Αφηρημένο

Πολλά μοναδικά βιολογικά χαρακτηριστικά του HIV-1 Vpr είναι μια δυνητικά ισχυρό παράγοντα για την αντικαρκινική θεραπεία κάνουν. Πρώτον, Vpr αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων από επαγωγή του κυτταρικού κύκλου G2 σύλληψης. Δεύτερον, προκαλεί απόπτωση μέσω πολλαπλών μηχανισμών, η οποία θα μπορούσε να είναι σημαντική, καθώς μπορεί να είναι σε θέση να ξεπεράσει αποπτωτική αντίσταση που παρουσιάζεται από πολλούς καρκινικά κύτταρα, και, τέλος, Vpr επιλεκτικά σκοτώνει ταχέως αναπτυσσόμενη κυττάρων σε ένα ρ53-ανεξάρτητο τρόπο. Για να αποδειχθεί η πιθανή χρησιμότητα της Vpr ως αντικαρκινικού παράγοντα, θα πραγματοποιηθεί μελέτες απόδειξη της έννοιας

in vitro

και

in vivo

. Τα αποτελέσματα των προκαταρκτικών μελετών μας απέδειξαν ότι Vpr επάγει κυτταρικό κύκλο G2 σύλληψη και απόπτωση σε μια ποικιλία τύπων καρκίνου. Επιπλέον, τα ίδια αποτελέσματα θα μπορούσαν Vpr επίσης να ανιχνευθεί σε μερικά καρκινικά κύτταρα που είναι ανθεκτικά σε αντικαρκινικά φάρμακα όπως δοξορουβικίνη (ϋΟΧ). Για να επεξηγηθεί περαιτέρω η πιθανή αξία του Vpr σε αναστολή της ανάπτυξης του όγκου, υιοθετήσαμε ένα μοντέλο DOX ανθεκτικό νευροβλαστώματος με ένεση κυττάρων SK-N-SH σε C57BL /6N και C57BL /scid ποντικοί /6J-scid. Υποθέσαμε ότι Vpr είναι σε θέση να μπλοκάρει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και διεγείρει απόπτωση ανεξάρτητα από την κατάσταση της αντοχής στα φάρμακα των όγκων. Πράγματι, η παραγωγή της Vpr

μέσω του αδενοϊικού παράδοση

σε κύτταρα νευροβλαστώματος προκάλεσε G2 σύλληψη και την απόπτωση στα δύο φαρμάκων αφελή και DOX-ανθεκτικά κύτταρα. Επιπλέον, προ-μόλυνση ή ενδοογκική ένεση

vpr

εκφράζοντα αδενοϊικό σωματιδίων σε όγκους νευροβλαστώματος σε ποντίκια SCID αξιοσημείωτα ανέστειλε την ανάπτυξη του όγκου. Ως εκ τούτου, Vpr θα μπορούσε ενδεχομένως να χρησιμοποιηθεί ως ένα συμπληρωματικό ιικό θεραπευτικός παράγοντας για την επιλεκτική αναστολή της ανάπτυξης όγκου σε αντικαρκινική θεραπεία, ιδίως όταν άλλες θεραπείες σταματήσουν να λειτουργούν

Παράθεση:. Zhao RY, Liang D, Li G, Larrimore CW , Mirkin BL (2010) Αντι-καρκίνο Επίδραση του HIV-1 Viral πρωτεΐνη R στην δοξορουβικίνη Ανθεκτικό νευροβλάστωμα. PLoS ONE 5 (7): e11466. doi: 10.1371 /journal.pone.0011466

Επιμέλεια: Φατάχ Kashanchi, George Mason University, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 6, Μαΐου, 2010? Αποδεκτές: 8 του Ιούνη του 2010? Δημοσιεύθηκε: 7 Ιουλίου 2010

Copyright: © 2010 Zhao et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε εν μέρει από το Ιατρικό Συμβούλιο Έρευνας Chicago, Illinois τμήμα Δημοσίων ενισχύσεων και του τμήματος υπηρεσιών Ανθρώπινου Υγείας των ΗΠΑ και το Πανεπιστήμιο του Maryland Medical Center (για να RYZ). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Αν και υπήρξαν μεγάλες προόδους στη θεραπεία του καρκίνου κατά τη διάρκεια των τελευταίων δεκαετιών, εξακολουθεί να υπάρχει μια σειρά από σημαντικά εμπόδια που περιορίζουν τη χρήση ορισμένων από αυτές τις νέες θεραπείες. Τα εμπόδια που παρουσιάζονται περιλαμβάνουν, αλλά δεν περιορίζονται σε αυτά, 1) χρησιμεύουν παρενέργεια λόγω μη ειδική κυτταροτοξικότητα των θεραπειών, 2) ανάπτυξη αντοχής φαρμάκου, και 3) ανάπτυξη της αντοχής των όγκων στην απόπτωση. Επομένως, οποιαδήποτε αντικαρκινικός παράγοντας που θα μπορούσε να αποφύγει είτε ή να παρακάμψουν τις αδυναμίες του ορισμένες από τις τρέχουσες αντικαρκινικές αγωγές θα είναι μεγάλης σημασίας για το μελλοντικό σχεδιασμό της θεραπείας κατά του καρκίνου. Ιδανικά, ένας αποτελεσματικός παράγοντας κατά του καρκίνου θα πρέπει να έχει τις ακόλουθες ιδιότητες. Θα πρέπει να είναι σε θέση να 1) μπλοκ μόνο μη φυσιολογικό κυτταρικό πολλαπλασιασμό που προκύπτει από την απώλεια της κανονικής ρύθμισης του κυτταρικού κύκλου, π.χ., μεταλλάξεις κυτταρική οδοφράγματος? 2) να προκαλέσει παρατεταμένη διακοπή του κυτταρικού κύκλου που θα μπορούσε να οδηγήσει σε κυτταρικό θάνατο ή απόπτωση? 3) επάγει ειδικές θανάτωσης κυττάρων σε καρκινικά κύτταρα με ελάχιστη ή καθόλου επίδραση επί των φυσιολογικών κυττάρων? 4) να είναι σε θέση να παρακάμψετε αποπτωτικών αντίσταση, ένα τυπικό χαρακτηριστικό πολλών καρκινικών κυττάρων? 5) έχουν το κύτταρο θανάτωση επίδραση ανεξάρτητη από κοινού ογκογόνους μεταλλάξεις όπως ρ53? 6) παρέχουν το ίδιο σύλληψη και θανάτωση κυττάρου αποτελέσματα σε ανθεκτικά κύτταρα φαρμάκου, δηλαδή, όταν άλλα χημειοθεραπευτικό φάρμακο αποτυγχάνει? και 7) απορροφάται εύκολα ή εκκρίνονται από τα κύτταρα κατά την αρχική βιοδραστική της μορφή.

Η ιική πρωτεΐνη R (Vpr) κατασκευασμένο από τον ανθρώπινο ιό ανοσοανεπάρκειας τύπου 1 (HIV-1) θα μπορούσαν δυνητικά να εκπληρώσει πολλά από τα προαναφερθέντα κριτήρια. Επειδή, 1) Vpr μπλοκ πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων από επαγωγή G2 κύκλου κυττάρου [1], [2], και αυτό συλλαμβάνοντας επίδραση είναι ανεξάρτητη από τα κλασικά σημεία ελέγχου του DNA [3], [4]? 2) Vpr επάγει την απόπτωση μέσω πολλαπλών οδών που δεν εξαρτώνται από κυτταρικές αποκρίσεις ξενιστή [5], [6]? και 3) Vpr επιλεκτικά σκοτώνει ταχέως αναπτυσσόμενη κυττάρων σε ένα ρ53-ανεξάρτητο τρόπο [7], [8], υποδηλώνοντας Vpr-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο μπορεί να προσφέρει πιο επιλεκτικά δύναμη στη θανάτωση καρκινικών κυττάρων από τα φυσιολογικά κύτταρα και αυτή η κυτταροτοξική ιδιότητα θα πρέπει να είναι αποτελεσματική σε πολλές των καρκίνων, στους οποίους το γονίδιο p53 είναι μεταλλαγμένο. 4) Η ίδια η Vpr δεν είναι μεταδοτική? 5) Vpr είναι μια διαλυτή πρωτεΐνη που είναι επίσης φυσικά σε μεταγωγή. φυσική ικανότητα tranducing της πρωτεΐνης επιτρέπει να ληφθεί μέχρι και εκκρίνεται από τα κύτταρα, χωρίς τη βοήθεια οποιασδήποτε ειδικής όχημα μεταφοράς [9]? και 6) Vpr είναι ένα βιριόν που σχετίζεται με πρωτεΐνη. Αυτό επιτρέπει δυνατή παράδοση της πρωτεΐνης Vpr για τη στόχευση συγκεκριμένων όγκων όπως νευροβλάστωμα ή γλοίωμα χρησιμοποιώντας ειδικά σχεδιασμένους ιικών φορέων [Για ανασκοπήσεις, βλέπε [10]].

HIV-1 Vpr είναι ένα μικρό εξάρτημα ιική πρωτεΐνη με ένα μέσο μήκος 96 αμινοξέων και ένα υπολογισμένο μοριακό βάρος 12,7 kD. Vpr είναι μια μοναδική πρωτεΐνη που δείχνει καμία γνωστή ομολογία με οποιεσδήποτε άλλες τρέχουσες κυτταρικές πρωτεΐνες. Μια τριτοταγής δομή Vpr προτείνονται βάσει της ανάλυσης NMR αποτελείται από ένα τομέα α-έλικα-στροφή-α-έλικα στην αμινο-τερματικό ήμισυ μεταξύ των αμινοξέων 17 έως 46 και μια μακρά α-έλικα από τα αμινοξέα 53 έως 78 το καρβοξυλ-τερματικό ήμισυ [11]. Αυτές οι τρεις α-έλικες διπλωμένο γύρω από ένα υδρόφοβο πυρήνα σε μία δομή που επιτρέπει την αλληλεπίδραση μεταξύ Vpr και άλλες διαφορετικές κυτταρικές πρωτεΐνες [12]. Οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ Vpr και κυτταρικές πρωτεΐνες υπογραμμίζουν τις πολύπλευρες ρόλους στην παρεμβολή της με κυτταρικές λειτουργίες ξενιστή όπως περιγράφεται παραπάνω [Για σχόλια, δείτε [8], [13], [14]].

Ένα από τα πιο δύσκολα καρκίνοι για τη θεραπεία είναι το νευροβλάστωμα. Αυτή η θανατηφόρα σάρκωμα αποτελείται από κακοήθη κύτταρα που νευροβλάστες είτε εμφανίζεται στο αυτόνομο νευρικό σύστημα ή στα μυελό των επινεφριδίων. Νευροβλάστωμα θεωρείται ένα είδος νευροπεπιθηλιακά όγκου που προσβάλλει κυρίως βρέφη και παιδιά έως 10 ετών. Είναι ένα από τα πιο κοινά συμπαγείς όγκους της πρώιμης παιδικής ηλικίας. Ο όγκος προέρχεται συνήθως στα μυελό των επινεφριδίων, με την πιο κοινή τοποθεσία είναι η κοιλιά (κοντά επινεφριδίων), αλλά μπορεί επίσης να βρεθεί στο δέρμα, το στήθος, το λαιμό, τη λεκάνη, ή άλλους τομείς. Ενώ είναι κατανοητό ότι γενετικές μεταλλάξεις είτε κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του εμβρύου ή εκείνα που έχουν κληρονομήσει οδηγούν σε νευροβλάστωμα, η ακριβής αιτία αυτών των γενετικών μεταλλάξεων είναι ακόμη άγνωστες. Οι θεραπευτικές επιλογές που είναι διαθέσιμες περιλαμβάνουν κατά κύριο λόγο χειρουργική επέμβαση, χημειοθεραπεία, ακτινοθεραπεία, και μεταμόσχευση μυελού των οστών. Ωστόσο, παρά τις διάφορες επιλογές θεραπείας, η νοσηρότητα του καρκίνου εξακολουθεί να είναι πολύ υψηλό και είναι σήμερα κοντά στο 100%. Ο πρωταρχικός λόγος για μια τέτοια υψηλή νοσηρότητα είναι επειδή οι περισσότεροι ασθενείς έχουν εκτεταμένη νόσο κατά τη διάγνωση και αυτοί οι όγκοι αναπτύσσουν ταχεία αντίσταση στη χημειοθεραπεία και ακτινοθεραπεία.

Ένα κύριο προσέγγιση για τη θεραπεία του καρκίνου περιλαμβάνει συχνά τη χημειοθεραπεία. Χημειοθεραπεία δρα σκοτώνοντας ταχέως διαιρούμενο κυττάρων, η οποία είναι ένα κύριο ιδιότητα των καρκινικών κυττάρων. Δυστυχώς, νευροβλάστωμα αναπτύσσει αντίσταση γρήγορα σε χημειοθεραπευτικούς παράγοντες και καθιστά δύσκολη την επεξεργασία. Υπάρχουν αρκετοί πιθανοί λόγοι για την αντίσταση χημειοθεραπεία, αυτοί περιλαμβάνουν 1) κύτταρα που δεν θανατώνονται από τη χημειοθεραπεία μεταλλαχθεί και να γίνουν πιο ανθεκτικά, 2) πρωτεΐνες που φαρμάκων μεταφορά σε καρκινικά κύτταρα σταματούν να εργάζονται, 3) τα κύτταρα μπορεί να αρχίσει να αντλεί φάρμακα έξω από το κύτταρο ως γρήγορα καθώς μπορούν να εισέλθουν στο κύτταρο, 4) τα γονίδια που προκαλούν μια υπερπαραγωγή πρωτεϊνών που καθιστούν ένα φάρμακο αναποτελεσματικό μπορεί να ενισχύεται, και 5) τα καρκινικά κύτταρα μπορεί να αρχίσει να επισκευάσει τα διαλείμματα του DNA που προκαλούνται από τη θεραπεία. Λαμβάνοντας υπόψη την ταχεία αντοχή φαρμάκου νευροβλαστώματος και ένα περιορισμένο αριθμό φαρμάκων που διατίθενται σήμερα για τη θεραπεία του νευροβλαστώματος, υπάρχει μεγάλη ανάγκη για μια νέα θεραπεία που θα μπορούσε να συνεχίσει την εξάλειψη κακοήθων κυττάρων όταν αυτά τα κύτταρα αναπτύξει ανθεκτικότητα σε άλλα αντικαρκινικά φάρμακα. Μια πιθανή νέα λύση σε αυτό το δίλημμα είναι η πιθανή χρήση του HIV-1 Vpr με μοναδικά βιολογικά χαρακτηριστικά του περιγράφονται ανωτέρω.

Για να αποδειχθεί η πιθανή χρησιμότητα του Vpr ως αντικαρκινικού παράγοντα, έχουμε πραγματοποιήσει θωράκιση έναντι της of-concept προκαταρκτικών μελετών

in vitro

και

in vivo

. Τα αποτελέσματα των μελετών μας έδειξαν ότι Vpr επάγει κυτταρικό κύκλο G2 σύλληψη και απόπτωση σε μια μεγάλη ποικιλία τύπων καρκίνου. Έχουμε αποδείξει περαιτέρω ότι τα ίδια αποτελέσματα Vpr μπορεί επίσης να ανιχνευθεί σε καρκινικά κύτταρα που είναι ανθεκτικά σε αντικαρκινικά φάρμακα όπως DOX. Επιπλέον, έχουμε υιοθετήσει ένα πρότυπο σύστημα νευροβλαστώματος ποντικού που μας επιτρέπει να δείξουμε την επίδραση καταστολής της Vpr στην αύξηση του όγκου

in vivo

.

Αποτελέσματα

Vpr επάγει G2 του κυτταρικού κύκλου σύλληψης σε διάφορα καρκινικά κύτταρα

Vpr έχει παρατηρηθεί ότι επάγει τον κυτταρικό κύκλο G2 διακοπή σε μια ευρεία ποικιλία ευκαρυωτικών κυττάρων που κυμαίνονται από σχάση μαγιά για ανθρώπινα κύτταρα [15], [16]. Αυτές οι παρατηρήσεις υποδηλώνουν ότι είναι εντόνως διατηρημένες κυτταρικές δραστηριότητες σε ευκαρυωτικά κύτταρα που επηρεάζονται πράγματι από Vpr. Σε αυτή τη μελέτη, επιλέχθηκε ο αδενοϊικός σύστημα μόλυνση για να μετρηθεί η πιθανή επίδραση του HIV-1 επί της διέγερσης του κυτταρικού κύκλου G2 σε διάφορους τύπους καρκίνου (Πίνακας 1) όπως περιγράφεται προηγουμένως [17] – [19]. Τα αδενοϊικά συστήματα επιτρέπει σχεδόν 100% των κυττάρων να έχει μολυνθεί από μεταγωγή και την ανίχνευση των επιδράσεων Vpr είναι σε θέση να παρατηρηθεί ήδη από 5 ωρών [18]. Χρησιμοποιώντας αυτό το σύστημα, δοκιμάσαμε την πιθανή επίδραση της Vpr σε διάφορους τύπους καρκινικών κυτταρικών σειρών. Αυτοί οι τύποι του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας περιλαμβάνουν (HeLa), του μαστού (MCF-7), των ωοθηκών (Α2780), και Τ- ή λεμφώματα Β-κυττάρων (Jurkat και SU-DHL-4). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1 και τον Πίνακα 1, Vpr επάγεται κυτταρικού κύκλου G2 διακοπή σε όλους τους τύπους καρκινικών κυττάρων δοκιμάστηκε με την εξαίρεση ότι παρατηρήθηκε μόνο μερική μετατόπιση G2 στα κύτταρα MCF-7 (Σχήμα 1 – μέση). Η λειτουργική σημασία αυτής της μερικής επαγωγής G2 εικάζεται στη συζήτηση. Επιπλέον, αυτή η επαγωγή G2 φαίνεται να είναι ανεξάρτητη από την κατάσταση του γονιδίου ρ53, η οποία είναι σύμφωνη με μια σειρά από προηγούμενες εκθέσεις [7], [20]

Όλα καρκινικές κυτταρικές σειρές (βλέπε Πίνακα 1 για λεπτομέρειες?. Μόνο οι 3 κυτταρικές σειρές που παρουσιάζονται εδώ ως παραδείγματα) αναπτύχθηκαν όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι. Τα κύτταρα μετάγονται με Adv ή ADV-Vpr με ΜΟΙ 1,0. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν 48 ώρες μετά τη μόλυνση (

μετά την έγχυση.

), Τα κύτταρα στη συνέχεια παρασκευάζονται όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Cellular περιεχόμενο DNA αναλύθηκε με FACScan κυτταρομετρία ροής (Becton Dickinson) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [4], [19]. Τα προφίλ του κυτταρικού κύκλου διαμορφώθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό ModFit (Verity Software House, Inc.).

Η

Vpr επάγει τον κυτταρικό κύκλο G2 σύλληψη και κυτταρικό θάνατο ανεξαρτήτως του καθεστώτος ανθεκτικότητας στα φάρμακα στη δοξορουβικίνη

δοξορουβικίνη (αδριαμυκίνη, hydroxydaunorubicin, ϋΟΧ) είναι ένα αντικαρκινικό φάρμακο που έχει χρησιμοποιηθεί για τη θεραπεία ενός ευρέος φάσματος καρκίνων, συμπεριλαμβανομένου του μαστού, του στομάχου, του πνεύμονα, των ωοθηκών και του καρκίνου της ουροδόχου κύστης, καθώς και λευχαιμία, πολλοί τύποι καρκινώματος, και των μαλακών ιστών σαρκώματα. Ο ακριβής μοριακός μηχανισμός του DOX δεν έχει εδραιωθεί. Ωστόσο, είναι γνωστό ότι παρεμβάλλονται DNA και να διακόψει την αντιγραφή του DNA έτσι οδηγούν σε κυτταρικό θάνατο [21]. Ακόμα κι αν DOX συνεχίζει να είναι ένα ουσιαστικό συστατικό της αντικαρκινικών θεραπειών πρώτης γραμμής στη θεραπεία πολλών τύπων όγκων, της ανάπτυξης του φαρμάκου όγκου ανθεκτικά σε DOX και άλλα αντικαρκινικά θεραπευτικά σχήματα είναι ένα σημαντικό εμπόδιο για την επίτευξη επιτυχούς αντικαρκινικές αγωγές [22], [23]. Να διερευνήσει κατά πόσον Vpr μπορεί να εμποδίσει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων από G2 σύλληψη και να σκοτώσει αυτά τα αντι-καρκινικά κύτταρα του όγκου ανθεκτικών στα φάρμακα, εκφράσαμε το

vpr

γονίδιο

μέσω

Adv-Vpr μεταγωγή σε τρία ζεύγη των ναρκωτικών αφελή (WT) και DOX-ανθεκτική (ϋΟΧ-R) καρκινικά κύτταρα. Είναι ανθρώπινου νευροβλαστώματος (SK-N-SH), οστεοσάρκωμα (SAOS2), και αδενοκαρκινώματος του μαστού (MCF-7). Αυτές οι κυτταρικές γραμμές DOX ανθεκτικές δημιουργήθηκαν με συνεχή επώαση του γονικές κυτταρικές σειρές με βαθμιαίες αυξήσεις των συγκεντρώσεων DOX που κυμαίνονται από 10

-9 να 10

-6 Μ επί μία περίοδο 3 έως 6 μηνών. Λεπτομερής μέθοδος για τη δημιουργία αυτών των DOX-ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές έχουν περιγραφεί προηγουμένως [24]. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 1, η έκφραση του Vpr προκαλεί διακοπή της κυτταρικής ανάπτυξης σε όλα τα κύτταρα ελέγχθηκαν ανεξάρτητα από το ανθεκτικών στα φάρμακα κατάστασης για να DOX. Επιπλέον, η μέτρηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της βιωσιμότητας με τη δοκιμασία ΜΤΤ, που μεταβολίζει τετραζολίου (ΜΤΤ), έδειξε μικρή κυτταρικό πολλαπλασιασμό ή βιώσιμων κυττάρων αριστερά 5 ημέρες μετά Adv-Vpr μεταγωγή (Σχήμα 2)? Ομοίως, ο προσδιορισμός της ακεραιότητας της κυτταρικής μεμβράνης με trypan blue, το οποίο βάφει μόνο τα νεκρά κύτταρα, έδειξε ότι Vpr προσδίδει πολύ ισχυρή κυτταροτοξικότητα σε αυτά τα κύτταρα (Εικόνα 2).

Τρία ζεύγη φαρμάκου αφελή (WT) και DOX-ανθεκτικά (ϋΟΧ-R) καρκινικά κύτταρα ελέγχθηκαν για Vpr επαγόμενη G2 σύλληψη (Πίνακας 1) και σε κυτταρικό θάνατο. Αυτές οι κυτταρικές σειρές καρκίνου αναπτύχθηκαν όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι. Τα κύτταρα μετάγονται με Adv ή ADV-Vpr με ΜΟΙ 2,5. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε είτε με τη δοκιμασία εξαίρεσης κυανούν τρυπανίου, το οποίο προσδιορίζει τα νεκρά κύτταρα (επάνω εικόνα) ή με την δοκιμασία ΜΤΤ για να μετρηθεί η επιβίωση των κυττάρων (κάτω σχήμα). Τα κύτταρα εξετάστηκαν πέντε ημερών

μετά την έγχυση

Intials:. WT, άγριου τύπου? Dox-R, δοξορουβικίνη ανθεκτικά? 1, Mock? 2, Adv και 3, Adv-Vpr.

Η

Vpr προκαλεί δοσοεξαρτώμενη θάνατο των κυττάρων και την απόπτωση σε DOX-αφελή και ανθεκτικά νευροβλάστωμα κύτταρα

Για να κατανοήσουμε περαιτέρω Vpr που προκαλείται θανάτωση κυττάρων στα κύτταρα αφελείς και ανθεκτικά όγκου των ναρκωτικών και να προετοιμαστούν για μια

in vivo

μελέτη της επίδρασης του δυνητικού Vpr σχετικά με την ανάπτυξη του όγκου σε ένα μοντέλο ποντικού, αποφασίσαμε να εστιάσουμε την προσπάθεια μελέτης μας για το νευροβλάστωμα. Το νευροβλάστωμα επελέγη ως πρότυπο σύστημα επειδή νευροβλάστωμα είναι ένας από τους πιο κοινούς συμπαγείς όγκους της πρώιμης παιδικής ηλικίας που βρίσκονται συνήθως σε βρέφη ή μικρά παιδιά. Ένας άλλος λόγος για την επιλογή του μοντέλου νευροβλάστωμα είναι ότι το ανθρώπινο νευροβλάστωμα ξενομοσχεύματος σύστημα μοντέλου ποντικού είναι καλά εδραιωμένη [25], [26].

Πριν από τη διεξαγωγή

in vivo

μελέτες του ποντικιού, θα καθοριστεί πρώτα η δυναμικό δοσοεξαρτώμενη αποκρίσεις του Vpr που προκαλείται θανάτωσης κυττάρων τόσο σε άγριου τύπου (WT) και φάρμακο ανθεκτικά κύτταρα νευροβλαστώματος (ϋΟΧ-R) SK-N-SH. Το μπλε της τρυπάνης και οι ποσοτικοί προσδιορισμοί ΜΤΤ χρησιμοποιήθηκαν για να μετρηθεί ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός και η βιωσιμότητα 5 ημέρες μετά τον έλεγχο Adv και μεταγωγές Adv-Vpr. Περίληψη των αποτελεσμάτων αυτών φαίνονται στο Σχήμα 3Α-a. Ενώ η αύξηση της πολλαπλότητας της μολυσματικότητας (ΜΟΙ) ελέγχου Adv δεν προκάλεσε σημαντική κυτταρικό θάνατο, μια σαφής δοσοεξαρτώμενη θανάτωσης κυττάρων δείχθηκε σε αμφότερα τα κύτταρα WT και DOX-R όπως υποδεικνύεται από το μπλε τρυπάνης δοκιμασίας. Στο χαμηλό τέλος, ΜΟΙ 1.0 προκάλεσε περίπου 40-80% κυτταρικό θάνατο? ενώ όλα τα κύτταρα (100%) θανατώθηκαν με ΜΟΙ 10,0. Η δοκιμασία ΜΤΤ έδειξε την αντίστοιχη δοσοεξαρτώμενη μείωση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της επιβίωσης των κυττάρων, και η κηλίδα Western αναλύσεις επιβεβαίωσαν ότι Vpr παρήχθη σε αυτές τις Adv-Vpr-μολυσμένα κύτταρα (Σχήμα 3Α-Β). Για περαιτέρω κατανόηση της δυναμικής της επίδρασης Vpr σχετικά με τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και η βιωσιμότητα μετρήθηκε συναρτήσει του χρόνου (έως 5 ημέρες) με ΜΟΙ 2,5. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Β, ψευδο ή Adv μολυσμένα κύτταρα έδειξαν κανονική του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και έφθασε ένα πλατό μετά από 3 ημέρες με ελάχιστη ή καθόλου πολλαπλασιασμό των κυττάρων ανιχνεύθηκε σε κύτταρα μολυσμένα Adv-Vpr. Η μειωμένη μεταβολική δραστηριότητα την πάροδο του χρόνου πρότεινε να αυξηθεί κυτταρικό θάνατο την πάροδο του χρόνου. Για να αξιολογηθεί περαιτέρω η λειτουργία του Vpr που προκαλείται θανάτωσης κυττάρων σε κύτταρα νευροβλαστώματος (έστω Vpr θανατώνει αυτά τα κύτταρα από την απόπτωση ή άλλο μηχανισμό) δυναμικό της κασπάσης-3 αποτέλεσμα διάσπασης μετρήθηκε ως ένδειξη της απόπτωσης. Για να γίνει διάκριση Vpr-κυτταρικό θάνατο που επάγεται από την επίδρασή της επί του κυτταρικού κύκλου, ένα Vpr μεταλλαγμένο (F34I) που προκαλεί επαγωγή G2 αλλά δεν επάγει τον κυτταρικό θάνατο, επίσης περιλαμβάνονται στην παρούσα μελέτη ως μάρτυρας [18], [27], [28] . Μετά την αδενοϊική μόλυνση, το καθεστώς της κασπάσης-3 παρακολουθήθηκε ξεκινώντας από 6 έως 36 ώρες με ανάλυση κηλίδας Western χρησιμοποιώντας αντισώματα έναντι συνολικού κασπάσης-3 (Σχήμα 3C, κορυφή λωρίδα) ή ειδικά διασπασμένη κασπάση-3 (Σχήμα 3C – μεσαία λωρίδα). Αριθ διάσπαση της κασπάσης-3 ανιχνεύθηκε στα Adv-F34I Vpr-μολυσμένα κύτταρα (που υποδεικνύεται με «m») καθ ‘όλη τη διάρκεια της δοκιμής? η διάσπαση της κασπάσης-3 φαίνεται καθαρά από 24-36 ώρες σε κύτταρα που είχαν μολυνθεί με τον άγριο τύπο (υποδεικνύεται με «w») Vpr.

A. Vpr προκαλεί δοσοεξαρτώμενη κυτταρικό θάνατο σε ναρκωτικά αφελείς και ανθεκτικά κύτταρα SK-N-SH. ένα. Επίπεδο Vpr-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο εξετάστηκε από μόλυνση DOX-αφελή και ανθεκτικά κύτταρα SK-N-SH χρησιμοποιώντας αυξανόμενη ΜΟΙ Adv ή ιούς Adv-Vpr. Ο θάνατος των κυττάρων μετρήθηκε με προσδιορισμό της ακεραιότητας και τον πολλαπλασιασμό της κυτταρικής μεμβράνης με τη χρήση Trypan blue προέντασης (αριστερά) ή η κυτταρική βιωσιμότητα με την δοκιμασία ΜΤΤ (δεξιά). Πολλαπλασιασμό των κυττάρων και η βιωσιμότητα εξετάστηκαν πέντε ημερών

μετά την έγχυση

. σι. Vpr παραγωγή πρωτεΐνης επιβεβαιώθηκε με ανάλυση στυπώματος Western. Σημειώστε ότι είναι πολύ δύσκολο να ανιχνευθεί Vpr πρωτεΐνη σε χαμηλό ΜΟΙ. Η επιτυχής μόλυνση Adv-Vpr επαληθεύτηκε με διευρυμένη πυρήνες των κυττάρων, όπως έχει ήδη αναφερθεί [43]. Β Vpr επάγει κυτταρικό θάνατο πάροδο του χρόνου σε ναρκωτικά αφελείς και ανθεκτικά κύτταρα SK-N-SH. Και τα δύο φάρμακα αφελείς και ανθεκτικά κύτταρα SK-N-SH αντιμετωπίζονται με τον ίδιο τρόπο όπως και A. Μόνο MOI2.5 χρησιμοποιήθηκε εδώ. Γ Vpr επάγει την απόπτωση σε φάρμακα αφελείς και ανθεκτικά κύτταρα SK-N-SH. Κασπάση-3 διάσπαση παρακολουθήθηκε μέχρι και 36 ώρες. Αρχικά: Csp3, κασπάσης-3? CL-Csp3, διασπασμένη κασπάση-3? m, Adv-VprF34I? w, Adv-Vpr.

Η

Μαζί, τα αποτελέσματα αυτών των

in vitro

μελέτες υποστηρίζουν την ιδέα ότι Vpr μπλοκ νευροβλάστωμα πολλαπλασιασμό των κυττάρων από τον κυτταρικό κύκλο G2 σύλληψης και θανάτωσης κυττάρων

μέσω

απόπτωση. Το πιο σημαντικό, Vpr παρέχει αυτές τις κυτταροτοξικές επιδράσεις στα κύτταρα νευροβλάστωμα σε συγκρίσιμο επίπεδο ανεξάρτητα από το καθεστώς ανθεκτικότητας στα φάρμακα τους.

In vivo

επίδραση της Vpr στην αύξηση του όγκου νευροβλάστωμα σε ένα σύστημα μοντέλο ποντικού

στη συνέχεια εξετάσαμε την επίδραση Vpr στην ανάπτυξη του όγκου των κυττάρων νευροβλαστώματος στο C57-SCID σύστημα μοντέλου ποντικού [29], [30]. Δύο διαφορετικές προσεγγίσεις χρησιμοποιήθηκαν για την εισαγωγή Vpr σε όγκους, δηλαδή, προ ιική μεταγωγή πριν από τον ενοφθαλμισμό των κυττάρων σε ποντίκια ή μετα-ενδοογκική ένεση. Για προ-μεταγωγή, άγριου τύπου και DOX-ανθεκτικά SK-N-SH εγχύθηκαν με Adv, Adv-VprF34I και Adv-Vpr

s.c.

Στο αριστερό πλευρό του C57-SCID του. Το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε κάθε 7 ημέρες. Τελική μέτρηση του μεγέθους του όγκου ήταν κατά 26 ημέρες μετά την μεταγωγή και τα ποντίκια στη συνέχεια θυσιάστηκαν για περαιτέρω ανάλυση. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Α, ένα μέσο μέγεθος όγκου περίπου. 2 οπι φαίνεται καθαρά στα ποντίκια που εμβολιάστηκαν με WT ή ϋΟΧ ανθεκτικά SK-N-SH κύτταρα 26 ημέρες μετά την μεταγωγή. Παρόμοια μεγέθη του όγκου παρατηρήθηκαν επίσης σε ποντίκια μολυσμένα Ad-F34Ivpr. Αντίθετα, πολύ μικρά οζίδια στο σημείο της ένεσης παρατηρήθηκαν στις Ad-Vpr-μετάγονται ποντίκια, υποδηλώνοντας έκφραση του Vpr σε αυτά τα κύτταρα παρεμπόδισε την ανάπτυξη τους σε C57-SCID ποντίκια. Για την ελαχιστοποίηση των πιθανών διακύμανση των μεμονωμένων ποντικών, τα μεμονωμένα ποντίκια ενέθηκαν με τις τρεις μεταγωγή ιών

s.c.

Στην κοιλιακή περιοχή, όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Β. Παρόμοιο με αυτό που έχουμε παρατηρήσει σε ποντίκια που εμβολιάσθηκαν με μόνο θεραπεία, περίπου ίσο μέγεθος των όγκων παρατηρήθηκαν στις θέσεις των Adv ή ADV-F34Ivpr ενέσεων, ενώ μικρή ή καθόλου οζίδια παρατηρήθηκαν στις θέσεις των ενέσεων Adv-Vpr.

η καταστολή της ανάπτυξης του όγκου νευροβλαστώματος από Vpr αποδεικνύεται εδώ είτε με προ-μεταγωγή Adv-Vpr (ΑΒ) ή μετα-ενδοογκική ένεση (C). Για προ-μεταγωγή, άγριου τύπου (WT) ή DOX ανθεκτικά SK-N-SH κύτταρα αναπτύχθηκαν σε DMEM συμπληρωμένο με 10% FBS στους 37 ° C με 95% αέρα /5% CO

2 ατμόσφαιρα. Φρέσκα κύτταρα αναπτύχθηκαν πρώτα σε μία πλάκα 12 φρεατίων για 36 ώρες και αδενοϊική μεταγωγή εκτελέσθηκε 5 ώρες πριν από τον ενοφθαλμισμό των κυττάρων με ΜΟΙ 2,5, το οποίο προσδιορίστηκε εμπειρικά. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με Trpsin- EDTA, επαναιωρήθηκαν σε DMEM και πλένονται με PBS 3 φορές. Τελική κύτταρα εναιωρήθηκαν σε ϋΜΕΜ για εμβολιασμό. Περίπου 2 × 10

6 κύτταρα του όγκου των 100 μΙ εγχύθηκαν

s.c.

Στο αριστερό πλευρό του C57-SCID του. 3-4 ποντίκια ενέθηκαν για κάθε επεξεργασία. Αυτές οι ομάδες θεραπείας περιλαμβάνουν μια ιογενή ελέγχου Adv, Adv-Vpr και Adv-F34IVpr. Το μεταλλαγμένο F34IVpr χρησιμοποιήθηκε εδώ ως μάρτυρας αφού ένα μόνο αλλαγή αμινοξέος του αμινοξέος 34 από Φαινυλαλανίνη (F) σε ισολευκίνη (Ι) καθιστά Vpr μπορεί να προκαλέσει απόπτωση (Σχήμα 3C), αλλά επιτρέπει την κυτταρικού κύκλου για να εισάγετε ένα παρατεταμένο G2 φάσης [18], [27], [28]. Το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε κάθε 7 ημέρες με μέτρηση δύο κατακορύφων διαμέτρων όγκου χρησιμοποιώντας παχύμετρο. Τελική μέτρηση του όγκου ήταν κατά 26 ημέρες μετά την μεταγωγή και τα ποντίκια στη συνέχεια θυσιάστηκαν για περαιτέρω ανάλυση. Για ενδοτραυματική έγχυση του Vpr, το WT και ϋΟΧ-R κύτταρα νευροβλαστώματος SK-N-SH παρασκευάστηκαν ουσιαστικά με τον ίδιο τρόπο όπως περιγράφηκε παραπάνω. 200 μΙ του Adv, Adv-Vpr ή ADV-F34Ivpr ήταν στη συνέχεια με ένεση διακριτικά 3-φορές σε όγκους 2 εβδομάδες μετά τον ενοφθαλμισμό των κυττάρων με ένα ιικό συγκέντρωση 1.012 /ml. Το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε κάθε 7 ημέρες. Τελική μέτρηση του μεγέθους του όγκου ήταν στις 39 ημέρες μετά την ένεση και οι ποντικοί στη συνέχεια θυσιάστηκαν για περαιτέρω ανάλυση. Τρία ανεξάρτητα πειράματα πραγματοποιήθηκαν και τα αποτελέσματα αυτών των πειραμάτων με μέσο μέγεθος του όγκου με τυπική απόκλιση (SD) παρουσιάζονται στον Πίνακα 2.

Η

Ένα από τα πιθανά επιχειρήματα σχετικά με τα αποτελέσματα που προκύπτουν από την προ-μεταγωγής είναι ότι η έκφραση του Vpr

in situ

μπορούσε ταχέως να σκοτώσει τα κύτταρα SK-N-SH αποτρέποντας έτσι το σχηματισμό όγκου και έτσι τη δοκιμή της επίδρασης Vpr στην πραγματική ανάπτυξη του όγκου. Για να παρακαμφθεί αυτό το πρόβλημα, χρησιμοποιήθηκε μία εναλλακτική μέθοδος μετα-εντός του όγκου ένεση. Τα κύτταρα νευροβλαστώματος SK-N-SH WT και DOX-R παρασκευάσθηκαν και εμβολιάσθηκαν ουσιαστικά με τον ίδιο τρόπο όπως περιγράφεται παραπάνω. Το Adv, Adv-Vpr ή ADV-F34Ivpr κατόπιν εγχύθηκε διακριτικά 3-φορές σε όγκους 2 εβδομάδες μετά τον ενοφθαλμισμό των κυττάρων. Το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε κάθε 7 ημέρες. Τελική μέτρηση του μεγέθους του όγκου ήταν στις 39 ημέρες μετά την ένεση και οι ποντικοί στη συνέχεια θυσιάστηκαν για περαιτέρω ανάλυση. Στατιστικά δοκιμές διεξήχθησαν για να αξιολογηθεί το δυναμικό των διαφορών στο μέγεθος του όγκου κάθε εβδομάδα ή κατά τη διάρκεια ολόκληρης της πειραματικής περιόδου. Τα τελικά αποτελέσματα παρουσιάζονται στον Πίνακα 2. Ακόμη και αν Vpr μειωμένη 44,1 ± 11,8% της ανάπτυξης του όγκου στην άγριου τύπου όγκων SK-N-SH από την 1η εβδομάδα μετά την ένεση εντός του όγκου, που υποδεικνύεται στατιστικές αναλύσεις ένας

t

– αξία 2,35 (p = 0.10), δηλαδή, χωρίς καμία στατιστική διαφορά? Παρομοίως, καμία διαφορά ανάπτυξη του όγκου παρατηρήθηκε σε όγκους Dox-R σε εβδομάδες 1. Ωστόσο, στατιστική παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές τόσο σε όγκους άγριου τύπου και Dox-R από την εβδομάδα 2 και εβδομάδα 3. Ειδικότερα, στα κύτταρα νευροβλαστώματος WT , Vpr μειωμένη 64,2 ± 6,7% ή 76,4 ± 5,9% της ανάπτυξης του όγκου μέχρι την εβδομάδα 2 ή 3 μετά ενδοογκική ένεση, αντίστοιχα? Ομοίως, ένα συγκρίσιμο ποσοστό μείωσης (67.1 ± 4.5% ή 75.6 ± 1.8%) ανιχνεύθηκε επίσης στα κύτταρα DOX-R κατά την ίδια χρονική περίοδο. Σύγκριση της ανάπτυξης του όγκου κατά τη διάρκεια ολόκληρης της πειραματικής περιόδου με βάση το μέσο σταθμισμένο ποσά [31] πρότεινε συνολικές διαφορές στην ανάπτυξη του όγκου μεταξύ των ποντικιών που έλαβαν σχήματα ελέγχου διαφημίσεων και Ad-Vpr ένεση ποντίκια (p & lt? 0,05). Αντίθετα, υπάρχουν διαφορές στατιστική βρέθηκαν μεταξύ του ελέγχου διαφημίσεων και ομάδες Ad-F34IVpr. Ως εκ τούτου, είναι σαφές ότι η έκφραση της Vpr σε όγκους έχει μειώσει σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου και την έκφραση του Vpr πράγματι καταστέλλει την ανάπτυξη του όγκου των ανθρώπινων κυττάρων νευροβλαστώματος ανεξάρτητα από την κατάσταση του ανθεκτικά στα φάρμακα.

Η

Συζήτηση

στην παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι μια ιική πρωτεΐνη Vpr πολλαπλασιασμό μπλοκ κυττάρου HIV-1 συλλαμβάνοντας εκείνων των κυττάρων στη φάση G2 του κυτταρικού κύκλου σε τύπους διάφορες καρκινικές κυτταρικές δοκιμάστηκαν (Πίνακας 1? Εικόνα 1). Επιπλέον, Vpr επάγει κυτταρικό θάνατο σε τρεις από αυτές τις καρκινικές κυτταρικές γραμμές ανεξάρτητα από το αν είναι ανθεκτικά ή ευαίσθητα σε DOX (Σχήμα 2). Περαιτέρω αναλύσεις της επίδρασης Vpr σε κύτταρα νευροβλαστώματος έδειξαν ότι Vpr επάγει κυτταρικό θάνατο με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 3Α-Β)

μέσω

απόπτωσης όπως υποδεικνύεται από κασπάση-3 διάσπαση (Σχήμα 3C). Με τη χρήση ενός μοντέλου νευροβλαστώματος ποντικού, έχουμε δείξει περαιτέρω ότι η παράδοση του Vpr

μέσω αδενοϊικού παράδοσης

σε όγκους νευροβλαστώματος, είτε με προ-μόλυνση (Σχήμα 4Α-Β) και εντός του όγκου έγχυση (Σχήμα 4C), αξιοσημείωτα ανέστειλε όγκου ανάπτυξη. Έτσι, οι περιγράφεται αποτελέσματα δείχνουν από την απόδειξη της ιδέας ότι Vpr μπορεί να είναι ένας καλός υποψήφιος για περαιτέρω έρευνα σχετικά με το ρόλο της στην καταστολή των όγκων ειδικά σε εκείνους που είναι ανθεκτικά σε αντικαρκινικά φάρμακα.

Ακόμα κι αν Vpr επάγει G2 του κυτταρικού κύκλου σύλληψη σε όλα τα είδη καρκινικών κυττάρων που εξετάστηκαν, παρατηρήθηκε ότι το επίπεδο της G2 συνελήφθησαν κυττάρων στην κυτταρική σειρά καρκίνου του μαστού MCF-7 ήταν πολύ μειωμένη (Σχήμα 1 – μέση). Δεν είναι σαφές προς το παρόν γιατί αυτή η κυτταρική σειρά είναι μερικώς ανθεκτικό σε Vpr επαγόμενη σύλληψη G2. Ωστόσο, φαίνεται να είναι μια ενδιαφέρουσα συσχέτιση μεταξύ Vpr επαγόμενη G2 σύλληψης και την ενζυματική κατάσταση της πρωτεϊνικής φωσφατάσης 2Α (ΡΡ2Α) εκεί. Όπως έχουμε αναφέρει προηγουμένως, ένα από τα μοναδικά χαρακτηριστικά του Vpr που προκαλείται σύλληψη G2 είναι ότι απαιτεί τη λειτουργία του ΡΡ2Α [2], [4], [16], [32]. Αναζήτηση της βιβλιογραφίας έδειξε ότι η Α ρυθμιστική υπομονάδα της ΡΡ2Α είτε μειώνεται σημαντικά ή να χαθούν στην κυτταρική σειρά MCF-7 [33], [34]. Η μείωση του G2 σύλληψης σε κύτταρα MCF-7 υποστήριξαν την ιδέα ότι Vpr αναστέλλει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό με πρόκληση G2 σύλληψης μέσω μιας ΡΡ2Α μεσολάβηση μηχανισμός [4], [32]. Επιπλέον, αυτή η παρατήρηση υποδηλώνει ότι Vpr μπορεί να μην είναι σε θέση να εμποδίσει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων από G2 διακοπή σε όλα τα κύτταρα του όγκου, ιδιαίτερα εκείνων των όγκων κύτταρα που περιέχουν μεταλλάξεις που σχετίζονται με ΡΡ2Α. Περαιτέρω έρευνα της έννοιας αυτής είναι σίγουρα δικαιολογημένη ιδίως στο πλαίσιο της χρήσης Vpr ως αντικαρκινικού παράγοντα.

Vpr επάγει κυτταρικό θάνατο και απόπτωση μέσω πολλαπλών μηχανισμών [Για ανασκοπήσεις, βλέπε [5], [6]] . Από Vpr είναι σε θέση να προκαλεί κυτταρικό θάνατο και την απόπτωση στα δύο DOX-αφελή και ανθεκτικά κύτταρα νευροβλαστώματος, ένα ή μερικά από αυτά που προτείνονται οδοί Vpr μπορεί να έχει προκαλέσει την παρατηρούμενη κυτταροτοξικότητα. μελλοντική προσπάθεια μας θα επικεντρωθεί σε δοκιμή την οποία ο μηχανισμός της Vpr-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο θα μπορούσε να ξεπεράσει αποπτωτικών αντίσταση, ένα τυπικό χαρακτηριστικό πολλών καρκινικών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων νευροβλάστωμα. Με βάση τα δεδομένα που δείχνονται στο Σχήμα 3C, είναι σαφές ότι η Vpr είναι σε θέση να προκαλέσει απόπτωση όπως υποδεικνύεται από τη διάσπαση της κασπάσης-3. Αυτή η παρατήρηση είναι συνεπής με τον χαρακτηρισμό μας της Vpr απόπτωση στα ίδια κύτταρα νευροβλαστώματος φαίνεται από την χρησιμοποίηση της δοκιμασίας του παραρτήματος V [35]. Εκεί, έχουμε αποδείξει ότι περαιτέρω Vpr απόπτωση στα κύτταρα νευροβλαστώματος SK-N-SH μέσω ενός μιτοχόνδρια-εξαρτώμενη και κασπάσης-9-διαμεσολαβούμενη μηχανισμός [35].

Χρησιμοποιήσαμε προ-μόλυνση και ενδο- ογκική ενέσεις σε μοντέλο ποντικού μας για την εισαγωγή του Vpr σε όγκους νευροβλαστώματος. Αυτές οι δύο μέθοδοι χρησιμοποιήθηκαν επειδή η έκφραση της Vpr

in situ

θα μπορούσε γρήγορα να σκοτώσει τα κύτταρα και έτσι να αποτρέψουν τις δοκιμές σε πραγματικές ανάπτυξη του όγκου. Τα αποτελέσματά μας απέδειξαν τις δύο μεθόδους μείωσε σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου μετά την εισαγωγή του Vpr. Συγκριτικά, DOX-ανθεκτικά κύτταρα έδειξαν επίσης παρόμοιο επίπεδο όγκου μείωσης του μεγέθους που υποστηρίζουν την υπόθεση ότι η έκφραση Vpr καταστέλλει την ανάπτυξη όγκων, ανεξάρτητα από τα ναρκωτικά κατάστασης ανθεκτικά.

Αξίζει να σημειωθεί ότι, στις περιγράφονται πειράματα, δεν το κάναμε ελεγχθεί η πιθανή επίδραση Vpr σε μεταστατικά κύτταρα νευροβλάστωμα. Κάναμε, όμως, διενεργείται προκαταρκτική φαρμακολογικές μελέτες για να δοκιμάσουν πιθανές δυσμενείς επιπτώσεις των C57-SCID ποντίκια όταν εκτέθηκαν σε Vpr μέσα από συστηματική ένεση για όλο το σώμα. Σε αυτά τα πειράματα, η κλιμακούμενη αύξηση των ιικών σωματιδίων Adv-Vpr που κυμαίνονται από 1 × 10

13-6 × 10

13 ιικών σωματιδίων ενέθηκαν σε C57-SCID ποντίκια μέσα στις φλέβες της ουράς. Δεν προφανείς ανεπιθύμητες ενέργειες παρατηρήθηκαν σε εκείνα τα ποντίκια κατά τη διάρκεια ολόκληρης της πειραματικής περιόδου. Παθολογική εξέταση των διαφόρων οργάνων 3 εβδομάδες μετά την ιική ένεση δεν έδειξε σαφή κυτταροτοξικά αποτελέσματα που επιβάλλονται από Vpr (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ως εκ τούτου, η συστηματική εισαγωγή Vpr θα μπορούσε επίσης να είναι μια επιλογή για τις μελλοντικές δοκιμές.

Η έννοια της χρήσης HIV-1 Vpr ως πιθανός αντικαρκινικός παράγοντας δεν είναι νέα. Στην πραγματικότητα, εκτός πρώιμες μελέτες συμπεριλαμβανομένων δική μας έχουν δείξει τη δυνατότητα αυτή [36] και μια σειρά από μελέτες έχουν δείξει ότι η παράδοση του Vpr για διαφόρων όγκων όπως μελάνωμα [37] – [39], ηπάτωμα [40], [41] και του στόματος καρκίνο [42] καταστέλλουν την ανάπτυξη του όγκου

in vivo

. Αυτό που είναι νέο, ωστόσο, είναι ότι έχουμε καταδείξει για πρώτη φορά ότι Vpr είναι ικανό να καταστέλλει την ανάπτυξη του όγκου ανεξάρτητα από το αν είναι ευαίσθητο ή ανθεκτικό σε ένα αντικαρκινικό φάρμακο μέσω της επαγωγής του κυτταρικού κύκλου G2 σύλληψη και απόπτωση. Αυτό το εύρημα θα μπορούσε δυνητικά να είναι σημαντική λόγω καταστροφής των ανθεκτικών στα φάρμακα καρκινικών κυττάρων είναι μια δυναμική και ισχυρό νέο και εναλλακτικό μέσο αντικαρκινικό κάνει. Αυτό το είδος της αντικαρκινικού παράγοντα μπορεί να γίνει ιδιαίτερα χρήσιμη ως συμπληρωματικό ιικό θεραπευτικός παράγοντας για επιλεκτική αναστολή της ανάπτυξης του όγκου, ιδίως όταν άλλες θεραπείες αποτυγχάνουν.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρικές γραμμές και καλλιέργεια

Διάφορες ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές που αντιπροσωπεύουν διαφορετικούς τύπους καρκίνων με ή χωρίς αντίσταση φαρμάκου στην δοξορουβικίνη αντικαρκινικό φάρμακο (DOX) χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη και συνοψίζονται στον πίνακα 1. Εκτός και αν ειδικά ορίζεται, αυτές οι κυτταρικές γραμμές αναπτύχθηκαν σε Τροποποιημένο κατά Dulbecco Αετού Medium (ϋΜΕΜ) (Cellgro) ή RPMI 1640 (Sigma) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS, Invitrogen). Η επώαση έγινε στους 37 ° C σε ένα 5% CO

2 θερμοκοιτίδα.

αδενοϊική μόλυνση

αδενοϊικός φορέας (Adv) και αδενοϊικού φορέα εισάγεται με τον

vpr

γονίδιο (Adv-Vpr) παρασχέθηκαν ευγενώς από τον Dr LJ Zhao [17]. Περίπου 1 χ 10

6 των κυττάρων δοκιμής μολύνθηκαν με Adv ή ADV-Vpr ιούς. Σαράντα οκτώ ώρες

μετά την έγχυση.

, Τα κύτταρα συλλέχθηκαν για ανάλυση κύκλου κυττάρου ή ανάλυση στυπώματος Western. Μολύνσεις πραγματοποιήθηκαν σε πολλαπλότητα μόλυνσης (ΜΟΙ) 1,0 για αναλύσεις κυτταρικού κύκλου, όπως φαίνεται στον Πίνακα 1 και το Σχ. 1. ΜΟΙ 2.5 χρησιμοποιήθηκε για την αρχική κυτταρικό θάνατο αναλύσεις όπως φαίνεται στο Σχ. 2.Υπό αυτό το αδενοϊικό κατάσταση μεταγωγής, μεγαλύτερη από 90% αποδοτικότητα μόλυνση επιτεύχθηκε με αυτά τα ιικά αποθέματα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

κυτταρικού κύκλου ανάλυση

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν 48 ώρες

pi

, κατόπιν πλύθηκαν δύο φορές με 2 ml 5 mM EDTA /PBS και φυγοκεντρήθηκαν στις 1500 rpm.