ότι οι συνοδοί βρέθηκαν σε αυξημένα επίπεδα σε πολλούς συμπαγείς όγκους και αιματολογικές κακοήθειες [5], [6]. έκφραση τους μπορεί εν μέρει υπόψη για την ικανότητα των κακοήθων κυττάρων να διατηρήσουν ομοιόσταση πρωτεΐνης στο δυσμενές υποξική και όξινο μικροπεριβάλλον του όγκου. Μέσω της αλληλεπίδρασής τους με κλειδί ρυθμιστικές πρωτεΐνες, μοριακές chaperones ρυθμίζουν τον κυτταρικό κύκλο και προστατεύουν τα κύτταρα από προγραμματισμένο θάνατο. Προάγουν κυττάρων όγκου επιβίωση, την ανάπτυξη και μετάσταση, ακόμη και σε υποβαθμισμένες συνθήκες αυξητικού παράγοντα, επιτρέποντας τη συνέχιση της μετάφρασης πρωτεϊνών και κυτταρικού πολλαπλασιασμού [7]. Τέλος, οι μοριακοί συνοδοί θεωρούνται κρίσιμες για να επιτρέπει κύτταρα όγκου να ανέχονται γενετικές αλλοιώσεις που διαφορετικά θα ήταν μοιραία [5]. Πράγματι, μοριακοί συνοδοί όπως Hsp90 δρουν ως βιοχημική ρυθμιστικά για τις πολυάριθμες γενετικές αλλοιώσεις που είναι χαρακτηριστικές των περισσότερων ανθρώπινων καρκίνων και δίσκους ογκογένεση [8].

Molecular chaperones είναι πανταχού παρόντα πρωτεΐνες που είναι τα προϊόντα διακριτών, άκρως συντηρημένη , οικογένειες γονιδίων. Αυτά ταξινομούνται σε διάφορες κατηγορίες με βάση το μοριακό τους μάζες, κυτταρική κατανομή και λειτουργία [9]. Τα μέλη της οικογένειας Hsp60 είναι ιδιόμορφη ως προς το ότι σχηματίζουν σύμπλοκα υψηλού σχήματος δακτυλίου μοριακού βάρους πρωτεΐνης. Αυτά τα σωματίδια είναι αλήθεια νανομηχανές αναδίπλωση τροφοδοτείται από ΑΤΡ και ονομάζεται σαπερονινών. Δύο κατηγορίες σαπερονινών οριστεί [10]. Οι σαπερονινών ομάδα Ι αποτελείται από μία μόνο πολυπεπτιδική αλυσίδα και αποτελούσα έχουν ένα 7 φορές συμμετρία. Αυτή η ομάδα αποτελείται από GroEL [11] και το μιτοχονδριακό ομόλογό cpn60 του. Οι σαπερονινών ομάδας II αποτελεί έχουν 8 φορές συμμετρία και περιλαμβάνουν αρχαιοβακτηριακό thermosomes και την κυτοσολική σαπερονίνης contaning t-συγκρότημα πολυπεπτίδιο 1 (ΚΔ), επίσης γνωστή ως το συγκρότημα δαχτυλίδι TCP1 (TRIC) [12]? ΚΔ /TRIC είναι ένα συγκρότημα 16 υπομονάδες που αποτελείται από δύο πλάτη με πλάτη στοιβάζονται δακτυλίους, που το καθένα περιέχει οκτώ διαφορετικές υπομονάδες περίπου 60 kDa (α, β, γ, δ, ε, ζ-1, η και θ) [13] ? [14]. ΚΔ /TRIC συνεργάζεται με την πρωτεΐνη συμπαράγοντες να πάει πάσο πρωτεΐνες πελάτη-στόχο. Hop /P60, ένας συμπαράγοντας της Hsp70 και Hsp90, αυξάνει την αναδίπλωση της αποτελεσματικότητας με τη διευκόλυνση της ανταλλαγής νουκλεοτιδίων [15]. Phosducin σαν πρωτεΐνη 3 (PhLP3) είναι ένας αρνητικός ρυθμιστής της αναδίπλωσης και συγκρατεί πελάτης πρόσβαση πρωτεΐνη στο θάλαμο αναδίπλωσης [16]. Τέλος, η μοριακή συνοδός prefoldin (PFD) ρυθμίζει επίσης δραστηριότητα ΚΔ /TRIC καθώς προσφέρει πρωτεΐνες πελάτη [17], [18]

ΚΔ /TRIC διαμεσολαβεί την αναδίπλωση των τουμπουλίνες και actins [19].? [20], συμπεριλαμβανομένης της centrosomal γ-τουμπουλίνης και centractin [21]. Η αυξανόμενη λίστα των ΚΔ /TRIC πελατών περιλαμβάνει πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην καρκινογένεση με κυκλίνη Ε [22], η Von Hippel-Lindau (VHL) ογκοκατασταλτικό πρωτεΐνη [23], η κυκλίνη Β και p21

ras [24]. Εκτός από την απαίτηση της για actins και τουμπουλίνες αναδίπλωση, υπάρχουν ενδείξεις ότι ΚΔ /TRIC είναι ισχυρά επάνω ρυθμισμένη κατά την διάρκεια της G1 /μετάβαση S φάση του κυτταρικού κύκλου μέχρι την πρώιμη φάση S, και ότι αυτό το γεγονός ελέγχεται στο επίπεδο του mRNA [ ,,,0],25]. Επιπλέον, η ρύθμιση προς τα κάτω της έκφρασης CCTα συνδέεται με μία αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, μια μείωση στην βιωσιμότητα των κυττάρων, διακοπή του κυτταρικού κύκλου και την κυτταρική απόπτωση [26].

Συνολικά, οι παρατηρήσεις αυτές υποδηλώνουν έντονα ότι ΚΔ /TRIC παίζει βασικό ρόλο στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου και ότι θα μπορούσε να εμπλέκεται στην ανάπτυξη των όγκων.

Εδώ θα ποσοτικοποιήσει i) τα επίπεδα έκφρασης της ΚΔ /TRIC και τους εταίρους της, συμπεριλαμβανομένων Hsc 70 και Hsp70 (HSC /p70), PhLP3 , Hop /P60, prefoldin και DNAJB1 σε καρκινικούς ανθρώπινες κυτταρικές σειρές και ii) τη δραστηριότητά της στα κυτταρικά εκχυλίσματα. Συνολικά, τα επίπεδα έκφρασης του ΚΔ /TRIC σε καρκινικές κυτταρικές σειρές είναι υψηλότερα από ότι σε φυσιολογικά κύτταρα. Εντυπωσιακά όμως ΚΔ δραστηριότητα /TRIC δεν συσχετίζονται πάντα με τα επίπεδα έκφρασης της. Ως εκ τούτου, τεκμηριωμένες τα επίπεδα έκφρασης των διαμορφωτών ΚΔ /TRIC. Η ανάλυσή μας φέρνει νέες ιδέες για το ρόλο των πρωτεϊνών πτυσσόμενα μηχανήματα στην ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων.

Υλικά και Μέθοδοι

Ανθρώπινο Γραμμές κυττάρων και κυτταρικών εκχυλισμάτων Προετοιμασία

Δεκαπέντε ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών , που προέρχεται από καρκίνους διαφόρων οργάνων και δείχνοντας διακριτικά χαρακτηριστικά, και ένα μη-καρκινικό κύτταρο γραμμή εγκατεστημένος από φυσιολογικό εμβρυϊκό πνευμονικό ιστό ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC? Rockville, MD). Τρεις άλλες κυτταρικές γραμμές προήλθαν από άλλες πηγές: SH-5YSY αγοράστηκε από την Sigma-Aldrich (Saint Louis, USA), OVCAR-8, μια κυτταρική γραμμή NCI, παρεσχέθη από τον Dr Liscovitch (Rehovot, Israel) και SF268 ελήφθη από το εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου (NCI Frederick, MD, USA). ΜΙΑ-ΡΑΟΑ-2, MRC5-SV2, HepG2 και ΚΒ κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco (DMEM) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS). HCT116, SK-OV3, ΗΤ-29, Κ-562, HL-60, PC3, HeLa, MCF-7, MDA-MB-435S, MDA-MB-431, Α549, SF-268, HCT15 και OVCAR-8 κύτταρα ήταν συνήθως καλλιεργούνται σε 10% FBS /RPMI 1640 συμπληρωμένο με πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη, fungizone και γλουταμίνη. κύτταρα SH-5YSY καλλιεργήθηκαν σε ένα μίγμα DMEM και του Ham F12 συμπληρωμένο με 10% FBS, γλουταμίνη και πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη. Τα χαρακτηριστικά κυτταρικές σειρές και οι αναφορές που δίνονται στον Πίνακα 1.

Η

Τα κύτταρα μετρήθηκαν, πλύθηκαν και συλλέχθηκαν. Η πυκνότητα των κυττάρων ρυθμίσθηκε σε 24,10

7 κύτταρα /ml σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, ρΗ 7,5, 1 mM φθοριούχο φαινυλμεθυλσουλφονύλιο). Αιωρούμενα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πάγο και υποβλήθηκε σε 10 κύκλους έκθεσης σε υπερήχους που αποτελείται από ένα δεύτερο ερέθισμα 1 με ισχύ εξόδου 10 watts σε απόσταση από 15 δευτερόλεπτα χρησιμοποιώντας μια συσκευή υπερήχων Branson 150, ενώ το θραύσμα ανθρώπινου ήπατος (HNCL), του οποίου η καταγωγή και συλλογή πριν 1995, μετά την ηθική επιτροπή του Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale περιγράφονται στο [27], [28], ομογενοποιείται σε πάγο χρησιμοποιώντας ένα Κόντες Teflon-γυαλί ομογενοποιητή. Πλήρης λύση των κυττάρων ελέγχθηκε χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο και την ιοντική ισχύ των εκχυλισμάτων ρυθμίστηκε σε 140 mM Tris /HCl, ρΗ 7,5, 14 mM MgCl

2, 1 mM DTT, 70 mM KCl, 4 mM ΑΤΡ και 10% γλυκερόλη (ν /ν). Τα εκχυλίσματα διαυγάστηκαν με φυγοκέντρηση στα 12.000 χ g για 10 λεπτά στους 4 ° C και η συγκέντρωση πρωτεΐνης στα υπερκείμενα προσδιορίστηκε με τη μέθοδο Bradford [29]. Κουνέλι προϊόν λύσεως δικτυοκυττάρων (RRL) που παρασκευάστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [30] χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας σε όλα τα πειράματα.

Αντισώματα

Ποντίκια πολύκλωνα αντισώματα κατά του ανθρώπινου PhLP3 (αντι TXNDC9), Hop /ρ60 ( αντι STIP1) και PFD5 (αντι PFDN5) αγοράστηκαν από Abnova (Ontario, Canada). Ποντίκι μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι Hsc70 /p70 αγοράστηκε από StressGen (Victoria, BC, Καναδάς). Κουνέλι πολυκλωνικό αντίσωμα να DNAJB1 αγοράστηκε από την Sigma-Aldrich (Saint Louis, USA). Κουνελιού πολυκλωνικό αντίσωμα έναντι CCTα παρήχθη στο εργαστήριο [24].

Western Blotting

Ένα τυπικό εύρος που περιλαμβάνει CCTα (100, 50, 25, 12,5 μg /ml), PhLP3 (0,5, 0.25, 0.125 μg /ml), PFD5 (25, 12.5, 6.25 μg /ml), Hop /ρ60 (6, 3, 1,5 μg /ml) και Hsp70 (80, 40, 20, 10 μg /ml) επιλύθηκε με ηλεκτροφόρηση SDS-πολυακρυλαμιδίου (PAGE) με τη χρήση 12% πηκτών πολυακρυλαμιδίου [31] με δύο αραιώσεις (1/4 ή 1/8 και 1/16) του κάθε εκχύλισμα κυττάρων και αποτυπώθηκε στο φίλτρο νιτροκυτταρίνης [32]. Κάθε φίλτρο ανιχνεύθηκε διαδοχικά με τις πέντε πρωτεύοντα αντισώματα μετά την αναγέννηση μεμβράνη με επώαση στους 50 ° C σε 62.5 mM Tris /HCl ρΗ 6,8, 100 mM β-μερκαπτοαιθανόλη και 2% SDS (ν /ν). Αντιδραστική ζώνες έγιναν ορατές με χημειοφωταύγεια χρησιμοποιώντας υπόστρωμα λέκιασμα Pierce ECL Western (Thermo επιστημονική, Rockville, USA) σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή και το σήμα χημειοφωταύγειας έγινε με ψηφιακή λήψη με ΣΕΝ-3000 αναλυτή φωταύγειας της εικόνας (Fujifilm). Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν τουλάχιστον εις διπλούν για βιολογικές επαναλήψεις, που αντιστοιχούν σε ανεξάρτητες καλλιέργειες κυττάρων και οι μέσες τιμές και την τυπική απόκλιση προήλθαν από τις δύο ανεξάρτητες μετρήσεις. Οι ποσότητες του ΚΔ /TRIC, PhLP3, PFD5 και Hop /ρ60 στα διάφορα εκχυλίσματα ποσοτικοποιήθηκαν με σύγκριση της φωτοβολίας στα κυτταρικά εκχυλίσματα με εκείνη των προτύπων γνωστής συγκέντρωσης σε ηλεκτροφόρηση πάνω στην ίδια πηκτή.

Folding Δραστηριότητα δοκιμασία

[

35S] -επισημασμένο εκτυλίχθηκε β-ακτίνη πρωτεΐνη-στόχο παράχθηκε με έκφραση σε

Ε. coli

και καθαρίστηκε όπως περιγράφεται από τους Gao et al. [33]. Οι δραστηριότητες αναδίπλωση των κυτταρικών εκχυλισμάτων, RRL και HNCL προσδιορίστηκαν και αναλύθηκαν μετά από αραίωση από μετουσιωτικό ραδιοεπισημασμένης β-ακτίνης σε εκχυλίσματα κυττάρων, RRL και HNCL αραιωμένο σε ρυθμιστικό διάλυμα αναδίπλωσης (80 mM MES /KOH, ρΗ 6,8, 1 mM MgCl

2, 1 mM DTT, 1 mM EGTA, 1 mM ΑΤΡ). Η συγκέντρωση πρωτεΐνης εντός των εκχυλισμάτων ήταν 15 mg /ml ή 2,5 mg /ml. Τα προϊόντα της αντίδρασης διαχωρίστηκαν σε πηκτές πολυακρυλαμιδίου μη μετουσίωσης 6%. Τα πήγματα ακολούθως ξηραίνονται και εκτίθενται σε μια οθόνη φωσφόρου αποθήκευσης (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA, USA) και αναπτύχθηκε σε ένα Storm PhosphorImager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA, USA). Ένα παράδειγμα μιας ξεδιπλωμένης αντίδραση αναδίπλωσης β-ακτίνης CCT μεσολάβηση φαίνεται στο Σχήμα S1. Όλα τα πειράματα έγιναν εις διπλούν. Οι μέσες τιμές και η τυπική απόκλιση προήλθαν από τις δύο ανεξάρτητες μετρήσεις.

εκχυλίσματα κυττάρων ανοσο-εξάντληση

Δύο αυθαίρετα επιλέξει εκχυλίσματα κυττάρων (MIA-ΡΑΟΑ-2 και OVCAR-8) και ο έλεγχος ανοσο-απαλείφθηκαν με τη χρήση είτε αντι PhLP3, αντι-Hop /P60, αντι- PFD5, αντι-Hsc /ρ70 ή αντισώματα αντι-CCTα. Τα εκχυλίσματα επωάστηκαν για 2 ώρες στους 4 ° C υπό ήπια κίνηση με την κατάλληλη αντίσωμα και τα σύμπλοκα πρωτεΐνης-αντισώματος καθιζάνουν μετά από ολονύκτια επώαση στους 4 ° C με σφαιρίδια πρωτεΐνης Α Sephrose CL-4B (GE Healthcare) εξισορροπημένη σε 50 mM Tris -ΗΟΙ, ρΗ 7.0. Τα υπερκείμενα ανακτήθηκαν, η συγκέντρωση πρωτεΐνης μετρήθηκε και η ικανότητα του ανοσο-εξαντλημένο εκχύλισμα να αναδιπλωθεί [

35S] -επισημασμένο ξεδιπλωμένη β-ακτίνης αναλύθηκε

in vitro

.

Ανάλυση εικόνας, Στατιστική Ανάλυση και υπολογισμοί

Ψηφιακές εικόνες που λαμβάνονται με την Fujifilm ΣΕΝ-3000 αναλυτή και τη Θύελλα PhosphorImager αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό ΝΙΗ εικόνας (US National Institute of Health, Bethesda, MD).

Οι εντάσεις που προκύπτουν από την ανάλυση εικόνας αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας δύο δειγμάτων με μονόπλευρο t-τεστ ανεξάρτητων Student.

Ο αριθμός των /TRIC και PFD σωματίδια ΚΔ ανά κύτταρο προέρχεται από μετρήσεις της συγκέντρωσης χρησιμοποιώντας την ακόλουθη εξίσωση : Όπου n είναι ο αριθμός των ΚΔ /TRIC ή σωματίδια PFD, C, το ποσό της ΚΔ /TRIC ή PFD υπολογίζεται από μετρήσεις κηλίδας Western σε σύγκριση με γνωστές ποσότητες CCTα ή PFD5 σε mg /ml, C

n, είναι ο αριθμός των κυττάρων /ml, Mw, είναι το μοριακό βάρος του ΚΔ /TRIC ή PFD σωματίδια (750000 για ΚΔ /TRIC, 100.670 για PFD) και

Ν

την σταθερά του Avogadro (6.023 × 10

23).

Αποτελέσματα

ΚΔ /TRIC έκφραση και δραστηριότητα

ΚΔ /TRIC είναι απολύτως απαραίτητες για την αναδίπλωση των δύο βασικών πρωτεϊνών του κυτταροσκελετού actins και τουμπουλίνες

στο vivo

. Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά για την έκφραση και η δραστικότητα του σε καρκινικά κύτταρα. Συγκρίναμε τα επίπεδα έκφρασης και η δραστικότητα του ΚΔ /TRIC σε 18 κυτταρικές γραμμές καρκίνου από διάφορα όργανα και μια κανονική κυτταρική σειρά (MRC5-SV2), ένα ομογενοποίημα ανθρώπινα μη-καρκίνο του ήπατος (HNCL) και λύμα δικτυοκυττάρων κουνελιού (RRL), όπου ΚΔ /TRIC είναι γνωστό ότι εκφράζεται και υψηλής δραστικότητας. Η ποσοτικοποίηση της ΚΔ /TRIC σε κηλίδες Western (Σχήμα 1) αποκάλυψε ότι, η μέση συγκέντρωση της ΚΔ /TRIC στον καρκίνο εκχυλίσματα κυττάρων είναι περίπου 5 μg ανά mg ολικών πρωτεϊνών και περίπου 3 με 4,10

8 ΚΔ σωματίδια /TRIC ( βλέπε πειραματικό τμήμα διαδικασίες για τον υπολογισμό πίνακα S1 για ΚΔ /TRIC σωματίδια αριθμός στις διάφορες κυτταρικές γραμμές), εκτός για MIA-PaCa2, MRC5-SV2, MDA-MB-231 και HL-60 κυτταρικές γραμμές όπου ΚΔ /TRIC ποσά είναι 2 έως 3 φορές σε τη μέση τιμή. Σε HNCL και RRL, το ποσό της ΚΔ /TRIC είναι το μισό του μέσου όρου που μετρήθηκε για καρκινικές κυτταρικές σειρές. Αξίζει επίσης να σημειωθεί ότι το ποσό αυτό είναι το χαμηλότερο (1.6 μγρ /mg του συνόλου των πρωτεϊνών) σε SH-SY5Y κυτταρική σειρά ανθρώπινου νευροβλαστώματος. έτσι ΚΔ έκφρασης /TRIC φαίνεται ρυθμισμένη προς τα πάνω σε όλες τις κυτταρικές γραμμές καρκίνου, ειδικότερα, σε MIA-PaCa2, MDA-MB-231 και κυτταρικές σειρές HL-60 (Σχήμα 1). Για να καθοριστεί εάν η έκφραση ΚΔ /TRIC συσχετίζεται με την δραστικότητα του ραδιοεπισημασμένου ποσοτικοποιήσαμε μετουσιωμένα, αναδίπλωση ακτίνης στα κυτταρικά εκχυλίσματα συμπληρώνονται με Mg

2+ και ΑΤΡ όπως περιγράφεται στην ενότητα πειραματικές διαδικασίες. Τα αποτελέσματα, που παρουσιάζονται στο Σχήμα 2 έδειξαν ότι η δραστηριότητα ΚΔ /TRIC δεν συσχετίζονται πάντα με το επίπεδο έκφρασης του. Πράγματι, ενώ η αναδίπλωση δραστηριότητα του ΚΔ /TRIC σε ΜΙΑ-PaCa2, MDA-MB-231 και MDA-MB-435S εκχυλίσματα κυτταρική γραμμή ήταν ιδιαίτερα συμβιβάζεται με τα σημαντικά επίπεδα του ΚΔ /TRIC εντός των εκχυλισμάτων, διαπιστώθηκε πολύ χαμηλή περιεκτικότητα σε εκχύλισμα γραμμή HL-60 κυττάρων, δηλαδή την κυτταρική γραμμή που περιέχει τα υψηλότερα ποσά της ΚΔ /TRIC, συγκρίνετε το Σχήμα 1 στο Σχήμα 2.

το ποσό της ΚΔ /TRIC σε 18 καρκίνου και μια κανονική (MRC5-SV2) κυτταρικές γραμμές εκχυλίσματα, που παρασκευάστηκε όπως περιγράφεται στην ενότητα πειραματικές διαδικασίες, μια μη-καρκίνου του ήπατος ομογενοποίημα (HNCL) και λύμα δικτυοκυττάρων κουνελιού (RRL) προσδιορίστηκε με σύγκριση της έντασης CCTα μετράται για κυτταρικά εκχυλίσματα αραιώνονται 4 και 16 φορές με εκείνη των γνωστών ποσοτήτων του CCTα (100, 50, 25, 12,5 μg /ml) μετανάστευσε στο ίδιο 12% SDS γέλη πολυακρυλαμιδίου με κηλίδωση Western. Οι μέσες ποσότητες του ΚΔ /TRIC στα διάφορα εκχυλίσματα εκφράζεται ως συνάρτηση της συνολικής περιεκτικότητας των εκχυλισμάτων πρωτεϊνών.

Η

ΚΔ /TRIC αναδίπλωση δραστηριότητα στις καρκινικές κυτταρικές γραμμές 18, η κανονική κυτταρική γραμμή MRC5-SV2 και το ανθρώπινο μη-καρκινικές ήπατος προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας [

35S] -επισημασμένο μετουσιωμένα β-ακτίνη αναδίπλωσης, όπως περιγράφεται στην ενότητα πειραματικές διαδικασίες. Τα προϊόντα της αντίδρασης αναλύθηκαν σε πηκτώματα πολυακρυλαμιδίου μη μετουσίωσης 6%. ΚΔ /TRIC ειδική δραστικότητα, που προέρχεται από τον ποσοτικό προσδιορισμό των β-ακτίνης ζώνες εντάσεις εκφράζεται ως συνάρτηση της συνολικής συγκέντρωσης πρωτεΐνης. Οι εικόνες, καταγράφηκαν χρησιμοποιώντας ένα phosphorimager για [

35S] -επισημασμένο ακτίνης αντιδράσεις αναδίπλωσης σε ρυθμιστικό διάλυμα αναδίπλωσης, RRL, MIA-PaCa-2 και HeLa κυτταρικά εκχυλίσματα διαχωρίστηκαν σε ένα φυσικό 6% πηκτή πολυακρυλαμιδίου, φαίνονται στο ένθετο.

η έκφραση της ΚΔ TRIC Ρυθμιστές /δραστηριότητα

Δεδομένου ότι το επίπεδο έκφρασης της ΚΔ /TRIC δεν συσχετίζεται με τη δραστηριότητά της και να κατανοήσουν καλύτερα πώς η τελευταία διαμορφώνεται στα καρκινικά κύτταρα, έχουμε ποσοτικά /TRIC διαμορφωτές δραστηριότητα ΚΔ, prefoldin, Hop /ρ60 και PhLP3, στα κυτταρικά λύματα. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται στην Εικόνα 3Α δείχνουν ότι η συγκέντρωση Hop /ρ60 εντός των κυτταρικών σειρών που χρησιμοποιήθηκε είναι περίπου 0,4 μg /mg ολικών πρωτεϊνών κατά μέσο όρο. Hop /ρ60 εμφανίζεται κάτω-εκφράζεται στην πλειονότητα των κυτταρικών γραμμών που χρησιμοποιούνται όταν το επίπεδο έκφρασης της είναι κανονικοποιημένο με εκείνη στο ήπαρ ομογενοποίημα μη καρκινικά (HNCL) που χρησιμοποιούνται σε όλη αυτή τη μελέτη (Σχήμα S2). έκφραση Hop /P60 είναι η υψηλότερη στην MRC5-SV2, HCT116, PC3 και κυτταρικές σειρές HL-60 όπως είναι σε HNCL.

Το ποσό των (Α) Hop /P60, (Β) PhLP3 και (C ) PFD σε 18 καρκίνου και μια κανονική (MRC5-SV2) κυτταρικές σειρές εκχυλίσματα, μια μη-καρκίνο του ήπατος ομογενοποιημένο (HNCL) και λύμα δικτυοερυθροκυττάρων κουνελιού (RRL) προσδιορίστηκε με τη σύγκριση του σήματος χημειοφωταύγειας που καταγράφεται για Hop /p60, PhLP3 και PFD στην κυτταρικά εκχυλίσματα αραιώνονται 4 και 16 φορές με εκείνη των γνωστών ποσοτήτων των πρωτεϊνών για τα ίδια στυπώματα Western.

η

ΚΔ /TRIC έκφραση είναι επίσης υψηλό σε MRC5-SV2 και HL-60. Παραδόξως όμως, δεδομένου ότι Hop /ρ60 είναι ένας παράγοντας ανταλλαγής νουκλεοτιδίων αναμένεται να ευνοήσει ΚΔ /TRIC μεσολάβηση αναδίπλωσης, η αναδίπλωση δραστηριότητα MRC5-SV2 και HL-60 εκχυλίσματα κυττάρων είναι χαμηλή. Ομοίως, ενώ η ΚΔ /TRIC και συγκεντρώσεις /P60 Hop είναι σχετικά υψηλό σε HCT116 εκχυλίσματα κυττάρων, η αναδίπλωση δράση του εκχυλίσματος είναι από τα χαμηλότερα. Συμπεραίνουμε από αυτές τις παρατηρήσεις που το επίπεδο έκφρασης των Hop /P60 δεν είναι ο μόνος υπεύθυνος των αυξηθεί ή να μειωθεί ΚΔ /TRIC μεσολάβηση αναδίπλωση απόδοσης. Ως εκ τούτου, τεκμηριώνεται PhLP3, τη λειτουργική ανταγωνιστή του λυκίσκου /P60, έκφραση στις καρκινικές κυτταρικές γραμμές που χρησιμοποιήθηκαν. έκφραση PhLP3 διαφέρει σημαντικά από το ένα κύτταρο γραμμή στην άλλη. Η πρωτεΐνη δεν ήταν ανιχνεύσιμη σε 11 κυτταρικές γραμμές καρκίνου χρησιμοποιήσαμε και περίπου 0,03 μg /mg ολικών πρωτεϊνών (Σχήμα 3Β) σε 8 άλλες κυτταρικές σειρές. Όταν ανιχνεύσιμη, PhLP3 εμφανίζεται πάνω εκφράζεται όταν το επίπεδο έκφρασης της ομαλοποιείται με αυτή HNCL (Εικόνα S2). Εδώ πάλι, δεν ήμασταν σε θέση να συσχετίσει ένα επίπεδο έκφρασης υψηλό PhLP3 με χαμηλή δραστηριότητα /TRIC ΚΔ. Πράγματι, η συγκέντρωση PhLP3 είναι από τα υψηλότερα στην PC3 και τα εκχυλίσματα των κυττάρων MDA-MB-231 (Εικόνα 3Β), όπου ΚΔ /TRIC δραστηριότητα είναι από τις υψηλότερες (Σχήμα 2).

Τελικά ποσοτικά prefoldin επίπεδα έκφρασης, όπως αυτό συν-συνοδός βοηθά ΚΔ /TRIC στο buffering συγκεντρώσεις πρωτεΐνης πελάτη στο κυτταρόπλασμα και την παράδοσή τους στο ΚΔ /TRIC. συγκέντρωση Prefoldin διαφέρει ελάχιστα από το ένα κύτταρο στο άλλο και είναι κατά μέσο όρο 2 μg /mg ολικών πρωτεϊνών (Σχήμα 3C). Prefoldin επίπεδο έκφρασης είναι δύο φορές χαμηλότερο από το μέσο όρο σε MIA-PaCa2, MRC5-SV2, HCT116, SH-SY5Y και τα εκχυλίσματα των κυττάρων SK-OV-3 και είναι σημαντικά υψηλότερο από το μέσο όρο της HL-60, Κ562, HeLa, KB, MDA εκχυλίσματα κυττάρων -ΜΒ-231 και MCF7. Έτσι, υπάρχει ένας συσχετισμός μεταξύ της δραστηριότητας /TRIC ΚΔ και το επίπεδο έκφρασης της prefoldin. Η υψηλότερη prefoldin εκφράζεται, το χαμηλότερο η δραστηριότητα της ΚΔ /TRIC είναι. Τέλος, αξίζει να σημειωθεί ότι PFD εκφράζεται σε υψηλότερα επίπεδα σε όλες τις καρκινικές κυτταρικές σειρές σε σύγκριση με HNCL (Εικόνα S2). Καθώς αυτή η πρωτεΐνη είναι ένα μέρος ενός συμπλόκου που αποτελείται από 6 υπομονάδες, ο μέσος αριθμός των ενεργών σωματιδίων ανά κύτταρο κυμαίνεται από 5 έως 24 10

8 (Πίνακας S1).

Η έλλειψη συσχετισμού μεταξύ της αύξησης ή μειωμένα επίπεδα έκφρασης Hop /p60 και PhLP3 και δραστηριότητα /TRIC ΚΔ υποδηλώνει ότι η τελευταία δεν διαμορφώνεται αποτελεσματικά από αυτά τα πολυπεπτίδια. Για να βεβαιωθείτε ότι αυτή είναι πράγματι η υπόθεση και να κατανοήσουν καλύτερα πώς Hop /p60 και PhLP3 επηρεάζουν ΚΔ /TRIC αναδίπλωση δραστηριότητα, εξετάσαμε τις συνέπειες της ανοσο-καταστρέφουν Hop /ρ60 ή PhLP3 από δύο αυθαίρετα επιλέξει κυτταρικών εκχυλισμάτων: ΜΙΑ-ΡΑΟΑ-2 ( Σχήμα 4Α) και OVCAR-8 (Σχήμα 4C) στην δραστικότητα /TRIC ΚΔ. Η ανοσο-εξάντληση των Hop /p60 δεν είχε καμία επίδραση στη δραστηριότητα ΚΔ /ΤΡΙΟ (Σχήμα 4Β, D). Σε αντίθεση, PhLP3 ανοσο-εξάντληση από ένα εκχύλισμα κυττάρων όπου εκφράζεται σημαντικά, όπως OVCAR-8, οδήγησε σε δραματική μείωση στην ΚΔ δραστηριότητα /TRIC (Σχήμα 4Β, D). Αυτό υποδηλώνει έντονα ότι PhLP3 συμμετέχει ενεργά στη διαμόρφωση του κοινού δασμολογίου ΤΡΙΟ δραστηριότητα /.

ΚΔ /TRIC αναδίπλωση δραστηριότητα MIA-ΡΑΟΑ-2 και (Γ) OVCAR-8 κυττάρων εκχυλίσματα (Α) πριν και μετά την ΚΔ /TRIC , Hop /ρ60 ή PhLP3 ανοσοεξάντληση αναλύθηκε χρησιμοποιώντας [

35S] -επισημασμένο, μετουσιωμένη β-ακτίνης. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης των εκχυλισμάτων κυττάρων MIA-PaCa-2 και OVCAR-8 ήταν 2,5 και 15 mg /ml, αντίστοιχα. Εγγενής ένταση ζώνης β-ακτίνης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα PhosphorImager. Η ποσότητα του φυσικού β-ακτίνης μετρήθηκαν μετά ανοσοεξάντληση εκφράζεται ως κλάσμα του ποσού που μετράται για τα κυτταρικά εκχυλίσματα πριν ανοσοεξάντληση στο (Β) MIA-PaCa-2 και (D) OVCAR-8 κυτταρικά εκχυλίσματα.

Η

Hsc /p70 Modulate ΚΔ /TRIC Δραστηριότητα

ΚΔ /TRIC συνεργάζεται με άλλες μοριακές συνοδούς [2]. Hsc 70 και Hsp70 (HSC /ρ70) έχουν δειχθεί ότι προάγουν πρωτεΐνες πελάτη σύνδεση προς ΚΔ /TRIC για παράδειγμα [34], [35]. Για να προσδιοριστεί εάν τα επίπεδα Hsc /έκφρασης ρ70 συσχετίζονται με ότι δραστικότητας /TRIC ΚΔ, τα ποσά των Hsc /ρ70 στα καρκινικά κυτταρική γραμμή εκχυλίσματα που χρησιμοποιούνται σε όλη αυτή τη μελέτη προσδιορίστηκαν ποσοτικά με κηλίδωση Western. Οι ζώνες διπλή παρατηρούνται στις κηλίδες προέρχονται από την συστατική (Hsc70, 73 kDa) και το στρες που προκαλείται μορφή (Hsp70, 72 kDa) του συνοδού. Hsp70 εμφανίζεται υπερεκφράζεται στις κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες από την ένταση από τα ελαφρύτερα μπάντες για τα Δυτικά κηλίδες. Αυτό υποδηλώνει έντονα ότι το άγχος που σχετίζεται με μορφή της συνοδού επάγεται σε καρκινικές κυτταρικές σειρές. Η ποσότητα του Hsc /ρ70 στα διάφορα κυτταρικά εκχυλίσματα μετρήθηκε είναι 5 μg /mg ολικών πρωτεϊνών κατά μέσο όρο, εκτός από MRC5-SV2, Α549, Κ-562, MDA-MB-435S και ΚΒ κυτταρικές γραμμές όπου η συγκέντρωση /ρ70 Hsc είναι 2 έως 3 φορές υψηλότερη και SH-5YSY όπου είναι 2 φορές μικρότερη (Σχήμα 5). Ομοίως, στην κυτταρική σειρά αδενοκαρκινώματος μαστού MCF7 και ηπατοκαρκινώματος κυτταρική γραμμή HepG2, η HSC /p70 είναι 7 έως 12 φορές τη μέση τιμή. Τέλος, αξίζει να σημειωθεί ότι η έκφραση /ρ70 Hsc ρυθμίζεται αυξητικά σε όλες τις καρκινικές κυτταρικές γραμμές με τα επίπεδα έκφρασης φθάνοντας σε κύτταρα HepG2 160 φορές ότι εντός του ήπατος ομογενοποίημα μη καρκινικά (HNCL) χρησιμοποιείται ως αναφορά σε κύτταρα HepG2 (σχήμα 5).

Η ποσότητα του Hsc /ρ70 σε 18 καρκίνου και μια κανονική (MRC5-SV2) κυτταρικές σειρές εκχυλίσματα, ένα ομογενοποίημα ήπατος (HNCL) και λύμα δικτυοκυττάρων κουνελιού (RRL) προσδιορίστηκε με σύγκριση του σήματος χημοφωτισμού που καταγράφεται για Hsc /ρ70 σε κυτταρικά εκχυλίσματα αραιώνονται 4 και 16 φορές με εκείνη των γνωστών ποσοτήτων της πρωτεΐνης στα ίδια Western blots. Οι μέσες ποσότητες Hsc /p70 στα διάφορα εκχυλίσματα εκφράζεται ως συνάρτηση του συνολικού περιεχομένου των εκχυλισμάτων πρωτεϊνών.

Η

Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η ΚΔ δραστηριότητα /TRIC είναι από τα χαμηλότερα σε κυτταρικές σειρές που εκφράζουν τα υψηλότερα επίπεδα Hsc /p70 (συγκρίνετε δραστηριότητα /TRIC ΚΔ με τα ποσά των Hsc /p70 σε MCF7 HepG2 και Κ-562). Ομοίως, ΚΔ δραστηριότητα /TRIC εμφανίζεται το υψηλότερο στην κυτταρική σειρά εκχυλίσματα όπου τα επίπεδα Hsc /p70 είναι χαμηλότερες από το μέσο όρο (συγκρίνετε ΚΔ TRIC δραστηριότητα /προς τα ποσά των Hsc /p70 σε ΜΙΑ-ΡΑΟΑ-2, HCT15, PC-3, και MDA -ΜΒ-231). Αυτό θα μπορούσε κάλλιστα να είναι η συνέπεια της πρωτεΐνης πελάτη διαχωρισμού μεταξύ Hsc /P70 και ΚΔ /TRIC με αυξημένες ποσότητες πρωτεϊνών πελάτη διαθέσιμο για σύνδεση με ΚΔ /TRIC με την παρουσία υψηλών συγκεντρώσεων /p70 Hsc.

Για την περαιτέρω έγγραφο HSC /P70 και ΚΔ συνεργασία /TRIC στην αναδίπλωση πρωτεϊνών, που προσδιορίστηκαν ΚΔ /TRIC δραστηριότητα αναδίπλωση πρωτεϊνών πελάτη καρκινικών κυττάρων εκχυλίσματα παρακάτω HSC /p70 ανοσοεξάντληση. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται στο Σχήμα 6 δείχνει καθαρά ότι ΚΔ /TRIC μεσολάβηση β-ακτίνης αναδίπλωσης μειώνεται πάνω από 65% σε MIA-PaCa-2 και OVCAR-8 κατόπιν Hsc /ρ70 ανοσοεξάντληση. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν σαφώς ότι η HSC /P70 και ΚΔ /ΤΡΙΟ συνεργάζονται.

ΚΔ /TRIC μεσολάβηση επισημανθεί, μετουσιωμένη β-ακτίνης αναδίπλωση στο (Α) ΜΙΑ-ΡΑΟΑ-2 και OVCAR-8 εκχυλίσματα κυττάρων πριν και μετά HSC /P70 ανοσοεξάντληση. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης των εκχυλισμάτων κυττάρων MIA-PaCa-2 και OVCAR-8 ήταν 2,5 και 15 mg /ml, αντίστοιχα. Native ένταση της ζώνης β-ακτίνης recoded χρησιμοποιώντας ένα PhosphorImager. Η ποσότητα του φυσικού β-ακτίνης μετρήθηκαν μετά ανοσοεξάντληση εκφράζεται ως κλάσμα του ποσού που μετράται για τα κυτταρικά εκχυλίσματα πριν ανοσοεξάντληση στο (Β) MIA-PaCa-2 και (Γ) OVCAR-8 κυτταρικά εκχυλίσματα.

Η

οι παρατηρήσεις μας είναι συμβατά με την άποψη ότι οι πρωτεΐνες πελάτη Hsc /p70 προσκρουστήρες ΚΔ /TRIC [36]. Πράγματι, η ανοσοεξάντληση της Hsc /p70 οδηγεί σε μείωση της ΚΔ /TRIC πισίνα πολυπεπτίδιο πελάτη λόγω της μείωσης της ποσότητας των διαθέσιμων πρωτεϊνών πελάτη ΚΔ /ΤΡΙΟ.

Συζήτηση

ΚΔ /TRIC διαδραματίζει κεντρικό ρόλο στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων μέσω της ικανότητάς της να διευκολύνει την αναδίπλωση του ί) – κυτταροσκελετικές πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην κυτταρική διαίρεση, π.χ. α, β και γ-τουμπουλίνες [23], [15], [31], [25], α και β actins και centractin [14], [36], [25], ii) – ογκοπρωτεϊνών όπως κυκλίνη Ε [ ,,,0],22], η Von Hippel-Lindau (VHL) ογκοκατασταλτικό πρωτεΐνη [23], η κυκλίνη Β και p21

ras [24]. ΚΔ έκφρασης /TRIC είναι επιπλέον ρυθμίζεται προς τα πάνω κατά τη διάρκεια της G1 /μετάβαση S φάση του κυτταρικού κύκλου [25], ενώ τα κάτω ρύθμιση του οδηγεί στην αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, μία μείωση στην βιωσιμότητα των κυττάρων, διακοπή του κυτταρικού κύκλου και την κυτταρική απόπτωση [26 ].

για να προσδιορίσετε αν ΚΔ δραστηριότητα /TRIC εξαρτάται απλά από το επίπεδο έκφρασης του, συγκρίναμε τα επίπεδα έκφρασης της ΚΔ /TRIC σε 18 ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές, μία φυσιολογική κυτταρική σειρά και ένα φυσιολογικό ανθρώπινο ήπαρ. Δείξαμε ότι η δραστηριότητα ΚΔ /TRIC δεν συσχετίζονται πάντα με το επίπεδο έκφρασης του. Ως εκ τούτου, ποσοτικοποιούνται ΚΔ /TRIC ρυθμιστές δραστηριότητας στις καρκινικές κυτταρικές γραμμές που χρησιμοποιούνται σε όλη αυτή τη μελέτη. Δείξαμε ότι Hop /P60 δεν είναι ο μόνος υπεύθυνος των αυξηθεί ή να μειωθεί ΚΔ /TRIC μεσολάβηση αναδίπλωση απόδοσης. Ομοίως, δεν ήμασταν σε θέση να αποκαλύψει μια συσχέτιση μεταξύ του επιπέδου έκφρασης PhLP3 και δραστηριότητα /TRIC ΚΔ στις κυτταρικές σειρές όπου η έκφραση PhLP3 ήταν ανιχνεύσιμη. Ως εκ τούτου, ποσοτικά τα επίπεδα των πρωτεϊνών που βοηθούν ειδικά ΚΔ /TRIC, όπως prefoldin, ή πρωτεΐνες προσκρουστήρες πελάτη συγκεντρώσουν μέσα στο κυτταρόπλασμα, όπως Hsc /p70. Δείξαμε ότι η υψηλότερη prefoldin εκφράζεται, τόσο χαμηλότερη είναι η δραστηριότητα του ΚΔ /TRIC είναι. Δείξαμε επίσης ότι η δραστηριότητα ΚΔ /TRIC είναι το υψηλότερο στην κυτταρική σειρά εκχυλίσματα όπου τα επίπεδα Hsc /p70 είναι το χαμηλότερο. Τα ευρήματα αυτά υποδεικνύουν έντονα ότι οι πρωτεΐνες πελάτη διχοτόμηση μεταξύ prefoldin ή /και της HSC /P70 και ΚΔ /TRIC. Με την παρουσία του υψηλής prefoldin ή /και των συγκεντρώσεων /ρ70 Hsc, ένα σημαντικό κλάσμα των πρωτεϊνών του πελάτη είναι ρυθμισμένο από τις τελευταίες αυτές μοριακές chaperones και δεν είναι διαθέσιμο για δέσμευση με ΚΔ /TRIC ενώ όταν prefoldin ή /και των συγκεντρώσεων /ρ70 Hsc είναι χαμηλά το κλάσμα της πρωτεΐνες πελάτης δεσμεύεται να αυξάνει ΚΔ /TRIC. Έτσι, οι διακυμάνσεις στα επίπεδα έκφρασης του prefoldin ή /και της HSC /ρ70 ρυθμίζει τη διαθεσιμότητα των πρωτεϊνών πελάτη για ΚΔ /TRIC. Αυτό φαίνεται από τη διαπίστωση ότι η ανοσο-εξάντληση του /p70 πισίνα του κυτταροπλάσματος Hsc οδηγεί σε εξάντληση του απομονωμένου πρωτεϊνών πελάτη και μια σημαντική μείωση στην σταθερή δραστηριότητα /ΤΡΙΟ κατάσταση ΚΔ. Η διαπίστωση ότι ο αριθμός των ΚΔ /TRIC και prefoldin σωματιδίων μέσα στο κυτοσόλιο των κυτταρικών σειρών καρκίνου του δεν διαφέρουν κατά περισσότερο από μία τάξη μεγέθους υποδεικνύουν είτε ότι η αναδίπλωση μηχανήματα εξελίχθηκε κατά τέτοιο τρόπο ώστε prefoldin και /ή λειτουργία Hsc /ρ70 σε συνδυασμό με το ΚΔ ή ότι το μέγιστο ποσό του πελάτη πολυπεπτιδίων η αναδίπλωση μηχάνημα μπορεί να αποθηκεύσει /ρυθμιστικού και το κύτταρο μπορεί να φιλοξενήσει είναι της ίδιας τάξης μεγέθους από αυτό των σωματιδίων /TRIC ΚΔ. Αυτό ισχύει ιδιαίτερα στην περίπτωση που η ομάδα των πολυπεπτιδίων που σχετίζονται με prefoldin και /ή Hsc /p70 στο κυτταρόπλασμα αποτελεί την αποκλειστική πηγή πρωτεϊνών πελάτη ΚΔ /ΤΡΙΟ.

Σε γενικές γραμμές, η μελέτη μας αποκαλύπτει μια λειτουργική αλληλεπίδραση μεταξύ μοριακές chaperones που θα μπορούσαν να αντιπροσωπεύουν μια ακριβή ρύθμιση της δραστικότητας /TRIC ΚΔ στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων μέσω αλλαγών στα κυτταρικά επίπεδα prefoldin ή /και της HSC /ρ70. Οι παρατηρήσεις μας δείχνουν επίσης ότι η διαθεσιμότητα των πρωτεϊνών πελάτη για ΚΔ /TRIC είναι το περιοριστικό βήμα που ρυθμίζει δραστηριότητα ΚΔ /TRIC. Πράγματι, αυξημένη prefoldin ή /και της HSC /συγκεντρώσεις ενδοκυτταρική p70 οδηγεί σε μειωμένη ποσά των ελεύθερων πρωτεϊνών του πελάτη και την αντιμετώπιση της ΚΔ ΤΡΙΟ δραστηριότητα /. Ομοίως, η αύξηση του ποσού των συγκεντρώσεων πρωτεΐνης πελάτη σε μια δεδομένη Hsc /p70 αποδόσεις συγκέντρωση του ελεύθερου πρωτεϊνών πελάτη prefoldin ή /και και επαναφέρει δραστηριότητα ΚΔ /TRIC. Έτσι, μία τριμερής αλληλεπίδραση μεταξύ ΚΔ /TRIC, prefoldin ή /και της HSC /ρ70, από τη μία πλευρά, οι πρωτεΐνες του πελάτη, από την άλλη, φαίνεται κρίσιμη για τη ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, ιδίως σε ένα πλαίσιο όπου ο κυτταροσκελετικές και ογκο-πρωτεΐνες που είναι κρίσιμης σημασίας για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και η βιωσιμότητα είναι από τους σημαντικότερους πελάτες της ΚΔ /ΤΡΙΟ.

η ΕΥΑ /p70 συν-συνοδοί από την οικογένεια Hsp40 διαμορφώνουν την αλληλεπίδραση των Hsc /p70 με πρωτεΐνες πελάτη του [37]. Ως εκ τούτου, προσδιορίζεται ποσοτικά το επίπεδο έκφρασης ενός από τα μείζονα επαγώγιμων μέλη της οικογένειας Hsp40 [38] στις καρκινικές κυτταρικές γραμμές που χρησιμοποιούνται σε όλη αυτή τη μελέτη. DNAJB1 επίπεδο έκφρασης είναι το υψηλότερο σε MIA-PaCa-2, MDA-MB-231 και τα κύτταρα ΗΤ29 (δεν φαίνεται). Αυτή η παρατήρηση είναι σύμφωνη με υψηλότερο κύκλο εργασιών των πρωτεϊνών πελάτη Hsc /p70-δεσμεύεται και την επακόλουθη άνω του μέσου όρου ΚΔ /TRIC δραστηριότητα που μετρήθηκε για αυτά τα εκχυλίσματα. Ωστόσο, τα επίπεδα έκφρασης DNAJB1 ήταν σχετικά μέτρια σε δύο άλλες κυτταρικές σειρές (HCT15 και PC-3) εμφανίζουν άνω του μέσου όρου ΚΔ ΤΡΙΟ δραστηριότητα /.