Αφηρημένο

Η μετάσταση είναι η κύρια αιτία θνησιμότητας σε ασθενείς με συμπαγείς όγκους. Ο εντοπισμός των ακριβών μόρια που συνδέονται με CRC μετάσταση μπορεί να είναι ζωτικής σημασίας να κατανοήσουμε τη διαδικασία, η οποία μπορεί επίσης να μεταφραστεί στη διάγνωση και τη θεραπεία της CRC. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνούμε τη σύνδεση των προτύπων έκφρασης microRNA με λεμφαδένα μετάσταση καρκίνου του παχέος εντέρου. Μεταξύ αυτών των υποψήφιων miRNAs, η έκφραση του miRNA-145 ήταν σημαντικά σχετίζεται με μετάσταση λεμφαδένα του CRC. Τόσο

in vitro

και

in vivo

μελέτη έδειξε ότι πάνω ρύθμιση του miR-145 θα μπορούσε να βελτιώσει την ικανότητα της μετανάστευσης και εισβολής του καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρων, ενώ δεν παρατηρήθηκε καμία επίδραση επί του πολλαπλασιασμού. Ο μηχανισμός αυτής της προσφοράς σχετίζεται με τη σταθεροποίηση της Hsp-27, μία πρωτεΐνη η οποία παίζει σημαντικό ρόλο στην προώθηση της μετάστασης. Τα αποτελέσματα αυτά μπορεί να είναι ζωτικής σημασίας για την κατανόηση CRC μετάσταση και μπορεί να μεταφραστεί με τη διάγνωση και τη θεραπεία της CRC

Παράθεση:. Yuan W, Sui C, Liu Q, W Tang, ένα Η, Ma J (2014) Up -Κανονισμός του microRNA-145 Associates με Λεμφικού μετάσταση στους λεμφαδένες στον καρκίνο του παχέος εντέρου. PLoS ONE 9 (7): e102017. doi: 10.1371 /journal.pone.0102017

Επιμέλεια: Rolf Müller, Πανεπιστήμιο Philipps, Γερμανία

Ελήφθη: 10 Απρίλη του 2013? Αποδεκτές: 14 Ιούν του 2014? Δημοσιεύθηκε: 14 του Ιουλίου, 2014

Copyright: © 2014 Yuan et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Πρόγραμμα βασικής Έρευνας της Κίνας (Grant όχι. 2011CB911004), η εκπαίδευση του έργου του Πεκίνου για τις κορυφαίες Ταλέντα (Z131107000513001), Πεκίνο Nova Πρόγραμμα (Z131107000413066) και το Πεκίνο Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Grant αρ. 7122150). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) κατατάσσει την τρίτη πιο κοινή όγκου και η τέταρτη κύρια αιτία θνησιμότητας από καρκίνο σε όλο τον κόσμο [1]. Παρά το γεγονός ότι πολλά επιτεύγματα στην αντιμετώπιση της CRC τις τελευταίες δεκαετίες, το συνολικό ποσοστό επιβίωσης των ασθενών με CRC έχει οριακά αλλάξει. Κακή πρόγνωση και ποσοστό επιβίωσης οφείλονται κυρίως στη μετάσταση, έτσι περισσότερο από το ένα τρίτο των ασθενών με CRC θα αναπτύξουν τελικά μεταστατικών παθήσεων [2]. Ως εκ τούτου, προσδιορίζοντας τις ακριβείς μόρια που συνδέονται με CRC μετάσταση μπορεί να είναι ζωτικής σημασίας να κατανοήσουμε τη διαδικασία, η οποία μπορεί επίσης να μεταφραστεί στη διάγνωση και τη θεραπεία της CRC.

Τα microRNAs (miRNAs) είναι 21- έως 25-νουκλεοτίδιο μονής λανθάνον, μη-κωδικοποίησης των μορίων RNA που ασκούν τις λειτουργίες τους με σύνδεση προς τους 3′-αμετάφραστες περιοχές αντίστοιχους στόχους mRNA τους [3]. Έχει υπολογιστεί ότι το ένα τρίτο του συνόλου των ανθρώπινων γονιδίων μπορεί να ρυθμιστεί με miRNAs, υποδεικνύοντας ότι miRNAs έχουν καθοριστικό ρόλο σε φυσιολογικές και παθολογικές διεργασίες [4] – [5]. Ένας μεγάλος αριθμός ευρήματα δείχνουν ότι οι miRNAs εμπλέκονται σε ανθρώπινους καρκίνους. Η ακατάλληλη έκφραση των miRNAs μπορεί να οδηγήσει στην ανώμαλη έκφραση των γονιδιακών προϊόντων τα οποία μπορούν να συμβάλουν στην απόκτηση από τα χαρακτηριστικά του καρκίνου. Οι παρατηρήσεις αυτές πρότειναν τη λειτουργία των miRNAs ως καταστολείς των όγκων ή ογκογονίδια [6] – [8].

Πρόσφατα, πειστικά στοιχεία έδειξαν ότι μια σειρά από miRNAs διαδραματίζουν καίριο ρόλο στην CRC μετάσταση. Για παράδειγμα, Asangani et al. προσδιορίζονται mir-21 ως υποστηρικτής μετάσταση στο CRC [9]. Liu et al ανέφεραν ότι miR-499-5p ενισχυμένη κυτταρική εισβολή και μετάσταση όγκου σε CRC με στόχευση FOXO4 και PDCD4 [10]. Okamoto Κ, έδειξε ότι πάνω ρύθμιση του miR-493 κατά τη διάρκεια καρκινογένεσης θα μπορούσε να αποτρέψει μετάσταση στο ήπαρ σε CRC [11]. Ωστόσο, μετάσταση προέκυψε από ένα σύνθετο καταρράκτη των βιολογικών διεργασιών και οι ακριβείς μοριακοί μηχανισμοί που διέπουν CRC μετάσταση είναι μακριά από το να είναι πλήρως κατανοητή.

Σε αυτή τη μελέτη, τα προφίλ έκφρασης των miRNAs στην κύρια βλάβη CRC με ή χωρίς λεμφαδένες μετάσταση στους λεμφαδένες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μια μικροσυστοιχία miRNA και ποσοτική αλυσίδα πολυμεράσης αντίστροφης μεταγραφής (qRT-PCR). Στο πλαίσιο αυτό, επιλέχθηκε miR-145, όπως εμφανίζεται δραματική up-κανονισμού CRC με λεμφικό κόμβο μετάσταση σε σύγκριση με εκείνη χωρίς μετάσταση λεμφαδένα. Τόσο

in vitro

και

in vivo

μελέτη έδειξε ότι πάνω ρύθμιση του miR-145 θα μπορούσε να βελτιώσει την ικανότητα της μετανάστευσης και εισβολής του καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρου. Επιπλέον, iTRAQ (ισοβαρικών ετικέτα για σχετική και η απόλυτη ποσοτικοποίηση) επισήμανση και 2DLC-ESI-MS /MS (χρωματογραφία υγρού tandem MS) για τον εντοπισμό των κυτταρικών πρωτεϊνών που άμεσα ή έμμεσα ρυθμίζονται από miR-145. Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι miR-145 θα μπορούσε να διαδραματίσει ένα σημαντικό ρόλο στην μετάσταση του CRC με σταθεροποίηση του Hsp-27.

Αποτελέσματα

1. Διαφορετικά προφίλ έκφρασης των miRNAs του CRC με ή χωρίς μετάσταση λεμφαδένα

Για να διερευνήσουν τη συσχέτιση των προτύπων έκφρασης microRNA με τον λεμφαδένα μετάσταση του καρκίνου του παχέος εντέρου, οκτώ πρωτογενή ορθοκολικό καρκίνο ιστούς που προέρχονται από ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου σταδίου ΙΙ-ΙΙΙ με (n = 4) ή χωρίς (n = 4) μετάσταση λεμφαδένα συλλέχτηκαν και τα προφίλ έκφρασης miRNA από αυτά προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας Agilent miRNA μικροσυστοιχιών. Μεταξύ των μοναδικών 851 ανιχνευτή ανθρώπινου miRNA, 32 miRNAs εντοπίστηκαν εκφράζονται διαφορικά σε CRC ιστούς μεταξύ λεμφαδένα μετάσταση θετική και αρνητική ομάδα (

P

& lt? 0,05). Είκοσι ένα από αυτά παρατηρήθηκαν σημαντικά αυξημένη έκφραση σε CRC με μετάσταση στους λεμφαδένες. Από την άλλη πλευρά, 11 από αυτούς είχαν υποεκφράζεται σημαντικά σε λεμφαδένα μετάσταση θετικούς ιστούς CRC. Χωρίς επίβλεψη ανάλυση ομαδοποίησης με αυτά τα 32 σημαντικά δυσρυθμισμένη miRNAs (21 miRNAs με σημαντική υπερέκφραση και 11 miRNAs με σημαντική ρύθμιση προς τα κάτω) ήταν σε θέση να διακρίνουν τις CRCs με ή χωρίς λεμφαδένα μετάσταση (Εικ. 1Α).

Α. Το πιστοποιημένο αποτέλεσμα της ανάλυσης μικροσυστοιχιών. Ιεραρχική συσταδοποίηση από 32 σημαντικά απορρυθμισμένης miRNAs προφίλ έκφρασης σε ανθρώπινα πρωτογενή ορθοκολικό καρκίνο ιστοί που προέρχονται από ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου (LNM-Ρ, η = 4) ή χωρίς (LNM-Ν, Ν = 4) λεμφαδένα μετάσταση. B.Validation επιλεγμένων miRNAs προβλέπεται να απορυθμίζεται σε CRC με ή χωρίς λεμφαδένες μετάσταση στους λεμφαδένες χρησιμοποιώντας qRT-PCR στους ίδιους ιστούς που χρησιμοποιούνται για την ανάλυση μικροσυστοιχίας. Τα στοιχεία που παρουσιάζονται σε Β είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων, και παρουσιάζονται ως πλάσια έκφραση ρυθμίζεται σύμφωνα με U6 ± SD (τυπική απόκλιση) .C. Ανάλυση QRT-PCR της σχετικής έκφρασης του miR-145 σε επιπλέον 202 (LNM-Ν = 99? LNM-Ρ = 103) περιπτώσεις των ανθρώπινων ιστών CRC, συμπεριλαμβανομένων των δειγμάτων όγκου (Τ) και ταιριάζουν δείγμα μη καρκινικό ιστό (ΝΤ) από τον ίδιο ασθενή. Κάθε δείγμα αναλύθηκε εις τριπλούν και κανονικοποιήθηκαν ως προς U6. *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt?. 0.01

Η

2. Επαλήθευση της έκφρασης των miRNAs με πραγματικού χρόνου PCR ανάλυση

Για να επικυρώσετε τα δεδομένα μικροσυστοιχιών miRNA, πραγματοποιήσαμε ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου (qRT-PCR) για την ανάλυση του επιπέδου έκφρασης των miRNAs 11 που ήταν τα πιο σημαντικά δυσρυθμισμένη miRNAs ή που δεν έχουν αναφερθεί συσχέτιση της με την μετάσταση, συμπεριλαμβανομένων των miR-99b, -125b, -100, -99a, -152, -199b-5P, -145, -376c, -29b, -95 και -1274a. Εξετάσαμε την έκφραση των miRNAs στους ίδιους ιστούς που χρησιμοποιούνται για την ανάλυση μικροσυστοιχίας. Μετά την κανονικοποίηση με το ενδογενές U6 ελέγχου, δεδομένα qRT-PCR επιβεβαίωσε ότι η έκφραση της 8ης miRNAs έδειξε να είναι συνεπής με αποτέλεσμα μικροσυστοιχίας. Μεταξύ αυτών, η έκφραση του miRNA-145 εμφανίζεται η πιο σημαντική διαφορά μεταξύ των ιστών του καρκίνου των δύο ομάδων (Εικ. 1Β).

Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω το προφίλ έκφρασης miR-145, ανάλυση qRT-PCR πραγματοποιήθηκε σε επιπλέον 202 δείγματα CRC (99 CRC ασθενείς με μετάσταση λεμφαδένα και 103 ασθενείς CRC χωρίς μετάσταση λεμφαδένα) (βλέπε πίνακα 1 και τον πίνακα S1). Όπως φαίνεται στο Σχ. 1C, miR-145 υποεκφράζονται σε ορθοκολικό καρκίνο δείγματα με ή χωρίς μετάσταση σε σύγκριση με γειτονικά φυσιολογικούς ιστούς, αντίστοιχα, το οποίο είναι σύμφωνο με προηγούμενες αναφορές από άλλους [14]. Ωστόσο, η έκφραση του miR-145 ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα σε CRC με λεμφαδένα μετάσταση από ότι χωρίς μετάσταση λεμφαδένα. Αυτή η αλλαγή πρότεινε ότι το miR-145 μπορεί να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην CRC λεμφαδένα μετάσταση.

Η

3. Η υπερέκφραση του miR-145 δεν έχει καμία επίδραση στον πολλαπλασιασμό των HCT-8 κύτταρα

Για να καθοριστεί αν η έκφραση του miR-145 επηρεάζουν τη βιολογική λειτουργία των κυττάρων CRC, υπερεκφρασμένης μοντέλο miR-145 δημιουργήθηκε το HCT-8 κύτταρα χρησιμοποιώντας ένα φακοϊό σύστημα, το οποίο αναφέρεται ως HCT-8-miR-145 κύτταρα σε αυτό το χαρτί. Τα επίπεδα των HCT-8-miR-145 κύτταρα και ψευδο κύτταρα ελέγχου (HCT-8-NC) miR-145 προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας qRT-PCR (Εικ. 2Α). Ένα σημαντικό αυξητική ρύθμιση του miR-145 σε HCT-8-miR-145 κυττάρων παρατηρήθηκε σε σύγκριση με εκείνη σε κύτταρα HCT-8-NC. Για να παρατηρηθεί η επίδραση του miR-145 επί των κυττάρων HCT-8, ο ρυθμός ανάπτυξης των κυττάρων ή του κυτταρικού κύκλου εκτιμήθηκε με CCK-8 ή FACS δοκιμασία, αντίστοιχα. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Β και 2C, ο ρυθμός πολλαπλασιασμού ή κυτταρικό κύκλο των HCT-8-miR-145 κύτταρα δεν άλλαξε σε σχέση με HCT-8-NC. Αυτό το αποτέλεσμα πρότεινε ότι η υπερέκφραση του miR-145 δεν επηρέασε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό ή κυτταρικό κύκλο των HCT-8 κύτταρα.

(Α) qRT-PCR ανάλυση του miR-145 έκφραση σε HCT-8 κύτταρα επιμολυσμένα με το φορέα έκφρασης lenti-miR-145 ή ο φορέας αρνητικός μάρτυρας miRNA χρησιμοποιώντας ένα φακοϊό σύστημα. (Β), τα ποσοστά της διάδοσης των HCT-8-miR-145 ή HCT-8-NC κύτταρα ανιχνεύεται με CCK-8 δοκιμασία. (Γ) Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου των HCT-8-miR-145 ή HCT-8-NC κύτταρα με κυτταρομετρία ροής. Δεδομένων αντιπροσωπεύει μέσο όρο + SD τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

4. miR-145 προωθείται μετανάστευση CRC και την εισβολή

in vitro

και

in vivo

Η

Στη συνέχεια αναλύεται κατά πόσο miR-145 συνέβαλαν για να αλλάξει η μεταναστευτική κινητικότητα των κυττάρων CRC. Σε σύγκριση με την πλαστή ομάδα, κυτταρική μετανάστευση ήταν σημαντικά αυξημένη σε HCT-8-miR-145 κύτταρα σε μία δοκιμασία μετανάστευσης transwell κυττάρων (Σχ. 3Α). Ένα παρόμοιο αποτέλεσμα παρατηρήθηκε επίσης σε προσδιορισμό κυτταρικής εισβολής (Σχ. 3Β). Προσδιορίσαμε επίσης την ικανότητα του miR-145 για την προώθηση της μετανάστευσης σε άλλες κυτταρικές γραμμές CRC (SW480 και SW620). Όπως έδειξε στο Σχ. S1 στο File S1, η υπερέκφραση του miR-145 αύξησε σημαντικά τη μεταναστευτική ικανότητα των κυττάρων SW620, ενώ χωρίς εμφανή αλλαγή στην SW480 κύτταρα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα παρέχουν ισχυρές ενδείξεις ότι τα πάνω ρύθμιση του miR-145 θα μπορούσε να προωθήσει την κυτταρική μετανάστευση και εισβολή

in vitro

. Επειδή η έκφραση του miR-145 στο HCT-8 κύτταρα παρουσίασαν τη χαμηλότερη έκφραση σε σύγκριση με εκείνη σε άλλα κύτταρα CRC, το υπόλοιπο της εργασίας επικεντρώθηκε σε αυτή την κυτταρική σειρά CRC να παρουσιάζουν τα τυπικά την επικύρωση.

(Α) μετανάστευση και την εισβολή (Β) προσδιορισμός των HCT-8-miR-145 ή HCT-8-NC κύτταρα. Οι εικόνες ήταν εκπρόσωποι τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Μέσος αριθμός αριθμός κυτταρικής μετανάστευσης ανά πεδίο από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα ± SD φαίνεται από το σχήμα στήλης. **

P

& lt? 0,01. εικόνων (C) Φωτογραφία του μεσεντερικών λεμφαδένων μετάσταση από γυμνούς ποντικούς που εγχέεται στο ήπαρ με HCT-8-miR-145 ή κύτταρα HCT-8-NC που ακολουθείται από χειρουργικό ράμμα. Τα ζώα θανατώθηκαν 2 εβδομάδες μετά ενδο-ηπατικό κύτταρο εμβολιασμό. (D) Συχνότητα μεσεντερικών μετάσταση λεμφαδένα σε ποντικούς (πίνακας) και μέσος αριθμός των ορατών μεταστατικών οζιδίων σε μεσεντέριο (σχήμα στήλη). **

P

& lt?. 0.01

Η

Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω αυτή την έννοια, ένα γυμνό μοντέλο ποντικού ορθότροπων μεταμόσχευση συστάθηκε για να μελετήσει κατά πόσο η υπερέκφραση του miR-145 θα μπορούσε να προωθήσει τη μετάσταση των όγκων

in vivo

. Βρήκαμε καμία σημαντική διαφορά του βάρους ή του όγκου των πρωτογενών όγκων στο ήπαρ και από τα δύο μεταμοσχευμένα HCT-8-miR-145 κύτταρα και κύτταρα HCT-8-NC. Βρήκαμε επίσης ότι το 100% των ποντικών στην HCT-8-miR-145 ομάδα είχαν την μεσεντέρια μετάσταση λεμφαδένα και ο μέσος αριθμός των μεταστατικών οζιδίων έφθασε 149 ± 15. Ωστόσο, δεν υπήρχε κανένας από ποντίκια στην ομάδα ελέγχου HCT-8-NC εμφανίζοντας μεσεντερικών λεμφαδένων μετάσταση (Σχ. 3C, 3D). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν ότι το υψηλό επίπεδο του miR-145 θα μπορούσε να προωθήσει τη μετανάστευση CRC και εισβολή

in vitro

και

in vivo.

Η

5. Ανάλυση των διαφορικά εκφρασμένων πρωτεϊνών

Τα παραπάνω ευρήματα έδειξαν ότι το miR-145 λειτουργεί ως prometastatic miRNA στην CRC. Να επιδιώξουν να αποκτήσουν μια καλύτερη κατανόηση των πρωτεϊνών που επηρεάζονται άμεσα ή έμμεσα από το miR-145 υπερέκφραση, HCT-8-miR-145 και τα κύτταρα HCT-8-NC λύθηκαν, και υποβλήθηκαν σε επισήμανση iTRAQ, 2DLC-ESI-MS /MS ανάλυση. Ένα σύνολο 1.117 διακριτές πρωτεΐνες ταυτοποιήθηκαν και ποσοτικά, το οποίο στη συνέχεια διηθείται με το χέρι επιλεγμένες παραμέτρους αποκλεισμού φίλτρου. Πήραμε ένα 1,3 φορές αλλαγή cut-off για το λόγο iTRAQ να χαρακτηρίσει τις πρωτεΐνες ως προς τα επάνω ή προς τα κάτω ρύθμιση. Αυτό το cut-off εφαρμόστηκε επειδή αρκετές προηγούμενες μελέτες iTRAQ διεξαχθεί στο εργαστήριο μας έδειξαν ότι η τεχνική παραλλαγή ήταν σταθερά κάτω από 30%, το κριτήριο της αποκοπής έγινε επίσης δεκτή από προηγούμενες έρευνες [12]. Οι πρωτεΐνες θεωρήθηκαν προς τα πάνω ή προς τα κάτω-ρυθμίζονται μόνο όταν οι αναλογίες τους έκφραση (HCT-8-miR-145 κύτταρα έναντι HCT-8-NC κύτταρα) ήταν & gt? 1.3 (1 × 1.3) ή & lt? 0,77 (1 × 1.3) και έδειξε στατιστικώς σημαντική.

Έτσι 13 πρωτεΐνες υποβλήθηκαν σε διαλογή ως διαφορικά εκφρασμένων πρωτεϊνών, συμπεριλαμβανομένων 7 σημαντικά επάνω ρυθμισμένη πρωτεΐνες και 6 αξιοσημείωτα κάτω-ρυθμιζόμενες πρωτεΐνες (Πίνακας S2, S3). Μεταξύ 13 διαφορικά εκφρασμένων πρωτεϊνών, η αυξητική ρύθμιση των πρωτεϊνών θερμικού σοκ 27 (HSP-27) ελέγχθηκε με τη χρήση κηλίδωση western (Σχ. 4Α). Ως εκ τούτου, επιλέξαμε Hsp-27 για περαιτέρω διερεύνηση.

(Α) Τα επίπεδα έκφρασης του Hsp-27 εξετάστηκαν σε HCT-8-miR-145 ή κύτταρα HCT-8-NC με κηλίδωση Western ανάλυση. (Β) Η έκφραση του HSP-27 πρωτεΐνη ανιχνεύθηκε σε CRC και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών με δοκιμασία κηλίδος Western. Οι σχετικές αναλογίες /ακτίνης Hsp27 των μεμονωμένων ζωνών φαίνεται ως η μέση + SD των τιμών που προέρχονται από όλα τα δείγματα ασθενούς (μη καρκινικό ιστό, η = 47? καρκινικό ιστό LNM-Ρ, n = 41? LNM-Ν ιστό όγκου, n = 43). (C-D) MiR-145 Enhanced Hsp-27 Σταθερότητα στο CRC Cells.HCT-8-miR-145 ή κύτταρα HCT-8-NC επωάστηκαν με το κυκλοεξιμίδιο αναστολέα πρωτεϊνικής σύνθεσης (CHX, 0,5 μg /μΙ) (C) ή αναστολέα πρωτεασώματος MG-132 (5 μΜ) (D) για 24 ώρες. Το επίπεδο της συνολικής Hsp-27 ανιχνεύθηκε με κηλίδωση Western ανάλυση. Οι σχετικές αναλογίες /ακτίνης Hsp27 των επιμέρους ζώνες εμφανίζονται ως η μέση τιμή ± SD των τιμών ομαλοποιήθηκε σε βήτα-ακτίνη.

Η

Για να επικυρώσετε περαιτέρω τη σχέση μεταξύ Hsp-27 πρωτεΐνη και miR-145 έκφρασης στο CRC , αναλύσαμε το προφίλ έκφρασής τους σε πρωτογενή δείγματα ανθρώπινου ιστού (συμπεριλαμβανομένου του 41 CRC με LNM, 43 CRC χωρίς LNM, 47 παρακείμενο μη καρκινικό ιστό), χρησιμοποιώντας κηλίδωση Western ή qRT-PCR αντίστοιχα. Μεταξύ των δειγμάτων 131 ανθρώπινου ιστού, η έκφραση του HSP-27 ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα σε CRC με μετάσταση λεμφαδένα σε σύγκριση με εκείνη χωρίς μετάσταση λεμφαδένα. Η τάση αυτή είναι σύμφωνη με το προφίλ έκφρασης του miR-145. Υπήρξε μια ισχυρή, θετική συσχέτιση (Spearman) μεταξύ Hsp-27 πρωτεΐνη και miR-145 έκφρασης (

r

= 0,402?

P

& lt? 0,0001). (Σχήμα 4Β, Σχ S2 και S3 στο αρχείο S1). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι miR-145 εμπλέκεται, τουλάχιστον εν μέρει, σε up-ρυθμίσεως των Hsp-27 πρωτεϊνική έκφραση.

6. Ενίσχυση της Hsp-27 σταθερότητα με miR-145 σε κύτταρα CRC

Δεν υπήρχε ανιχνεύσιμη αλλαγή του Hsp-27 μεταγραφικό επίπεδο μετά miR-145 ανοδική ρύθμιση (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Μόνο πρωτεΐνες, αλλά δεν mRNA της Hsp-27 ήταν διαμορφωμένο από miR-145, προτείνοντας αυτού του κανονισμού είναι μετα-μεταγραφικά. Για να διερευνήσουν περαιτέρω την πρωτεΐνη πάνω ρύθμιση της Hsp-27 που επηρεάζονται από miR-145, που ανιχνεύθηκε κατά πόσον miR-145 ενισχύεται η σταθερότητα της Hsp-27 πρωτεΐνης. HCT-8-miR-145 κύτταρα και κύτταρα HCT-8-NC υπέστησαν αγωγή είτε με τον αναστολέα σύνθεσης πρωτεΐνης, κυκλοεξιμίδιο (CHX), ή αναστολέας πρωτεασώματος, MG-132, αντίστοιχα. Όπως απεικονίζεται στο 4Γ και 4Δ, την αυξημένη έκφραση της Hsp-27 στο miR-145 υπερεκφράζεται κύτταρα καταργήθηκε όταν επωάστηκαν με MG132. Ένα τέτοιο φαινόμενο δεν βρέθηκε όταν επωάζονται με CHX. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι miR-145 δεν μπορεί να επηρεάσει την σύνθεση των πρωτεϊνών του Hsp-27, αλλά θα μπορούσε να μειώσει το ποσοστό του Hsp-27 αποικοδόμηση, η οποία ενισχυμένη σταθερότητα του.

7. Κάτω ρύθμιση της Hsp-27 εξασθενεί την ογκογόνο δράση του miR-145

Για να επαληθεύσετε αν η ρύθμιση προς τα πάνω της Hsp-27 συμβάλλει στην miR-145 που προκαλείται από την κινητικότητα στο CRC κυττάρων, μια σειρά από δοκιμασίες ήταν διενεργείται

in vitro

. HSP-27 siRNA ή τον έλεγχο siRNA είχε αρχικά επιμολυνθεί σε HCT-8-miR-145 κύτταρα. Η μείωση των πρωτεϊνών έκφραση του HSP-27 επιβεβαιώθηκε μέσω κηλίδωση western (Σχ. 5Α). μετανάστευση του κυττάρου στη συνέχεια παρατηρήθηκαν χρησιμοποιώντας δοκιμασία επούλωσης πληγών (Εικ. 5Β). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η κινητικότητα των HCT-8-miR-145 κύτταρα επιμολυσμένα με Hsp-27 siRNA ήταν αξιοσημείωτα πιο αργή από αυτή των κυττάρων που επιμολύνθηκαν με τον έλεγχο siRNA. Ένα παρόμοιο αποτέλεσμα ελήφθη επίσης σε μία δοκιμασία κυττάρου εισβολή. Πειράματα προσδιορισμού διείσδυση Transwell-Matrigel διεξήχθησαν με HCT-8-miR-145 κύτταρα επιμολυσμένα με Hsp-27 siRNA ή ελέγχου siRNA. Σε σύγκριση με τον μάρτυρα, γκρεμίζω του Hsp-27 ανέστειλαν την ικανότητα εισβολής των HCT-8-miR-145 κύτταρα (Σχ. 5C). Τα άλλα τρία διαφορετικά ολίγο siRNA της Hsp-27 ήταν σε θέση να ανακεφαλαιώσω παρόμοιο φαινότυπο (Εικ. S4 στο αρχείο S1). Τα αποτελέσματα αυτά εκδηλώνεται η Hsp-27 ήταν ένα σημαντικό κατάντη διαμεσολαβητή κατά τη διάρκεια της prometastasis που σχετίζονται με miR-145.

(Α) HCT-8-mir-145 (mir-145) ή HCT-8-NC (NC κύτταρα) επιμολύνθηκαν με Hsp-27 siRNA (MIR-145 + si-hsp27) ή αρνητικός έλεγχος siRNA (MIR-145 + mock). Η έκφραση του HSP-27 πρωτεΐνη ανιχνεύθηκε με δοκιμασία κηλίδος Western. (Β) την επούλωση των πληγών δοκιμασία για να αξιολογηθεί η επίδραση της HSP-27 siRNA σε HCT-8-miR-145 κύτταρα. (C) Νοκ ντάουν της Hsp-27 με siRNA σε HCT-8-miR-145 κύτταρα ανέστειλε σημαντικά την εισβολή των κυττάρων. Οι εικόνες ήταν εκπρόσωποι τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Μέσος αριθμός αριθμός εισβολή των κυττάρων ανά πεδίο από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα ± SD φαίνεται από το σχήμα στήλης. **

P

& lt?. 0.01

Η

Συζήτηση

Η μετάσταση είναι το βασικό χαρακτηριστικό της κακοήθειας. Αν και υπάρχουν πολλές αναφορές της έκφρασης των miR-145 σε καρκίνους, η έκθεση της λειτουργίας του miR-145 στην ανάπτυξη μετάσταση του CRC είναι σπάνια λίγα. Στην τρέχουσα μελέτη, διερευνήσαμε την έκφραση του miR-145 στην πρωτογενή καρκινικό ιστό των ασθενών CRC με ή χωρίς μετάσταση λεμφαδένα. Το miR-145 ταυτοποιήθηκε ως υποεκφράζεται σε δείγματα CRC με ή χωρίς μετάσταση λεμφαδένα σε σύγκριση με παρακείμενες φυσιολογικούς ιστούς αντίστοιχα, η οποία είναι συνεπής με προηγούμενες αναφορές από άλλους [14] – [16]. Ωστόσο, η έκφραση του miR-145 εμφανίζεται μια δραματική ρύθμιση προς τα πάνω σε CRC με λεμφαδένα μετάσταση, που ήταν έξω από τις προσδοκίες μας. Επειδή στη γνώση μας, η τάση έκφραση των γονιδίων που σχετίζονται με όγκους που συνήθως κινούνται προς μία κατεύθυνση κατά μήκος της ανάπτυξης του όγκου. Για να επιβεβαιωθεί το αποτέλεσμα της προκαταρκτική παρατήρηση μας, η ακριβής έκφραση του miR-145 στην πρωτογενή CRC ιστό 103 ασθενείς με μετάσταση στους λεμφαδένες και 99 ασθενείς χωρίς μετάσταση λεμφαδένα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας qRT-PCR. Κάθε δείγμα αναλύθηκε εις τριπλούν και κανονικοποιήθηκαν έναντι ενός ενδογενούς U6 ελέγχου. Αυστηρά πρότυπα βαθμονόμησης και μεγάλη ποσότητα των δειγμάτων όγκου χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη εξασφάλισε την αξιοπιστία των αποτελεσμάτων μας. Εμείς δεν διαπίστωσαν σημαντική διαφορά σε σύγκριση του επιπέδου έκφρασης miR-145 σε παρακείμενες φυσιολογικούς ιστούς μεταξύ CRC με ή χωρίς μετάσταση στους λεμφαδένες. Ωστόσο, παρατηρήθηκε μια σαφής συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης του miR-145 και του λεμφικού μετάσταση. Σε αυτές τις CRC δείγματα ασθενών, miR-145 έδειξαν σημαντική υψηλότερη έκφραση στον καρκίνο με λεμφαδένα μετάσταση από εκείνους που δεν μετάσταση στους λεμφαδένες, η οποία επιβεβαίωσε περαιτέρω αποτέλεσμα σειρά μας. Επιπλέον, όπως αναλύσαμε δεδομένα από αρκετές άλλες miRNAs, παρατηρήσαμε επίσης παρόμοια προφίλ έκφρασης του μείωση, την αποκατάσταση, αλλά όχι περαιτέρω ρύθμιση προς τα κάτω, παράλληλα με την ανάπτυξη του CRC (μη δημοσιευμένα δεδομένα). Αυτές οι παρατηρήσεις των άλλων που σχετίζονται με CRC miRNAs επιβεβαίωσαν την ακρίβεια των αποτελεσμάτων μας, που πρότεινε ότι ένα miRNA εμφανίσει ίσως διαφορετικό προφίλ έκφρασης σε διαφορετικά στάδια του καρκίνου. Εκτός διαφορά στάδιο, η έκφραση του miR-145 φαίνεται να εξαρτάται από τον τύπο του ιστού. Για παράδειγμα, Sachdeva et al βρήκαν ότι η ρύθμιση προς τα κάτω του miR-145 ήταν περισσότερο εμφανές στην CRC σε σχέση με τον καρκίνο του μαστού [17]. Όλες αυτές οι παρατηρήσεις έδειξαν ότι ορισμένα miRNAs μπορούν να multitasking αλληλεπιδρώντας με διαφορετικά γονίδια-στόχους σε διάφορα κύτταρα και ιστούς [18].

Για να διερευνηθεί η σχέση του προς τα πάνω ρύθμιση του miR-145 με τη μετάσταση του καρκίνου του παχέος εντέρου, μελέτες miR-145 κέρδος-of-λειτουργία πραγματοποιήθηκαν σε ανθρώπινα κύτταρα CRC χρησιμοποιώντας φακοϊό σύστημα. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι πάνω ρύθμιση του miR-145 θα μπορούσε να προωθήσει τη μετανάστευση CRC και την εισβολή

in vitro

και

in vivo,

ενώ δεν παρατηρήθηκε καμία επίδραση στην ανάπτυξη των κυττάρων. Αυτά τα στοιχεία ήταν ασυμβίβαστη με κάποιες άλλες εκθέσεις που έδειξαν αντι-ογκογόνο ρόλο του miR-145 στην μετάσταση. Ωστόσο, τα δεδομένα που προκύπτουν από τις παρατηρήσεις αυτές ήταν είτε από ιστούς διαφορετικούς από κόλον [17], [19] – [20]. Arndt et al ανέφεραν μια ογκογόνο ρόλο του miR-145 σε CRC, το οποίο είναι σε καλή συμφωνία με τα αποτελέσματά μας [21]. Αυτά τα ευρήματα επιβεβαίωσαν επίσης ότι η λειτουργία του miR-145 που σχετίζονται με την ανάπτυξη του καρκίνου είναι τύπου ιστών ειδικά.

Αυτή η μελέτη παρέχει την πρώτη απόδειξη ότι το miR-145 λειτουργεί κυρίως ως prometastatic miRNA σε προχωρημένο CRC. Είναι σε γενικές γραμμές ότι μόνο συγκεκριμένες miRNA μπορεί να ρυθμίσει πολλαπλά γονίδια-στόχους, γεγονός που υποδηλώνει ότι μόνο miRNA θα μπορούσε να πραγματοποιήσει μια ποικιλία λειτουργιών στοχεύοντας διαφορετικά γονίδια σε διάφορες κυτταρικές πλαίσια [22]. Στο αρχικό στάδιο του CRC, miR-145 ρυθμίζεται προς τα κάτω, δείχνοντας το στόχο του που σχετίζονται με τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Στο προχωρημένο στάδιο, υψηλή έκφραση του miR-145 μπορεί να σχετίζονται με τους στόχους εναντίον της μετάστασης. MiR-17-5p, ένα καλά διερευνηθεί miRNA, θα μπορούσε να στοχεύσει προ- και αντι-πολλαπλασιαστική γονίδια και να ενεργεί τόσο ως ογκογονίδιο και ένα καταστολέα όγκου σε διαφορετικές μορφές καρκίνου [13], [23] – [24]. MiR-143, ένα άλλο καρκίνο που σχετίζεται miRNA, η έκφρασή του είναι πάντα συνεπής με miR-145 (δεν το κάναμε εξετάσεις συν-έκφραση της με miR-145 στη μελέτη μας), έδειξε πολλαπλών λειτουργιών στη μετάσταση του καρκίνου [25]. Στο σύνολό τους, τα ευρήματα αυτά υποστηρίζουν την υπόθεση ότι miR-145 μπορεί να παίζει ένα συγκρότημα λειτουργία στην ανάπτυξη του CRC.

Προκειμένου να αποκαλύψει πιθανές γονίδια τελεστές που συμμετέχουν σε αυτή τη λειτουργία, προσδιορίσαμε κυτταρικές πρωτεΐνες οι οποίες άμεσα ή έμμεσα ρυθμίζεται από miR-145, χρησιμοποιώντας επισήμανση iTRAQ και 2DLC-ESI-MS /MS. Οι αναλύσεις μας έδειξαν ότι Hsp-27 ήταν ρυθμισμένη σε miR-145 υπερεκφράζεται κύτταρα CRC. Θερμότητα πρωτεΐνη σοκ 27 (HSP-27), ένα σημαντικό μέλος της μικρής οικογένειας Hsp, εκφράζεται παντού σε διάφορους τύπους κυττάρων και εμπλέκονται σε κυτταρικές αποκρίσεις για μια ποικιλία τάσεων όπως θερμικό σοκ, υπέρτονο στρες, το οξειδωτικό στρες [26] – [27]. Υψηλά επίπεδα Hsp-27 βρέθηκε ότι σχετίζονται με τη μετάσταση διαφόρων τύπων όγκου συμπεριλαμβανομένων CRC, του καρκίνου του προστάτη, του καρκίνου του στομάχου, του ηπατοκυτταρικού καρκίνου, κεφαλής και λαιμού πλακωδών κυττάρων καρκίνου [28] – [30]. Συγκεκριμένα, έχει αποδειχθεί ότι η αυξημένη επίπεδο έκφρασης της Hsp-27 το CRC συνδεόταν με την μετάσταση λεμφαδένα [31] – [32]. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι υπήρχε μια ισχυρή, θετική συσχέτιση μεταξύ της Hsp-27 πρωτεΐνη και η έκφραση του miR-145 στην πρωτογενή δείγματα ανθρώπινου ιστού, η οποία έδειξε ότι το miR-145 συμμετείχε, τουλάχιστον εν μέρει, σε up-ρύθμισης της Hsp-27 έκφραση της πρωτεΐνης .

Νοκ ντάουν της Hsp-27 έκφραση γονιδίων από siRNA βρέθηκε να αντιστρέψει miR-145-μεσολάβηση επαγωγή της κυτταρικής μετανάστευσης CRC στη μελέτη μας. Ο ρόλος του miR-145 για τη διατήρηση της υψηλού επιπέδου Hsp-27 δεν ήταν μέσω της άμεσης στόχευσης γονιδίων αλλά σταθεροποίηση της Hsp-27. Αν και ο ρόλος και η κλινική έκβαση της Hsp-27 σε πρωτογενείς όγκους έχει μελετηθεί καλά και τεκμηριωμένες [33], η λειτουργία του στη μετάσταση εισβολή είναι ακόμα ασαφής. Περαιτέρω έρευνες για τον εντοπισμό του μηχανισμού της Hsp-27 που εμπλέκονται στην CRC μετάσταση θα εμπλουτίσει περαιτέρω την κατανόησή μας σχετικά με τη ρύθμιση προς τα πάνω του miR-145 στο CRC.

Εν κατακλείδι, η παρούσα μελέτη έδειξε ότι πάνω ρύθμιση του miR -145 συνέβαλε στην λεμφαδένα μετάσταση του CRC. Ο μηχανισμός αυτής της συνεισφοράς που συνδέονται με τη σταθεροποίηση του Hsp-27, μία πρωτεΐνη η οποία παίζει σημαντικό ρόλο στην προώθηση της μετάστασης. Μελλοντική κατεύθυνση της αξιολόγησης του miR-145 θα πρέπει να επικεντρωθεί στη μελέτη του μηχανισμού που θα μπορούσε να οδηγήσει στην εφαρμογή της στη διάγνωση μετάστασης και η θεραπεία της CRC.

Υλικά και Μέθοδοι

Κλινικά δείγματα

Τα δείγματα ιστών που αναλύθηκαν σε αυτή τη μελέτη ελήφθησαν από 202 ασθενείς (117 άνδρες και 85 γυναίκες) που υποβλήθηκαν σε χειρουργική εκτομή για CRC στο Αντικαρκινικό Νοσοκομείο, κινεζική Ακαδημία Ιατρικών Επιστημών, Πεκίνο, Κίνα. Τα δείγματα που χρησιμοποιούνται με τις γραπτές πληροφορημένες συγκαταθέσεις από ασθενείς και με την έγκριση της Κινεζικής Ακαδημίας Ιατρικών Επιστημών Αντικαρκινικό Νοσοκομείο. Κανένας από τους ασθενείς έλαβαν χημειοθεραπεία ή ακτινοθεραπεία πριν από την χειρουργική εκτομή. Το ολικό αντανακλούν τη φυσική διανομή κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά των ασθενών CRC. Χειρουργικά παρασκευά- είχαν ιστολογικά εξετάστηκαν με αιματοξυλίνη και χρώση ηωσίνης. Πρωτογενής καρκινικούς ιστούς και τα αντίστοιχα των παρακείμενων ιστών μη-όγκου συλλέγεται αμέσως μετά τη χειρουργική αφαίρεση και καταψύχθηκαν ταχέως σε υγρό άζωτο για περαιτέρω χρήση. Χωρίσαμε αυτή την ομάδα ασθενών σε δύο ομάδες. Εκείνοι με επιβεβαιωμένη LNM είχαν χαρακτηριστεί ως θετική ομάδα λεμφαδένων (LNP) και εκείνων που δεν έχουν ανιχνεύσιμο LNM ονομάστηκαν την ομάδα λεμφαδένων αρνητικό (LNN). Όλες οι περιπτώσεις εξετάστηκαν και επιβεβαιώθηκε από δύο έμπειρους παθολόγους. Τα κλινικά χαρακτηριστικά αυτών των δειγμάτων φαίνονται στον Πίνακα 1.

καλλιέργειας κυττάρων

Η ανθρώπινη κυτταρική σειρά CRC HCT-8 αγοράστηκε από το Ινστιτούτο των Βασικών Ιατρικών Επιστημών Κινεζική Ακαδημία της κυτταρικής καλλιέργειας Ιατρικών Επιστημών » κέντρο (Πεκίνο, Κίνα). Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (Gibco, CA), 100 U /ml πενικιλλίνης και 100 μg /ml στρεπτομυκίνης. Τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C και συμπληρωμένο με 5% CO

2 σε υγροποιημένο θάλαμο.

Microarray ανάλυση

Οκτώ πρωτογενή ορθοκολικό καρκίνο ιστούς που προέρχονται από ασθενείς σταδίου καρκίνο του παχέος εντέρου ΙΙ-ΙΙΙ με (n = 4) ή χωρίς (n = 4) μετάσταση λεμφαδένα συλλέχτηκαν και τα προφίλ έκφρασης του miRNA προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας Agilent miRNA μικροσυστοιχιών. Εν συντομία, ολικό RNA εκχυλίστηκε από τα δείγματα όγκων χρησιμοποιώντας το miRVana miRNA Απομόνωση Kit (Ambion Inc., ΤΧ, USA). Η ποιότητα και η ποσότητα του RNA δείγματα αξιολογήθηκαν από ένα 2.100 Bioanalyzer χρησιμοποιώντας το RNA 6.000 κιτ Pico LabChip (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Η μικροσυστοιχία περιλαμβάνει ανιχνευτές για 851 ανθρώπινα miRNAs από την v.12.0 βάση δεδομένων Sanger. Τα πειράματα μικροσυστοιχιών έγιναν σε ShanghaiBio Corporation χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο Agilent miRNA επισήμανση και υβριδισμός κιτ, Agilent ανθρώπινη σειρά miRNA (V2) και Agilent μικροσυστοιχιών σαρωτή. Όλα τα αρχικά δεδομένα μικροσυστοιχιών έχει κατατεθεί στη βάση δεδομένων NCBI GEO [GSE48074].

εκχύλιση RNA και σε πραγματικό χρόνο αλυσιδωτή αντίδραση ποσοτική ανάστροφης μεταγραφής-πολυμεράσης

Η miRNA καθαρίστηκε από καλλιεργημένα κύτταρα ή ιστούς χρησιμοποιώντας η Qiagen miRNeasy Mini Kit. Αντίστροφη μεταγραφή-αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας MiScript Reverse Transcription Kit (Qiagen, Germany).. Kit MiScript SYBR Green ΡΟΚ σε συνδυασμό με miRNA-ειδικούς εκκινητές (Mir-29b-1 * Cat.No. MS00009289, mir-95 Cat.No. MS00010906, mir-100 Cat.No. MS00003388, mir-125β Cat.No. MS00006629, mir-152 Cat.No. MS00003591, mir-376c Cat.No. MS00004046, mir-199b Cat.No. MS00003731, mir-145 Cat.No. MS00003528, mir-99Α Cat.No. MS00003374, mir-1274a Cat.No. MS00014420, Mir-99b Cat.No. MS00032165, Qiagen, Germany.) χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση ώριμη miRNAs επί LightCycler 480 (Roche, Βασιλεία, Ελβετία). Η σχετική έκφραση των miRNA σε σύγκριση με U6 (αρ. Κατ. MS00033740, Qiagen, Germany.) Υπολογίστηκε με τη χρήση της μεθόδου -ΔCt. Όλα qRT-PCR αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

Δημιουργία λεντοϊού να επιτευχθεί κέρδος του miR-145 λειτουργία

λεντοϊών pGCsil-GFP χρησιμοποιήθηκε για να μεταφέρουν την ανθρώπινη προ-miR-145 (ΜΙΚ -145) ή μη λειτουργικό έλεγχο (NC). Λεντοϊού κατασκευή φορέα και παραγωγή σωματιδίων λεντοϊού υψηλού τίτλου έγιναν από Genechem εταιρεία βιολογίας. Τα παραγόμενα φακοϊούς χρησιμοποιήθηκαν για να μολύνουν HCT-8 για 24-48 ώρες στους 1-5 ΜΟΙ, και τα επίπεδα έκφρασης του miR-145 προσδιορίστηκαν με δοκιμασίες qRT-PCR. Μολυσμένα πληθυσμοί εμφανίζουν μεταξύ πράσινα κύτταρα φθορίζουσα 70-90% χρησιμοποιήθηκε για μετέπειτα πειράματα.

Δοκιμασία πολλαπλασιασμού

Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε RPMI-1640 που περιέχει 10% ορό εμβρύου. 1 × 10

3 κύτταρα σπάρθηκαν σε επιπέδου πυθμένος πλάκες 96 φρεατίων και επωάζονται στους 37 ° C σε 5% CO2. Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με τη χρήση κυττάρων Μετρώντας Kit-8 (Dojindo Laboratories) σε day1, day3 και day5. Για την ανάλυση του κυτταρικού κύκλου, τα κύτταρα πλύθηκαν και στερεώθηκαν με παγωμένο 75% (ν /ν) αιθανόλης στους -20 ° C για 2 ώρες, στη συνέχεια βάφονται με ΡΙ σε συγκέντρωση 50 μg /mL υπό την παρουσία RNase Α ( 100 μg /ml). περιεχόμενο DNA αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής ανάλυση (Beckman Coulter, USA)

δοκιμασίες

μετανάστευση κυττάρων /εισβολή

Η κυτταρική κινητικότητα και διεισδυτικότητα προσδιορίστηκαν με μια 24 φρεατίων πλάκα transwell (μέγεθος πόρων 8 μm.? Costar), όπως περιγράφηκε προηγουμένως.

10 σε συντομία, για επικοινωνούντα δοκιμασίες μετανάστευσης, 1 × 10

4 κύτταρα τοποθετήθηκαν στην κορυφή θάλαμο επενδυμένο με τη μη επικαλυμμένη μεμβράνη. Για τις δοκιμασίες εισβολής, 3 × 10

4 κύτταρα τοποθετήθηκαν στον επάνω θάλαμο του κάθε ένθετου επικαλυμμένα με 200 mg /ml του Matrigel (BD Biosciences, CA, USA).

In vivo

δοκιμασίες μετάσταση

Για

in vivo δοκιμασίες

μετάστασης, 5 × 10

4 HCT-8-miR-145 κύτταρα ή κύτταρα HCT-8-NC εγχύθηκαν στο ήπαρ του γυμνούς ποντικούς ακολουθούμενη από χειρουργικό ράμμα (τρεις σε κάθε ομάδα, οι γυναίκες ηυ /ηυ). Μετά από 2 εβδομάδες, τα ποντίκια θανατώθηκαν, τα συκώτια τους αποκόπηκαν και τα μεσεντερικά μεταστάσεις λεμφαδένα μετρήθηκαν. Οι γυμνοί ποντικοί αγοράστηκαν από Vital ποταμό (Πεκίνο, Κίνα) και μεγάλωσε σε ένα συγκεκριμένο παθογόνο (SPF) πειραματόζωο. Όλα τα πειράματα με ζώα έχουν εγκριθεί από την Κινεζική Ακαδημία Ιατρικών Επιστημών και του Πεκίνου Ένωσης Ιατρικό Κολέγιο Επιτροπή Ηθικής και εκτελούνται σύμφωνα με τις νομικές απαιτήσεις.

επισήμανση iTRAQ και LC-ESI-MS /MS ανάλυση