Αφηρημένο

Στόχοι

Διαγράφεται καρκίνο του ήπατος 1 (DLC1), ένα μέλος της RhoGTPase ενεργοποίηση πρωτεϊνών (GAP) της οικογένειας, είναι γνωστό ότι έχει κατασταλτική δραστηριότητα σε ογκογενετικότητας και τη μετάσταση του καρκίνου. Ωστόσο, οι υποκείμενες μοριακοί μηχανισμοί για το πώς DLC1 καταστέλλει την κυτταρική κινητικότητα δεν έχουν πλήρως διευκρινιστεί. Rho-κινάση (ROCK) είναι ένας άμεσος κατάντη τελεστή του RhoA στη μεσολάβηση κυτταρικών γεγονότων κυτταροσκελετικές και κυτταρική κινητικότητα. Στην παρούσα μελέτη, με στόχο να διερευνήσει τις επιπτώσεις της DLC1 στο σηματοδοτικό μονοπάτι Rho /ROCK στο ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC).

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Έχουμε αποδείξει ότι DLC1 ρυθμίζεται αρνητικά Στερεώσεις βράχων εξαρτάται συσταλτικότητα ακτινομυοσίνης. Από μελέτη immumofluorescence βρήκαμε ότι η έκτοπη έκφραση της DLC1 κατήργησε Rho /ROCK μεσολάβηση αναδιοργάνωση κυτταροσκελετική συμπεριλαμβανομένων σχηματισμό ινών στρες και τοπικές συμφύσεις. Είναι μειωτικά επίσης φλοιού φωσφορυλίωση του φωτός αλυσίδα μυοσίνης 2 (MLC2). Αυτές οι ανασταλτικές γεγονότα από DLC1 ήταν RhoGAP-εξαρτώμενη, ως RhoGAP ανεπάρκεια μετάλλαξη του DLC1 (DLC1 K714E) κατάργησε τις εν λόγω ανασταλτική γεγονότα. Επιπλέον, από τη Δυτική μελέτη, μονάδα στόχευσης DLC1 ανέστειλε ROCK σχετίζονται φωσφατάσης ελαφριάς αλυσίδας μυοσίνης 1 (MYPT1) φωσφορυλίωση στη θρεονίνη 853. Με την εξέταση της μορφολογίας των κυττάρων κάτω από μικροσκόπιο, βρήκαμε ότι η έκτοπη έκφραση της κυρίαρχης-δραστικών ROCK απελευθερώνονται τα κύτταρα από την επαγόμενη DLC1 κυτταροσκελετού κατάρρευση και συρρίκνωση κυττάρου.

Συμπέρασμα

Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι DLC1 ρυθμίζει αρνητικά Rho /ROCK /MLC2. Αυτό εμπλέκει ένα βράχο με τη μεσολάβηση οδό DLC1 στην καταστολή της μετάστασης των κυττάρων HCC και εμπλουτίζει την κατανόηση των μοριακών μηχανισμών που εμπλέκονται στην εξέλιξη του ηπατοκυτταρικού καρκινώματος

Παράθεση:. Wong CC-L, Wong CM, Ko FC- F, Chan LK, Ching YP, Yam JW-P, et al. (2008) Διαγράφεται Καρκίνος του ήπατος 1 (DLC1) ρυθμίζει αρνητικά Rho /ROCK /MLC Διαδρομή στο ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα. PLoS ONE 3 (7): e2779. doi: 10.1371 /journal.pone.0002779

Επιμέλεια: Neil Hotchin, Πανεπιστήμιο του Birmingham, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 20η, Απριλίου 2008? Αποδεκτές: 30 Ιουν 2008? Δημοσιεύθηκε: 23 Ιουλίου, 2008

Copyright: © 2008 Wong et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη χρηματοδοτήθηκε από το Χονγκ Κονγκ Συμβούλιο Κονδυλίων Έρευνας (HKU 7436 /04M), RGC Συνεργατική Reseaarch Ταμείο (HKU 1 /06C), Μιχαήλ και Μπέττυ Kadoorie Καρκίνος Γενετικής Ερευνητικό Πρόγραμμα 2004. ΙΟΙ Ng είναι Loke Yew Καθηγητής Παθολογίας

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η μετανάστευση των κυττάρων περιλαμβάνει κύκλους βήματα που ξεκινούν από το. σχηματισμό των κυτταρικών προεξοχή στην αιχμή. Στις θέσεις της προεξοχής, οι εστιακές συμφύσεις σχηματίζονται για τη στερέωση του κυτταροσκελετού, κυρίως ακτίνη και μυοσίνη, προς την εξωκυτταρική μήτρα. Ο κυτταροσκελετός δημιουργεί ένταση η οποία οδηγεί σε ακτομυοσίνης συσταλτικότητα να μετατοπιστεί το κυτταρικό σώμα. Τέλος, η ένταση απελευθερώνει τις συμφύσεις από την πίσω ακμή του κυττάρου [1]. Απορρύθμιση σε οποιοδήποτε από τα βήματα που εμπλέκονται στην κυτταρική μετανάστευση μπορεί να οδηγήσει σε παρεκκλίνουσα κίνηση των κυττάρων και, σε καρκινικά κύτταρα, μετάσταση [2]. Το ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC) είναι ένας από τους πλέον διαδεδομένους καρκίνους παγκοσμίως. Ενδοηπατική μετάσταση είναι η κύρια αιτία θνησιμότητας σε ασθενείς με αυτή τη μορφή καρκίνου. Ως εκ τούτου, πιστεύουμε ότι η καλύτερη κατανόηση των μοριακών μηχανισμών που ρυθμίζουν τη μετανάστευση των κυττάρων HCC μπορεί να ρίξει φως στην ανάπτυξη νέων στοχευμένων θεραπευτική παρέμβαση.

Διαγράφεται καρκίνο του ήπατος 1 (DLC1), ένα ογκοκατασταλτικό γονίδιο, εντοπίστηκε για πρώτη φορά στην πρωτοβάθμια HCC ως ομόλογο p122RhoGAP αρουραίου [3]. Στο HCC, DLC1 έχει βρεθεί να κατέχουν όγκου κατασταλτικής ικανότητες [4] – [6] και υποεκφράζεται κυρίως μέσω διαγραφής γονιδίου και μεθυλίωσης του DNA [7] – [9]. Υποέκφραση DLC1 εμπλέκεται επίσης σε άλλους καρκίνους όπως του μαστού, του πνεύμονα και του προστάτη [9] – [14]. DLC1 δείχθηκε επίσης να ρυθμίζεται προς τα κάτω σε μεταστατικά κύτταρα σε σύγκριση με μη-μεταστατικά κύτταρα στο μητρικό και τα μοντέλα HCC [15], [16]. Η έκτοπη έκφραση του DLC1 βρέθηκε να καταστέλλει την κυτταρική μετανάστευση και εισβολή σε HCC, μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα, καρκίνο του μαστού, καρκίνο του πνεύμονα, τα μοντέλα κυτταρική σειρά καρκίνου των ωοθηκών [4], [15], [17] – [21], και υπερέκφραση του DLC1 στο μεταστατικό κυτταρική σειρά καρκίνου του μαστού θα μπορούσε να μετριάσει το μέγεθος και τη συχνότητα των πνευμονικών μεταστάσεων [15]. Ωστόσο, οι μοριακοί μηχανισμοί που διέπουν αυτή την καταστολή του κινήματος των κυττάρων και τη μετάσταση του καρκίνου παραμένουν ασαφή.

DLC1 είναι μέλος της RhoGTPase ενεργοποίηση της οικογένειας (RhoGAP) πρωτεΐνη και κατέχει δραστηριότητα RhoGAP ειδικά για RhoA [8]. DLC1 ρυθμίζει αρνητικά τη δραστηριότητα του RhoA ενισχύοντας ενδογενή GTP υδρολυτική δράση του RhoA, καταλύοντας έτσι την μετατροπή του RhoA από GTP-δεσμευμένη δραστική κατάσταση του να ανενεργή κατάσταση GDP-δεσμευμένη [22]. Rho-κινάση (ROCK) είναι το πιο γνωστό καθοδικός τελεστής του RhoA [23], [24]. Η δέσμευση του RhoA απελευθερώνει ROCK από τη δομή του autoinhibitory και ενεργοποιεί ROCK-προκαλούμενης κυτταρικής γεγονότα [23], [25] – [27]. ROCK είναι γνωστό ότι ρυθμίζει κυτταρικά γεγονότα που σχετίζονται με την κυτταρική κινητικότητα. Για παράδειγμα, ROCK δείχθηκε για τον έλεγχο των κυττάρων πολικότητας ρυθμίζοντας ΡΤΕΝ /Akt μονοπάτι σηματοδότησης σε ουδετερόφιλα [28] και τον έλεγχο σύσπασης ουρά σε μονοκύτταρα και κύτταρα καρκίνου του προστάτη [29] – [31]. ROCK ενισχύεται επίσης ακτινομυοσίνης συσταλτικότητα, ένα κύριο βήμα της κυτταρικής μετανάστευσης, όπως περιγράφεται παραπάνω [32]. Είναι σημαντικό, ROCK είναι μια κινάση που φωσφορυλιώνει και ενεργοποιεί πολλές κατάντη υποστρώματα, όπως ΙΙΜΚ και ελαφριά αλυσίδα μυοσίνης 2 (MLC2). Η φωσφορυλίωση αυτών των υποστρωμάτων είναι σημαντική στη ρύθμιση κυτταροσκελετική αναδιοργάνωση και τη μετανάστευση των κυττάρων [33], [34]. Υπερενεργοποίηση του μονοπατιού Rho /ROCK είναι γνωστό ότι συνδέονται με πιο επιθετικές ιδιότητες όγκου όπως μετάσταση και εισβολή [35] – [41]. Η απορρύθμιση της οδού Rho /ROCK μπορεί να είναι consequentially σχετίζονται με παρεκκλίνουσα ανάντη ρυθμιστικές μονοπάτι της. Έχουμε ήδη αποδείξει ότι DLC1 είναι μια πρωτεΐνη RhoGAP και επομένως είναι λογικό να υποθέσουμε ότι DLC1 καταστέλλει τη μετάσταση των καρκινικών κυττάρων μέσω της ρύθμισης αρνητικά ROCK μεσολάβηση του κυτταροσκελετού αναδιάταξη. Ωστόσο, αυτή η υπόθεση δεν έχει ποτέ δοκιμαστεί πειραματικά και η μηχανιστική βάση του πώς DLC1 καταστέλλει τη μετάσταση των καρκινικών κυττάρων δεν έχει οριοθετηθεί. Ως εκ τούτου, είναι στρατηγική για να εξετάσει τις πιθανές λειτουργικές σχέσεις μεταξύ DLC1 και οδός ROCK και τις επιπτώσεις τους στο HCC.

Στην παρούσα μελέτη, αποδείξαμε ότι DLC1 ανέστειλε ROCK μεσολάβηση του κυτταροσκελετού γεγονότα συμπεριλαμβανομένων σχηματισμό ινών στρες και εστιακό επαφής δίκτυο και φωσφορυλίωση MLC2 στο κυτταρικό φλοιό. Σημαντικά, αυτές οι ανασταλτικές επιδράσεις της DLC1 εξαρτάται από τη δραστηριότητά της RhoGAP. Επιπλέον, έχουμε δείξει ότι DLC1 λειτούργησε ως αρνητικός ρυθμιστής της ROCK στον έλεγχο κυτταρική μορφολογία. Συνολικά, αποδείξαμε ότι DLC1 ρυθμίζεται αρνητικά ROCK στην καταστολή της κίνησης των κυττάρων στο HCC.

Αποτελέσματα

DLC1 καταργηθεί σχηματισμό ROCK μεσολάβηση ινών στρες και εστιακή πρόσφυση δίκτυο

Κατ ‘αρχάς, θα ερωτηθούν αν ο σχηματισμός των ινών στρες και τοπικές συμφύσεις στα κύτταρα HCC ήταν ROCK εξαρτάται. Βρήκαμε ότι, οι ίνες στρες ομαδοποίηση συστοιχίες (βάφονται με phalloidin λεκέ) και το εστιακό συμφύσεις (παξιλλίνη), ιδιαίτερα εκείνων στην κεντρική περιοχή που συνδέεται με τονίσω ίνες, καταργήθηκαν μετά από θεραπεία αναστολέα ROCK (Σχήματα 1Α). Αυτό το εύρημα υποδεικνύει ότι ο σχηματισμός των ινών στρες και τοπικές συμφύσεις στα κύτταρα HCC είναι ROCK-εξαρτώμενη. Αναστολέας ROCK

(Α) κατέστειλε ίνα στρες και τον σχηματισμό εστιακών προσκόλληση σε κύτταρα HCC. SMMC-7721 κύτταρα σπάρθηκαν επάνω κάλυμμα ολίσθησης μία ημέρα πριν από τη θεραπεία. ίνες στρες βάφτηκαν με phalloidin λεκέ (κόκκινο) και το εστιακό συμφύσεις με παξιλλίνη λεκέ (πράσινο). ίνες στρες μπορεί να παρατηρηθεί σαφώς ως δέσμες που εκτείνεται κατά μήκος των κυττάρων και το εστιακό συμφύσεις συνδέθηκαν με την ίνα άγχος ομαδοποίηση συστοιχίες σε SMMC-7721 τον έλεγχο αντιμετωπίζονται παρωδία. Η θεραπεία με αναστολέα ROCK Y27632 στα 10 μΜ για 60 λεπτά κατέστειλε το σχηματισμό των ινών στρες και δικτύου εστιακών πρόσφυση σε SMMC-7721. (Β) και (Γ) DLC1 κατέστειλε ROCK μεσολάβηση ινών στρες και τον σχηματισμό εστιακών προσκόλληση σε κύτταρα HCC. SMMC-7721 κύτταρα (i) και BEL7402 (ii) επιμολύνθηκαν με πλασμίδια έκφρασης myc-tagged, pCS2 + ΜΤ, pCS2 + MT /DLC1, και pCS2 + MT /DLC1 K714E, και αναγνωρίζεται από αντι-myc αντισώματα (9Ε10). ίνες στρες και τοπικές συμφύσεις βάφτηκαν με phalloidin-TRITC και αντι-παξιλλίνη αντισώματος, αντίστοιχα. Άγριου-τύπου DLC1, αλλά όχι RhoGAP ανεπάρκεια μετάλλαγμα (DLC1 K714E), κατέστειλε τον σχηματισμό ινών στρες και μείωσε τον αριθμό των ινών στρες που συνδέονται με εστιακές συμφύσεις σχηματίζονται σε SMMC-7721 κύτταρα. Ποσοστό διαφορετικά κατασκευάσματα DLC1 επιμολυσμένα κύτταρα εμφανίζουν ίνες στρες ή εστιακές συμφύσεις παρουσιάστηκαν σε ραβδόγραμμα αναλόγως. Για κάθε κατασκεύασμα, το σύνολο των 67 έως 170 επιμολυσμένα κύτταρα μετρήθηκαν υπό μικροσκόπιο. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση (SD) των δεδομένων που ελήφθησαν από δύο ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Για να διερευνηθεί η ρυθμιστική λειτουργία της DLC1 σε βράχο με τη μεσολάβηση ινών στρες και το σχηματισμό εστιακών πρόσφυση στο HCC, έχουμε παροδικά υπερεκφράζεται DLC1 στην DLC1 ανεπάρκεια SMMC-7721 και BEL7402 HCC κύτταρα και οι επιπτώσεις της στο δίκτυο των ινών στρες και τοπικές συμφύσεις μελετήθηκαν. Η υπερέκφραση του άγριου τύπου DLC1 κατέστειλε σημαντικά τον σχηματισμό των ινών στρες και τοπικές συμφύσεις στα κύτταρα αυτά, όπως υποδεικνύεται από phalloidin (Εικόνα 1Β) και λεκέδες παξιλλίνη (Σχήμα 1 C-i και 1C-ΙΙ), αντίστοιχα. Ανάλογα με την αναστολή ROCK (Σχήμα 1Α), DLC1 κατήργησε κυρίως τα στρες ινών που συνδέονται με εστιακές συμφύσεις που βρίσκεται στην κεντρική περιοχή των κυττάρων (Σχήμα S1A). Η απώλεια των εστιακών συμφύσεων επιδεινώθηκε περαιτέρω με έκτοπη έκφραση της SAM περιοχή εξαλειμμένη μετάλλαξη του DLC1 (ΔSAM) (Σχήμα S1B), ένα κατασκεύασμα DLC1 περικοπεί που προκάλεσε μια πιο σοβαρή κυτταρική συρρίκνωση και απώλεια ινών στρες [4]. Αντίθετα, ένα RhoGAP ανεπάρκεια μετάλλαγμα (DLC1 K714E) δεν ήταν σε θέση να αναστέλλουν τόσο ίνες στρες και σχηματισμός εστιακών προσκόλλησης (Σχήματα 1Β και 1Γ). Τα ευρήματα έδειξαν ότι DLC1 ανέστειλε ROCK εξαρτάται ινών στρες και το σχηματισμό εστιακών πρόσφυση μέσω της δραστηριότητας RhoGAP.

DLC1 καταργούνται 2 φωσφορυλίωση ROCK-μεσολάβηση του φλοιού μυοσίνης ελαφριάς αλυσίδας

Ενεργά ROCK φωσφορυλιώνει ειδικά ελαφριά αλυσίδα μυοσίνης 2 (MLC2) σε Ser 19? Ως εκ τούτου, αυτή η ROCK-ειδική φωσφορυλίωση έχει ευρέως χρησιμοποιηθεί ως υποκατάστατος δείκτης της δραστηριότητας ROCK [36], [42] – [45]. Η φωσφορυλίωση του MLC2 στο Ser19 είναι σημαντική για την δραστικότητα της μυοσίνης η οποία είναι υπεύθυνη για ακτομυοσίνης συσταλτικότητας και ως εκ τούτου κύτταρο μετανάστευση [46]. Σε αυτή τη μελέτη, παρατηρήσαμε ότι φωσφο-MLC2 χρώση των κυττάρων BEL7402 HCC ήταν ιδιαίτερα έντονο στην κυψέλη φλοιό. Ωστόσο, όταν δραστηριότητα ROCK μπλοκαρίστηκε είτε με Y27632 (Σχήμα 2Α) ή έκτοπη έκφραση ενός κυρίαρχο-αρνητικό ROCK μεταλλαγμένο (Σχήμα 2Β), αυτό το περιφερικό φωσφορυλίωση MLC2 πλήρη κατάργηση και η φωσφορυλίωση της MLC2 έγινε κυρίως κυτταροπλασματική μοτίβο. Σε αντίθεση, έκτοπη έκφραση της δεσπόζουσας δραστικών ROCK κορυφώθηκε σε σημαντική αύξηση της φωσφορυλίωσης MLC2 σε δέσμες ακτίνης (Σχήμα 2Β). Τα ευρήματα αυτά δείχνουν ότι αυτό το ξεχωριστό μοτίβο φωσφορυλίωσης των MLC2 σε κυτταρικό φλοιό είναι στενά και θετικά ρυθμίζονται από τη δραστηριότητα ROCK.

(Α) BEL4702 HCC κυτταρική γραμμή που έλαβαν θεραπεία με πλαστή έλεγχο ή αναστολέα ROCK (Y27632) διερευνήθηκε με μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού αντίσωμα έναντι φωσφο-MLC2 (Ser 19). Φωσφο-MLC2 (πράσινο) ανιχνεύθηκε κυρίως στην κυτταρική φλοιό των κυττάρων BEL7402 (όπως υποδεικνύεται από τα βέλη) και αυτό του φλοιού πρότυπο χρώσης καταργήθηκε με επεξεργασία με αναστολέα ROCK Y27632. (Β) BEL7402 κύτταρα επιμολύνθηκαν με myc-tagged κυρίαρχο αρνητικό ROCK ή κυρίαρχη ενεργή κατασκευάσματα ROCK και ανιχνεύθηκαν με πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού έναντι myc επίτοπο (Α14) (Κόκκινο). Κυρίαρχο ενεργός (DA) ROCK προκάλεσε έντονη φωσφορυλίωση MLC2 (Ser 19) στα δέσμες ακτίνης (PRECENTAGE των κυττάρων που εμφανίζουν αυτό το φαινόμενο: 94,0% των DA ROCK-επιμολυσμένα κύτταρα σε σύγκριση με 0% του φορέα επιμολυσμένα κύτταρα). Τα βέλη δείχνουν τις δέσμες ακτίνης της κυρίαρχης ενεργό ROCK επιμολυσμένων κυττάρων όπου αυξημένη φωσφορυλίωση MLC2 (Ser 19). Κυρίαρχο αρνητικό (DN) ROCK κατέστειλε φλοιώδη φωσφορυλίωση MLC2 (Ser 19) (Ποσοστό κυττάρων που εμφανίζουν αυτό το φαινόμενο: 87,5% των DN ROCK-επιμολυσμένα κύτταρα σε σύγκριση με το 7,3% των επιμολυσμένων κυττάρων φορέα). Βέλη δείχνουν στο κυτταρικό φλοιό της κυρίαρχης αρνητικής ROCK επιμολυσμένων κυττάρων όπου χάθηκε φωσφορυλίωση MLC2 (Ser 19). Όπως φαίνεται, μια σφιχτή ρύθμιση και ένα βέλτιστο επίπεδο δραστηριότητας ROCK ήταν υποχρεωμένες να διατηρούν φλοιού φωσφορυλίωση της MLC2 (Ser 19) σε BEL7402 κύτταρα.

Η

επόμενο διερευνηθεί αν DLC1 θα μπορούσε να καταργήσει αυτόν τον βράχο ειδικά MLC2 μοτίβο φωσφορυλίωσης σε κύτταρα HCC. Αξιολογήσαμε πρώτα αν το φλοιώδες πρότυπο χρώσης φωσφο-MLC2 είχε σχέση με τα ενδογενή επίπεδα έκφρασης του DLC1 σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές. Παρατηρήσαμε εμφανή χρώση φωσφο-MLC2 στην κυτταρική φλοιό σε SMMC-7721, BEL7402, και κυτταρικές γραμμές WRL HCC (Σχήμα 3C), και καρκίνο του τραχήλου HeLa κυτταρική γραμμή (Σχήμα 3C), η οποία δεν είχε καμία έκφραση του DLC1 (Σχήμα 3Α). Από την άλλη πλευρά, HepG2 και Hep3B, οι δύο κυτταρικές σειρές HCC με έκφραση DLC1 (Σχήμα 3Α), εμφανίζεται διάχυτη κυτταροπλασματική χρώση φωσφο-MLC2 χωρίς καμία διακριτή φλοιώδη φωσφορυλίωση MLC2 στο κύτταρο περιφέρεια (Σχήμα 3Β).

έκφραση (Α) DLC1 mRNA και πρωτεΐνης σε κυτταρικές σειρές HCC. (Β) και (C) έκφραση DLC1 συσχετίστηκε με φωσφο-MLC2 πρότυπο χρώσης. Εκπρόσωπος εικόνες από DLC1-θετικά και DLC1-αρνητικών κυττάρων, αντίστοιχα. DLC1 θετικά Hep3B και HepG2, εμφανίζεται διάχυτη φωσφορυλίωση MLC2, ενώ DLC1 μη εκφράζοντας BEL7402 και HeLa, εμφάνισε έντονη φλοιού φωσφορυλίωση MLC2 σε κυτταρικό φλοιό.

Η

Για να βεβαιωθείτε ότι η αναστολή του φλοιού φωσφο-MLC2 είχε άμεση σχέση με DLC1, μπορούμε στη συνέχεια παροδικά εξέφρασε άγριου τύπου DLC1 και DLC1 RhoGAP ανεπάρκεια μεταλλαγμένο (K714E), αντίστοιχα, σε κύτταρα BEL7402 DLC1-null. Άγριου τύπου DLC1 μείωσε σημαντικά τον αριθμό των κυττάρων που έχουν φωσφο-MLC2 φλοιώδους χρώση (Σχήματα 4Α & amp? 4Β), που σηματοδοτεί την κατασταλτική ρόλος του DLC1 στη δραστηριότητα ROCK. Από την άλλη πλευρά, DLC1 RhoGAP ανεπάρκεια μετάλλαγμα (K714E) δεν ήταν σε θέση να καταργήσει φωσφο-MLC2 φλοιώδους χρώση (Σχήματα 4Α & amp? 4Β). Ως εκ τούτου, η παρατήρηση μας πρότεινε DLC1 ανέστειλε ROCK-ειδική φωσφορυλίωση MLC-2 σε κύτταρα HCC, μέσω της δραστηριότητας της RhoGAP.

(Α) pCS2 + φορέα MT μόνο, pCS2 + MT DLC1, και pCS2 + MT DLC1 K714E, αντίστοιχα , επιμολύνθηκαν σε BEL7402 κύτταρα. Αναγνώριση των επιμολυσμένων κυττάρων έγινε με ανίχνευση κυττάρων με c-myc αντισώματος (Α14) κουνελιού που ακολουθείται από χρώση με αντίσωμα αντι-κουνελιού συζευγμένο με Texas Red. Κύτταρα μετεμβολιασμένα με φορέα pCS2 + ΜΤ μόνος εμφανίζεται έντονη φλοιώδη φωσφορυλίωση MLC2 όπως υποδεικνύεται από τα βέλη. Κύτταρα μετεμβολιασμένα με DLC1 εμφανίζεται απώλεια της φλοιώδους φωσφορυλίωσης MLC2. Κύτταρα επιμολυσμένα με DLC1 K714E, το RhoGAP ανεπάρκεια μεταλλαγμένο, εξακολουθεί να εμφανίζεται έντονη φλοιώδη φωσφορυλίωση MLC2 όπως υποδεικνύεται από τα βέλη. (Β) Ποσοστό των διαφορετικών κατασκευασμάτων DLC1 παρουσιάζουν φλοιώδη φωσφορυλίωση MLC2 σε Ser 19 υπολογίστηκε και παρουσιάστηκε σε ένα ραβδόγραμμα. Για κάθε κατασκεύασμα, 80-100 επιμολυσμένα κύτταρα μετρήθηκαν και φλοιώδη MLC2 φωσφορυλίωση καταγράφηκε. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση (SD) των δεδομένων που ελήφθησαν από τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

DLC1 εξασθενημένη δράση φωσφατάσης μυοσίνης με τη μείωση της φωσφορυλίωσης της μυοσίνης φωσφατάση υπομονάδας στόχου 1 (MYPT1) σε Thr 853

Εκτός από τη φωσφορυλίωση της μυοσίνης, ROCK επίσης αυξάνει τη φωσφορυλίωση της μυοσίνης με φωσφορυλίωση υπομονάδα στόχο μυοσίνης φωσφατάση 1 (MYPT1) σε Thr 696 και Thr 853 και ως εκ τούτου απενεργοποιώντας το. Αν και Thr 696 από MYPT1 μπορεί να φωσφορυλιωθεί από άλλες πρωτεϊνικές κινάσες, Thr 853 φωσφορυλίωση, από την άλλη πλευρά, επιλεκτικά ρυθμίζεται από ROCK [32]. Επιπλέον, MYPT1 Thr 853 φωσφορυλίωση έχει αποδειχθεί ότι είναι ένα πολλά υποσχόμενο υποκατάστατο δείκτη που συσχετίζεται αντίστροφα με τη δραστικότητα φωσφατάσης μυοσίνης [36], [42] – [45]. Σε αυτή τη μελέτη, διαπιστώσαμε ότι, κατά Y27632 θεραπεία, τα επίπεδα φωσφορυλίωσης MYPT1 (Thr 853) έχουν μειωθεί σε όλες τις κυτταρικές σειρές HCC δοκιμάστηκαν (Σχήμα 5Α), ενώ τα ολικά επίπεδα MYPT1 παρέμεινε αμετάβλητη. Ομοίως, η υπερέκφραση του DLC1 εξασθενημένων φωσφορυλίωσης MYPT1 σε Thr853, υποδεικνύοντας την απώλεια δραστικότητας ROCK (Σχήμα 5Β). Η αδρανοποίηση της μυοσίνης φωσφατάση (όπως αντικατοπτρίζεται από την αυξημένη φωσφορυλίωση MYPT1) και ενεργοποίηση των MLC2 Τα συνδυασμένα αποτελέσματα της ROCK, και τα αποτελέσματα αυτά θα μπορούσαν να κατασταλεί από DLC1, οδηγώντας σε συνολική μείωση της φωσφορυλίωσης της μυοσίνης και μείωση της κυτταρικής συσταλτικότητας.

(Α) αναστολέα ROCK Y27632 καταστέλλεται φωσφορυλίωση MYPT σε Thr 853 σε όλες τις κυτταρικές σειρές HCC. (Β) DLC1 κατέστειλε φωσφορυλίωση MYPT σε Thr 853 σε 293 κύτταρα Τ. ένταση της ζώνης αναλύθηκε με AlphaEaseFC ™ και το ποσοστό υπολογίστηκε από τη σύγκριση με ανάλογα τον έλεγχό της.

Η

αναστολέα ROCK κατέστειλε HCC κυτταρική κινητικότητα

Με την έκτοπη έκφραση της DLC1 στην κυτταρική σειρά HCC, εμείς στο παρελθόν έδειξαν ότι DLC1 κατασταλεί σημαντικά τη μετανάστευση HCC κυττάρων και εισβολής [4]. Για να τεκμηριώσει την υπόθεση μας ότι DLC1 κατέστειλε την κυτταρική μετανάστευση μέσω αρνητικά τη ρύθμιση δραστηριότητα ROCK, εξετάσαμε την επίδραση του αναστολέα ROCK για τη μετανάστευση των κυττάρων HCC με φρεατίων δοκιμασία. Παρατηρήσαμε ότι η Y27632 αναστολέας ROCK κατέστειλε μετανάστευση των κυττάρων HCC, SMMC-7721 (Σχήμα 6Α αριστερό πάνελ) και BEL7402 (Σχήμα 6Β αριστερό πάνελ), όπως αποδεικνύεται από τον μειωμένο αριθμό μετανάστευσαν κυττάρων σε δοκιμασία transwell. Το εύρημα αυτό υποδηλώνει ότι η δραστηριότητα ROCK είναι ζωτικής σημασίας για τη μετανάστευση των κυττάρων HCC. Για να εξαλειφθεί οποιαδήποτε παρερμηνεία λόγω θανάτου κυττάρων που προκαλείται από την τοξικότητα του φαρμάκου, πραγματοποιήσαμε ποσοτικό προσδιορισμό του πολλαπλασιασμού των κυττάρων στα κύτταρα HCC. Δοκιμασία πολλαπλασιασμού των κυττάρων έδειξαν ότι Y27632 δεν επηρέασε την ανάπτυξη των κυττάρων η οποία επιβεβαίωσε ότι η αναστολή της ROCK επηρέασε μόνο τη μετανάστευση των κυττάρων HCC (Εικόνα 6Α και 6Β δεξιά πλευρά).

αναστολέα ROCK Y27632 κατέστειλε την κυτταρική μετανάστευση HCC. Y27632 μείωση του αριθμού των μετανάστευσαν (Α) SMMC-7721 κύτταρα (

P

& lt? 0,0001,

t-test

) και (Β) BEL7402 κύτταρα (P & lt? 0,0001,

t

-τεστ). Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση (SD) των δεδομένων που λαμβάνονται από τρία μικροσκοπικά πεδία. Πειράματα έχουν επαναλαμβάνεται τρεις φορές. δοκιμασία πολλαπλασιασμού των κυττάρων που φαίνεται στα δεξιά για να συγκρίνετε ρυθμός αύξησης του mock κυττάρων ελέγχου και Y27632 κύτταρα υποβάλλονται σε επεξεργασία.

Η

ROCK αντιστραφεί η κυτταρική μορφολογική αλλοίωση της DLC1

Έχουμε ήδη αποδείξει ότι DLC1 ήταν είναι σε θέση να επάγει κυτταρική μορφολογική αλλαγή με το σχηματισμό ινών μείωση του στρες στα κύτταρα HCC και ινοβλάστες [4]. Από ROCK αποτελεί βασικό ρυθμιστή σε κυτταροσκελετού σηματοδότηση και την οργάνωση του κυτταροσκελετού αποτελεί καθοριστικό παράγοντα της μορφολογίας των κυττάρων, εμείς εικάζουν ότι οι κυτταρικές μορφολογικές μεταβολές που προκαλούνται από DLC1 ήταν μέσω της ROCK. Για το σκοπό αυτό, παρατηρήσαμε το κύτταρο μορφολογία του DLC1 και ROCK συν-επιμολυσμένα κύτταρα με χρώση ανοσοφθορισμού. Μετρήσαμε επίσης τον αριθμό των κυττάρων που έδειξαν κύτταρο κατάρρευση ή συρρίκνωση που προκαλείται από κατάρρευση του κυτταροσκελετικών δικτύου (Εικόνα 7C), όπως περιγράφεται αλλού [4], [47] – [49]. Σε αυτή τη μελέτη, παρατηρήσαμε ότι η υπερέκφραση του DLC1 σε κύτταρα COS7 που επάγεται κυτταροσκελετικές κατάρρευση ή συρρίκνωση κυττάρου (Σχήμα 7Α-i), παρόμοια με τα προηγούμενα εύρημα μας [4]. Κυτταρική συρρίκνωση εντάθηκε από έκτοπη έκφραση της SAM domain-διαγράφεται μετάλλαξη του DLC1 (ΔSAM) (Σχήμα 7Β-i). Η συν-επιμόλυνση του κενού φορέα pEGFP δεν θα μπορούσε να διασώσει DLC1-επαγόμενο κυτταρικό μορφολογική αλλαγή, αλλά τα κύτταρα με κυρίαρχη ενεργή ROCK θα μπορούσε να ξεπεράσει την ανασταλτική ρύθμιση από DLC1 (Σχήμα 7Α-ΙΙ) και ακόμη και DLC1ΔSAM (Σχήμα 7Β-II) και κυκλοφόρησε κύτταρα από DLC1 επαγόμενη κυτταρική συρρίκνωση. Αυτό το πείραμα έδειξε ότι το Rock είναι ένα από τα κατάντη δράστες της DLC1 στο συντονισμό των μορφολογικές αλλαγές στα κύτταρα HCC.

COS7 κύτταρα συν-επιμολυσμένα με (Α) DLC1 και ROCK ή (Β) DLC1ΔSAM και ROCK, αντίστοιχα . Κύτταρα επιμολυσμένα με pCS2MT DLC1 ή pCS2MT DLC1ΔSAM εμφανίστηκε κόκκινο, ενώ τα κύτταρα επιμολυσμένα με pEGFP ή pEGFP ROCK εμφανίστηκε πράσινο. DLC1 επαγόμενη κύτταρο κυτταροσκελετικές κατάρρευση ή συρρίκνωση κυττάρου (Α-Ι), η οποία ήταν ενισχυθεί περαιτέρω και κατέδειξε με σαφήνεια από SAM-διαγραφεί κατασκεύασμα, pCS2 + ΜΤ DLC1ΔSAM (Β-i). ROCK ήταν σε θέση να αποκαταστήσει κύτταρα από DLC1 επαγόμενη κυτταρική συρρίκνωση (Α-ΙΙ) και ακόμη και από DLC1ΔSAM επαγόμενη έντονη συρρίκνωση κυττάρου (Β-ϋ). (C) Co-επιμολυσμένα κύτταρα μετρήθηκαν και μορφολογίες τους καταγράφονται. Ο αριθμός των συν-επιμολυσμένων κυττάρων που εμφανίζουν παρατηρήσιμα συρρίκνωση κυττάρου (κυτταρική κατάρρευση) διαιρέθηκε με συνολικό αριθμό των συν-επιμολυσμένων κυττάρων μετρήθηκαν, για τον υπολογισμό του ποσοστού των κυττάρων σε εμφανίζουν συρρίκνωση, όπως φαίνεται στο γράφημα μπάρας. Για κάθε στήλη, 150-200 συν-επιμολυσμένα κύτταρα μετρήθηκαν. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση (SD) των δεδομένων που ελήφθησαν από τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Συζήτηση

Ένας από τους σημαντικούς ρόλους του DLC1 είναι η ικανότητά του στην καταστολή της μετανάστευσης των καρκινικών κυττάρων και την εισβολή. Σε αυτή τη μελέτη για τη διαλεύκανση των υποκείμενων μηχανισμών στη ρύθμιση της κυτταρικής μετανάστευσης HCC και εισβολή από DLC1, έχουμε δείξει ότι DLC1 κατέστειλε την κυτταρική μετανάστευση HCC μέσω ρυθμίζει τον κυτταρικό σκελετό και ακτινομυοσίνης συστολή. Επίσης, έχουμε δείξει ότι DLC1 λειτούργησε ως αρνητικός ρυθμιστής της ROCK στον έλεγχο της μορφολογίας των κυττάρων.

DLC1 αρνητικά ρυθμιζόμενη μεσολάβηση ROCK συσταλτικότητα ακτινομυοσίνης

Η συσταλτική κίνηση των καρκινικών κυττάρων παράγεται από διαδοχικές συστολές της δέσμες ακτινομυοσίνης αποτελείται από ακτίνης και μυοσίνης που ονομάζεται ακτινομυοσίνης. Αυτές οι δέσμες ακτομυοσίνης, εμφανιζόμενα ως ίνες στρες, εκτείνονται κατά μήκος του κυτταρικού σώματος και να δημιουργήσει μια ένταση να παράγει συστολή κύτταρο να οδηγεί την κίνηση των κυττάρων με τη σύνδεση με τα εστιακά μόρια προσκόλλησης [50]. Με βάση την προηγούμενη μελέτη για την ανασταλτική επίδραση της DLC1 επί ινών στρες, στο παρόν βρήκαμε περαιτέρω ότι ο σχηματισμός των ινών στρες και δικτύου εστιακών συμφύσεων ήταν εξαρτημένη από DLC1 RhoGAP και δραστικότητα ROCK στα κύτταρα HCC. Αυτό το εύρημα περαιτέρω διαφωτίζει ότι οι ίνες στρες και τοπικές συμφύσεις εργάζονται χέρι-χέρι όπως περιγράφεται από Hall Α [51], και ο σχηματισμός τους είναι αλληλοεξαρτώμενες και σφιχτά ρυθμίζονται από RhoGAP της DLC1 και τη δραστηριότητα ROCK. Επιπλέον, DLC1 μειωμένη φωσφορυλίωση MYPT1 (Thr853) και φωσφορυλίωση MLC2 (Ser19) ROCK μεσολάβηση και, κατά συνέπεια, θα οδηγούσε σε μείωση των συνολικών φωσφορυλίωσης μυοσίνη και να προκαλέσει μια μείωση της συσταλτικότητας ινών στρες [46]. Όλες αυτές οι γραμμές των αποδεικτικών στοιχείων συγκλίνει για να εξηγήσει ότι DLC1 ελεγχόμενη μία από τις πιλοτικές μεταναστευτικών μηχανισμούς, συρρίκνωση ακτινομυοσίνης, παρόμοιο με ένα άλλο μέλος της οικογένειας RhoGAP, Ρ190-RhoGAP [52].

DLC1 καταργηθεί εστιακό σχηματισμό πρόσφυση και εντοπίζεται στην εστιακή πρόσφυση συγκρότημα

Μια ενδιαφέρουσα έκδοση των εύρημα σχετικά με την ανασταλτική επίδραση της RhoGAP σε κομβικό μόρια προσκόλλησης αυτή έχει προκύψει. DLC1 και αρκετά μέλη των πρωτεϊνών RhoGAP συμπεριλαμβανομένων P122-RhoGAP και RC-GAP72 βρέθηκαν να εντοπίζεται στις εστιακές συμφύσεις [47], [49]. Στην πραγματικότητα, άλλοι και έχουμε αναφερθεί στο παρελθόν ότι DLC1 εντοπισμένη επίσης να εστιακές συμφύσεις και αλληλεπίδρασε με τα μέλη της οικογένειας tensin [18], [53], [54]. Σε αυτή τη μελέτη, διαπιστώσαμε ότι DLC1 καταστέλλεται ο σχηματισμός εστιακών πρόσφυση ινών που συνδέονται με το στρες από τη δραστηριότητα της RhoGAP. Από μελέτη ανοσοφθορισμού, παρατηρήσαμε ότι, σε ένα τμήμα του DLC1 επιμολυσμένων κυττάρων, DLC1 εμφάνισαν ένα πρότυπο εστιακής προσκόλλησης εντοπισμού (Σχήμα S1A)? ενώ σε ορισμένες άλλες DLC1 επιμολυσμένα κύτταρα, ειδικά εκείνων που εμφανίζουν εκτεταμένη συρρίκνωση των κυττάρων, μια εντατική απώλεια του στρες ίνες συνδέονται εστιακές συμφύσεις παρατηρήθηκε (Εικ. 1 C). DLC1 εντοπισμού για να εστιακό συμφύσεις και ανασταλτική δράση της στις εστιακές συμφύσεις δεν αλληλοαποκλείονται. Θεωρούμε ότι το αποτέλεσμά της δόσης μπορεί να είναι ένας από τους παράγοντες που εμπλέκονται. Όταν ένα κύτταρο επιμολύνεται με μια υψηλή δόση DLC1, DLC1 θα σβήσουν όλες τις ίνες στρες και το άγχος ινών που συνδέονται με εστιακές συμφύσεις και να οδηγήσει σε εκτεταμένη κύτταρο κατάρρευση (Εικ. 1 C). Από την άλλη πλευρά, όταν ένα κύτταρο επιμολύνεται με μια χαμηλότερη δόση από DLC1, DLC1 θα σβήσουν οι περισσότερες ίνες στρες και το άγχος ίνες συνδέονται εστιακές συμφύσεις αλλά διαθέσει μερική εστιακές συμφύσεις που δεν συνδέονται με τονίσει ίνες και να οδηγήσει σε μια ηπιότερη κύτταρο κατάρρευση ( Εικόνα S1 Α). Μια άλλη κερδοσκοπία ήταν ότι παρόμοια με RC-GAP72 [47], DLC1 μπορεί να εντοπίζεται σε εστιακό πρόσφυση για να αποσυντεθεί των συμπλεγμάτων εστιακής προσκόλλησης.

κυτταροσκελετού που προκαλείται από την κατάρρευση συρρίκνωση των κυττάρων και ο αντίκτυπος της DLC1 για κυτταροσκελετού κατάρρευση

εστιακών συμφύσεων και ίνες στρες ακτινομυοσίνης λειτουργεί πάντα στο μεταξύ-εξαρτώμενο τρόπο και μαζί κατασκευάσει ένα ικρίωμα για να υποστηρίξει μια ανέπαφη μορφολογία του κυττάρου [47]. Οι διαταραχές του προαναφερθέντος δικτύου που προκαλείται από DLC1 οδήγησαν σε μια εντατική κατάρρευση κυττάρων κυτταροσκελετού με αποτέλεσμα τη συρρίκνωση του κυττάρου. Αυτό το εύρημα ήταν παρόμοια με Barberis D

et al.

‘S μελέτη για p190RhoGAP ότι η απώλεια των εστιακών συμφύσεων που επάγεται από p190RhoGAP προηγείται συρρίκνωση κυττάρων [48]. Παρατηρήσαμε ότι η απώλεια του συμφύσεων και των ινών στρες πραγματοποιήθηκε μια ώρα μετά την αναστολή ROCK από Y27632, αλλά τα κύτταρα δεν κατέρρευσε αμέσως (Σχήμα 1Α) μέχρι την παρατεταμένη θεραπεία της Y27632 έως και 24 ώρες (Εικόνα S2). Από αυτή την παρατήρηση, θα εικάζουν ότι η κατάρρευση των κυττάρων που προκαλείται από Y27632 θεραπεία ήταν ακολούθησε από την απώλεια της εστιακής προσκόλλησης και του δικτύου ινών στρες. Μετά την αναστολή της ROCK από Y27632, δεν ήταν δυνατόν να σχηματίζονται οι κυτταροσκελετικές δίκτυα και τα κύτταρα δεν μπορούσαν πλέον να αντέξουν την απώλεια των κυτταροσκελετικών δίκτυο και τελικά υποβάλλονται σε κατάρρευση κύτταρο, το οποίο παρατηρήσαμε ως συρρίκνωση κυττάρου (Σχήμα 8). Η παρούσα μελέτη έδειξε ότι η κυτταροσκελετού κατάρρευση που προκαλείται από DLC1, μια RhoGAP οποίο αρνητική ρύθμιση της συνδέεται με την εξέλιξη HCC, θα μπορούσε να αντιστραφεί εν μέρει από την ενεργό ROCK, περαιτέρω υπονοώντας ότι DLC1 ρυθμίζεται αρνητικά ROCK στον έλεγχο της συσταλτικότητας ακτινομυοσίνης, η μορφολογία των κυττάρων, και διαδοχικά μετανάστευση των κυττάρων . προηγούμενη μελέτη μας ανέφερε ότι DLC1 όχι μόνο κατέστειλε την κυτταρική μετανάστευση, αλλά και εισβολής κυττάρων που εμπλέκονται εξωκυττάρια μήτρα εμπόδιο. Sahai Ε

et al.

Ανέφεραν ότι κυτταρικές γραμμές καρκίνου θα μπορούσε να διαθέτει διαφορετικούς τρόπους κυτταρικής κινητικότητας και των στρογγυλεμένων καρκίνος μορφολογία κυτταρικών γραμμών ήταν πιο ευαίσθητα σε αναστολέα ROCK σε 3-διαστάσεων μήτρα [55]. Ωστόσο, αν το μοντέλο αυτό μπορεί να εφαρμοστεί σε κύτταρα HCC και αν άλλα εξωκυττάρια πρωτεολυτικών μονοπατιών coorperate με την DLC1 /Rho /ROCK /MLC μονοπάτι είναι ακόμη άγνωστες και περίμεναν να αντιμετωπιστούν.

(Α) ίνες στρες συνδέθηκαν με εστιακό συμφύσεις που σχηματίζουν ένα δίκτυο. ίνες στρες τεντωμένο κατά μήκος της κυτταρικής να παράσχει το κύτταρο ένα άθικτο μορφολογία. (Β) DLC1 RhoGAP ή απώλεια της δραστικότητας ROCK προκάλεσε την απώλεια των ινών στρες και τοπικές συμφύσεις. Λίγα εστιακό συμφύσεις και δέσμες των ινών άγχος παρέμενε. (Γ) Μια παρατεταμένη ή σοβαρή απώλεια ινών στρες και το εστιακό του δικτύου πρόσφυση που προκαλείται από DLC1 RhoGAP ή καταστολή της δραστηριότητας ROCK θα οδηγήσει στην εντατική κυτταροσκελετού κατάρρευση. Όλες οι ίνες στρες και τοπικές συμφύσεις καταργήθηκαν.

Η

Η μελέτη μας έδειξε ότι αναστολέα ROCK, Y27632, δεν επηρέασε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων HCC σε μια αποτελεσματική δόση που κατέστειλε την κυτταρική μετανάστευση HCC. Οι αναστολείς ROCK έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως σε ζωικά μοντέλα, όπως τα μοντέλα αρουραίων και ποντικών, χωρίς να προκαλεί σημαντικές τοξικότητα στα ζώα σε αποδοτικές δόσεις [35], [56]. Takamura et al. έδειξαν ότι θα μπορούσε να αναστείλει Y27632 ενδοηπατική μετάσταση του HCC [35] και πρόσφατα, άλλο αναστολέα ROCK, φασουδίλη, έχει εφαρμοστεί επιτυχώς σε κλινική δοκιμή σε ασθενείς με καρδιαγγειακές νόσους [57]. Οι μελέτες αυτές αποδεικνύουν ότι η τοξικότητα των αναστολέων ROCK στα κύτταρα περιορίζεται [35]. Συσσώρευση γνώσεων δείχνει ότι ROCK διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη μετάσταση του καρκίνου, και η παρούσα μελέτη έχει εμπλουτίσει τη γνώση σχετικά με το σηματοδοτικό μονοπάτι ROCK στο HCC. αναστολείς ROCK όπως Y27632 θα μπορούσε να είναι χρήσιμη για τη χημειοθεραπευτική παρέμβαση στην καταστολή ενδοηπατική μετάσταση, μια σημαντική αιτία θνησιμότητας σε ασθενείς HCC, χωρίς να προκαλεί πολύ αρνητικές συνέπειες για τους ασθενείς. Περαιτέρω χαρακτηρισμός των απόδοση των αναστολέων ROCK και θεραπείες αντι-ROCK στη θεραπεία της HCC αναμένεται ακόμη.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές και τα πλασμίδια

SMMC-7721 και BEL7402 ήταν δώρα από τη Σαγκάη Ινστιτούτο Κυτταρικής Βιολογίας, κινεζική Ακαδημία Επιστημών? 293Τ, COS7, HepG2 και Hep3B ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA). 293Τ, BEL7402, SMMC-7721, και COS7 καλλιεργήθηκαν σε Dulbecco Τροποποιημένο Eagle Medium (DMEM) υψηλής γλυκόζης συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό? Hep3B και HepG2 καλλιεργήθηκαν σε ελάχιστο βασικό μέσο (ΜΕΜ) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό. Myc-tagged κατασκευάσματα έκφρασης (pCAG) που φέρουν ανθρώπινο άγριου τύπου ROCK, κυρίαρχη ενεργό ROCK (1-725 αα), και κυρίαρχη αρνητική ROCK μεταλλαγμένο (K105A, I1009A) παρασχέθηκαν ευγενώς από τον S. Narumiya (Ιατρική Σχολή, Πανεπιστήμιο του Κιότο) [27]. Το ανθρώπινο τομέα ROCK κινάσης (ROCK 76-338 α.α.) ενισχύθηκε και κλωνοποιήθηκε μέσα σε φορέα pEGFPC3 χρησιμοποιώντας θέσεις πέψης ΚρηΙ και XhoI PCR και χρησιμοποιήθηκε ως κυρίαρχη ενεργή μορφή της ROCK. Άγριου-τύπου DLC1 και RhoGAP ανεπάρκεια μεταλλάγματα κλωνοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [4].

Η φαρμακευτική αγωγή και την επιμόλυνση

ROCK-ειδικός αναστολέας Y27632 λήφθηκε από Calbiochem (Darmstadt, Γερμανία). Για τη θεραπεία, τα κύτταρα προστέθηκαν Y27632 στα 10 μΜ και επωάστηκαν για 1 ώρα στους 37 ° C. Για την επιμόλυνση, 1 × 10

5 κύτταρα σπάρθηκαν σε καλυπτρίδες σε πλάκες 35-mm μία ημέρα πριν από την επιμόλυνση. Ενδείκνυται πλασμίδια επιμολύνθηκαν σε κύτταρα με αντιδραστήριο Fugene 6 (Roche, Βασιλεία, Ελβετία) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

μικροσκοπία ανοσοφθορισμού

Ποντίκια μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι φωσφο-μυοσίνης ελαφριάς αλυσίδας 2 (Ser 19) αγοράστηκε από την Cell Signaling Technology (Danvers, ΜΑ). Mouse μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι παξιλλίνη ελήφθη από την Upstate (Lake Placid, ΝΥ). μονοκλωνικό ποντικού (9Ε10) και πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού (Α14) αντισωμάτων έναντι του c-myc αποκτήθηκαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Texas Red συζευγμένων με χρωστική AffiniPure κατσίκας αντι-ποντικού IgG και με φλουορεσκεΐνη (FITC), συζευγμένης AffiniPure κατσίκας αντι-κουνελιού IgG αγοράσθηκαν από την Jackson Immuno Research Laboratories (West Grove, ΡΑ). Για τη χρώση ανοσοφθορισμού, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν σε παραφορμαλδεΰδη, κατέστησαν διαπερατά με TritonX, αποκλείστηκαν με αλβουμίνη βόειου ορού και κατόπιν επωάστηκαν με δεικνυόμενες πρωτογενή και δευτερογενή αντισώματα.