Αφηρημένο

Σε μια στρατηγική δύο σταδίων, μια ενδοπεριτοναϊκή (ΙΡ) ένεση της πολυ (αιθυλενογλυκόλης) –

μπλοκάρουν

-πολυ (ε-καπρολακτόνη) (ΡΕΟ

β

-pCl) μικκύλια που περιέχουν πακλιταξέλη (ΡΤΧ), κυκλοπαμίνη (CYP) και γκοσσυπόλης (ΣΓΠ) σε 30, 30, και 30 mg /kg, αντίστοιχα, debulked ιστοί όγκου από 1,3 φορές, με βάση την απώλεια της βιοφωταύγειας με & lt? 10% μεταβολή του σωματικού βάρους, και επαγόμενη απόπτωση σε περιτοναϊκή όγκους όταν χρησιμοποιείται ως εισαγωγική χημειοθεραπεία (nact) σε ένα ξενομόσχευμα ES-2-Luc-έδρανο μοντέλο για τον καρκίνο των ωοθηκών. Σε ένα δεύτερο στάδιο, μία ενδοφλέβια (IV) ένεση της απόπτωσης στόχευση GFNFRLKAGAKIRFGS-PEG-

β

-pCl μικκύλια περιέχουν ένα εγγύς υπέρυθρο (NIR) ανιχνευτή φθορισμού, DIR (1,1-dioctadecyltetramethyl indotricarbocyanine ιωδιούχο), οδήγησε σε αυξημένη περιτοναϊκή συσσώρευση dIR στην απόπτωση που προκαλείται ES-2-Luc ιστούς όγκων (

ex vivo

) κατά 1,5 φορές σε σύγκριση με το dIR μόρια που παραδίδονται από μεθοξυ ΡΕΟ

β

-pCl μικκύλια (μη στοχοθετημένης) στις 48 ώρες μετά την ένεση IV σε ένα δεύτερο βήμα. Ως αποτέλεσμα, ένα συνδυασμό των PEG-

β

-pCl μικκύλια να ενεργοποιήσετε την ανίχνευση υψηλής ανάλυσης του

ca

. όγκοι διαμέτρου 1 mm, με αποτέλεσμα εκτομή του 90% περίπου των όγκων, και χαμηλό δείκτη περιτοναϊκή καρκίνου (PCI) του

ca

. 7. Έτσι, ένα συνδυασμό των PEG-

β

-pCl μικκύλια που χρησιμοποιούνται για NCAT και NIR φθορισμού απεικόνιση της θεραπείας απόπτωση για διεγχειρητικές χειρουργικές καθοδήγηση μπορεί να είναι μια πολλά υποσχόμενη θεραπευτική στρατηγική για τον μεταστατικό καρκίνο των ωοθηκών.

Παράθεση: Cho Η, Cho CS, Indig GL, Lavasanifar Α, Vakili MR, Kwon GS (2014) πολυμερικά μικύλλια για απόπτωση-Στοχευμένες Optical Imaging του Καρκίνου και διεγχειρητικές χειρουργικές Προσανατολισμού. PLoS ONE 9 (2): e89968. doi: 10.1371 /journal.pone.0089968

Επιμέλεια: Sung Wan Kim, το Πανεπιστήμιο της Γιούτα, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 7 Νοέμ 2013? Αποδεκτές: 23 του Ιαν 2014? Δημοσιεύθηκε: 26η Φεβρουαρίου 2014

Copyright: © 2014 Cho et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε οικονομικά από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας (R21 CA-161537) και Carbone Κέντρο Καρκίνου στο Πανεπιστήμιο του Wisconsin-Madison. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος των ωοθηκών απεικονίζεται ως ασθένεια που ψιθυρίζει λόγω των νωχελικός συμπτώματα στα πρώιμα στάδια [1]. Δυστυχώς, δεν υπάρχουν αποτελεσματικές δοκιμασίες προσυμπτωματικού ελέγχου: γενική προβολή του καρκινικού αντιγόνου στον ορό 125 (CA 125) ή διακολπικό υπερηχογράφημα δεν επιτρέπει την έγκαιρη διάγνωση του καρκίνου των ωοθηκών. Εν μέρει λόγω των δυσκολιών στη διάγνωση, καρκίνο των ωοθηκών είναι η πιο θανατηφόρα γυναικολογική κακοήθεια [2]. Η συμβατική στρατηγική θεραπείας για τον καρκίνο των ωοθηκών περιλαμβάνει μια συνδυασμένη προσέγγιση που χρησιμοποιεί επιθετική κυτταρομειωτική χειρουργική επέμβαση και ενδοφλέβια (IV) χημειοθεραπεία (πλατίνας και ταξάνιο ανάλογα) [3].

Κατά την τελευταία δεκαετία, ένα πιθανό όφελος της χημειοθεραπείας δοθεί μέσω της ενδοπεριτοναϊκή (ΙΡ) διαδρομή για τον καρκίνο των ωοθηκών έχει παρατηρηθεί σε αρκετές κλινικές μελέτες και έχει επισημανθεί ότι η IP χημειοθεραπεία μπορεί να δώσει υψηλά ποσοστά ανταπόκρισης στο εσωτερικό της κοιλιάς οφείλεται στην περιτοναϊκή φράγμα πλάσμα που περιορίζει την έκθεση της χημειοθεραπείας σε περιτοναϊκή επιφάνειες, με αποτέλεσμα την υψηλότερη ναρκωτικών συγκέντρωση σε περιτοναϊκή κοιλότητα [3].

Χειρουργική είναι κρίσιμη για τους ασθενείς με ορθοκολικό και των ωοθηκών καρκίνους που έχουν εξαπλωθεί ευρέως στην περιτοναϊκή κοιλότητα. Υπάρχουν τρεις τύποι χειρουργικών debulking που έχουν προσπαθήσει να θεραπεύσουν ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών: (1) χειρουργική πρωτογενή debulking (αρχική χειρουργική), η οποία ήταν σε μεγάλο βαθμό η τυπική προσέγγιση? (2) διάστημα χειρουργική επέμβαση debulking μετά την εισαγωγική χημειοθεραπεία (nact), που προορίζεται για ασθενείς που είναι ιατρικά ακατάλληλα για άμεση λειτουργία ή των οποίων οι εκτεταμένες μεταστάσεις δεν μπορεί να εκτομή αρχικά? και (3) δευτερογενή χειρουργική επέμβαση debulking (επιπλέον χειρουργική επέμβαση), για ασθενείς που αναπτύσσουν υποτροπιάζουσες στη χημειοθεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών [1]. Αν και η βέλτιστη χειρουργική προσέγγιση παραμένει αμφιλεγόμενη, είναι πολύ σαφές ότι η βελτίωση της διεγχειρητικής συστήματα απεικόνισης του καρκίνου θα αποφέρει σημαντικό όφελος για την επιτυχή χειρουργική debulking του καρκίνου των ωοθηκών. Αν και ακτινολογικές προσεγγίσεις, όπως η αξονική τομογραφία (CT) και η μαγνητική τομογραφία (MRI) έχουν μεγάλη βοήθεια στον χαρακτηρισμό κακοήθειες μέσα στην περιτοναϊκή κοιλότητα, δεν είναι χρήσιμα για διεγχειρητική αξιολόγηση. Σε αντίθεση, η απεικόνιση φθορισμού έχει αποδειχθεί ότι είναι επιτυχής σε προκλινικές και κλινικές δοκιμές ως ένας οπτικός τεχνική προσφέρει σε πραγματικό χρόνο εικόνες του χειρουργικού στόχων (περιτοναϊκή καρκινωμάτωση και τον καρκίνο του μαστού) με επαρκή ανάλυση απεικόνισης και υψηλή διεγχειρητική ευαισθησία [4] – [8] . Coll και οι συνεργάτες του ανέφεραν ότι διεγχειρητική εγγύς υπέρυθρο φθορισμού (NIR) απεικονιστικά καθοδηγούμενη χειρουργική επέμβαση με τη χρήση ενός όγκου-πεπτίδιο που στοχεύει, σχεδία-γ (RGDfK)

4-Alex Fluor 700 (IV διαδρομή), σε ένα TSA-pGL3-ρουλεμάν μοντέλο ποντικού της περιτοναϊκής αδενοκαρκινώματος θα μπορούσε να βελτιώσει την ποιότητα των χειρουργικών debulking διπλασιάζοντας τον αριθμό των εντοπισμένων οζίδια του όγκου και τη συντόμευση του χρόνου λειτουργίας [5]. Τζιαχρήστος και οι συνεργάτες διεξάγεται με επιτυχία την πρώτη ανθρώπινη δοκιμή διεγχειρητικής ογκο-ειδικών απεικόνιση φθορισμού σε στάσης και debulking χειρουργική επέμβαση για καρκίνο των ωοθηκών χρησιμοποιώντας IV φολικού-FITC, και απέδειξαν ότι ο αριθμός των όγκων που ανιχνεύεται από τους χειρουργούς υπό την καθοδήγηση των εικόνων φθορισμού όγκου-ειδικά αυξημένη κατά 5,3 φορές (34

vs.

7) σε σύγκριση μόνο με το λευκό φως οπτική παρατήρηση [7]. Frangioni και τους συναδέλφους κατέδειξε επίσης την χρησιμότητα της FLARE (Fluorescence-Assisted εκτομή και Εξερεύνησης) συσκευή για την εικόνα καθοδηγούμενη ογκολογική χειρουργική επέμβαση στην πρώτη ανθρώπινη κλινική δοκιμή του καρκίνου του μαστού φρουρού λεμφαδένα (SLN) χαρτογράφηση ακόλουθα εντός του όγκου /υποδόρια ένεση 1 :1 μίγμα πράσινο ινδοκυανίνης και ανθρώπινη λευκωματίνη ορού (ICG: HAS) [6]. Σε αυτή τη δοκιμή, SLNs προσδιορίζονται από λεμφοσπινθηρογράφημα και φθορισμού NIR απεικόνισης ήταν ταυτόσημα σε 4 από ασθενείς με καρκίνο του μαστού 6

Εφαρμογή των νανοϋλικών ως παράγοντες απεικόνισης οπτικού φθορισμού χρησιμοποιώντας κβαντικές τελείες, νανοσωματίδια χρυσού, και φθορισμού ανιχνευτή που περιέχουν ή. – συζευγμένο νανοσωματίδια επέστησε την προσοχή για διαγνωστικούς σκοπούς σε προ-κλινικές μελέτες [9] – [13]. Πολυμερικά μικύλλια ανήκουν σε μια μεγάλη κατηγορία των νανοϋλικών που έχουν τεθεί αρκετές κλινικές δοκιμές για την παράδοση φαρμάκων,

π.χ.

. SP-1049C (δοξορουβικίνη, φάση ΙΙ), Genexol-PM (πακλιταξέλη, φάσης ΙΙ), και NC-6004 (σισπλατίνη, φάση Ι) [14]. Τα πολυμερικά μικύλλια προσφέρουν αρκετά πλεονεκτήματα όχι μόνο ως φορείς φαρμάκων, αλλά και ως οπτικά μέσα απεικόνισης στην ογκολογία: μικρού μεγέθους σωματίδια με στενή κατανομή μεγέθους, δομική σταθερότητα, υψηλή διαλυτότητα στο νερό, χαμηλή τοξική παρενέργεια έναντι των συμβατικών τασιενεργών (

π.χ.

. Cremophor EL), προνομιακή συσσώρευση σε συμπαγείς όγκους, μέσω ενισχυμένης διαπερατότητας και κατακράτησης (EPR) δράση, με σκοπό την καταστρατήγηση της νεφρικής διήθησης, και η πολυλειτουργικότητα με τη διακόσμηση επιφάνεια.

έχει συζητηθεί ότι η απόπτωση στοχευμένη χορήγηση φαρμάκων και την απεικόνιση του καρκίνου ( ειδικά για την απεικόνιση της ανταπόκρισης του όγκου σε χημειοθεραπεία) [15], [16] θα μπορούσε να είναι ανώτερη από καρκίνο που σχετίζεται αντιγόνου ή στρατηγική πρωτεΐνη στόχευσης σε ένα ευρύ φάσμα κακοηθειών, επειδή σημαντική ετερογένεια σε καρκινικές κυτταρικές πληθυσμούς δεν εγγυάται την αποκλειστική παρουσία της αντιγόνο και πρωτεΐνη βιοδεικτών σε ιστούς στόχους [17]. Χειρουργική ογκολόγους μπορούσαν να επωφεληθούν από την απεικόνιση του όγκου απόπτωση στοχευμένες (ανεξάρτητα από τον τύπο των κυττάρων και ενεργοποιεί επάγει θάνατο κυττάρων) μετά nact με μεγαλύτερη ακρίβεια και πιστότητα [18]. Έτσι, χειρουργική όγκων debulking χρησιμοποιώντας διεγχειρητική οπτική καθοδήγηση σε πραγματικό χρόνο εικόνες φθορισμού NIR θα μπορούσε να οδηγήσει σε βελτιωμένη χειρουργική ακρίβεια και την έκβαση. Ένα από τα πιο σημαντικά χαρακτηριστικά του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου, την απόπτωση, είναι η εξωτερίκευση της φωσφατιδυλοσερίνης (PS), το οποίο συνήθως βρίσκεται κατά κύριο λόγο στο εσωτερικό φύλλο της μεμβράνης πλάσματος [18].

Σε προηγούμενη εργασία μας, έχουμε αναφερθεί ότι πολυ (αιθυλενογλυκόλης) –

αποκλείσετε

-πολυ (ε-καπρολακτόνη) (ΡΕΟ

β

-pCl) μικκύλια που περιέχουν dIR (1,1-dioctadecyltetramethyl ιωδιούχου indotricarbocyanine) θα μπορούσε παθητικά συσσωρεύονται σε LS180 ανθρώπινους ιστούς στερεού όγκου κόλου από EPR αποτέλεσμα και παρέχει μη επεμβατική οριοθέτηση των ιστών LS180 όγκου με μια αναλογία όγκου-προς-μυ 30-43 από συλλεχθεί ιστούς [19]. Παρατηρήσαμε επίσης ενισχυμένη συσσώρευση DIR σε «γεμάτοι» ιστούς LS180 όγκου μετά από μια ένεση IV του πολυ-φαρμάκου που περιέχει πολυ (αιθυλενογλυκόλης) –

εμποδίσει

-πολυ (

D, L-γαλακτικό οξύ) (PEG –

b

-PLA) μικκύλια, γεγονός που υποδηλώνει την ύπαρξη ενός tandem πολυμερικών μικυλλίων που θα μπορούσαν να διευκολύνουν τη βελτίωση της οριοθέτησης του όγκου για χρήση σε χειρουργικές ογκολογία [20]. Πιο πρόσφατα, PEG-

b

-pCl μικκύλια με πακλιταξέλη (ΡΤΧ), κυκλοπαμίνη (CYP) και κατακάθι (GSP) στους 30, 30 και 30 mg /kg, αντίστοιχα (q7d χ 3) παραδίδεται μέσω IP, εμπόδισε την μεταστατική εξάπλωση του καρκίνου των ωοθηκών και εκτεταμένο σχηματισμό ασκίτη, με αποτέλεσμα την παρατεταμένη επιβίωση σε περιτοναϊκά μεταστατικό ES-2-Luc (αδιαφοροποίητη αδενοκαρκίνωμα, επιθετικά υπότυπος) και SKOV-3-Luc (ορώδες αδενοκαρκίνωμα, μέτριας ποιότητας υποτύπου) ποντικού ξενομοσχεύματος μοντέλα του καρκίνου των ωοθηκών [21].

προτείνουμε μια νέα στρατηγική δύο σταδίων για nact, απόπτωση στοχευμένη οπτική απεικόνιση και διεγχειρητικές χειρουργικές καθοδήγηση (Σχήμα 1). Στο πρώτο βήμα, ΡΕΟ

β

μικκύλια -pCl περιέχει PTX, CYP, και ΣΓΠ χρησιμοποιούνται για την IP nact και επαγωγή της απόπτωσης σε ιστούς όγκων. Σε ένα δεύτερο στάδιο, απόπτωση στόχευση PEG-

b

μικκύλια -pCl περιέχουν DIR μπορεί να συσσωρεύεται ενεργά σε αποπτωτικά ιστούς όγκων, επιτρέποντας οπτική απεικόνιση φθορισμού του απόπτωσης σε ένα πραγματικό χρόνο τρόπο (Σχήμα 1). Dir μόρια, NIR ανιχνευτές φθορισμού εκπομπής φωτός στο παράθυρο μήκους κύματος NIR, θα μπορούσε να είναι χρήσιμη ως ένας οπτικός παράγων απεικόνισης με φθορισμό, αποφεύγοντας ισχυρές αυτοφθορισμό από το δέρμα και το αίμα και επιτρέποντας ανιχνεύσιμα σήματα για να μετρηθεί μέσω αρκετών χιλιοστών ιστών [22]. Σε αυτή την εργασία, δείχνουμε ότι αυτό το δύο-βήμα τη στρατηγική οριοθέτηση ενισχυμένη όγκου σε φθορισμό NIR οπτική απεικόνιση και παρείχε χρήσιμες οδηγίες για διάστημα χειρουργική επέμβαση debulking σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος IP ES-2-Luc-ρουλεμάν του καρκίνου των ωοθηκών, σύζευξη δύο εφαρμογές των πολυμερικών μικκυλίων σε παροχή φαρμάκου και οπτικής απεικόνισης για τη χειρουργική ογκολογική θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών.

Η

Υλικά και Μέθοδοι

Παρασκευή PEG-

b

-pCl μικκύλια Διεξαγωγή ΡΤΧ, CYP και ΣΓΠ

Drug-φορτωμένο PEG-

β

-pCl μικκύλια παρασκευάστηκαν με μια μέθοδο εξάτμισης διαλύτη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [21]. Εν συντομία, 4,0 mg ΡΤΧ, CYP, και ΣΓΠ κάθε και 120 mg PEG-

β

-pCl (Μ

ν της PEG = 5,000 g /mol, Μ

ν της PCL = 10.000 g /mol, και το Μ

w /M

n = 1.26) (Advanced Πολυμερή Υλικά Inc., Montreal, Canada) διαλύθηκαν τελείως σε 1,0 ml ακετόνης που ακολουθείται από ταχεία προσθήκη 1,0 ml προθερμασμένου 0.9% αλατούχο διάλυμα στους 60 ° C με ζωηρή ανάμιξη. Η ακετόνη εξατμίστηκε υπό ελαττωμένη πίεση στους 60 ° C. Το υδατικό διάλυμα μικκυλίων φυγοκεντρήθηκε για 5 λεπτά στις 10,000 χ

g

και πέρασε μέσω ενός 0.2 μm αναγεννημένη κυτταρίνη (RC) στείρου φίλτρου σύριγγας (Corning, Tewksbury, ΜΑ) για την απομάκρυνση αδιάλυτων φαρμάκων. Το περιεχόμενο του ΡΤΧ, CYP, και GSP σε ΡΕΟ

b

-pCl μικκυλίων προσδιορίστηκε ποσοτικά με σύστημα αντίστροφης φάσης-HPLC (RP-HPLC) χρησιμοποιώντας ένα σύστημα Shimadzu Τονίζονται HPLC (Himadzu, Japan) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [ ,,,0],21]. Ο διαχωρισμός του ΡΤΧ, CYP, και GSP έγινε με ισοκρατικό τρόπο με κινητή φάση 55% ακετονιτρίλιο, 45% απεσταγμένο νερό, και 0.1% τριφθοροξεικό οξύ. ΡΤΧ, CYP, και GSP παρακολουθήθηκαν στα 227, 204, και 373 nm, αντίστοιχα, και εκλούστηκε σε 2.7 λεπτά, 1.9 λεπτά και 10.6 λεπτά, αντίστοιχα.

Παρασκευάσματα απόπτωση-στόχευσης PEG-

β

-pCl και μεθοξυ-ΡΕΟ

β

-pCl μικκύλια μεταφοράς dIR

Προετοιμασία της απόπτωσης στόχευση PEG-

β

-pCl (GFNFRLKAGAKIRFGS-PEG-

b

-pCl) μικκύλια που μεταφέρουν dIR ξεκίνησε με την μετατροπή της ακετάλης ομάδες στην επιφάνεια του PEG-

b

-pCl μικκύλια σε ομάδες αλδεϋδης (Σχήμα S1). Ακετάλη-PEG-

β

-pCl (Μ

ν της PEG = 5,000 g /mol, Μ

ν της PCL = 5,000 g /mol, και Μ

w /M

n = 1.13) παρασχέθηκε ευγενώς από τον Dr. Afsaneh Lavasanifar, Πανεπιστήμιο της Αλμπέρτα (Έντμοντον, Καναδάς). Η μέθοδος μετατροπής ήταν ελαφρώς τροποποιήσεις από τη βιβλιογραφία [23]. Ακετάλη-PEG-

b

-pCl συμπολυμερές διαλύεται σε ακετόνη σε συγκέντρωση 20 mg /mL. Το αποσταγμένο νερό προστέθηκε κατόπιν ταχέως στο διάλυμα πολυμερούς με έντονη ανάδευση σε θερμοκρασία δωματίου που ακολουθείται από εξάτμιση της ακετόνης υπό ελαττωμένη πίεση σε θερμοκρασία δωματίου. Το διάλυμα μικκυλίου φυγοκεντρήθηκε για 5 λεπτά στις 10,000 χ

g

και πέρασε μέσω ενός φίλτρου αποστειρωμένη σύριγγα 0,2 μm RC. Μετατροπή ακετάλης ομάδες ακετάλης-PEG-

b

-pCl μικκύλια διεξήχθη σε ρΗ 2,0 με προσθήκη 0,5 Ν ΗΟΙ. Μετά από 4 ώρες μέτρια ανάδευση σε θερμοκρασία δωματίου, η αντίδραση εξουδετερώθηκε με 0,5 Ν ΝαΟΗ για να σταματήσει η αντίδραση. Το εξουδετερωμένο διάλυμα μικκυλίων στη συνέχεια υποβάλλεται σε διαπίδυση έναντι νερού με μεμβράνη διαπίδυσης (MWCO 6000 g /mol) για την απομάκρυνση του άλατος όλη τη νύκτα και λυοφιλοποιήθηκε για 48 ώρες για τη μελλοντική χρήση. Λυοφιλισμένο δείγμα διαλύθηκε σε ΟϋΟ

3 (6 mg /ml) για την εκτίμηση του συντελεστή μετατροπής από την ακετάλη να αλδεϋδομάδα σε PEG-

β

-pCl από

1 NMR. Ελεύθερη πεπτίδιο, GFNFRLKAGAKIRFGS (UW Biotechnology Center, Madison, WI) σε Mw = 1769 g /mol (Σχήμα 2Α), διαλύθηκε σε ρυθμιστικό HEPES (10 mM, ρΗ 6.4) και αναμιγνύεται με το λυοφιλισμένο αλδεΰδη PEG-

b

-pCl μικκύλια για να ληφθούν 4 mg /ml πολυμερούς και 0,35 mg /mL συγκέντρωσης πεπτιδίου σε 2:01 γραμμομοριακή αναλογία (αλδεΰδη PEG-

b

-pCl: GFNFRLKAGAKIRFGS). Μετά από 2 ώρες από μέτρια ανάδευση, NaBH

3CN (10 ισοδύναμα) προστέθηκε στο μίγμα για να μειωθεί βάσης Schiff. Μετά από 4 ημέρες, διαλύματος μικκυλίων και πάλι σε διαπίδυση έναντι νερού με μεμβράνη διαπίδυσης (MWCO 6000 g /mol) και στη συνέχεια όλη τη νύκτα GFNFRLKAGAKIRFGS-PEG-

b

διαλύματος μικκυλίων -pCl λυοφιλίσθηκε για 48 ώρες. Η αποτελεσματικότητα σύζευξη του πεπτιδίου στην αλδεΰδη PEG-

b

-pCl προσδιορίστηκε με ανάλυση RP-HPLC. Εν συντομία, δείγματα (10 μλ) εγχύθηκαν σε μία στήλη Zorbax 300SB-C18 (4,6 χ 15 mm, που 3,5 μm, Agilent) διατηρήθηκε στους 40 ° C και ο ρυθμός ροής ήταν 0.8 mL /min. Βαθμιδωτή έκλουση πραγματοποιήθηκε με την κινητή φάση του 0.1% τριφθοροξικό οξύ σε απεσταγμένο νερό και 0,1% τριφθοροξικό οξύ σε 90/10 (ν /ν) ακετονιτρίλιο /αποσταγμένο νερό. Η κινητή φάση ήταν προγραμματισμένος ως εξής: 0 min 85% Α διαλύτη και 15% διαλύτη Β? 35 λεπτά, 50% διαλύτη Α και 50% διαλύτη Β Ελεύθερη πεπτιδίου παρακολουθήθηκε στα 215 nm και εκλούστηκε σε 16 min. Η ποσότητα του πεπτιδίου συζευγμένου σε PEG-

b

-pCl μικκυλίων υπολογίσθηκε με αφαίρεση της ποσότητας του ελεύθερου πεπτιδίου από την ποσότητα του πεπτιδίου που προστέθηκε αρχικά στις αντίδραση. Παράλληλα, λυοφιλήθηκε πεπτίδιο συζευγμένο σε PEG-

b

-pCl διαλύθηκε σε DMSO-

d

6 (6 mg /mL) για τον υπολογισμό ποσοστού σύζευξη του πεπτιδίου σε PEG-

β

-pCl από

1 NMR στους 80 ° C.

τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως% μόρια FLI dir δεσμεύεται σε πιάτα και% FLI από μόρια dir δεσμεύεται για ES-2-Luc ωοθηκών σφαιροειδή όγκου. BLI από ES-2-Luc κύτταρα και FLI από μόρια dir μετρήθηκαν με Xenogen IVIS 200 Series. (Α) Ανταγωνιστική δοκιμασία πρόσδεσης της απόπτωσης-στόχευσης PEG-

b

-pCl μικκύλια που μεταφέρουν Dir (πεπτίδιο 1.0 μΜ και 500 ηΜ Dir) προς υπολογιστή ή PS-επικαλυμμένες 96-βοθρίων (συνολικά 200 μΜ φωσφολιπιδίου ). (Β) Η ανταγωνιστική δοκιμή δέσμευσης της απόπτωσης στόχευση PEG-

β

-pCl μικκύλια που μεταφέρουν DIR σε απόπτωση που προκαλείται ES-2-Luc σφαιροειδή όγκου των ωοθηκών (** & lt? 0,01, *** & lt? 0.001) .

η

μεθοξυ-ΡΕΟ

β

-pCl και την απόπτωση στόχευση PEG-

β

-pCl μικκύλια που μεταφέρουν dIR παρασκευάστηκαν με μια μέθοδο εξάτμισης διαλύτη: 4,0 mg πολυμερών και 0.1 mg του dir (Invitrogen, Carlsbad, CA) διαλύθηκαν σε 1,0 mL ακετόνης, ακολουθούμενη από μία ταχεία προσθήκη PBS (10 mM, ρΗ 7,4) με έντονη ανάμιξη. Η ακετόνη εξατμίστηκε υπό ελαττωμένη πίεση σε θερμοκρασία δωματίου. Το υδατικό διάλυμα που περιέχει μικυλλίου DIR φυγοκεντρήθηκε για 5 λεπτά στις 10,000 χ

g

και πέρασε μέσω ενός φίλτρου αποστειρωμένη σύριγγα των 0,2 μm RC για την απομάκρυνση μη ενσωματωμένου DIR. Το περιεχόμενο του DIR σε μικκύλια ποσοτικοποιήθηκε με RP-HPLC όπως περιγράφεται προηγουμένως [20]. Η έκλουση του DIR έγινε σε έναν τρόπο βαθμίδωσης με κινητή φάση 70% αποσταγμένο νερό και 0,07% τριφθοροξικό οξύ ως διαλύτη Α και 30% ακετονιτρίλιο και 0,03% τριφθοροξικό οξύ ως διαλύτη Β DIR παρακολουθήθηκε στα 745 nm και εκλούστηκε σε 16 λεπτά.

Φυσική Χαρακτηρισμός της μεθοξυ-ΡΕΟ

β

-pCl και απόπτωση στόχευση PEG-

β

-pCl μικκύλια μεταφοράς dIR

Z -ΜΕΣΕΣ διάμετροι των μεθοξυ-ΡΕΟ

β

-pCl μικκύλια και την απόπτωση στόχευση PEG-

β

-pCl μικκύλια που μεταφέρουν dIR προσδιορίστηκαν με δυναμική σκέδαση φωτός (DLS) μετρήσεις χρησιμοποιώντας Zetasizer νανο- ZS (Malvern Instruments, Ηνωμένο Βασίλειο) στους 25 ° C με γωνία ανίχνευσης 173 ° και He-Ne laser ιόντων (4 mW, λ = 633 nm) για την προσπίπτουσα δέσμη. λειτουργιών αυτοσυσχέτισης δημιουργήθηκαν με βάση cumulant ανάλυση, τον υπολογισμό της υδροδυναμική διάμετρος των μικκυλίων από την εξίσωση Stokes-Einstein και ο δείκτης πολυδιασποράς (PDI). Πριν από τις μετρήσεις, τα διαλύματα μικκύλιο αραιώθηκαν με PBS (10 mM, ρΗ 7.4) για να δώσει μία συγκέντρωση πολυμερούς σε ~ 0,4 mg /mL, που αντιπροσωπεύει τη συγκέντρωση του πολυμερούς πάνω από την κρίσιμη συγκέντρωση μικυλλίων. DIR απόδοσης φόρτωσης παρουσιάστηκε ως πολυμερές βάρος% dir /βάρους. Η

in vitro

DIR κινητικές απελευθέρωσης της μεθοξυ-ΡΕΟ

β

-pCl και την απόπτωση στόχευση PEG-

β

-pCl μικκύλια που μεταφέρουν Dir μελετήθηκε για να εκτιμηθεί ο χρόνος για την απελευθέρωση του φαρμάκου 50% (t

1/2) με βάση ένα μοντέλο αποσύνθεση μιας φάσης χρησιμοποιώντας GraphPad Prism έκδοση 5.00 για Mac OS X (La Jolla, CA). DIR-φορτωμένο μικκύλια, που αντιπροσωπεύει 100 μg /mL του Dir, προστέθηκαν σε κασέτες διαπίδυσης (MWCO 20.000 g /mol), και κασέτες τοποθετήθηκαν σε 2.0 L PBS (10 mM, ρΗ 7,4) στους 37 ° C με μέτρια ανάδευση. Δείγματα (20 μΛ αποσύρθηκαν από κασέτες σε διάφορα χρονικά σημεία, 0, 0,5, 1, 2, 3, 8, 12, και 24 ώρες και μετά από κάθε δειγματοληψία, κασέτες αναπληρώνονται με 20 μΛ φρέσκου PBS (10 mM, ρΗ 7,4 ). Το περιεχόμενο του dIR σε μικκύλια αριστερά σε κασέτες αναλύθηκε με RP-HPLC όπως περιγράφεται παραπάνω.

Αξιολόγηση της PS-επιλεκτική δέσμευση της απόπτωσης-στόχευσης PEG-

b

-pCl μικκύλια μεταφοράς dIR

η πρόσδεση της απόπτωσης-στόχευσης PEG-

b

-pCl μικκύλια που μεταφέρουν dir να PS αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας πλάκες φωσφολιπίδια φρεάτιο [24] και σφαιροειδή όγκου 3-D που σχηματίζεται από λουσιφεράσης που εκφράζουν ES-2-Luc κύτταρα. PC ή PS διαλυτοποιήθηκαν σε αιθανόλη ακινητοποιήθηκε σε διαυγούς πυθμένα των 96 φρεατίων σε συγκέντρωση περίπου 200 μΜ σε κάθε φρεάτιο, και η αιθανόλη εξατμίστηκε σε θερμοκρασία δωματίου όλη τη νύχτα. Κάποια από PC ή PS-επικαλυμμένο φρεάτια επωάστηκαν με 1,0 μΜ ελεύθερου πεπτιδίου επί 3 ώρες για να κορεστεί PS σε φρεάτια επικαλυμμένα με φωσφολιπίδιο. απόπτωση στόχευση PEG-

b

-pCl μικκύλια που μεταφέρουν dir, που αντιπροσωπεύει 1,0 μΜ πεπτιδίου και 500 ηΜ dir, προστέθηκαν στα φρεάτια και επωάστηκαν για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου σε σκοτάδι. Κάθε φρεάτιο πλύθηκε με PBS (10 mM, pH 7,4) και την απόπτωση στόχευση PEG-

β

-pCl μικκύλια που μεταφέρουν DIR δεσμεύεται για πηγάδια ανιχνεύθηκε από Xenogen IVIS 200 Series (δαγκάνα Life Sciences, Hopkinton, ΜΑ) . ES-2-Luc σφαιροειδή όγκου 3-D παράχθηκαν με επίστρωση 5000 ES-2-Luc κύτταρα /φρεάτιο σε αγαρόζη επικαλυμμένα πλακίδια των 96 φρεατίων και επωάστηκαν για 4 ημέρες. ES-2 ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών διαμολύνθηκαν σταθερά με πλασμίδιο pGL4.51 λουσιφεράσης που εκφράζουν που περιέχει το γονίδιο αντοχής νεομυκίνης (Promega, Madison, WI) χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [21]. ES-2-Luc κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο McCoy 5Α συμπληρωμένο με 1% L-γλουταμίνη, 10% ορό εμβρύου μόσχου, 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη, και 750 μg /αντιβιοτικών mL G418 και διατηρήθηκαν στους 37 ° C υπό ατμόσφαιρα 5 % CO

2 σε υγροποιημένο επωαστή. PEG-

b

-pCl μικκύλια περιέχουν ΡΤΧ, CYP, και GSP (3.3, 3.3, και 3.3 ηΜ, αντιστοίχως) προστέθηκαν σε ES-2-Luc σφαιροειδή όγκου και επωάζονται για 3 ημέρες. Μερικά από αγωγή ES-2-Luc σφαιροειδή επωάστηκαν 3 ώρες με 200 ηΜ του ελεύθερου πεπτιδίου για να κορεστεί PS εκτίθεται στην σφαιροειδή όγκου. Απόπτωση στόχευση PEG-

b

-pCl μικκύλια που μεταφέρουν DIR προστέθηκαν στη συνέχεια ES-2-Luc σφαιροειδή όγκου σε μια τελική συγκέντρωση 200 ηΜ πεπτιδίου και 100 ηΜ Dir και επωάστηκαν για 30 λεπτά στους 37 ° C σε 5% CO

2 υγροποιημένο εκκολαπτήριο. Ως έλεγχος, η ένταση του βιοφωτισμός ES-2-Luc κύτταρα παρακολουθούνταν επίσης για να εξασφαλιστεί ότι ES-2-Luc σφαιροειδή όγκου σχηματίστηκαν με συνέπεια σε κάθε φρεάτιο, χρησιμοποιώντας Xenogen IVIS 200 Series.

Ενδοπεριτοναϊκή Ανθρωπίνων Ωοθηκών Ξενομοσχεύματος και μικυλλίου Θεραπείες

Γυναίκα 6-8 εβδομάδων αθυμικούς γυμνούς Foxnl

ηυ αγοράστηκαν από Harlan Laboratories (Madison, WI). Όλα τα πειράματα σε ζώα διεξήχθησαν αυστηρά σύμφωνα με τις συστάσεις στον Οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση των Ζώων Εργαστηρίου των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας (NIH). Η ηθική και ανθρώπινη χρήση ζώων ενημερώθηκε από την επιτροπή Όλα Campus ζώων Σχεδιασμού και Συμβουλευτικής (ACAPAC) και το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την Επιτροπή Θεσμικών Animal Care and Use (IACUC) στο Πανεπιστήμιο του Wisconsin-Madison (αριθμός άδειας: M02472) . Γενική αναισθησία προκλήθηκε με 1.5% ισοφλουράνιο /οξυγόνου και διατηρείται με 1% ισοφλουράνιο /οξυγόνου. ES-2-Luc κύτταρα τρυψινοποιήθηκαν, συλλέχθηκαν από υπο-συρρέουσες καλλιέργειες, και 1 × 10

6 κύτταρα /ζώο του ES-2-Luc κύτταρα ενέθηκαν μέσα στην περιτοναϊκή κοιλότητα αναισθητοποιημένων ποντικών. ΙΡ ένεση PEG-

b

-pCl μικκύλια που μεταφέρουν 30, 30, και 30 mg /kg του ΡΤΧ, CYP, και GSP διεξήχθη 7 ημέρες μετά τον εμβολιασμό του IP ES-2-Luc κύτταρα μετά από παρατήρηση της βιοφωταύγειας σήμα σε εικόνες σε ολόκληρο το σώμα των ζώων από Xenogen IVIS 200 Series. Μια μέρα μετά την ένεση ΙΡ του PEG-

β

-pCl μικκύλια που περιέχουν PTX, CYP, και ΣΓΠ, μεθοξυ ή απόπτωση στόχευση PEG-

β

-pCl μικκύλια που μεταφέρουν 250 μg /kg dir εγχύθηκε μέσω της φλέβας της ουράς αναισθητοποιημένων ζώων. Τα σωματικά βάρη των ζώων μετρήθηκαν με μια φορητή κλίμακα, και τη γενική εμφάνιση και η θνησιμότητα των ζώων παρακολουθούνταν προσεκτικά κατά τη διάρκεια όλων των σετ των πειραμάτων σε ζώα. Όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιηθεί η ταλαιπωρία των ζώων. Τα ζώα υποβλήθηκαν σε ευθανασία με ιατρικής ποιότητος διοξειδίου του άνθρακα με το ρυθμό ροής του 10-30% του όγκου του θαλάμου ευθανασία ανά λεπτό.

TUNEL Δοκιμασία

ES-2-Luc που φέρουν ξενομόσχευμα δοσολογήθηκε μέσω διαδρομή IP με ΡΕΟ

β

-pCl μικκύλια που μεταφέρουν PTX, CYP, και ΣΓΠ την 7η ημέρα μετά ES-2-Luc κύτταρα εμβολιάστηκαν στην περιτοναϊκή κοιλότητα. Στη συνέχεια, τα ζώα (

n

= 4) θυσιάστηκαν στις 0, 12, 24, 48, και 72 ώρες μετά τη θεραπεία μικκύλιο. Tumor, σπλήνα, τα νεφρά, το ήπαρ και τους ιστούς αποκόπηκαν. κατακερματισμού του DNA που προκαλείται από απόπτωση ανιχνεύθηκε σε ιστούς με τη μέθοδο TdT μεσολάβηση dUTP Nick-End επισήμανση (TUNEL) με τη χρήση κιτ δοκιμασίας αδιέξοδο Φθορομετρικής TUNEL (Promega, Madison, WI). Οι ιστοί τεμαχίστηκαν κατεψυγμένα σε 10 μm φέτες, διαπερατά από πρωτεϊνάση Κ, και μονιμοποιήθηκαν με 4% φορμαλδεΰδη. Το μίγμα της αντίδρασης που αποτελείται από TdT και σημασμένο με φλουορεσκεΐνη dUTP προστέθηκε σε σταθερό τμήμα των ιστών και επωάστηκαν για 1 ώρα στους 37 ° C σε υγροποιημένο θάλαμο σε σκοτάδι. θραύσματα και πυρήνες των κυττάρων couterstained με DAPI DNA φθορεσκεΐνη-σημασμένο έγιναν ορατά στα 520 nm και 460 nm, αντίστοιχα, χρησιμοποιώντας ένα συνεστιακό μικροσκόπιο (Olympus FV1000 FLUOVIEW, Minneapolis, ΜΝ). Αποπτωτικών κυττάρων και οι πυρήνες των κυττάρων φαίνεται στο πράσινο και μπλε, αντίστοιχα.

Η βιοφωταύγεια και φθορισμού Imagings

Xenogen IVIS 200 Series χρησιμοποιήθηκε για την εικόνα τόσο βιοφωταύγεια και φθορισμού από αντικείμενα

in vitro

,

in vivo

, και

ex vivo

. Xenogen IVIS 200 Series ήταν εξοπλισμένο με έναν 150 W λάμπα αλογόνου χαλαζία και 1 mW λέιζερ σάρωσης δύναμη. Οι εικόνες της οθόνης, εμφανίζεται με τη χωρική ανάλυση των & gt? 60 μm /pixel. εικόνες βιοφωτισμός αποκτήθηκαν από μια συσκευή φορτισμένη ζευγάρι (CCD) με τις ακόλουθες παραμέτρους: το χρόνο έκθεσης = 1 s, ενδοχείαση = μέσο, ​​και f /stop = 2.

In vitro

, D-λουσιφερίνης (δαγκάνα Ζωής Science, Hopinton, μΑ) σε συγκέντρωση 10 μg /φρεάτιο προστέθηκε σε ES-2-Luc σφαιροειδή όγκου 5 λεπτά πριν από την απεικόνιση βιοφωταύγειας, και

in vivo

, D-λουσιφερίνη σε 113 mg /kg εγχύθηκε IP σε ES-2-Luc που φέρουν μοντέλο ξενομοσχεύματος 5 λεπτά πριν από την απεικόνιση βιοφωταύγειας σε ολόκληρο το σώμα. Η δυναμική του ES-2-Luc ανάπτυξη του όγκου συλλέγονται και εμφανίζονται ως εικόνες χρωματική κωδικοποίηση χρησιμοποιώντας λογισμικό Live απεικόνισης για την ποσοτική ανάλυση και BLI του ES-2-Luc όγκους κλιμακώθηκε από τις συνολικές μετρήσεις.

εικόνες φθορισμού επίσης, αποκτήθηκε από μια φορτισμένη διάταξη ζευγάρι (CCD) με τις ακόλουθες παραμέτρους: το χρόνο έκθεσης = 1 s, ενδοχείαση = μέσο, ​​και f /stop = 2. ένα φίλτρο ρύθμιση για την ανίχνευση dir καθορίστηκε σε 745 nm για διέγερση και 800 nm για την εκπομπή. Όλες οι εικόνες με χρωματικό κώδικα συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας Ζήστε λογισμικό απεικόνισης για την απόκτηση και ανάλυση εικόνας. FLI του DIR αποδείχθηκε κατά μέσο απόδοση της ακτινοβολίας, το σύνολο των φωτονίων ανά δευτερόλεπτο ανά τετραγωνικό εκατοστό ανά στερακτίνιο στην περιοχή ακτινοβολίας (microwatts ανά τετραγωνικό εκατοστό): [ps

-1 εκατοστά

-2sr

-1] /[ ,,,0],μW cm

-2]. Ο φθορισμός του DIR σε ιστούς όγκων προσδιορίστηκε από τη μέση απόδοση της ακτινοβολίας σε ROI που γύρω ιστούς όγκων προκαθοριστεί από βιοφωταύγεια απεικόνισης της ίδιας ζώου.

βιοφωταύγεια και φθορισμού εικόνες ολόκληρου του σώματος καταγράφηκαν σε 6, 12, 24 και 48 ώρες μετά την ενδοφλέβια ένεση της ΡΕΟ

β

-pCl μικκύλια που μεταφέρουν σκην. Οι ποντικοί τοποθετήθηκαν στην κοιλιακή θέσεις για να ληφθούν βιοφωταύγεια και ο φθορισμός εικόνες χρωματική κωδικοποίηση σε ολόκληρο το σώμα. Όλες οι ρυθμίσεις εξοπλισμός για βιοφωταύγεια και φθορισμού imagings ήταν ταυτόσημα στο πείραμα πορεία του χρόνου.

Σε πραγματικό χρόνο φθορισμού Imaging Acquisition σε ζώα

Fluobeam 800 είναι ένα σύστημα απεικόνισης φθορισμού 2-D NIR αποτελείται από CCD φωτογραφική μηχανή και μια ολοκληρωμένη πηγή φωτός NIR (100 mW) με ένα μήκος κύματος διέγερσης στα 780 nm και μήκος κύματος εκπομπής σε & gt? 820 nm. Αυτό το σύστημα που προβλέπεται 7,5 × 10 cm ομοιογενές φωτισμένο χώρο και το φορητό σύστημα χειρός αποτελείται από κάμερα και laser βρισκόταν περίπου 20 εκατοστά πάνω από το αντικείμενο. εικόνες φθορισμού ήταν οθόνης εμφανίζεται με τη χωρική ανάλυση των 110 μm /pixel και καταγράφεται είτε ως μαύρο-άσπρο-και στατικών εικόνων (9 εικόνες /sec) ή βίντεο σε πραγματικό χρόνο (25 εικόνες /sec).

Χειρουργική Διαδικασία

Τα ζώα έλαβαν μια ένεση ΙΡ του D-λουσιφερίνης (113 mg /kg) 5 λεπτά πριν από την σε ολόκληρο το σώμα βιοφωταύγεια απεικόνισης κατά την ημέρα 9 μετά ES-2-Luc ενοφθαλμισμό κυττάρων (24 ώρες μετά την ένεση IV της PEG-

β

-pCl μικκύλια που μεταφέρουν dIR). Μετά την απεικόνιση βιοφωταύγειας σε ολόκληρο το σώμα διεξήχθη, τα ζώα θανατώθηκαν αμέσως. Όλα τα ζώα θανατώθηκαν υποβλήθηκαν σε λαπαροτομή μέσης γραμμής και βιοφωταύγεια εικόνες σε ολόκληρο το σώμα του τέμνεται ζώων ελήφθησαν και πάλι. Όλες οι χειρουργικές επεμβάσεις πραγματοποιήθηκαν σε ζώα και θυσιάστηκαν με μια χειρουργική ογκολόγος έμπειρος στη χειρουργική ποντικού. Σε ένα σύνολο πειραμάτων (

n

= 4), για λόγους σύγκρισης, η παραδοσιακή χειρουργική εκτομή του όγκου εκτελέστηκε σύμφωνα με τη συνήθη λευκού φωτός. Όταν η χειρουργική εκτομή του όγκου κρίθηκε ικανοποιητική, αποσυντίθενται ιστούς και το σφάγιο όγκου-όπως σαρώθηκαν από Xenogen IVIS 200 Series για τη λήψη εικόνων βιοφωταύγεια. Σε μια άλλη ομάδα ζώων (

n

= 4), σύστημα απεικόνισης NIR, το σύστημα απεικόνισης NIR Fluobeam 800 τέθηκε σε λειτουργία και η χειρουργική εκτομή του όγκου βοηθήθηκε από τις εικόνες φθορισμού σε πραγματικό χρόνο στην οθόνη. Όταν όγκο όπως η γρίπη

+ ιστοί αποκόπηκαν όσο το δυνατόν πληρέστερα, τεμαχίζεται ιστούς όγκων-όπως και ο σκελετός σαρώθηκαν χρησιμοποιώντας τη σειρά Xenogen IVIS 200 για να ληφθεί βιοφωταύγεια και φθορισμού εικόνων. Η διάρκεια της χειρουργικής επέμβασης καταγράφηκε από τη στιγμή της τομής στην ολοκλήρωση του debulking όγκου. Χειρουργική ακρίβεια αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας δύο υπολογισμών: (1)% άθροισμα των BLU

+ όγκου όπως ιστών με το άθροισμα του συνολικού όγκου-όπως ιστοί αποκόπηκαν καθ ‘όλη τη χειρουργική διαδικασία, και (2) τις συνολικές μετρήσεις της BLI της [ROI στα μέσα -line εγχάρακτη ζώων μείον ROI στην τεμαχίζεται σε ζώα] σε σχέση με αυτές της ΑΤΕ στην μεσαία γραμμή τέμνεται ζώων. Χειρουργικά ακρίβεια μετρήθηκε επίσης με τον υπολογισμό ενός δείκτη μετά εκτομή καρκίνο του περιτοναίου (PCI), όπως περιγράφεται από Sugarbaker [3]. Το PCI βασίζεται στην διανομή και το μέγεθος των βλαβών στην κοιλιά του ζώου. Σε αυτή τη μελέτη, PCI προσαρμόστηκε σε μεγέθη όγκου σε ποντικούς με τις ακόλουθες βαθμολογίες: Η κοιλία διαιρέθηκε σε 13 περιφέρειες και το μέγεθος της βλάβης (LS) βαθμολογήθηκε (0 έως 3) σε κάθε περιοχή ως εξής: κανένα οπτικό όγκοι (LS = 0), & gt? 0 έως 0,5mm όγκου (LS = 1), 0,6 έως 2,0 όγκων mm (LS = 2), και & gt? 2,0 mm όγκου (LS = 3). Συνολική βαθμολογία LS ανά ζώο αθροίζονται ως αριθμητική βαθμολογία που μπορεί να κυμαίνεται από 0 (δεν υπάρχουν όγκοι που παρατηρήθηκαν) σε 39 (13 τομείς × 3).

Στατιστική Ανάλυση

Η στατιστική ανάλυση έγινε με τη χρήση μονόδρομη ANOVA σε επίπεδο σημαντικότητας 5% σε συνδυασμό με πολλαπλές δοκιμές σύγκριση Tukey κατά GraphPad Prism ver 5,00 για Mac OS X (La Jolla, CA).

Αποτελέσματα

Χαρακτηρισμός της απόπτωσης στόχευση PEG –

β

-pCl μικκύλια μεταφοράς dIR

Ο Πίνακας 1 παρουσιάζει τα μεγέθη και οι αποδόσεις φόρτωσης (βάρος% dir /βάρος πολυμερούς) απόπτωσης στόχευση PEG-

β

-pCl ( GFNFRLKAGAKIRFGS-PEG-

β

-pCl) και μεθοξυ-ΡΕΟ

β

-pCl μικκύλια επιτευχθεί μετά το σχηματισμό dIR-ενσωματωθεί μικκύλια με μία τεχνική εξάτμισης του διαλύτη. Απόπτωση στόχευση PEG-

b

-pCl μικκύλια είχε μια ζ-μέση διάμετρο 83 ± 2 nm (δείκτης πολυδιασποράς, PDI 0.1) και μεθοξυ-ΡΕΟ-

b

-pCl μικκύλια είχε Ζ-μέση διάμετρο 45 ± 2 nm (PDI 0.1). Η αποτελεσματικότητα φόρτωσης DIR και για τις δύο μικκυλίων ήταν περίπου 2%. Πεπτίδιο (GFNFRLKAGAKIRFGS) ήταν συζευγμένο σε PEG-

β

-pCl μικκύλια με την μοριακή αναλογία σύζευξη σε 30%

μέσω

μια αντίδραση βάσης Schiff, με βάση τα αποτελέσματα και από τις δύο HPLC (αφαιρετικό ποσοτικοποίηση της μη συζευγμένο πεπτίδιο από το πεπτίδιο αρχικά προστίθεται για αντίδραση) και

1Η NMR (ποσοτικοποίηση του συζευγμένου πεπτιδίου) αναλύσεις (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Σε

ανάλυση 1Η NMR, η σχετική αναλογία της έντασης της κορυφής του βενζυλο πρωτονίων της φαινυλαλανίνης στο δ = 7,2 ppm στο πεπτίδιο με την κορυφή πρωτόνιο του μεθυλενίου από PEG πρωτονίων στο δ = 3,7 ppm καθορισμό του επιπέδου του πεπτιδίου επί PEG-

β

-pCl. Τα δεδομένα για το πεπτίδιο ποσοτικοποίηση από HPLC και

1 NMR παρέχονται συγκρίσιμες τιμές.