Αφηρημένο

Ιστορικό

βιμεντίνη είναι μια πανταχού παρούσα μεσεγχυματικά ενδιάμεσο νήμα υποστήριξη μηχανο-δομική ακεραιότητα των κυττάρων σε φάση ηρεμίας, ενώ συμμετέχουν στην προσκόλληση, τη μετανάστευση, την επιβίωση , και κυτταρική διεργασίες μέσω δυναμικών συναρμολόγησης /αποσυναρμολόγησης σηματοδότηση σε ενεργοποιημένα κύτταρα. Μαλακό σαρκώματα ιστού και μερικές επιθηλιακών καρκίνων που εμφανίζουν «επιθηλιακά σε μεσεγχυματικά μετάβαση» φαινοτύπων εκφράζουν vimentin. Withaferin-Α, φυσικά παραγόμενα βιοδραστικά ένωση, μπορεί να μοριακά στοχεύουν vimentin, γι ‘αυτό προσπάθησε να αξιολογήσει τις επιπτώσεις της στην ανάπτυξη του όγκου

in vitro

και

in vivo

διαλεύκανση έτσι το ρόλο της βιμεντίνης σε ναρκωτικά επαγόμενη απαντήσεις.

Μέθοδοι και Ευρήματα

Withaferin-Α προκάλεσε έντονη απόπτωση και διάσπαση vimentin σε καρκινικά κύτταρα vimentin εκφράζουν, αλλά σημαντικά λιγότερο σε φυσιολογικά μεσεγχυματικά κύτταρα. Αυτό προ-αποπτωτικών απόκριση καταργήθηκε μετά βιμεντίνη knockdown ή με αποκλεισμό της κασπάσης την επαγόμενη αποικοδόμηση βιμεντίνη μέσω αναστολείς κασπάσης ή υπερέκφραση της μεταλλαγμένης κασπάσης-ανθεκτικά βιμεντίνη. Οι έντονες αντι-αγγειογενετική επιδράσεις της Withaferin-Α αποδείχθηκε, με μόνο ελάχιστες επιδράσεις που παρατηρήθηκαν σε μη-πολλαπλασιαζόμενα ενδοθηλιακά κύτταρα. Επιπλέον, Withaferin-Α μπλοκάρει σημαντικά την ανάπτυξη των μαλακών ιστών σαρκώματος, τοπική υποτροπή, και μετάσταση σε ένα πάνελ των πειραμάτων ξενομοσχεύματος σάρκωμα μαλακών μορίων. Απόπτωση, μειωμένη αγγειογένεση, και η υποβάθμιση vimentin είχαν δει όλα σε δείγματα αντιμετωπίζονται Withaferin-Α.

Συμπεράσματα

Υπό το φως αυτών των ευρημάτων, η αξιολόγηση των Withaferin-Α, τα ανάλογά της, ή άλλα αντι- vimentin θεραπευτικές προσεγγίσεις σε σάρκωμα μαλακών μορίων και «επιθηλιακά σε μεσεγχυματικά μετάβασης» κλινικά πλαίσια δικαιολογείται

Παράθεση:. Lahat G, Zhu QS, Huang KL, Wang S, Bolshakov S, Liu J, et al. (2010) βιμεντίνη είναι ένα μυθιστόρημα Anti-Cancer θεραπευτικός στόχος? Insights από

In Vitro

και

In Vivo

Ποντίκια Ξενομοσχεύματος Σπουδών. PLoS ONE 5 (4): e10105. doi: 10.1371 /journal.pone.0010105

Επιμέλεια: Ιωσήφ Alan Bauer, Ίδρυμα Bauer Έρευνας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 26 Σεπτέμβρη 2009? Αποδεκτές: 3 Μαρτίου 2010? Δημοσιεύθηκε: 16 Απριλίου του 2010

Copyright: © 2010 Lahat et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από NCI /ΝΙΗ R01 CA138345 επιχορήγησης (έως DL) και επιχορήγηση σπόρων Amschwand σάρκωμα Ίδρυμα Καρκίνου (για SW). Το MD Anderson Cancer Κέντρο χαρακτηρισμό κυτταρική γραμμή και κυτταρογενετική βασικές εγκαταστάσεις και οι δύο υποστηρίζονται από NCI Κέντρο Καρκίνου παροχή στήριξης. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Αποτελείται από περισσότερο από 50 ιστολογικών υποτύπων, σάρκωμα μαλακών μορίων (STS) μπορούν να ταξινομηθούν σε δύο μεγάλες ομάδες: τα άτομα με ειδικές γενετικές αλλοιώσεις (μεταθέσεις ή σημειακές μεταλλάξεις) και σχετικά απλή καρυότυποι, και εκείνοι με πολύπλοκες, ασύμμετρες ανευπλοειδικών καρυότυποι [1], [2], [3], [4], [5], [6]. Καλύτερη κατανόηση των μοριακών ανωμαλιών οδήγηση του έναρξη και την εξέλιξη πολλών STS υποτύπων που ανήκουν στην πρώτη ομάδα (π.χ., μεταλλάξεις c-Kit σε γαστρεντερικούς στρωματικούς όγκους [GIST] ή το 17? 22 μετάθεση οδηγώντας σε PDGF-Β υπερ-έκφραση σε δερματοϊνοσάρκωμα protuberans? [DFSP]), έχει οδηγήσει σε κλινικές εφαρμογές της αποτελεσματικής στοχευμένες θεραπείες (π.χ. Imatinib mesylate) με σημαντικά βελτιωμένη έκβαση [6]. Τέτοιες θεραπευτικές εξελίξεις είναι πολύ ενθαρρυντικά και υπογραμμίζουν την ανάγκη για τον εντοπισμό άλλων νέων μοριακών στόχων σε επιπλέον STS υποτύπων

Η πλειοψηφία των STS ανήκουν στη δεύτερη ομάδα υπόθαλψη ανευπλοειδικών καρυότυποι.? Η ομάδα αυτή αποτελείται κυρίως από κακοήθη ινώδη histiocytoma (MFH, που ονομάζεται επίσης και αταξινόμητη πλειομορφικές σάρκωμα [UPS]), λειομυοσαρκωμάτων, κακοήθεις όγκοι περιφερικών νεύρων θήκη (MPNST), και αποδιαφοροποιημένων ή πλειομορφικές λιποσαρκώματα. Ενώ κλινική εικόνα και την ασθένεια εκδηλώσεις ποικίλουν ανάλογα με την ειδική ιστολογική υποτύπου, ως σύνολο, αυτές οι περίπλοκες STS καρυότυπο έχουν μια μελαγχολική πρόγνωση, με ποσοστό επιβίωσης 5-χρόνια μικρότερη από 50%. Παρά τις αρχικές τοπικό έλεγχο (επιτυγχάνεται με χειρουργική επέμβαση, με ή χωρίς ακτινοβολία), τοπικής υποτροπής και συστηματική διάδοση συμβαίνουν συχνά και την έλλειψη αποτελεσματικών θεραπευτικών επιλογών σε αυτές τις κλινικές σενάρια είναι το μεγαλύτερο άλυτο πρόβλημα στο STS. Σε αντίθεση με τη γενετική απλότητα της STS στην πρώτη ομάδα, η βιολογική και μοριακή ποικιλομορφία των πολύπλοκων STS καρυοτύπου περιορίζει σημαντικά την ταυτοποίηση μεμονωμένων και ειδικών εκτροπές «ογκογόνο εθισμός». Ενώ προκλητική, διαλεύκανση νέες θεραπείες που θα μπορούσαν να έχουν χρησιμότητα για ένα ευρύ φάσμα πολύπλοκων STS καρυότυπο είναι ζωτικής σημασίας.

Από τις αρχές της δεκαετίας του 1960, τα φυτά και τα μικρόβια έχουν αποδώσει αρκετά χρήσιμο, φυσικής προέλευσης, μικρά οργανικά μόρια που διαθέτουν αντικαρκινικές ιδιότητες [7], [8], [9], [10].

βιθάνια

(ashwagandha) είναι ένα φαρμακευτικό φυτό που χρησιμοποιείται ευρέως στην ινδική παραδοσιακή ιατρική για τη θεραπεία ένα ευρύ φάσμα διαταραχών [11], [12], [13], [14], [15]. Withaferin-Α (WFA), μια ιδιαίτερα οξυγονωμένο C-28 ergostane τύπου στεροειδή λακτόνη, είναι μια βιοδραστική ένωση που απομονώνεται από

βιθάνια

. WFA παρουσιάζει ποικίλες φαρμακολογικές δραστηριότητες, συμπεριλαμβανομένων αντιφλεγμονώδη, ανοσορυθμιστική και αντιαγγειογόνο δράση [15], [16], [17], [18]. Διάφορες ενδείξεις υποδεικνύουν ότι WFA έχει αντικαρκινικές ιδιότητες, που εκδηλώνεται με την άμεση στόχευση των κυττάρων όγκου και έμμεσα εμποδίζουν [σχετίζονται με όγκους νεοαγγείωση [19], [20]. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι η WFA καταστέλλει την ανάπτυξη ανθρώπινου μαστού και κύτταρα καρκίνου του προστάτη ‘

in vitro

και

in vivo

με επαγωγή απόπτωσης σημειώνονται [19], [21], [22]. WFA επαγόμενη κυτταροσκελετικές αρχιτεκτονική μεταβολή [23], [24], [25], αντιδραστική παραγωγή ειδών οξυγόνου [26], [27], μιτοχονδριακή δυσλειτουργία [26], και proteosomal αναστολή [21] έχουν επίσης προταθεί. Κανονική, μη καρκινογενής κύτταρα βρέθηκαν να είναι περισσότερο ανθεκτικά από καρκινικά κύτταρα για να WFA επαγόμενη απόπτωση [22]? εκλεκτικότητα για τα κακοήθη κύτταρα ενώ διαφυλάσσει τα φυσιολογικά κύτταρα είναι ένα ιδιαίτερα επιθυμητό χαρακτηριστικό των πιθανών αντικαρκινικών θεραπευτικών παραγόντων.

Οι ακριβείς μηχανισμοί δράσης WFA δεν έχουν οριστικοποιηθεί. Αρκετές μοριακοί στόχοι έχουν προταθεί, περιλαμβανομένων του παράγοντα μεταγραφής ΝΡ-κΒ [28], [29]? το μόριο σηματοδότησης AKT [27]? οι προ-αποπτωτικών μορίων PAR-4, FOXO-3, και ΒΙΜ [22]? και οι proteosomal β5 χυμοθρυψίνη υπομονάδα [21]. Μια πρόσφατη μελέτη που χρησιμοποίησε μια χημική γενετική και πρωτεομική δοκιμαζόμενων προσέγγιση [30], στην οποία ένα βιοτινυλιωμένο ανάλογο WFA χρησιμοποιήθηκε ως ανιχνευτής για να γκρεμίσει τους εταίρους δεσμευτική WFA στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Η στρατηγική αυτή είχε ως αποτέλεσμα την ταυτοποίηση βιμεντίνης, ενός τύπου III ενδιάμεσο νήμα, ως νέου υπόστρωμα WFA. Επιπλέον, WFA τροποποιημένων βιμεντίνη βρέθηκε να προκαλούν σημαντική προ-απόπτωσης και αντιαγγειογόνο δράση, ενώ vimentin νοκ ντάουν οδήγησε σε μειωμένη ευαισθησία WFA. Αυτά τα πειράματα προσφέρουν διορατικότητα δραστηριότητα WFA και να τονίσει την πιθανή χρησιμότητα της βιμεντίνης ως νέο αντικαρκινικό θεραπευτικό στόχο.

STS είναι μεσεγχυματικά και ως εκ τούτου, όλα εκφράζουν vimentin, ανεξάρτητα από την ιστολογική υποτύπου τους. Κατά συνέπεια, είναι εύλογο ότι αντι-βιμεντίνη θεραπευτικές στρατηγικές δύνανται προκαλούν ανεπιθύμητες-STS αντι σε ένα ευρύ φάσμα των STS. Η υπόθεση αυτή μας ώθησε να διαπιστωθεί η επίδραση της WFA σε πολύπλοκες STS καρυότυπος

in vitro

και

in vivo

. Χρησιμοποιήσαμε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές που αντιπροσωπεύουν λειομυοσάρκωμα, MPNST, ινοσάρκωμα, και η UPS /πλειομορφικές λιποσάρκωμα να αξιολογήσει τον αντίκτυπο της βιμεντίνης στην ευαισθησία WFA. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι STS είναι πολύ ευαίσθητα σε WFA, ένα αποτέλεσμα που είναι πολύ πιο έντονη από ό, τι σε επιθηλιακά καρκίνους vimentin αρνητικά. WFA επάγει μια κασπάσης-εξαρτώμενη αποδόμηση της βιμεντίνης, με αποτέλεσμα αξιοσημείωτη anoikis-ανεξάρτητης απόπτωσης και STS-συνδέονται αντιαγγειογόνο δράση. Τα αποτελέσματα υποστηρίζουν σθεναρά την αξιολόγηση της WFA ή αναλόγων της ως νέα κλινική στρατηγική για τους ασθενείς που φιλοξενούν αυτές τις καταστροφικές κακοήθειες.

Αποτελέσματα

σάρκωμα κύτταρα είναι ιδιαίτερα ευαίσθητα σε WFA

Για να αξιολογηθεί η επίδραση της WFA σε πολύπλοκες STS καρυότυπος έχουμε επιλέξει μια ομάδα ανθρώπινες κυτταρικές σειρές STS εκπροσωπούν ινοσαρκώματος (ΗΤ1080), λειομυοσάρκωμα (SKLMS1), MPNST (STS26T), και υψηλής ποιότητας πλειομορφικές σάρκωμα /λιποσάρκωμα (PLS-1). Αυτή η τελευταία κυτταρική γραμμή έχει πρόσφατα συσταθεί στο εργαστήριό μας (βλ δεδομένων S1 και το σχήμα S1 για περισσότερες λεπτομέρειες). Η επεξεργασία των παραπάνω κυττάρων με WFA οδήγησε σε σημαντική μείωση του αριθμού των προσκολλημένων κυττάρων και μορφολογικές αλλαγές που σημειώνονται, συμπεριλαμβανομένων των κυττάρων-στρογγυλοποίησης και πυρηνική συμπύκνωση (Σχήμα 1Α). Τα αποτελέσματα της WFA συνέβη ήδη 2 ώρες μετά την έναρξη της θεραπείας και ήταν δόση και το χρόνο-εξαρτώμενη (Εικόνα S2). δοκιμασίες ανάπτυξης κυττάρου κατέδειξε WFA επαγόμενη, δοσοεξαρτώμενη μείωση στην ανάπτυξη των κυττάρων STS (Σχήμα 1Β). Η μέση ± SD WFA IC

50 τιμές (μετά από 24 ώρες της θεραπείας) καταγράφηκαν ως 0,4 μΜ ± 0.07, 0.41 μΜ ± 0,03, 0,37 μΜ ± 0,12, και 0,53 μΜ ± 0.1, για ΗΤ1080, SKLMS1, STS26T, και PLS -1, αντίστοιχα. Ομοίως, οι χαμηλές δόσεις της WFA (0,5 μΜ) αναστέλλεται σημαντικά την ικανότητα σχηματισμού αποικιών STS κυττάρων (Σχήμα 1C). Τέλος, η επίδραση της WFA για STS αγκύρωση ανεξάρτητη ανάπτυξη διερευνήθηκε. Όλα τα κύτταρα STS αξιολογήθηκαν κατέδειξαν την ικανότητα να αναπτύσσονται σε μαλακό άγαρ? Η ανάπτυξη αυτή καταργήθηκε μετά από 24 ώρες από WFA (0,5 μΜ) αγωγή (Σχήμα 1 D). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι τα ανθρώπινα STS κύτταρα είναι πολύ ευαίσθητα στις ανασταλτικές δράσεις ανάπτυξης του WFA.

A)

θεραπεία WFA (1 μΜ /24 h) οδηγεί σε σημειώνονται μορφολογικές αλλαγές, συμπεριλαμβανομένων των κυττάρων-στρογγυλοποίησης και πυρηνική συμπύκνωση, το STS κύτταρα?

Β)

δοκιμασίες MTS επιδείξουν WFA που προκαλείται, δοσο-εξαρτώμενη μείωση στην κυτταρική ανάπτυξη STS?

C)

WFA (0,5 μΜ /24 h) αισθητά αναστέλλει STS ικανότητα σχηματισμού αποικίας των κυττάρων μετρήθηκε μετά από δέκα ημέρες?

D)

WFA (0,5 μΜ /24 h) καταργεί STS κύτταρο αγκύρωση ανάπτυξη ανεξάρτητη μετρήθηκε μετά από τρεις εβδομάδες. Γραφήματα αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο των τριών επαναλαμβανόμενων πειραμάτων ± SD.

Η

WFA προκαλεί σημειώνονται απόπτωση σε STS κύτταρα, αλλά λιγότερο απόπτωση σε κανονικούς ανθρώπινους ινοβλάστες και μυογενή κύτταρα

Για να αξιολογηθεί η επίδραση της WFA για STS κυτταρική επιβίωση, πραγματοποιήσαμε αναλύσεις Annexin V /FACS. STS κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις WFA (0-5 μΜ) για 4 ώρες και 24 ώρες? μια σημαντική επαγωγή της απόπτωσης ήταν εμφανής ακόμη και μέσα στο σύντομο χρονικό διάστημα, ιδίως όταν χρησιμοποιούνται υψηλές δόσεις (& gt? 2,5 μΜ, ρ & lt? 0,05? Σχήμα 2Α). Μια δόση και το χρόνο-εξαρτώμενη αύξηση στην απόπτωση των καρκινικών κυττάρων παρατηρήθηκε σε όλα τα κύτταρα που εξετάστηκαν. επαγωγή απόπτωσης αντικατοπτρίζεται και στην παρατηρούμενη αύξηση της κασπάσης 3 και διάσπαση PARP ενεργοποιηθεί (ανάλυση Western blot [WB]? Σχήμα 2Β)

Α)

Annexin-V /FACS αναλύσεις αποδεικνύοντας σήμανση. WFA επαγόμενη απόπτωση σε κύτταρα STS (μαύρες ράβδοι αντιπροσωπεύουν 4 ώρες θεραπείας WFA και γκρι μπάρες αντιπροσωπεύουν 24 ώρες)?

Β)

WFA (1 μΜ /24 ώρες) προκαλεί κασπάσης-3 (ενεργοποίηση Casp-3) διάσπαση και PARP σε STS κύτταρα (ανάλυση WB)?

C)

STS κύτταρα είναι ανθεκτικά σε anoikis σύγκριση με τα φυσιολογικά ανθρώπινους δερματικούς ινοβλάστες (NHDF). WFA (1 μΜ /24 ώρες) επάγει την απόπτωση στα δύο επισυνάπτεται και κυμαινόμενου STS κύτταρα?

D)

ηλεκτρονική μικροσκοπία μετάδοσης (ΤΕΜ) φωτογραφίες που απεικονίζουν STS απόπτωση των κυττάρων (μεγάλο βέλος-πυρηνική συμπύκνωση, μικρό βέλος-κυτταροπλασματική διόγκωση) σε απάντηση WFA. Νέκρωση αποδεικνύεται στην πλωτή STS κύτταρα?

Ε)

NHDF είναι πιο ανθεκτικά στις επιδράσεις της WFA (IC50: 3,7 μΜ ± 0,15) σε σύγκριση με STS κύτταρα. Διαγράμματα αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο τριών πειραμάτων ± επαναλαμβανόμενων SD.

Η

Στη συνέχεια, αξιολογήσαμε εάν WFA επαγόμενη απόπτωση μπορεί να αποδοθεί στην απώλεια των κυττάρων του όγκου του πρόσφυση και την απόσπαση από την πλάκα καλλιέργειας, με αποτέλεσμα anoikis. Κανονική ανθρώπινους δερματικούς ινοβλάστες (NHDF) υποβλήθηκαν σημαντική απόπτωση όταν καλλιεργούνται σε εναιώρημα, ενώ STS κύτταρα ήταν ανθεκτικά σε anoikis και καμία σημαντική αύξηση στην απόπτωση μπορεί να παρατηρηθεί (Εικόνα 2C). WFA αυξημένη απόπτωση των δύο επισυνάπτεται και κυμαινόμενο STS κύτταρα.

WFA απόπτωση επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με τη χρήση ηλεκτρονικής μικροσκοπίας μετάδοσης (ΤΕΜ). Σημάδια της απόπτωσης, συμπεριλαμβανομένης συμπύκνωσης χρωματίνης και κυτταρόπλασμα συρρίκνωση, ήταν εμφανής μέσα σε 4 ώρες. Μετά από 24 ώρες, με την ένδειξη απόπτωση παρατηρήθηκε, μαζί με την απώλεια πυρηνική μεμβράνη και κυτταροπλασματική διόγκωση? Οι επιδράσεις αυτές παρατηρήθηκαν και στις δύο επισυνάπτεται και κυμαινόμενου STS κύτταρα. Πλωτή νεκρωτικό STS κύτταρα παρατηρήθηκαν επίσης (~20-30% των συνολικών επιπλέοντα κύτταρα).

Τέλος, θα αξιολογηθεί η επίδραση της WFA σε φυσιολογικά μεσεγχυματικά κύτταρα (Σχήμα 2Ε και S3). Πρωτογενείς καλλιέργειες NHDF και ανθρώπινων εντερικών κυττάρων λείων μυών (HISMC) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αυξανόμενες δόσεις WFA για 24 ώρες. Σε αντίθεση με τις παρατηρήσεις μας σε STS κύτταρα, μειώσεις του αριθμού των κυττάρων και μορφολογικές αλλαγές ήταν εμφανείς με μικροσκοπία μόνο μετά από υψηλές δόσεις WFA (& gt? 2,5 μΜ). Μέση τιμή ± SD WFA IC

50 τιμές ήταν 3,7 μΜ ± 0,15 και 3,2 μΜ ± 0,21 για NHDF και HISMC, αντίστοιχα. Αυτές οι τιμές ήταν περισσότερο από 9 φορές υψηλότερες από εκείνες που παρατηρούνται σε STS κύτταρα. Ομοίως, WFA προκάλεσε σημαντικά χαμηλότερο ποσοστό απόπτωσης σε αυτά τα φυσιολογικά κύτταρα (P & lt? 0,05). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι WFA είναι ένας ισχυρός προαποπτωτική ένωσης. STS κύτταρα είναι ιδιαίτερα ευαίσθητα σε WFA, ενώ τα φυσιολογικά μεσεγχυματικά κύτταρα είναι πιο ανθεκτικά στις επιπτώσεις της.

WFA καταργεί τη μετανάστευση STS κυττάρων και εισβολή

Στη συνέχεια εκτιμήσαμε την επίδραση της WFA για STS μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή. STS κύτταρα προκατεργάστηκαν με χαμηλές δόσεις WFA (0,5 μΜ) για 4 ώρες, στο οποίο σημείο WFA πλύθηκε off προσεκτικά και μια γρατσουνιά πληγή δοκιμασία επούλωσης διεξήχθη. Παρατηρήσαμε μια σημαντική μείωση της μετανάστευσης (Σχήμα S4A). Επιπλέον, τροποποιημένους θαλάμους Boyden χρησιμοποιήθηκαν για την ποσοτικοποίηση της επίδρασης της WFA για τη μετανάστευση και εισβολή. STS κύτταρα προκατεργάστηκαν με μια χαμηλή δόση WFA (0,5 μΜ) για 4 ώρες. Μετά τη διακοπή της WFA, τα κύτταρα πλύθηκαν και μετρήθηκαν? μόνο βιώσιμα κύτταρα περαιτέρω χρησιμοποιηθούν. WFA αναστέλλει σημαντικά τη μετανάστευση και την εισβολή σε όλα τα κύτταρα STS εξετάστηκαν (Ρ & lt? 0,05? Σχήμα S4B).

Ένα πιθανό προειδοποίηση σε αυτά τα πειράματα είναι ότι η επίδραση καταδεικνύεται μπορεί να αντανακλά αντιαποπτωτικού ή ανασταλτική της ανάπτυξης επιδράσεις της WFA αντί άμεσες επιπτώσεις της στην κινητικότητα και /ή εισβολή. Για την αντιμετώπιση αυτής της δυνατότητας, σε συνδυασμό με τα παραπάνω πειράματα, μπορούμε προεπεξεργασμένα STS κύτταρα με χαμηλή δόση WFA (0,5 μΜ για 4 ώρες) ή DMSO (έλεγχος)? σε διακοπή της WFA, τα κύτταρα πλύθηκαν και μετρήθηκαν, και βιώσιμα κύτταρα επανα-επιχρυσωμένο. Κυττάρων μετρώντας στο τέλος του πειράματος έδειξε μόνο μια μικρή μείωση (& lt? 10%) του αριθμού των βιώσιμων κυττάρων WFA επεξεργασμένα σε σχέση με τον αριθμό των κυττάρων ελέγχου που έλαβαν (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η WFA καταργεί STS κυτταρική κινητικότητα και την εισβολή.

WFA προκαλεί υποβάθμιση βιμεντίνη και βιμεντίνης νοκ ντάουν μειώνει την ευαισθησία των κυττάρων στην WFA

Μια πρόσφατη μελέτη εντόπισε vimentin ως πιθανή μοριακό στόχο WFA [30]. Ως εκ τούτου, αξιολογήσαμε την επίδραση της WFA για βιμεντίνη έκφρασης και την υποβάθμιση. θεραπεία WFA οδήγησε σε μειωμένα επίπεδα βιμεντίνη πλήρους μήκους και αυξημένη έκφραση των προϊόντων αποδόμησης βιμεντίνης σε όλα τα κύτταρα STS δοκιμάστηκαν (Εικόνα 3Α). WFA επίδραση στη βιμεντίνη είναι δόση και το χρόνο που εξαρτώνται? υψηλές συγκεντρώσεις WFA να οδηγήσει σε διάσπαση vimentin μετά από μόνο 4 ώρες θεραπείας, ενώ η υποβάθμιση vimentin παρατηρείται μετά από 24 ώρες με χαμηλότερες δόσεις.

Α)

θεραπεία WFA (5 μΜ /4 ώρες) αποτελέσματα σε μειωμένα επίπεδα πλήρους μήκους (FL) βιμεντίνη και αυξημένη έκφραση των προϊόντων αποδόμησης βιμεντίνης (VDP) σε όλες τις STS κύτταρα που εξετάστηκαν. Μία δοσοεξαρτώμενη επίδραση WFA σε κύτταρα SKLMS1 αγωγή για 4 h δείχνεται επίσης. διάσπαση βιμεντίνης παρατηρείται δευτερεύουσα σε χαμηλές συγκεντρώσεις WFA μετά από 24 ώρες θεραπείας?

Β)

αντι-βιμεντίνη SMARTpool siRNA (20 nM) προκαλεί σημαντική μείωση της έκφρασης vimentin στα κύτταρα SKLMS1 (WB). Βιμεντίνης knockdown ουσιαστικά μπλοκ WFA επαγόμενη (1 μΜ /24 hr) απόπτωση?

C)

ενδογενής vimentin για πρώτη φορά γκρέμισε στα κύτταρα SKLMS1 χρησιμοποιώντας αντι-βιμεντίνη αντιπληροφοριακά ολιγομερή φωσφοροδιαμιδικός μορφολινο. Μετά knockdown, βιμεντίνη ήταν βίαια εκ νέου εκφράζεται στα κύτταρα (WB). Παρόμοια με τα αποτελέσματα του siRNA knockdown, αντι-βιμεντίνη ολιγομερή μορφολινο σημαντικά μπλοκ WFA επαγόμενη (1 μΜ /24 hr) απόπτωση. Re-έκφραση της βιμεντίνης επαναφέρει SKLMS1 ευαισθησία στο WFA?

D)

STS κύτταρα (SKLMS1 και PLS1) εκφράζουν σημαντικά υψηλότερα επίπεδα διαλυτών βιμεντίνης σε σύγκριση με τα φυσιολογικά κύτταρα μεσεγχυματικά (λεία μυϊκά κύτταρα: HA-SMC και HC-SMC και ινοβλάστες: NHDF). (ΝΤ siRNA = μη στόχευση siRNA, Vim siRNA = αντι-βιμεντίνη siRNA smartpool? ΝΤ μορφολινο μορφολινο = μη στόχευση? Vim KD = vimentin νοκ ντάουν)

Η

Για να καθοριστεί εάν η επίδραση της WFA για STS κύτταρα είναι τουλάχιστον εν μέρει, με τη μεσολάβηση βιμεντίνης, που επέλεξε να χρησιμοποιήσει μια προσέγγιση vimentin νοκ ντάουν. Αντι-βιμεντίνη SMARTpool siRNA προκάλεσε σημαντική μείωση στην έκφραση vimentin στα κύτταρα SKLMS1 (WB? Σχήμα 3Β). Βιμεντίνης knockdown

per se

δεν προκάλεσε σημαντική απόπτωση σε κύτταρα STS, σε σύγκριση με ψευδο ή μη στόχευση διαμόλυνση siRNA. Όπως ήταν αναμενόμενο σύμφωνα με τα παραπάνω πειράματα, η θεραπεία WFA οδήγησε σε σημαντική απόπτωση σε ψευδο και μη επιμολυσμένα κύτταρα στόχευση siRNA. Ωστόσο, βιμεντίνη knockdown μπλοκάρει ουσιαστικά WFA επαγόμενη απόπτωση. Μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η WFA επαγόμενη αποικοδόμηση βιμεντίνη είναι απαραίτητη για ενισχυμένο θεραπευτικό αποτέλεσμα.

Για να επιβεβαιωθεί ο πιθανός ρόλος της βιμεντίνης σε WFA απόπτωση, χρησιμοποιήσαμε ένα διάσωσης πειραματική προσέγγιση. Η ενδογενής vimentin για πρώτη φορά γκρέμισε στα κύτταρα SKLMS1 χρησιμοποιώντας αντι-βιμεντίνη αντιπληροφοριακά ολιγομερή φωσφοροδιαμιδικός μορφολινο. Αυτές μορφολινο στοχεύουν βιμεντίνη προ-mRNA, επιτρέποντας έτσι την αναγκαστική επανέκφραση του βιμεντίνη με επιμόλυνση ένας βιμεντίνη κατασκεύασμα ανθεκτικά στην συνεχή παρουσία των ολιγομερών μορφολινο. Μετά knockdown, βιμεντίνη ήταν βίαια εκ νέου εκφράζεται στα κύτταρα (WB, Εικόνα 3C)? κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με WFA ή DMSO ως έλεγχος και υποβλήθηκαν σε ανάλυση αννεξίνης V /FACS. Παρόμοια με τα αποτελέσματα του siRNA knockdown, θεραπεία αντι-βιμεντίνη ολιγομερή μορφολινο μπλοκαριστεί σημαντικά WFA επαγόμενη απόπτωση. Re-έκφραση της βιμεντίνης αποκατασταθεί SKLMS1 ευαισθησία σε WFA (Εικόνα 3C).

Και οι δύο STS κύτταρα και φυσιολογικά μεσεγχυματικά κύτταρα εκφράζουν βιμεντίνη. Ωστόσο, όπως φαίνεται στο Σχήμα 2, WFA επάγει πιο σημαντική προ-αποπτωτικά αποτελέσματα σε STS κύτταρα σε σύγκριση με τα φυσιολογικά κύτταρα μεσεγχυματικά (δηλ ινοβλάστες και μυϊκά κύτταρα). Οι προηγούμενες δημοσιευμένα δεδομένα που περιγράφεται παραπάνω (30) που προσδιορίζονται WFA να συνδέεται με τετραμερή, διαλυτά βιμεντίνη. Έτσι, επιδιώξαμε να αξιολογήσει τα επίπεδα αυτού του κλάσματος βιμεντίνης σε φυσιολογικά STS εναντίον κυττάρων. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3D, τα κύτταρα όγκου εκφράζουν σημαντικά υψηλότερα επίπεδα διαλυτών, δωρεάν βιμεντίνη σε σύγκριση με την κανονική μεσεγχυματικά κύτταρα. Το εύρημα αυτό προσφέρει μια πιθανή εξήγηση για την παρατηρούμενη διαφορά των αποτελεσμάτων WFA μας.

WFA που προκαλείται υποβάθμιση βιμεντίνη είναι κασπάσης-εξαρτώμενη

βιμεντίνης υποβάθμισης εμφανίζεται συνήθως μέσα από την ενεργοποίηση της οδού κασπάσης. Για να αξιολογηθεί το κατά πόσον WFA επαγόμενη αποικοδόμηση βιμεντίνη είναι αποτέλεσμα της διάσπασης κασπάσης, έχουμε προεπεξεργασμένα STS με Z-VAD (Promega, Madison, WI), ένας αναστολέας παν-κασπάσης, πριν από τη θεραπεία WFA (για 24 ώρες). Z-VAD προεπεξεργασία είχε ως αποτέλεσμα μειωμένη αποικοδόμηση βιμεντίνη σε συνδυασμό με χαμηλότερα επίπεδα τόσο διασπασμένη κασπάση-3 και ενεργοποιούνται PARP (Σχήμα 4Α). Επιπλέον, Z-VAD προεπεξεργασία ακύρωσε σημαντικά WFA επαγόμενη απόπτωση (μετά από 24 ώρες θεραπείας WFA) σε STS κύτταρα (Σχήμα 4Β). Στη συνέχεια, μετά από βιμεντίνη knockdown χρησιμοποιώντας oligos μορφολινο, κύτταρα SKLMS1 επιμολύνθηκαν για να εκφράσουν είτε βιμεντίνη άγριου τύπου ή μεταλλαγμένη βιμεντίνη σε θέσεις διάσπασης κασπάσης (D85N και D259N). WFA (1 μΜ) προκάλεσε σημαντική απόπτωση σε βιμεντίνη επιμολυσμένα κύτταρα άγριου τύπου στις οποίες παρατηρήθηκαν αποικοδόμηση βιμεντίνη και την ενεργοποίηση της κασπάσης-3 (Σχήμα 4C). Ωστόσο, παρατηρήσαμε μια σημαντική μείωση της WFA επαγόμενη απόπτωση σε κύτταρα που εκφράζουν το μεταλλαγμένο βιμεντίνη, και έχουμε παρατηρήσει μια δραματική μείωση τόσο της υποβάθμισης βιμεντίνη και την ενεργοποίηση της κασπάσης-3 (Σχήμα 4C). Στο σύνολό τους, τα στοιχεία αυτά υποδηλώνουν μια πιθανή WFA που προκαλείται από τον φαύλο κύκλο, όπου WFA σύνδεση με vimentin προκαλεί υποβάθμιση του από κασπάσες και είπε τα αποτελέσματα υποβάθμιση στην πρόσθετη ενεργοποίηση της κασπάσης και απόπτωση.

Α)

Pretreatement (4 ώρες) κυττάρων SKLMS1 με Z-VAD (ένας αναστολέας παν-κασπάσης) οδηγεί σε μειωμένη WFA επαγόμενη (24 h) αποικοδόμηση βιμεντίνη σε συνδυασμό με χαμηλότερα επίπεδα τόσο διασπασμένη κασπάση-3 και ενεργοποιούνται PARP?

Β)

Z-VAD (4 ώρες) προεπεξεργασία καταργεί σημαντικά WFA επαγόμενη (24 h) απόπτωσης σε κύτταρα SKLMS1?

C)

βιμεντίνης γκρέμισε κύτταρα SKLMS1 επιμολύνθηκαν για να εκφράσουν είτε vimentin άγριου τύπου ή βιμεντίνη μεταλλαχθεί σε θέσεις διάσπασης κασπάσης (D85N και D259N). WFA (1 μΜ /24 hr) προκαλεί έντονη απόπτωση σε άγριου τύπου βιμεντίνη επιμολυσμένα κύτταρα στα οποία μπορεί να ανιχνευθεί αποδόμηση βιμεντίνη και την ενεργοποίηση της κασπάσης-3 (WB). Ωστόσο, μια σημαντική μείωση στην WFA επαγόμενη απόπτωση σε κύτταρα που εκφράζουν το μεταλλαγμένο βιμεντίνη, παρατηρείται καθώς και μια μείωση τόσο της υποβάθμισης βιμεντίνη και την ενεργοποίηση της κασπάσης-3. (WT Vim = άγριου τύπου βιμεντίνης? Μουτ Vim = μεταλλαγμένο vimentin? Vim FL = πλήρους μήκους vimentin? Προϊόντα VDP = υποβάθμιση vimentin)

Η

WFA που προκαλείται από μοριακά απορυθμίσεις είναι, τουλάχιστον εν μέρει, με τη μεσολάβηση vimentin

Διάφοροι μοριακοί μηχανισμοί έχουν προταθεί στο παρελθόν για τη βάση WFA αντι-ογκογόνο δράση συμπεριλαμβανομένων των αναστολή της φωσφορυλίωσης ΑΚΤ [27], κατάργηση του ΝΡ-κΒ λειτουργία [20], [31], και η αναστολή απευθείας proteosomal [21] . Επιδιώξαμε πρώτος που θα αξιολογήσει κατά πόσον αυτές οι μοριακές απορρυθμίσεις συμβαίνουν σε STS κύτταρα σε ανταπόκριση στη θεραπεία WFA. Παρατηρήσαμε μια WFA δόση και το χρόνο-εξαρτώμενη μείωση στην ρΑΚΤ επίπεδα, αλλά όχι συνολικά επίπεδα ΑΚΤ, σε STS κύτταρα (Σχήμα 5Α). Παρομοίως, μία εξαρτώμενη από τη δόση μείωση στην ΝΡ-κΒ (ρ65) αποδείχθηκε επίσης, αν και η μείωση αυτή συνέβη μόνο μετά από 24 ώρες θεραπείας. δραστικότητα ΝΡ-κΒ, από την άλλη πλευρά, αποδείχθηκε ότι αναστέλλεται νωρίς μετά τη θεραπεία, υποδηλώνοντας μηχανισμούς άλλους από μειωμένη έκφραση πρωτεΐνης ΝΡ-κΒ που επηρεάζουν δραστικότητα ΝΡ-κΒ. Επιπλέον, βρήκαμε μια σημαντική δόση και το χρόνο που εξαρτάται από τη συσσώρευση των ουβικουιτινωμένης πρωτεϊνών, υποστηρίζοντας WFA που προκαλείται από την αναστολή proteosomal σε αυτά τα κύτταρα.

Α)

θεραπεία WFA επάγει μία δόση και το χρόνο – δοσοεξαρτώμενη μείωση της ρΑΚΤ χωρίς επίδραση στη συνολική ΑΚΤ. Παρομοίως, μία εξαρτώμενη από τη δόση μείωση στην πρωτεϊνική έκφραση ΝΡ-κΒ (ρ65) φαίνεται επίσης, αν και αυτή η μείωση λαμβάνει χώρα μόνο μετά από 24 ώρες θεραπείας. δραστικότητα ΝΡ-κΒ σε κύτταρα PLS1, όπως απεικονίζεται στις γραφικές παραστάσεις αντιπροσωπεύουν τα αποτελέσματα του προσδιορισμού λουσιφεράσης ανταποκριτή, δείχνεται να αναστέλλεται νωρίς μετά τη θεραπεία (4 ώρες). Μια αξιοσημείωτη δόση και το χρόνο-εξαρτώμενη συσσώρευση των πρωτεϊνών ουβικουιτινωμένης δείχνεται επίσης?

Β)

βιμεντίνης knockdown σε κύτταρα SKLMS1 καταργεί WFA (2,5 μΜ /24 h) προκληθείσα ρΑΚΤ αναστολή, NF-κΒ μείωση πρωτεΐνης, και αυξημένα επίπεδα πρωτεΐνης ουβικιτινίωση. Ομοίως, μπλοκ βιμεντίνη knockdown WFA (1 μΜ /4 h) προκληθείσα μείωση της δραστηριότητας του ΝΡ-κΒ. Γραφήματα αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο των τριών επαναλαμβανόμενων πειραμάτων ± SD.

Η

Τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν έναν κεντρικό ρόλο για βιμεντίνη σε απάντηση κυττάρων να WFA. Έτσι, επιδιώξαμε να αξιολογήσει κατά πόσον τα αποτελέσματα της WFA σε αυτές τις διαφορετικές πορείες μπορεί, τουλάχιστον εν μέρει, να διαμεσολαβείται από βιμεντίνη. κύτταρα SKLMS1 επιμολύνθηκαν παροδικά με αντι-βιμεντίνη siRNA ή μη στόχευση siRNA και στη συνέχεια κατεργάζεται με WFA. Βιμεντίνης knockdown κατήργησε WFA επαγόμενη ρΑΚΤ αναστολή, μείωση των πρωτεϊνών και δραστικότητα αποκλεισμός ΝΡ-κΒ, και αυξημένα επίπεδα πρωτεΐνης ουβικιτινίωση (Σχήμα 5Β). Αυτά τα πειράματα παρέχουν περαιτέρω ενδείξεις ότι οι συνέπειες της WFA μεσολάβηση βιμεντίνη και αναδεικνύουν νέες δυνητικές λειτουργίες vimentin.

WFA επάγει απόπτωση σε ενδοθηλιακά κύτταρα καλλιεργούνται σε STS-εγκαταστημένα μέσα

Ανάλογα με τα στερεά κακοήθειες, STS αποτελούνται από δύο όγκων και που σχετίζονται με όγκους φυσιολογικά κύτταρα? ανάπτυξη STS, τη μετανάστευση, και τη διάδοση εξαρτώνται από την cross-talk μεταξύ αυτών των δύο διαμερισμάτων. STS είναι γενικά πολύ αγγειακές και αγγειογόνων, με αποτέλεσμα την αύξηση μεταστατικό δυναμικό. Προηγούμενη δεδομένα υποδηλώνουν ότι η WFA μπορεί να φιλοξενούν αντιαγγειογενετικές ιδιότητες [17], [30]. Για την περαιτέρω επέκταση αυτών αρχικές παρατηρήσεις και την αξιολόγηση των πιθανών αντιαγγειογόνο δράση του WFA στο πλαίσιο του μικροπεριβάλλοντος STS, αξιολογήσαμε την επίδραση της WFA επί ενδοθηλιακών κυττάρων που καλλιεργούνται σε κανονικό μέσο ελέγχου (που στερείται αγγειογόνων παραγόντων, μιμούμενη ηρεμίας ενδοθηλιακά κύτταρα) και στα ενδοθηλιακά κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε STS-ρυθμισμένο μέσο (CM? μιμούνται πολλαπλασιαζόμενων αγγειογόνων ενδοθηλιακών κυττάρων). Χρησιμοποιήσαμε δύο ανθρώπινα ενδοθηλιακά (HDMEC) και ενδοθηλιακά κύτταρα ποντικού (LEC) και παρατηρήθηκαν σημαντικά υψηλότερη WFA επαγόμενη αναστολή της ανάπτυξης σε ενδοθηλιακά κύτταρα καλλιεργούνται σε STS-CM από ό, τι μέσο ελέγχου (Mean ± SD WFA IC

50: 0,42 μΜ ± 0,16 έναντι 1,4 μΜ ± 0,04 σε HDMEC και 0,38 μΜ ± 0,09 έναντι 2,3 μΜ ± 0.1 σε LEC? Ρ & lt? 0,05, Σχήμα 6Α). Ομοίως, WFA που προκαλείται από τα υψηλότερα επίπεδα της απόπτωσης στα ενδοθηλιακά κύτταρα που αναπτύσσονται σε STS-CM σε σχέση με το μέσο ελέγχου (Εικόνα 6Β).

Α)

Ένα σημαντικά υψηλότερο ποσοστό των WFA που προκαλείται (24 h ) αναστολή της ανάπτυξης παρατηρείται σε ενδοθηλιακά κύτταρα (ανθρώπινα δερματικά μικροαγγείων ενδοθηλιακά κύτταρα-HDMEC και ποντικού ενδοθηλιακά κύτταρα του πνεύμονα-LEC) καλλιεργήθηκαν σε STS ρυθμισμένο μέσο (CM) από ό, τι στον έλεγχο κανονικό μέσο (RM)?

Β)

WFA (1 μΜ /24 ώρες) προκαλεί υψηλότερα επίπεδα απόπτωσης στα ενδοθηλιακά κύτταρα που αναπτύσσονται σε STS-CM σε σχέση με το μέσο ελέγχου?

C)

WFA (1 μΜ /24 ώρες) προκαλεί σημαντικά υψηλότερα ποσοστά της υποβάθμισης βιμεντίνης και ενεργοποίηση της κασπάσης-3 σε ενδοθηλιακά κύτταρα που αναπτύσσονται σε STS-CM ό, τι σε ηρεμία ενδοθηλιακά κύτταρα?

D)

WFA (1 μΜ) καταργεί τη μετανάστευση και την εισβολή ενδοθηλιακών κυττάρων καλλιεργούνται σε STS-CM?

Ε)

WFA (2 mg /kg) έχει σαν αποτέλεσμα μια σημαντική μείωση του μέσου αριθμού των CD31-θετικών (κόκκινο) τα αιμοφόρα αγγεία σε σύγκριση με τον έλεγχο της θεραπείας DMSO σε

in vivo δοκιμασία

Gelfoam . CD-31 (κόκκινο) /ΤΟΥΝΕΛ (πράσινο) διπλή χρώση αποκαλύπτει απόπτωση των ενδοθηλιακών κυττάρων σε ποντίκια WFA-θεραπεία. Διαγράμματα αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο τριών πειραμάτων ± επαναλαμβανόμενων SD. (Vim FL = πλήρους μήκους vimentin? VDP = vimentin προϊόντων αποδόμησης)

Η

Τα ενδοθηλιακά κύτταρα είναι μεσεγχυματικά στην καταγωγή και ως εκ τούτου εκφράζουν βιμεντίνης, έτσι ώστε να αξιολογηθεί η επίδραση της WFA στην έκφραση βιμεντίνη και διάσπαση σε δύο τακτικές μέσα ενημέρωσης και STS-CM. Είναι ενδιαφέρον, WFA επάγεται σημαντικά υψηλότερα ποσοστά αποικοδόμησης βιμεντίνη και την ενεργοποίηση της κασπάσης-3 σε ενδοθηλιακά κύτταρα που αναπτύσσονται σε STS-CM ό, τι σε ηρεμία ενδοθηλιακά κύτταρα (Σχήμα 6C). Στη συνέχεια, αξιολογήθηκε η επίδραση της WFA επί μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων και εισβολή. Παρόμοια με την προηγουμένως περιγραφείσα πειραματική προσέγγιση που χρησιμοποιείται με STS κύτταρα, χρησιμοποιήσαμε βιώσιμων ενδοθηλιακών κυττάρων προεπεξεργασία με βραχυπρόθεσμη WFA (4 ώρες) σε τροποποιημένο προσδιορισμούς θάλαμο Boyden. Όπως αναμενόταν, STS-CM ενισχυμένη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων και την εισβολή. Πιο σημαντικό, WFA κατήργησε τη μετανάστευση και την εισβολή των ενδοθηλιακών κυττάρων που καλλιεργούνται σε STS-CM, αλλά δεν είναι ότι εκείνοι που καλλιεργούνται σε κανονικό μέσο (Σχήμα 6D).

Τέλος, για να επιβεβαιώσετε ότι εμφανίζεται η παρατηρούμενη WFA αντιαγγειογόνο δράση

in vivo

καθώς, πραγματοποιήσαμε μια Gelfoam δοκιμασία αγγειογένεσης σφουγγάρια Gelfoam επωάστηκαν σε STS-CM και εμφυτεύεται υποδορίως στα πλευρά των ποντικών SCID. Δύο ημέρες μετά την εμφύτευση, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή με ε.π. WFA (2 mg /kg? Η = 4) ή DMSO (n = 4) για 10 συνεχόμενες ημέρες? κατά τον τερματισμό της μελέτης, οι Gelfoams αποκόπηκαν και υποβλήθηκαν σε ανάλυση IHC (Σχήμα 6Ε). θεραπεία WFA οδήγησε σε σημαντική μείωση του μέσου αριθμού των CD31-θετικών αγγείων σε σύγκριση με τον έλεγχο της θεραπείας DMSO (41 ± 7.2 έναντι 6 ± 5,3, αντίστοιχα? Ρ & lt? 0,05). CD-31 /TUNEL διπλή χρώση αποκάλυψε απόπτωση των ενδοθηλιακών κυττάρων σε ποντίκια WFA φάρμακο. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι WFA καταργεί δυνητικά την κυτταρική ανάπτυξη, αναστέλλει τη μετανάστευση και την εισβολή, και επάγει την απόπτωση σε πολλαπλασιαζόμενα ενδοθηλιακά κύτταρα εντός του μικροπεριβάλλοντος STS.

ευαισθησία επιθηλιακούς καρκίνους προέλευσης »να WFA ενισχύεται σε κύτταρα που εμφανίζουν επιθηλιακά μεσεγχυματικά να μετάβασης ( EMT)

μας κεντρική υπόθεση είναι ότι τα κύτταρα που εκφράζουν vimentin αναμένεται να επιδείξουν μεγαλύτερη ευαισθησία WFA. Σε αντίθεση με STS, οι πιο κοινές επιθηλιακών καρκίνων προέλευσης δεν εκφράζουν φυσικά vimentin. Ωστόσο, σημαντικό στοιχεία δείχνουν ότι τόσο εισβολή και τη μετάσταση μπορεί να εξαρτάται καθοριστικά από την απόκτηση ενός φαινοτύπου «μεσεγχυματικά» της προσβολής καρκινικών κυττάρων [32], [33], [34]. Ένα από τα κύρια χαρακτηριστικά αυτού του επιθηλιακού σε μεσεγχυματικά μετάβασης, επάγεται vimentin έκφρασης. Λαμβάνοντας αυτό υπόψη, αναλύσαμε την έκφραση vimentin σε ένα πάνελ κυτταρικών γραμμών καρκινώματος και αξιολογούνται απόκρισή τους σε WFA. Τρία από τα κύτταρα (MCF7, ΗΤ29, και TMK1) παρουσίασαν καθόλου έκφραση mRNA βιμεντίνη και πρωτείνη, και τα άλλα δύο (MDA231 και Α549) εξέφρασε βιμεντίνη (Σχήμα 7Α). Κύτταρα που εκφράζουν βιμεντίνης ήταν σημαντικά πιο ευαίσθητα στην WFA από εκείνα που δεν εκφράζουν βιμεντίνη (Μέση ± SD WFA IC

50 τιμές σε MDA231 και Α549 κύτταρα ήταν 1,3 μΜ ± 0,42 και 1,8 μΜ ± 0,37, αντίστοιχα, και 2,9 μΜ ± 0,31, 7,8 μΜ ± 2,34, 3,1 μΜ ± 0.18 σε MCF-7, ΗΤ29 και κύτταρα TMK1, αντίστοιχα? Ρ & lt? 0,05). Παρομοίως, WFA (1 μΜ για 24 ώρες) προκάλεσε μία σημαντικά υψηλότερη αποπτωτική ρυθμό σε κύτταρα καρκινώματος που εκφράζουν βιμεντίνη (Ρ & lt? 0,05? Σχήμα 7Β). ανάλυση WB αποκάλυψε περαιτέρω προϊόντα αποικοδόμησης βιμεντίνη σε MDA231 κύτταρα σε συνδυασμό με ενισχυμένη διασπάται επίπεδα κασπάσης-3 και ενεργοποιείται η έκφραση ΡΑΚΡ (Σχήμα 7C). Αντίθετα, μόνο ελάχιστη ή καθόλου έκφραση του διασπασμένη κασπάση-3 και ενεργοποιούνται PARP καταδείχθηκε σε MCF7 και ΗΤ29 κύτταρα, αντίστοιχα. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται εδώ υποστηρίζουν περαιτέρω το ρόλο της βιμεντίνης ως μοριακός στόχος WFA, γεγονός που υποδηλώνει την πιθανή θεραπευτική αποτελεσματικότητα της WFA για επιθηλιακών καρκίνων που εμφανίζουν φαινοτύπους EMT.

Α)

WFA που προκαλείται αντιστοιχεί αναστολή της ανάπτυξης για βιμεντίνη επίπεδο έκφρασης σε επιθηλιακό καρκίνο προέλευση κύτταρα?

Β)

WFA (1 μΜ για 24 ώρες) προκαλεί μία σημαντικά υψηλότερη αποπτωτική ρυθμό σε κύτταρα καρκινώματος που εκφράζουν βιμεντίνη?

C)

WB ανάλυση που αποδεικνύει vimentin κύτταρα MDA231 υποβάθμιση σε συνδυασμό με ενισχυμένη διασπαστεί επίπεδα της κασπάσης-3 και ενεργοποιείται η έκφραση PARP.