Αφηρημένο

Τα περισσότερα καρκινικά κύτταρα εκφράζουν υψηλά επίπεδα της τελομεράσης και πολλαπλασιάζονται επ ‘αόριστον. Εκτός από την λειτουργία συντήρησης τελομερούς του, τελομεράση έχει επίσης μια λειτουργία προ-επιβίωσης με αποτέλεσμα μια αυξημένη αντοχή έναντι βλάβης του DNA και μειωμένη επαγωγή απόπτωσης. Πάντως, οι μοριακοί μηχανισμοί για αυτή την προστατευτική λειτουργία παραμένουν ασαφείς και δεν είναι σαφές εάν είναι συνδεδεμένο με διατήρηση των τελομερών ή είναι μάλλον ένα μη-τελομερούς λειτουργία της πρωτεΐνης τελομεράσης, TERT. Αποδείχθηκε πρόσφατα ότι η πρωτεΐνη υπομονάδα της τελομεράσης μπορεί μεταφοράς από τον πυρήνα στο μιτοχόνδρια κατά οξειδωτικό στρες όπου προστατεύει τη μιτοχονδριακή λειτουργία και μειώνει την ενδοκυτταρική οξειδωτικό στρες. Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι η ενδογενής τελομεράσης (TERT πρωτεΐνη) λεωφορεία από τον πυρήνα σε μιτοχόνδρια κατά του οξειδωτικού στρες σε καρκινικά κύτταρα και αναλύθηκαν τα πρότυπα πυρηνικής αποκλεισμός της ενδογενούς τελομεράσης μετά τη θεραπεία με υπεροξείδιο του υδρογόνου σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές. πληθυσμοί κυττάρων αποκλείονται TERT από τον πυρήνα κατά του οξειδωτικού στρες σε ένα ετερογενές τρόπο. Βρήκαμε μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ πυρηνικό εντοπισμό του τελομεράσης και υψηλής βλάβη του DNA, ενώ τα κύτταρα τα οποία εξαιρούνται τελομεράση από τον πυρήνα εμφανίζεται καθόλου ή πολύ χαμηλή βλάβη του DNA. Εμείς πρότυπο πυρηνικών και μιτοχονδριακών τελομεράσης χρησιμοποιώντας οργανιδίου ειδικούς φορείς εντοπισμός και επιβεβαίωσαν ότι μιτοχονδριακή εντοπισμός της τελομεράσης προστατεύει τον πυρήνα από η ζημία του DNA και απόπτωση, ενώ, αντίθετα, πυρηνικό εντοπισμό του τελομεράσης συσχετίζονται με μεγαλύτερες ποσότητες βλάβης του DNA και της απόπτωσης. Είναι γνωστό ότι η βλάβη του πυρηνικού DNA μπορεί να προκληθεί από μιτοχονδριακά παράγεται αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS). Έχουμε αποδείξει εδώ ότι το μιτοχονδριακό εντοπισμό της τελομεράσης αποτρέπει συγκεκριμένα βλάβη του πυρηνικού DNA με τη μείωση των επιπέδων των μιτοχονδριακών ROS. Προτείνουμε ότι αυτή η μείωση του οξειδωτικού στρες μπορεί να είναι μια πιθανή αιτία για την υψηλή αντοχή στο στρες των κυττάρων του καρκίνου και θα μπορούσε να είναι ιδιαίτερα σημαντικό για καρκινικά βλαστικά κύτταρα

Παράθεση:. Singhapol C, D Pal, Τσαπιέβσκι R, Porika Μ, Nelson G, Saretzki GC (2013) Μιτοχονδριακή τελομεράση Προστατεύει τα καρκινικά κύτταρα από το πυρηνικό DNA Ζημιές και την απόπτωση. PLoS ONE 8 (1): e52989. doi: 10.1371 /journal.pone.0052989

Επιμέλεια: Janine Santos, Πανεπιστήμιο Ιατρικής και Οδοντιατρικής του Νιου Τζέρσεϊ, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 14 του Αυγούστου 2012? Αποδεκτές: 27 του Νοεμβρίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 9 Ιανουαρίου, 2013

Copyright: © 2013 Singhapol et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Chatchawan Singhapol χρηματοδοτήθηκε από μια υποτροφία από την κυβέρνηση της Ταϊλάνδης. Glyn Νέλσον υποστηρίχθηκε από την nr επιχορήγηση BBSRC. BB /C008200 /1 (CISBAN). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Gabriele Saretzki είναι ένα PLoS ONE συντάκτης και μέλος της Συντακτικής Επιτροπής. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Η τελομεράση είναι ένα ένζυμο γνωστός για το ρόλο της στην διατήρηση των τελομερών. Κύτταρα με χαμηλή έκφραση ή καθόλου τελομεράσης χάσουν επαναλήψεις των τελομερών κατά τη διάρκεια της κυτταρικής διαίρεσης, τελικά οδηγεί σε κυτταρική γήρανση. Πιο καρκινικά κύτταρα, γεννητικών κυττάρων και των αρχέγονων βλαστικών κυττάρων εκφράζουν υψηλά επίπεδα της τελομεράσης, συμβάλλοντας έτσι στην pluripotency και αθανασία. Προκειμένου να διατηρηθεί τελομερή το ένζυμο χρειάζεται καταλυτική υπομονάδα της (TERT) καθώς και το συστατικό RNA (TERC ή TR) η οποία περιέχει το πρότυπο για τη σύνθεση των τελομερών.

Τα τελευταία χρόνια, ωστόσο, αποδείξεις έχουν συσσωρευθεί ότι τελομεράση , και ιδίως καταλυτική TERT υπομονάδα της, εμπλέκεται σε διάφορες λειτουργίες μη-τελομερούς σχετίζεται όπως ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης, αυξητικών παραγόντων και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων [1] – [6]. Επιπλέον, διάφορες ομάδες έχουν δείξει ότι τα λεωφορεία TERT από τον πυρήνα και μετατοπίζεται προς τα μιτοχόνδρια κατά εξωγενές στρες [7] – [12]. Εμείς και άλλοι έχουν δείξει έναν προστατευτικό ρόλο του τελομεράσης εντός μιτοχονδρίων [10] – [12], ενώ αδυναμία του παλινδρομούσα τελομεράσης οδηγεί σε κυτταρικό στρες, προλαμβάνει αθανατοποίηση και αυξάνει την ευαισθησία έναντι γενοτοξικό στρες, όπως φαίνεται πρόσφατα από ομάδα Santos «[13] – [ ,,,0],15].

Τα περισσότερα καρκινικά κύτταρα εκφράζουν υψηλά επίπεδα της τελομεράσης, μια σημαντική προϋπόθεση για αόριστο πολλαπλασιασμό και την αθανασία. Επιπλέον, η τελομεράση συνεισφέρει στην ογκογένεση μέσω μη τελομερών εξαρτώμενη μηχανισμούς που δεν είναι καλά κατανοητή ακόμη [16].

Η τελομεράση έχει έτσι προταθεί ότι είναι ένας σημαντικός στόχος κατά του καρκίνου, με τις πρώτες κλινικές δοκιμές του τελομεράση αναστολέας imetelstat επιτυχία σε εξέλιξη [17], [18]. Η τελομεράση ρυθμίζεται σε πολλαπλά επίπεδα και υποκυτταρικός εντοπισμός είναι ένα από αυτά. επιβίωση των κυττάρων του καρκίνου μετά θεραπευτικές αγωγές μπορεί να είναι ετερογενής με μερικά κύτταρα ανταποκρίνονται στη θεραπεία, ενώ άλλοι φαίνονται να είναι ανθεκτικά, συμβάλλοντας στην επιβίωση των κυττάρων του όγκου. Μια καλύτερη εικόνα για τις βιολογικές επιπτώσεις των διαφόρων υποκυτταρικών τοπικές προσαρμογές της TERT μπορεί να οδηγήσει στην ανάπτυξη πιο αποτελεσματικών θεραπειών κατά του καρκίνου.

Εδώ θα χαρακτηρίζεται τον αποκλεισμό της τελομεράσης από τον πυρήνα κατά την εφαρμογή του στρες και βρήκε ένα ετερογενές άγχος απόκριση σε καρκίνο κυτταρικούς πληθυσμούς. Είναι σημαντικό ότι, υπήρχε μια εντυπωσιακή συσχέτιση μεταξύ της τελομεράσης /TERT συγκρατείται μέσα στον πυρήνα και υψηλή DNA βλάβη. Αντίθετα, κύτταρα τα οποία αποκλείονται τελομεράσης γρήγορα από τον πυρήνα συσσωρευμένα καθόλου ή πολύ μικρές ποσότητες της βλάβης του DNA. Με τη μοντελοποίηση των διαφόρων υποκυτταρικούς εντοπισμούς τελομεράσης χρησιμοποιώντας οργανίδιο στόχευση «σκοπευτή» φορείς επιδεικνύουμε εδώ ότι μιτοχονδριακή τελομεράσης αποτρέπει βλάβη του πυρηνικού DNA, καθώς και την επαγωγή της απόπτωσης μετά από θεραπεία με H

2O

2 και ακτινοβολία. Προτείνουμε ότι η μειωμένη παραγωγή του μιτοχονδριακού αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) θα μπορούσε να είναι ο υποκείμενος μηχανισμός για να εξηγήσει πώς μιτοχονδριακή TERT αποτρέπει βλάβη πυρηνικό DNA.

Έτσι, ο αποκλεισμός του τελομεράσης από τον πυρήνα μετά το στρες, όπως αντικαρκινική θεραπευτική αγωγή θα μπορούσε να είναι ένας προστατευτικός μηχανισμός που μειώνει βλάβη του πυρηνικού DNA και την απόπτωση με τη μείωση του οξειδωτικού στρες μέσα μιτοχόνδρια. Αυτό θα μπορούσε να συμβάλει στην αυξημένη αντίσταση των εν λόγω καρκινικών κυττάρων έναντι διαφόρων θεραπειών κατά του καρκίνου.

Αποτελέσματα και Συζήτηση

Υποκυτταρική παλινδρόμηση των πρωτεϊνών TERT από τον πυρήνα στο μιτοχόνδρια είχε δειχθεί προηγουμένως σε διάφορους κυτταρικούς τύπους , συμπεριλαμβανομένων των καρκινικών κυττάρων [7], [10] – [12]. Επιβεβαιώσαμε αυτό παλινδρόμηση των ενδογενών τελομεράσης μετά H

2O

2 θεραπεία σε κύτταρα HeLa και MCF7 (Σχ. 1Α) από τον πυρήνα στο μιτοχόνδρια και να ποσοτικοποιηθούν την εξαίρεση σε σύγκριση με κύτταρα MRC-5 /hTERT (Πίνακας 1). Προκειμένου να αξιολογηθεί η κινητική παλινδρόμηση των TERT με περισσότερες λεπτομέρειες αναλύσαμε 3 κυτταρικές σειρές, συμπεριλαμβανομένων κυτταρικών σειρών 2 καρκίνου, καθώς και hTERT υπερεκφράζουν MRC-5 ινοβλάστες, και ακολούθησε τους πάνω από 5 ημέρες.

Παράδειγμα καθίστανται προβολές 3D όγκου deconvolved συνεστιακής εικόνες από κύτταρα HeLa και MCF7 χωρίς θεραπεία (έλεγχος, αριστερό πλαίσιο) ή σε επεξεργασία με 400 μΜ h

2O

2 για 3 h (δεξί πάνελ). Πράσινο αντιπροσωπεύει πράσινο φθορισμό Mitotracker, κόκκινο αντι-τ ανοσο-φθορισμού και μπλε πυρηνικό DNA (DAPI). Αξιοσημείωτη colocalization μεταξύ Mitotracker πράσινο και TERT εμφανίζεται με κόκκινο-πράσινο ανάμειξης που εμφανίζεται ως κίτρινο. B-D: TERT κινητική εντοπισμός σε 3 πληθυσμούς κυτταρική γραμμή μετά από αγωγή με 400 μΜ H

2O

2 πάνω από 5 ημέρες. Β: HeLa C: MCF7 D: MRC-5 /hTERT. Μαύρες γραμμές: πυρηνική TERT, κόκκινες γραμμές: κυτταροπλασματική TERT. Μπαρ είναι μέσοι όροι ± SE από τουλάχιστον 30 κύτταρα ανά χρονικό σημείο και κυτταρική γραμμή από 3 ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Σε όλες τις 3 κυτταρικές σειρές αποκλεισμού πυρηνική TERT ξεκίνησε περίπου 45 λεπτά μετά την έναρξη της H

2O

2 θεραπεία. Σε hTERT υπερεκφράζουν ινοβλάστες ο αποκλεισμός φτάσει στο μέγιστο του 60% μετά από 3 ώρες, ενώ χρειάστηκαν δύο καρκινικές κυτταρικές σειρές μέχρι μια μέρα να φτάσει σε ένα επίπεδο αποκλεισμό των 50-60% (Εικ. 1Β-Δ). Αυτό αντιστοιχεί καλά με το TERT μιτοχονδριακή δεδομένα συν-εντοπισμό από ομοεστιακό εικόνες μας από τις 3 κυτταρικές σειρές (Πίνακας 1). Περιέργως, το επίπεδο πυρηνικής αποκλεισμό των 50-60% επέμεινε σε όλες τις 3 κυτταρικές σειρές έως 5 ημέρες, το μεγαλύτερο χρονικό διάστημα σημεία που αναλύθηκαν (Εικ. 1Β-Δ και S1). Έτσι, ο αποκλεισμός των πυρηνικών TERT είναι μια μάλλον επίμονη διαδικασία που μπορεί να διαρκέσει έως και αρκετές ημέρες μετά από μια μονή δόση bolus 400 μΜ H

2O

2. Απ ‘όσο γνωρίζουμε, αυτή είναι η πρώτη φορά που η κινητική αποκλεισμού TERT έχει ερευνηθεί διεξοδικά και συγκρίθηκαν σε τρεις διαφορετικές κυτταρικές γραμμές σε ένα χρονικό πλαίσιο 5 την ημέρα. Η μακρά επιμονή της πρωτεΐνης TERT έξω από τον πυρήνα στις καρκινικές κυτταρικές γραμμές θα μπορούσε να είναι ένας σημαντικός συνεισφέρων σε αυξημένη αντίσταση και μειωμένη απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα μετά από θεραπεία φαρμάκου ή ακτινοβολία σε σύγκριση με μη καρκινικά κύτταρα, τα οποία στις περισσότερες περιπτώσεις δεν εκφράζει ή μάλλον χαμηλά επίπεδα τελομεράσης. Έχουμε δείξει στο παρελθόν ότι η τελομεράση αρνητικά ινοβλάστες είναι πολύ πιο ευαίσθητα σε απόπτωση μετά από αγωγή με H

2O

2 και ετοποσίδη από τελομεράση τους υπερεκφράζουν τους ομολόγους [10]. Είχαμε, επίσης, δείξει στο παρελθόν [10] ότι ο αποκλεισμός TERT από τον πυρήνα είναι αναστρέψιμη πάνω από ένα χρονικό διάστημα περίπου 10 ημερών. Ωστόσο, δεν γνωρίζουμε αν η επίμονη πρωτεΐνη TERT εντός μιτοχόνδρια έρχεται πάντα από τον πυρήνα ή αν νεοσυντιθέμενες πρωτεΐνη TERT είναι εισάγονται απευθείας στα μιτοχόνδρια. Αυτό το ζήτημα απαιτεί περαιτέρω διερεύνηση.

Στη συνέχεια συσχετίστηκαν αποκλεισμό της τελομεράσης για κάθε μεμονωμένο κύτταρο με το επίπεδο της βλάβης του DNA του σε 3 ώρες μετά H

2O

2 θεραπεία. Εμείς ποσοτικά το επίπεδο TERT αποκλεισμού για κάθε μεμονωμένο κύτταρο, είτε πυρηνικά, αν περισσότερο από το 75% του συνόλου των TERT ήταν στον πυρήνα, ή κυτταροπλασματική /μιτοχονδριακή εάν περισσότερο από το 75% των TERT ήταν έξω από τον πυρήνα με τα υπόλοιπα κύτταρα που έχουν ταξινομηθεί ως ενδιάμεσο φαινότυπο.

Βρήκαμε μια σαφή ετερογένεια για τον αποκλεισμό της πυρηνικής TERT μεταξύ των κυττάρων εντός ενός πληθυσμού (Εικ. 2Α και S2A). Περιέργως, βρήκαμε ότι τα κύτταρα που είχαν εξαιρεθεί τελομεράσης 3 ώρες μετά την αγωγή έδειξαν καθόλου ή πολύ χαμηλή βλάβη του DNA ενώ εκείνα με πυρηνικά τελομεράσης είχαν σημαντικά υψηλότερο ποσό ζημίας πυρηνικού DNA σε όλες τις κυτταρικές σειρές 3 (Εικ. 2). Επίσης, τα κύτταρα με ένα ενδιάμεσο πρότυπο αποκλεισμού έδειξε ένα ενδιάμεσο επίπεδο βλάβη, εξακολουθεί να είναι σημαντικά υψηλότερο από τα κύτταρα με τελείως αποκλειστεί τελομεράσης, αλλά όχι σημαντικά διαφορετικά από αυτά με κυρίως πυρηνική τελομεράσης. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι ένα υψηλό επίπεδο πυρηνικής αποκλεισμού (& gt? 75%) και μιτοχονδριακή εντοπισμός του TERT είναι απαραίτητη προκειμένου να ασκήσει τη λειτουργία προστασίας του [10] – [15]. Απόλυτη επίπεδα βλάβη του DNA ήταν διαφορετική μεταξύ των κυτταρικών γραμμών 3 με τις δύο κυτταρικές σειρές καρκίνου εμφανίζει πολύ υψηλότερα επίπεδα από ό, τι ζημιά TERT υπερεκφράζουν ινοβλάστες. Μετρήσαμε επίσης τις απόλυτες εντάσεις σήματος TERT για τις 3 διαφορετικές εντοπίσεις και διαπίστωσε ότι μιτοχονδριακή σήμα TERT ήταν πάντοτε χαμηλότερη από εκείνη στον πυρήνα ή σε ενδιάμεση κατάσταση (Σχ. S2B). Είχε δείξει στο παρελθόν ότι το επίπεδο της πρωτεΐνης TERT ρυθμίζεται προς τα κάτω μέσα στα μιτοχόνδρια μετά H

2O

2 θεραπεία που θα μπορούσε να εξηγήσει την παρατήρηση αυτή [19].

ενώ το μιτοχονδριακό της τελομεράσης αποτρέπει. Α-Γ: Εκπρόσωπος εικόνες της TERT εντοπισμού (πράσινο), και χρώση γH2A.X (κόκκινο). Μπλε: DAPI πυρηνική επίχρωση Α: HeLa Β: MCF7 C: κύτταρα MRC-5 /hTERT. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για 3 ώρες με 400 μΜ H

2O

2. TERT εντοπισμός προσδιορίστηκε όπως περιγράφεται για το Σχήμα 1Β και ομαδοποιούνται σε 3 κατηγορίες: πυρηνικός TERT (N) TERT (C) και ενδιάμεσος TERT (Ι) εντοπισμού. Παραδείγματα για τις 3 διαφορετικές εντοπίσεις υποδεικνύονται με βέλη. D: Συσχέτιση μεταξύ υποκυτταρικό εντοπισμό TERT και τα επίπεδα βλάβης πυρηνικό DNA (αριθμός γH2A.X εστιών). Κυτταροπλασματική TERT εντοπισμού συσχετίζεται με χαμηλή βλάβη πυρηνικό DNA σε όλες τις κυτταρικές σειρές 3, ενώ η πυρηνική TERT εντοπισμού αποτέλεσμα υψηλές πυρηνικές ζημίες μετά από 3 ώρες από τη θεραπεία με 400 μΜ H

2O

2. Ενδιάμεσοι TERT εντοπισμός αποτελέσματα σε ενδιάμεσα επίπεδα βλάβη του DNA. Μαύρες γραμμές: HeLa, κόκκινες γραμμές: MCF7, πράσινες γραμμές: MRC-5 /hTERT. Μπαρ είναι μέσος όρος ± SE από τουλάχιστον 40-100 κύτταρα ανά κυτταρική σειρά σε επανειλημμένα πειράματα. * P & lt?. 0.05

Η

Μια συσχέτιση μεταξύ της τριτοβάθμιας βλάβη του DNA στα καρκινικά κύτταρα και nuclearly περιορίζεται τελομεράσης μπορεί να λεωφορείο οφείλεται σε μετάλλαξη στο σήμα πυρηνικού εξαγωγή του περιγράφηκε πρόσφατα από Κοβαλένκο και οι συνεργάτες του [13]. Το μεταλλαγμένο TERT προκάλεσε μια αύξηση στην αυθόρμητη τελομερών καθώς και μη-τελομερούς βλάβη πυρηνικό DNA σε 2 καρκινικές κυτταρικές γραμμές σε σύγκριση με τα ίδια κύτταρα χωρίς το μεταλλαγμένο TERT [13]. Επιπλέον, τα καρκινικά κύτταρα με ένα μεταλλαγμένο TERT που περιορίστηκε στον πυρήνα και μπορεί να χάσει την ικανότητά σαΐτα πολλαπλασιασμό τους, δεν ήταν σε θέση να σχηματίζουν αποικίες σε μαλακό άγαρ και έδειξε μία αυξημένη ποσότητα μιτοχονδριακού βλάβης του DNA [13]. Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η υπο-κυτταρική παλινδρόμηση των TERT θα μπορούσε να έχει σημαντικές συνέπειες για την ευαισθησία των κυττάρων έναντι βλάβης του DNA. Αυτή η αυξημένη αντίσταση οφείλεται στην υψηλή έκφραση τελομεράσης και την πυρηνική αποκλεισμό TERT θα μπορούσε να προωθήσει την επιβίωση των καρκινικών βλαστικών κυττάρων τα οποία θα μπορούσε να οδηγήσει σε υποτροπή μετά τη θεραπεία [17]. Υπάρχει επίσης προηγουμένως δημοσιευμένα στοιχεία ενός προστατευτικού ρόλου των πυρηνικών TERT έναντι επαγόμενης σταυροσπορίνη απόπτωση [9]. Ωστόσο, η σταυροσπορίνη είναι ένας αναστολέας της πρωτεϊνικής κινάσης που ενεργοποιεί την απόπτωση με γρήγορο τρόπο χωρίς την πρόκληση βλάβης του DNA και ανεξάρτητη από μιτοχόνδρια. Συνεπώς, προτείνουμε ένα διαφορετικό μηχανισμό δράσης και στα δύο πειράματα.

επόμενο πρότυπο τις διάφορες εντοπίσεις TERT χωριστά με υπερ-έκφραση πυρηνικών και μιτοχονδριακών οργανιδίων ειδικών φορείς που εκφράζουν την καταλυτική υπομονάδα τελομεράσης TERT συγχωνευμένο με ένα myc-tag σε 3 καρκινικές κυτταρικές σειρές: HeLa, MCF7 και U87 γλοιοβλαστώματος (Εικ. 3). Μεταβατικά διαμολυνθέντα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία είτε με H

2O

2 ή ακτινοβολία και αναλύθηκαν για γH2A.X DNA εστίες βλάβη και TERT εντοπισμό χρησιμοποιώντας το συγχωνευμένο myc-tag. Ο εντοπισμός για μιτοχονδριακή (Mito TERT) και της πυρηνικής TERT φαίνεται στο Σχ. 3Α και Β (άνω πλαίσια). Δεν υπήρχε διαφορά στα επίπεδα βλάβη του DNA μεταξύ των κυττάρων που επιμολύνθηκαν με είτε τον φορέα ή un-επιμολυσμένα κύτταρα πριν από τη θεραπεία. Ωστόσο, βρήκαμε ότι σε όλες τις 3 κυτταρικές σειρές και τις δύο θεραπείες, τα κύτταρα με μιτοχονδριακή TERT εντοπισμός είχαν σημαντικά λιγότερη βλάβη του DNA σε σύγκριση με εκείνα τα κύτταρα τα οποία είτε εκφράζονται πυρηνικών TERT ή ήταν un-επιμολυσμένα (Σχ. 3 Α-ϋ). Προκειμένου να αποκλειστεί ότι η ενδογενής τελομεράσης αλληλεπιδράσει με την πρωτεΐνη shooter TERT υπερεκφράζεται επαναλάβαμε το πείραμα σε ένα SV40 απαθανάτισε MRC-5 κυτταρική σειρά που διατηρεί τα τελομερή του μέσω ενός εναλλακτικού μηχανισμού επιμήκυνση [20]. Μετά την ακτινοβόληση, βρήκαμε την ίδια προστατευτική επίδραση του μιτοχονδριακού τελομεράσης (Εικ. 3 Ε). Χρησιμοποιήσαμε επίσης ένα αντίσωμα έναντι 53BP1, μια άλλη πρωτεΐνη που εμπλέκεται στην απόκριση βλάβης DNA για να επιβεβαιώσει τα αποτελέσματα μας ότι εστίες βλάβη του DNA έχουν υψηλή περιεκτικότητα σε κύτταρα επιμολυσμένα με πυρηνικά TERT ενώ αντίθετα εκείνοι επιμολυσμένα με μιτοχονδριακή TERT δείχνουν λιγότερη βλάβη του DNA από μη-επιμολυσμένα κύτταρα ( Εικ. S3).

H

2O

2 μεταχείρισης σε σχέση με τον εντοπισμό των πυρηνικών TERT σε 4 διαφορετικές κυτταρικές σειρές. Α: Organelle ειδικούς φορείς TERT επιμολύνθηκε σε κύτταρα HeLa. Πάνω πίνακας: αντιπροσωπευτικών εικόνων από κύτταρα επιμολυσμένα με μιτοχονδριακή και πυρηνική φορείς TERT σκοπευτή με και χωρίς αγωγή με 200 μΜ H

2O

2 για 3 ώρες. χρώση TERT (χρησιμοποιώντας myc-tag) συγχωνευμένο με την πρωτεΐνη TERT (πράσινο) και χρώση γH2A.X (κόκκινο) για εστίες βλάβης του DNA. Τα βέλη δείχνουν τα επιμολυσμένα κύτταρα. Κάτω πίνακας: Ποσοτικοποίηση των κυττάρων με υψηλά επίπεδα DNA εστιών βλάβης για επιμολυσμένα και μη-επιμολυσμένα κύτταρα με και χωρίς H

2O

2 θεραπεία. Μπαρ είναι μέσος όρος ± SE από 3 ανεξάρτητα πειράματα, * P & lt? 0,05. Β: Organelle ειδικούς φορείς TERT διαμολύνονται σε κύτταρα MCF7. Πάνελ όπως περιγράφεται για Α, C-F: Ποσοτικοποίηση των κυττάρων με υψηλά επίπεδα DNA εστιών βλάβης για επιμολυσμένα και μη-επιμολυσμένα κύτταρα με και χωρίς ακτινοβολία-χ. C: MCF7 μετά από 20 Gy Χ ακτινοβολία. D: U87 μετά από 20 Gy Χ-ακτινοβόληση. Ε: MRC-5 /SV40 μετά από 10 Gy Χ-ακτινοβόληση. Οι μπάρες μέση τιμή ± SE από 3 ανεξάρτητα πειράματα. * P & lt?. 0.05

Η

Από τα υψηλά ποσά των ζημιών πυρηνικού DNA πιστεύεται ότι μειώνουν την επιβίωση των κυττάρων που αναλύθηκαν κατά πόσον οι θεραπείες που χρησιμοποιούνται άγχος θα έθετε σε κίνδυνο και την επιβίωση των κυττάρων και να προκαλέσουν απόπτωση. Εμείς αγωγή 3 κυτταρικών σειρών που επιμολύνθηκαν με δύο φορείς TERT σκοπευτή με H

2O

2 και Χ-ακτινοβολία και προσδιορίζεται επαγωγή απόπτωσης χρησιμοποιώντας αντίσωμα εναντίον ενεργοποιημένης κασπάσης 3. Είναι ενδιαφέρον, δεν είναι μια ενιαία κύτταρο επιμολυσμένα με μιτοχονδριακή TERT έδειξε κανένα σημάδι της απόπτωσης, ενώ περίπου το 20% των κυττάρων un-επιμολυσμένα και μεταξύ 40-60% των κυττάρων που εκφράζουν το πυρηνικό shooter ήταν αποπτωτικά (Εικ. 4). Αυτό το αποτέλεσμα επιβεβαιώνει ότι πράγματι η προκαλούμενη βλάβη του DNA βρέθηκαν σε κύτταρα με τις επιπτώσεις εντοπισμού πυρηνικών TERT άμεσα στην επιβίωση των κυττάρων, ενώ το μιτοχονδριακό TERT προστατεύει αποτελεσματικά ενάντια σε απόπτωση. Προκειμένου να διευκρινιστεί ο μηχανισμός με τον οποίο μιτοχονδριακό TERT μπορεί να προστατεύσει τα καρκινικά κύτταρα από βλάβη του πυρηνικού DNA μετρήσαμε την ποσότητα του μιτοχονδριακού ROS μετά H

2O

2 θεραπεία και ακτινοβολία χρησιμοποιώντας χρώση mitosox ως μέτρο της μιτοχονδριακής δημιουργίας υπεροξειδίου πέραν να myc-τριτ χρώση για πυρηνικά και μιτοχονδριακή «σκοπευτής» φορείς στις ίδιες 3 καρκινικές κυτταρικές σειρές (Σχ. 5 Α-Ε). Mitosox χρωστική παραλαμβάνεται από μιτοχόνδρια σε μια μεμβράνη δυναμικό ειδικό τρόπο. Προκειμένου να αποκλειστεί ότι οι διαφορετικές δυναμικό της μεμβράνης προκαλέσει τις συνέπειες, μετρήσαμε δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης στα κύτταρα HeLa και MCF7 επιμολυσμένα με δύο σκοπευτές TERT και σύγκριση τους με μη-επιμολυσμένα κύτταρα μετά H

2O

2 θεραπεία καθώς και το Χ -ακτινοβολία. Σύμφωνα με τα προηγούμενα ευρήματα μας για αυξημένο δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης σε MRC-5 /hTERT σε σύγκριση με τη γονική ινοβλάστες τα αποτελέσματα επιβεβαιώνουν σημαντικά υψηλότερο δυναμικό της μεμβράνης σε κύτταρα που υπερεκφράζουν το μιτοχονδριακό TERT, η οποία είναι σε κύτταρα HeLa ήδη εμφανής ακόμη και πριν από οποιαδήποτε θεραπεία στρες (Εικ. S4). Ως εκ τούτου, τα επίπεδα mitosox βρέθηκε στα πειράματά μας αντιπροσωπεύουν πραγματικά διαφορετικά επίπεδα ROS που εξαρτώνται από TERT εντοπισμού. Βρήκαμε ότι η υπερ-έκφραση του μιτοχονδριακού TERT σε όλους τους τύπους κυττάρων οδήγησε σε σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα ROS μετά H

2O

2 θεραπεία και την ακτινοβόληση σε σύγκριση με μη-επιμολυσμένα κύτταρα ή εκείνες που υπερεκφράζεται πυρηνικό TERT (Εικ. S4 )

Εκπρόσωπος εικόνες της ενεργοποιημένης κασπάσης 3 (φαίνεται με κόκκινο χρώμα) σε ένα:. Hela, Β: MRC /SV40, C: κύτταρα U87 επιμολυσμένα με Mito TERT και την πυρηνική TERT (myc-tag, εμφανίζεται με πράσινο χρώμα) μετά από 400 μΜ h

2O

2 θεραπεία για 3 ώρες ή ακτινοβολία με 20 Gy. D: Ποσοτικοποίηση του ποσοστού των αποπτωτικών κυττάρων από τις κυτταρικές σειρές 3 μετά H

2O

2 θεραπεία, Ε: Ποσοτικοποίηση του ποσοστού των αποπτωτικών κυττάρων από τις κυτταρικές σειρές 3 μετά Χ-ακτινοβόληση. Μπαρ παρόν μέση τιμή και τυπικό σφάλμα από περίπου 45 επιμολυσμένα κύτταρα ανά κατάσταση και κυτταρική σειρά. * P & lt? 0,05

Η

Άνω πίνακα:. Εκπρόσωπος εικόνες της χρώσης ROS (κόκκινο, mitosox) και TERT εντοπισμού (myc-tag, πράσινο) μετά οργανίδιο συγκεκριμένες επιμόλυνση TERT και 100 μΜ H

2O

2 θεραπεία για 3 ώρες σε κύτταρα HeLa. Άνω σειρά: mito- TERT, κάτω σειρά: πυρηνική TERT. Τα βέλη δείχνουν τα επιμολυσμένα κύτταρα. Κάτω πίνακας: Ποσοτικοποίηση των επιπέδων ROS μετριέται ως ποσοστό του mitosox θετική περιοχή από όλη την κυτταρόπλασμα χρησιμοποιώντας ImageJ σε επιμολυσμένα και μη επιμολυσμένα κύτταρα. Β: κύτταρα MCF7, πάνελ όπως περιγράφεται για την Α Γ: Ποσοτικοποίηση των ROS στα κύτταρα U87 μετά από 3 ώρες 100 μΜ H

2O

2 θεραπεία. D-F: Ποσοτικοποίηση των επιπέδων ROS μετά Χ-ακτινοβόληση. D: MCF7 μετά από 20 Gy Χ-ακτινοβόληση. Ε: U87 μετά από 20 Gy Χ-ακτινοβόληση F: MRC-5 /SV40 μετά από 10 Gy Χ-ακτινοβόληση. Ράβδοι αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SE από 3 ανεξάρτητα πειράματα. * P & lt?. 0.05

Η

Και πάλι χρησιμοποιήσαμε MRC-5 κύτταρα /SV40 χωρίς ενδογενή τελομεράσης για να επιβεβαιωθούν τα αποτελέσματα από τις 3 καρκινικές κυτταρικές γραμμές και βρήκε την ίδια προστατευτική επίδραση της μιτοχονδριακά εντοπίζεται TERT σε επίπεδα ROS ( Εικ. 5F). επίπεδα ROS στα κύτταρα που εκφράζουν το πυρηνικό TERT «σκοπευτής» ήταν συνήθως δεν διαφέρει από un-επιμολυσμένα κύτταρα με την εξαίρεση των MCF7 και κύτταρα MRC-5 /SV40 μετά την ακτινοβολία, όπου η πυρηνική σκοπευτής επιμολυσμένα κύτταρα έδειξαν χαμηλότερα επίπεδα ROS από un-επιμολυσμένα κύτταρα.

Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι από μετακινούνται στα μιτοχόνδρια τελομεράση /TERT όχι μόνο προστατεύει το οργανίδιο, αλλά με μείωση της μιτοχονδριακής παραγωγή υπεροξειδίου επίσης έμμεσα προστατεύει τον πυρήνα από βλάβη του DNA. Παρόμοιες παρατηρήσεις της τελομεράσης μετακινούνται από πυρηνόπλασμα να πυρηνίσκους είχε αναφερθεί στο παρελθόν κάτω από τις ιοντίζουσες ακτινοβολίες στην πρωτοβάθμια και καρκινικά κύτταρα [21]. Οι συγγραφείς είχαν σκεφτεί ότι η τελομεράση θα μπορούσε να επηρεάσει αρνητικά με ένζυμα επισκευής στον πυρήνα κάτω από συνθήκες αυξημένης βλάβης του DNA και το άγχος. Τα αποτελέσματά μας φαίνεται να υποστηρίζει αυτή την πρόταση ότι η τελομεράση μπορεί να είναι «ανεπιθύμητα» εντός του πυρήνα υπό συνθήκες βλάβης του DNA. Η τελομεράση έχει δειχθεί ότι «θεραπεύσει» χρωμοσώματα επιχειρώντας μια μορφή της επιδιόρθωσης του DNA με την προσθήκη αλληλουχιών τελομερών σε σπασμένα άκρα των τελομερών [22]. Ωστόσο, αυτό δεν μπορεί να οδηγήσει σε σωστή επιδιόρθωση του DNA, όπως είναι γνωστό πρέπει να διεξάγονται από αληθινά συστήματα επιδιόρθωσης του DNA.

Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι το μιτοχονδριακό εντοπισμό τελομεράσης μειώνει ειδικώς την παραγωγή ROS μιτοχονδριακή και κυτταρικό οξειδωτικό στρες μετά την επαγωγή της εξωγενούς στρες παράγεται από H

2O

2 ή ακτινοβολία στα καρκινικά κύτταρα και θα μπορούσε με αυτόν τον τρόπο την πρόληψη των ζημιών στο πυρηνικό DNA. Θα μπορούσε επίσης να εξηγήσει γιατί παλινδρόμηση των τελομεράσης από τον πυρήνα στο μιτοχόνδρια φαίνεται να προάγουν την κυτταρική επιβίωση, ενώ στα κύτταρα όπου τελομεράση δεν είναι σε θέση να εγκαταλείψουν τη συσσώρευση βλάβη πυρήνα DNA παρατηρείται.

Diehn και συνεργάτες ανέφεραν πρόσφατα ότι ο καρκίνος βλαστικά κύτταρα που παρήγαγαν λιγότερο ROS λόγω των υψηλότερων αντιοξειδωτικό έκφραση συσσωρευμένη λιγότερο βλάβη DNA μετά την ιονίζουσα ακτινοβολία [23]. Θα ήταν ενδιαφέρον να διαπιστωθεί αν αυτά τα κύτταρα έχουν επίσης περισσότερες αποκλείονται τελομεράση από βλαστικά κύτταρα μη-καρκίνου μετά την ακτινοβόληση. Έχει αποδειχθεί ότι τα καρκινικά βλαστικά κύτταρα εκφράζουν το επίπεδο δραστηριότητας υψηλό τελομεράσης? Ωστόσο, τίποτα δεν είναι γνωστό σχετικά με TERT μετακινούνται σε αυτά τα κύτταρα [24].

Έχουμε αποδείξει στο παρελθόν ότι η εξωγενής παραγωγή ROS από την ακτινοβολία σε ινοβλάστες ζημιές μιτοχόνδρια και επιταχύνει βλάβη πυρηνικό DNA δημιουργία μιας θετικής ανάδρασης [25]. Προτείνουμε ότι μια τέτοια λειτουργική αλληλεπίδραση μεταξύ μιτοχόνδρια και του πυρήνα υπάρχει και στα καρκινικά κύτταρα και άλλα τελομεράση θετικά κύτταρα, όπου τελομεράσης εισέρχεται μιτοχόνδρια ώστε να μειωθεί ROS οι οποίες προκαλούνται από χημειοθεραπευτικά φάρμακα και ακτινοβολία. Έτσι, φαίνεται ότι οι θεραπείες κατά του καρκίνου μπορεί να προκαλέσει μια νέα, άγνωστη έως σήμερα μηχανισμό παλινδρόμηση τελομεράσης που αποτρέπει την βλάβη του πυρηνικού DNA με τη μείωση της μιτοχονδριακής παραγωγή ROS μέσω επαγωγής παλινδρόμηση τελομεράσης. Λόγω της ετερογενούς μοτίβο του θα μπορούσε επίσης να εξηγήσει την αντίσταση ορισμένων, αλλά όχι όλα, τα καρκινικά κύτταρα κατά θεραπευτικές αγωγές.

Υλικά και Μέθοδοι

Cells

HeLa, MCF7, U87 και MRC5 /SV40 κύτταρα προήλθαν από την ATCC. MRC5 αγοράστηκαν από ECACC (Λονδίνο). hTERT υπερέκφραση διεξήχθη χρησιμοποιώντας ρετροϊική επιμόλυνση hTERT όπως περιγράφηκε νωρίτερα [10]. U 87 και MRC5 /SV40 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ΜΕΜ και DMEM αντίστοιχα συμπληρωμένο με 1% μη-απαραίτητο αμινοξύ, 10% FCS (Sigma), 2 mM γλουταμίνη και 1% πενικιλίνη /στρεπτομυκίνη. Όλοι οι άλλοι τύποι κυττάρων καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ (ΡΑΑ) που περιείχε 10% FCS (Sigma), 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (ΡΑΑ) και 2 mM γλουταμινικού (Gibco). Τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C σε θερμοκρασία περιβάλλοντος οξυγόνο και 5% CO

2.

Θεραπείες

Τα κύτταρα σπάρθηκαν 1 ή 2 ημέρες πριν από τη θεραπεία σε καλυπτρίδες 19 mm σε 12 φρεατίων για χρώσης ανοσο-φθορισμού (5 × 10

4 ανά φρεάτιο).

H

2O

2 θεραπεία (SIGMA) πραγματοποιήθηκε σε μέσο ελεύθερο ορού για τους υποδεικνυόμενους χρόνους και συγκεντρώσεις. Το χρησιμοποιούμενο H

2O

2 συγκεντρώσεις είχαν βελτιστοποιηθεί για κάθε διαφορετικό τύπο πειράματος. X-ακτινοβολία στα 10 και 20 Gy διεξήχθη χρησιμοποιώντας Faxitron (Elektron Technology, UK). Για όλα τα πειράματα ακτινοβόλησης (εκτός ανάλυση απόπτωση) τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και αναλύθηκαν 20 λεπτά μετά την αγωγή. Τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας 4% παραφορμαλδεϋδη σε PBS για 10 λεπτά.

ανοσο-φθορισμού χρώσης και απεικόνισης

Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν σε καλυπτρίδες χρησιμοποιώντας 4% παραφορμαλδεϋδη για 10 λεπτά. Μονά ή διπλά ανοσο-χρώση πραγματοποιήθηκε με τα ακόλουθα πρωτογενή αντισώματα: ποντίκι γH2A.X (Upstate), κουνελιού αντι-τ (Rockland), κουνελιού αντι-Κί67 (Abcam) και αντι myc-tag (Abcam). Ιδιαιτερότητα και την έλλειψη υποβάθρου χρώση του αντισώματος που χρησιμοποιείται TERT έχει επιβεβαιωθεί (Εικ. S5). Δευτερεύουσα αντισώματα ήταν: κατσίκας αντι-ποντικού και κουνελιού Alexafluor 594 και 488 (Molecular Probes /Invitrogen). Πυρηνική χρώση παρατηρήθηκε χρησιμοποιώντας DAPI. Εικόνες για κάθε κανάλι ελήφθησαν χρησιμοποιώντας ένα AxioImager Ζ1 μικροσκόπιο (Zeiss) εξοπλισμένο με κατάλληλο κύβους φίλτρο για να φασματικά διακρίνει Alexafluor

488 και Alexafluor

594, διασφαλίζοντας καμία διαρροή διαμέσου αυτού σε /από είτε φθοροφόρο (δημιουργήθηκαν κατά το παρελθόν, τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται) . Οι εικόνες στη συνέχεια αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ImageJ. Κατώτατα όρια ορίστηκαν για κάθε εικόνα ξεχωριστά.

Ομοεστιακή μικροσκόπιο φθορισμού και συν-εντοπισμός ανάλυση

Τα κύτταρα φορτώθηκαν με 400 nM Mitotracker πράσινο (Molecular Probes) για 30 λεπτά στους 37 ° C πριν από την καθήλωση και Στη συνέχεια χρωματίζονται με αντίσωμα αντι-TERT και Alexa Fluor® 594. οι εικόνες συλλήφθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Zeiss LSM 510 εξοπλισμένο με στόχο NA 63 × 1.4 με την pinhole σετ για 1 μονάδα Airy (Zeiss, Γερμανία). Ζ στοίβες λήφθηκαν κάθε 100 nm για κάθε κελί (δειγματοληψία & gt? 2 × κριτήρια Nyquist). Εικόνες deconvolved και στη συνέχεια αναλύθηκαν για το αντικείμενο συν-εντοπισμό σε 3D χρησιμοποιώντας το λογισμικό Huygens (SVI, Κάτω Χώρες). Για την ανάλυση colocalization και την προετοιμασία της εικόνας, οι deconvolved εικόνες που παρέχονται σε 3 διαστάσεων όγκους. Ενιαία κύτταρα απομονώθηκαν μέσα στην εικόνα και εντοπίστηκαν ενιαίο, ενοποιημένο αντικείμενα (μιτοχονδριακό και Τριτ) χρησιμοποιώντας «Κοινός εντοπισμός αντικείμενο» σε Huygens με ένα cut-off για να αποκλείσει οποιαδήποτε αντικείμενα μικρότερα από ό, τι ένα μιτοχόνδριο στο πράσινο κανάλι Mitotracker. Huygens τότε υπολογίζεται coefficent συσχέτιση ενός Pearson για κάθε κελί για 3 διαστάσεων colocalization μεταξύ μιτοχόνδρια και χρώση Τριτ. Αυτό μας επέτρεψε να προβλέψει με ακρίβεια αλήθεια colocalization (εντός των ορίων της παραγραφής περίθλασης) των δύο χρωμάτων ανεξάρτητα από διαφορετικά μήκη κύματος τους.

Organelle Ειδικές Επιμόλυνση

TERT περιέχει πυρηνικών και μιτοχονδριακών οργανιδίων ειδικούς φορείς ( pCMV-myc-mitoTERT και pCMV-myc-nucTERT ήταν ένα είδος δώρο από J. Haendeler και Joachim Altschmied, Ντίσελντορφ, Γερμανία και περιγράφηκε προηγουμένως [9], [11]). Παροδική επιμόλυνση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen, USA) των Mito-TERT και ηυο-hTERT «shooter» φορείς. Οι μέσες αποτελεσματικότητες επιμόλυνσης 48 ώρες μετά την επιμόλυνση ήταν μεταξύ 25 και 30%. Μεταβατικά διαμολυνθέντα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή 2 ημέρες μετά την επιμόλυνση είτε με H

2O

2 ή ακτινοβολία.

Προσδιορισμός επιπέδου ROS

Τα κύτταρα χρωματίστηκαν με 5 μΜ mitosox (Invitrogen, USA ) για 15 λεπτά μετά H

2O

2 θεραπεία ή ακτινοβολία πριν από τη μονιμοποίηση και χρώση αντισώματος. επίπεδα ROS προσδιορίστηκε ως το ποσοστό των κυτταροπλασματικών σήματος mitosox από το σύνολο των κυτταροπλασματική περιοχή χρησιμοποιώντας Image J (https://rsbweb.nih.gov/ij/).

Ανάλυση βλαβών του DNA

Ανάλυση της βλάβης του DNA πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ανοσο-φθορισμού, είτε ως ένα ενιαίο χρώση με γ-H2A.X ή διπλή χρώση με TERT. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν, κατέστησαν διαπερατά με PBG (PBS, BSA, fishskin ζελατίνη και 0.5% Triton) και γ-H2A.X αντίσωμα εφαρμόστηκε στα κύτταρα και στη συνέχεια χρωματίζονται με Alexa Fluor® 594. Αντι myc-tag και Alexa Fluor® 488 ήταν χρησιμοποιείται για να απεικονίσει επιμολυσμένα πρωτεΐνη TERT. Τα πλακίδια εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας ένα Zeiss Axiovision φθορισμού μικροσκόπιο (Zeiss, Germany). Για την ανάλυση του DNA να βλάψει τον αριθμό των εστιών βλάβης του DNA μετρήθηκε για κάθε τύπο TERT εντοπισμού ξεχωριστά από 20-40 κύτταρα ανά ομάδα και κυτταρική γραμμή.

Μέτρηση της TERT Αποκλεισμού Rate

Για κάθε μεμονωμένο κύτταρο, το τριτο εντοπισμός με το χέρι ποσοτικά με σύγκριση των σημάτων τελομεράσης εντός και έξω από τον πυρήνα, χρησιμοποιώντας Image J. Υποκυτταρική περιοχές προσδιορίστηκαν για τα πυρηνικά και κυτοσολικά περιοχές χρησιμοποιώντας ελεύθερο επιλογής. σήματα έκφρασης στην επιλεγμένη περιοχή αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας τη λειτουργία υπολογισμού περιοχή μετά κατωφλίου για την αφαίρεση του θορύβου. Το αποτέλεσμα του κάθε κυττάρου έδειξε ένα ποσοστό του σήματος TERT εκφράζεται στο υποκυτταρικό διαμέρισμα:

% TERT πυρηνική έκφραση = σήμα TERT στον πυρήνα περιοχή /συνολικό σήμα TERT × 100,

% TERT κυτταροπλασματική έκφραση = σήμα TERT στην /συνολικό σήμα TERT του κυτταροπλάσματος περιοχή × 100. Το μέσο ποσοστό των πυρηνικών και κυτταροπλασματικών εντοπισμό των TERT από τουλάχιστον 30 μεμονωμένα κύτταρα λήφθηκε για να προσδιοριστεί το μέσο ποσοστό του συνόλου του πληθυσμού.

Συσχέτιση της Κυτταρικής TERT Localization και βλάβη του DNA Επίπεδο

κατέταξε την εντόπιση του TERT σε 3 κατηγορίες: πυρηνικός TERT (N): 75% -100% του σήματος TERT κατοικεί μέσα στον πυρήνα, κυτταροπλασματική TERT (C): 75% -100% του σήματος TERT κατοικεί έξω από τον πυρήνα και όλα τα άλλα ποσοστά για την κατηγορία του ενδιάμεσου εντοπισμού (Ι). Για κάθε μία από τις 3 κατηγορίες που καθορίζεται ο αριθμός των γH2A.X εστιών από περίπου 40-100 κύτταρα ανά κυτταρική σειρά.

Ανάλυση της απόπτωσης

Hela, U87 και κύτταρα /SV40 MRC επιμολύνονται με shooter πυρηνικών και μιτοχονδριακών TERT. Μετά από 2 μέρες υποβλήθηκαν σε θεραπεία είτε με 400 μΜ H

2O

2 ή 20 Gy ακτινοβολίας και αφήνεται για 1 ακόμη ημέρα (U87 και MRC /SV40) ή 2 ημέρες για HeLa οφείλεται σε μια γνωστή καθυστέρηση στην επαγωγή της απόπτωσης σε Αυτά τα κύτταρα. Αφού τα κύτταρα στερέωση βάφτηκαν με myc-tag για TERT και ενεργοποιημένα κασπάσης 3 (Abcam) προκειμένου για την επισήμανση αποπτωτικά κύτταρα. Τα αποτελέσματα έχουν προσδιοριστεί 30 – 150 επιμολυσμένα κύτταρα ανά κυτταρική σειρά και την κατάσταση.

Στατιστικά

Ένας τρόπος ANOVA πραγματοποιήθηκε με τη χρήση Sigma Plot (Systat Software Inc, USA).

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

ανοσο-στυπώματος της πυρηνικής και μιτοχονδριακό κλάσμα σε κύτταρα HeLa και MCF7 σε επεξεργασία με 400 μΜ H

2O

2 για 5 ημέρες.