Αφηρημένο

Ιστορικό

Η χρήση συζυγών αντισώματος /απταμερούς-φάρμακο μπορεί να είναι μια πολλά υποσχόμενη μέθοδο για την μείωση της τοξικότητας, ενώ η αύξηση η αποτελεσματικότητα της χημειοθεραπείας.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

σε αυτή τη μελέτη, η αντικαρκινική παράγοντας δοξορουβικίνη (Dox) ενσωματώθηκε στο τροποποιημένο DNA απταμερούς TLS11a-GC, το οποίο στοχεύει ειδικά LH86, έναν άνθρωπο κυτταρικής σειράς ηπατοκυτταρικού καρκινώματος. δοκιμασίες κυτταρικής βιωσιμότητας έδειξαν ότι τα προϊόντα σύζευξης TLS11a-GC-Dox εμφάνισαν τόσο δραστικότητα και ειδικότητα στόχου. Σημαντικά, παρεμβαλλόμενα Dox στο τροποποιημένο απταμερούς αναστέλλεται μη ειδική πρόσληψη της μεμβράνης διαπερατό Dox με την κυτταρική γραμμή που δεν αποτελούν στόχο. Δεδομένου ότι τα προϊόντα σύζευξης είναι επιλεκτικά για κύτταρα που εκφράζουν υψηλότερες ποσότητες πρωτεϊνών στόχων, και οι δύο κριτήρια σημειώνεται παραπάνω ικανοποιούνται, καθιστώντας TLS11a-GC-Dox συζυγή πιθανοί υποψήφιοι για στοχευμένη παράδοση σε κύτταρα καρκίνου του ήπατος.

Συμπεράσματα /Σημασία

Λαμβάνοντας υπόψη τον μεγάλο αριθμό των διαθέσιμων απταμερών που έχουν συγκεκριμένους στόχους για μια ευρεία ποικιλία των καρκινικών κυττάρων, αυτή η νέα μέθοδος παρεμβολής απταμερούς-φάρμακο θα έχει πολλά υποσχόμενες συνέπειες για χημειοθεραπευτικά γενικά

Παράθεση:. Meng L, Yang L, Zhao Χ, Zhang L, Zhu Η, Liu C, et al. (2012) Στοχευμένη Παράδοση παράγοντες χημειοθεραπείας Χρησιμοποιώντας ένα ήπατος Καρκίνος-Ειδικές απταμερές. PLoS ONE 7 (4): e33434. doi: 10.1371 /journal.pone.0033434

Επιμέλεια: Μιχαήλ Β Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 24, Οκτ, 2011? Αποδεκτές: 8 Φλεβάρη του 2012? Δημοσιεύθηκε: 25 Απριλίου 2012 |

Copyright: © 2012 Meng et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας (NIH) GM066137, GM079359 και CA133086. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

είναι γνωστό ότι οι παραδοσιακοί παράγοντες χημειοθεραπείας καρκίνου μπορεί να προκαλέσει σοβαρές ανεπιθύμητες ενέργειες από μη ειδική τοξικότητα τους. Για να ξεπεραστεί αυτό το πρόβλημα και την επίτευξη συγκεκριμένων χορήγησης φαρμάκων, η ομάδα μας και άλλοι ερευνητές έχουν χρησιμοποιήσει αντισώματα [1], [2] ή απταμερών [3], [4], [5], [6], [7], [8] [9], [10] για το σχεδιασμό συζεύγματα συνδέτη-συνδεδεμένο φάρμακο για εφαρμογές στοχευμένη παράδοση.

τα απταμερή είναι μονόκλωνα ολιγονουκλεοτίδια που δεσμεύονται ειδικά σε μικρά μόρια, [11] πεπτίδια και πρωτεΐνες. [12] Τα απταμερή όχι μόνο παρέχουν τα πλεονεκτήματα των αντισωμάτων, όπως η υψηλή εξειδίκευση και συγγένεια, αλλά επίσης να έχουν χαμηλή ανοσογονικότητα και υψηλή σταθερότητα, με εύκολη σύνθεση και τροποποίηση. Πρόσφατα, μια διαδικασία που ονομάζεται κύτταρο-SELEX (Συστηματική εξέλιξη προσδεμάτων δι ‘εκθετικού εμπλουτισμού) έχει αναπτυχθεί για να δημιουργήσει απταμερή για ειδική αναγνώριση καρκινικά κύτταρα-στόχους, συμπεριλαμβανομένων των Τ-κυττάρων οξεία λεμφοβλαστική λευχαιμία (Τ-κυττάρου ALL), μικρό-κυττάρου καρκίνων του πνεύμονα , καρκίνων του ήπατος και των κυττάρων μολυσμένων από ιούς. [13], [14], [15], [16], [17], [18], [19] Αυτές απταμερή είναι πολύ ειδικά για διαφορετικούς τύπους καρκινικών κυττάρων και έχουν εξαιρετική συγγένειες σύνδεσης. Επειδή απταμερή παρέχουν εξειδίκευση σε μοριακό επίπεδο, πιστεύεται ότι προϊόντα σύζευξης απταμερούς-φαρμάκου μπορεί να ενισχύσει την αποτελεσματικότητα της χορήγησης φαρμάκων, ενώ την ίδια στιγμή, μειώνοντας συστημική τοξικότητα.

Το ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC) είναι ένα από τα πιο κοινή και θανατηφόρα καρκίνων στον κόσμο. Προκαλεί περίπου 600.000 θανάτους κάθε χρόνο. Επί του παρόντος, αγωγές για πρώιμο καρκίνο του ήπατος έχουν στηριχθεί σε μεταμόσχευση ήπατος και χειρουργική εκτομή. Συμβατική χημειοθεραπεία δεν έχει αποτελεσματική με τους ασθενείς με καρκίνο του ήπατος, και δεδομένου ότι οι χημειοθεραπευτικοί παράγοντες δεν είναι ειδικά για τον καρκίνο του ήπατος κύτταρα, τοξικές παρενέργειες ως αποτέλεσμα. Σε μια προηγούμενη δημοσίευση, αναφέραμε την ανάπτυξη μιας σειράς ειδικών απταμερών βασίζεται σε ένα μοντέλο ποντικού. [14] Ένα από αυτά τα απταμερή μπορούν επίσης να αναγνωρίζουν ειδικά ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του ήπατος, και αναφέρουμε εδώ ένα νέο σχέδιο για τη στοχευμένη παράδοση δοξορουβικίνη (Dox) σε καρκίνο του ήπατος κύτταρα.

Η δοξορουβικίνη έχει χρησιμοποιηθεί για τη θεραπεία του καρκίνου του ήπατος, με τη μορφή εντοπισμένη χορήγηση, αλλά η αποτελεσματικότητά του παρεμποδίζεται από τοξικές παρενέργειες. Για να ξεπεραστεί αυτό το πρόβλημα, έχουμε παρεμβάλλονται Dox σε ένα τροποποιημένο ανιχνευτή απταμερές. Dox είναι γνωστό ότι παρεμβάλλονται μέσα στο κλώνο DNA από την παρουσία του επίπεδου αρωματικούς δακτυλίους στο μόριο Dox. Πρόσφατες έρευνες έχουν ήδη δείξει ότι η δοξορουβικίνη μπορεί να παρεμβάλλει σε απταμερούς Α10 για την παροχή ειδικής αποτελεσματικότητα θανάτωσης για καρκινικά κύτταρα του προστάτη. [6], [20].

Το απταμερές TLS11a είχε προηγουμένως επιλεγεί από κύτταρο-SELEX κατά του ηπατώματος κυτταρική γραμμή ποντικού BNL 1ME A.7R.1 (MEAR). [14] επιλέχθηκε για αυτή την εφαρμογή, διότι έδειξε μεγάλη συγγένεια σύνδεσης για LH86, ήπατος καρκινικής κυτταρικής γραμμής. [21] Προκειμένου να επιτευχθεί μεγαλύτερη αποτελεσματικότητα παρεμβολή, μια μακριά ουρά GC προστέθηκε στον TLS11a για να σχηματίσουν ένα τροποποιημένο απταμερούς, TLS11a-GC. Μέσω της αλληλεπίδρασης, η αναλογία μεταξύ δοξορουβικίνη και TLS11a-GC ήταν 25:1. Κατά συνέπεια, η απόδοση παροχής της Δοξορουμπισίνης ήταν πολύ υψηλότερη σε σύγκριση με την αρχική TLS11a. Επίσης,

in vitro

και

in vivo

πειράματα έδειξαν ότι TLS11a-GC-Dox συζεύξεις έχουν πολύ καλύτερη απόδοση συγκεκριμένων θανάτωσης για καρκινικά κύτταρα-στόχους σε σχέση με την ελεύθερη Dox και τον έλεγχο συζυγών απταμερούς-Dox.

Αποτελέσματα

Η συγγένεια δέσμευσης του απταμερούς TLS11a

το απταμερές TLS11a (Εικ. 1α) δημιουργήθηκε κατά την BNL 1ME A.7R.1 (MEAR) ηπατώματος κυτταρική γραμμή ποντικού [ ,,,0],14] και έδειξε ισχυρή συγγένεια σύνδεσης (Kd = 4,51 ± 0,39 nM). [14] Η LH86 κυτταρική γραμμή δημιουργήθηκε από έναν ασθενή με καρκίνο του ήπατος. [21] Όταν TLS11a χρησιμοποιήθηκε για να ελεγχθεί κύτταρα LH86, προφανής ικανότητα πρόσδεσης παρατηρήθηκε (Σχ. 1β). Επίσης, όταν τα ανθρώπινα κανονικά κύτταρα ήπατος, Hu1082, δοκιμάστηκαν χρησιμοποιώντας TLS11a, δεν παρατηρήθηκε καμία σημαντική δέσμευση (Εικ. 1c). Στο Σχ. 1b και c, το πράσινο ιστόγραμμα δείχνει την δέσμευση υποβάθρου (απταμερούς ελέγχου, TD05), και οι κόκκινες εντάσεις φθορισμού δείχνουν την πρόσδεση των TLS11a με κύτταρα-στόχους και τον έλεγχο. Σε σύγκριση με το απταμερές ελέγχου, υπάρχει μια σημαντική διαφορά μεταξύ της αντοχής σύνδεσης του TLS11a σε κύτταρα LH86 και Hu1082. Δεν έχουν αναφερθεί στο παρελθόν ανιχνευτής διακρίνει μεταξύ του ήπατος καρκινικά κύτταρα και τα ανθρώπινα φυσιολογικά κύτταρα του ήπατος. Επίσης, η Kd του TLS11a να LH86 ήταν 7.16 ± 0.59 ηΜ (Σχ. 1 d), σε σύγκριση με 4,51 ± 0,39 ηΜ έως BNL 1ME A.7R.1. [14].

(α) Η δευτεροταγής δομή του απταμερούς TLS11a και ικανότητα σύνδεσης του στο (β) LH86 και (γ) ανθρώπινα κανονικά κύτταρα ήπατος, Hu1082. Το πράσινο ιστόγραμμα δείχνει την δέσμευση υποβάθρου (απταμερούς ελέγχου, TD05), και οι κόκκινες εντάσεις φθορισμού δείχνουν την πρόσδεση του TLS11a με κύτταρα-στόχους και τον έλεγχο. Όλες οι ανιχνευτές σημάνθηκαν με Φυκοερυθρίνη-Cy5.5. (Δ) προσδιορισμός Kd

Η

ανοσοϊστολογική απεικόνιση και μικροσκοπία φθορισμού έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως στη μελέτη των συμπαγών όγκων.? Ως εκ τούτου, αξιολογήσαμε επίσης αν TLS11a θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για την απεικόνιση όγκων με LH86, τη θετική κυτταρική γραμμή. Το σχήμα δείχνει τα S1 συνεστιακή εικόνες των LH86 ανιχνεύονται με TLS11a και μία αλληλουχία ελέγχου, TD05 (Κείμενο S1). Υπήρξε σημαντική ισχύ του σήματος του TLS11a σύγκριση με τον αρνητικό έλεγχο, και το πρότυπο σήμα δείχνει ότι τα απταμερή συνδέονται στην επιφάνεια των κυττάρων.

Συνήθως υποτίθεται ότι απταμερή επιλέγονται έναντι κυτταρικών γραμμών δεσμεύονται σε κυτταρικό πρωτεϊνών μεμβράνης . Αυτό έχει αποδειχθεί σε περισσότερα πρωτόκολλα SELEX περιλαμβάνουν καρκινικές κυτταρικές σειρές. [22], [23] Προκειμένου να διερευνηθεί το μόριο-στόχο του TLS11a, πραγματοποιήσαμε μια δοκιμασία πρωτεάσης, στην οποία τα κύτταρα LH86 υποβλήθηκαν σε αγωγή με θρυψίνη επί 10 λεπτά στους 37 ° C. Μετά την περίοδο επώασης, η δραστικότητα της πρωτεάσης διεκόπη με την προσθήκη παγωμένου PBS που περιείχε 20% FBS. Τα κύτταρα πλύθηκαν γρήγορα δύο φορές με φυγοκέντρηση και στη συνέχεια επωάζονται με τα απταμερή. Όπως φαίνεται στο Σχήμα S2, TLS11a έχασε αναγνώριση σημαντικά σε κύτταρα κατεργασμένα με τρυψίνη (S1 κειμένου). Τα σήματα φθορισμού μειώνεται στο παρασκήνιο, υποδεικνύοντας ότι η επεξεργασία των κυττάρων με τις πρωτεάσες που προκαλούνται πέψη της πρωτεΐνης-στόχου, με τη σειρά του δείχνει ότι το μόριο στόχος της TLS11a είναι μία πρωτεΐνη μεμβράνης.

Μία δοκιμασία εσωτερικοποίηση ήταν τότε για να προσδιοριστεί εάν TLS11a μπορούσε να εσωτερικεύεται κατά τη δέσμευση του στόχου. κύτταρα LH86 επωάστηκαν πρώτα με βιοτίνης επισημασμένο TLS11a ή TD05 και στη συνέχεια περαιτέρω επωάστηκαν με στρεπταβιδίνη συζευγμένη με ΡΕ-Cy5.5. Στη συνέχεια, το ρυθμιστικό απομακρύνθηκε, και το μέσο καλλιέργειας με LysoSensor ™ Πράσινο DND-189 προστέθηκε στα κύτταρα και επωάζονται στους 37 ° C για δύο ώρες. LysoSensor χρησίμευσε ως ένας δείκτης της θέσης λυσόσωμα στα κύτταρα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα S3, υπήρχε σαφής εσωτερικοποίηση του απταμερούς (S1 κειμένου). Το σήμα TLS11a προέρχεται από το εσωτερικό των κυττάρων και όχι στα εξωτερικά περιθώρια, και συν-εντοπισμένη με LysoSensor. Η αλληλουχία ελέγχου έδειξε κανένα σήμα είτε στο 4 ° C ή 37 ° C προσδιορισμούς. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι μπορεί να έχουν TLS11a συνδέεται προς μία πρωτεΐνη που θα μπορούσε να εσωτερικεύεται.

Σύζευξη και Μελέτης ακινήτου του απταμερούς-Dox Complex

Dox είναι γνωστό ότι παρεμβάλλονται μέσα στο κλώνο DNA με την παρουσία του επίπεδη αρωματικούς δακτυλίους, και δεσμεύεται κατά προτίμηση με 3-5′-GC αλληλουχίες δίκλωνου ή 5′-CG-3 ‘. [24], [25]. Η δευτερεύουσα δομή του TLS11a, όπως προβλέπεται από το λογισμικό NUPACK (https://www.nupack.org/), παρουσιάζεται στο Σχήμα 1α. Σύμφωνα με τη δομή, υπάρχουν δύο 5’-GC-3 ‘ή 5′-CG-3’ αλληλουχίες στην αλληλουχία TLS11a έτσι ώστε μία αλληλουχία TLS11a μπορεί να παρεμβάλλει ένα μέγιστο δύο μορίων δοξορουβικίνης. Προκειμένου να παρεμβάλλονται περισσότερα μόρια δοξορουβικίνη, μια μακριά ουρά GC προστέθηκε στο 5 ‘άκρο του TLS11a να παράγει ένα τροποποιημένο απταμερούς, TLS11a-GC (Σχ. 2α). Λόγω της μακράς ουράς GC, GC-TLS11a σχηματίζει μια δομή διμερούς. Nupack υπολογισμός έδειξε ότι ένα διμερές TLS11a-GC θα μπορούσαν να παρεμβάλλονται μέχρι 56 μόρια δοξορουβικίνη να παράγει μια αναλογία TLS11a-GC-to-δοξορουβικίνη των 1:28. Μια αλληλουχία απταμερές ελέγχου, TD05, τροποποιήθηκε επίσης με μια μακριά ουρά GC για να δώσει το ίδιο απταμερές αναλογία δοξορουβικίνη (Σχ. 2β) να. Ακόμα κι αν οι TLS1a-GC και TD05-GC διμερή μπορούσε παρεμβάλλονται μέχρι 28 Dox ανά απταμερούς, την αναλογία μεταξύ απταμερούς και δοξορουβικίνη κρατήθηκε σε 1:25 σε αυτά τα πειράματα.

Η παρεμβολή του Dox σε GC-τροποποιημένο απταμερή σχηματίζεται φυσική συζεύξεις. (Α) TLS11a-GC-Dox. (Β) TD05-GC-Dox. (Γ) ψύξη του φθορισμού Dox μετά την παρεμβολή. Η συγγένεια δέσμευσης του (δ) TLS11a-GC ή (ε) TD05-GC σε κύτταρα LH86 παρακολουθήθηκε μέσω κυτταρομετρίας ροής. Το σήμα φθορισμού είναι από Φυκοερυθρίνη-Cy5.5. Η εσωτερίκευση του (στ) Dox, (ζ) TLS11a-GC-Dox, και (h) TD05-GC-Dox παρατηρήθηκαν με συνεστιακή μικροσκόπηση.

Η

Είναι γνωστό ότι Dox έχει ιδιότητες φθορισμού, αλλά η παρεμβολή Dox σε DNA απταμερούς αποσβένει το φθορισμό της Dox λόγω του σχηματισμού συμπλοκών μεταφοράς φορτίου μεταξύ των βάσεων του DNA και του δακτυλίου ανθρακυκλίνη. [26], [27], [28] Για να εξεταστεί αν τέτοιες αλληλεπίδραση συμβαίνει με τροποποιημένα TLS11a-GC και TD05-GC απταμερή, φθορισμός αποκτήθηκε Dox με την απουσία και με την παρουσία ενός από τους απταμερών (Εικ. 2γ) . Το διάλυμα της ελεύθερης Dox είχε το υψηλότερο σήμα φθορισμού σε σύγκριση με την μαύρη ομάδα (ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης). Όταν τροποποιημένο απταμερούς (TLS11a-GC ή TD05-GC) προστέθηκε στο διάλυμα ϋοχ στις 1:28 αναλογία και αναμιγνύεται καλά, ο φθορισμός μειώθηκε δραματικά σχεδόν στο επίπεδο φόντου, υποδεικνύοντας ότι η παρεμβολή του Dox σε DNA απταμερούς είναι εφικτή και η ταχεία . Ακόμη και μετά το σύμπλοκο διάλυμα απταμερές-Dox διατηρήθηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 3 ώρες, ο φθορισμός παρέμεινε η ίδια, υποδεικνύοντας ότι το σύμπλοκο απταμερές-Dox είναι πολύ σταθερό.

Η συγγένεια δέσμευσης του TLS11a-GC προσδιορίστηκε με μια μέθοδος ανταγωνισμού. Μετά από επώαση με μη σημασμένο TLS11a-GC, οι θέσεις σύνδεσης επί κυττάρων LH86 πλήρως κατειλημμένα. Στη συνέχεια, όλα τα κύτταρα επωάζονται περαιτέρω με χρωστική σημασμένο TLS11a. Επειδή όλες οι θέσεις πρόσδεσης επί της κυτταρικής μεμβράνης που καταλαμβάνεται από μη επισημασμένο TLS11a-GC, χρωστική-σημασμένο TLS11a δεν θα μπορούσε να συνδέεται προς κύτταρα LH86, και μετά από πλύσιμο κανένα σήμα φθορισμού ανιχνεύθηκε (Εικ. 2d). Την ίδια στιγμή, ένα πείραμα ανταγωνισμού μεταξύ TD05-GC και dye- επισημασμένο TLS11a διεξήχθη. Επειδή TD05-GC δεν συνδέεται προς LH86, οι θέσεις πρόσδεσης ήταν διαθέσιμα για αλληλεπίδραση με βαφή-επισημασμένο TLS11a, καταλήγοντας σε ένα σήμα υψηλής φθορισμού (Σχ. 2e). Μετά από τροποποίηση με την μακριά ουρά GC, η κυτταρομετρία ροής δεδομένων έδειξε σαφώς ότι TLS11a-GC θα μπορούσε ακόμα να δεσμεύεται με κύτταρα LH86, ενώ TD05-GC δεν μπορούσε.

απελευθέρωση δοξορουβικίνη ερευνήθηκε χρησιμοποιώντας συνεστιακή μικροσκοπία. Μετά από 1 ώρα επώαση με δοξορουβικίνη ή συζεύγματα απταμερούς-Dox, τα κύτταρα επωάστηκαν περαιτέρω για 3 ώρες στους 37 ° C πριν από την απεικόνιση. Το Σχήμα 2στ δείχνει ότι τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με ελεύθερη δοξορουβικίνη είχε την πιο Doxorubicin σε πυρήνες τους, ενώ οι πυρήνες των κυττάρων που έλαβαν θεραπεία με προϊόντα σύζευξης TLS11a-GC-Dox (Σχ. 2g) περιείχε επίσης δοξορουβικίνη. Ωστόσο, οι πυρήνες των κυττάρων που έλαβαν θεραπεία με προϊόντα σύζευξης TD05-GC-Dox (Εικ. 2h) περιείχε σχεδόν καθόλου δοξορουβικίνη. Αυτό το πείραμα επιβεβαίωσε ότι TLS11a-GC-Dox συζυγή είχε ειδική συγγένεια δέσμευσης με LH86 κυττάρων σε σύγκριση με TD05-GC-Dox συζυγή. Επιπλέον, Dox θα μπορούσε να απελευθερωθεί από συζυγών TLS11a-GC-Dox μετά την εσωτερίκευση και θα μπορούσε να εισέρχεται στον πυρήνα.

Κυττάρου τοξικότητα του απταμερούς-Dox Συζεύγματα

Η κυτταρική βιωσιμότητα LH86 αντιμετωπίζονται με TLS11a-GC -Dox, TD05-GC-Dox, δοξορουβικίνη, TLS11a-GC, ή TD05-GC δοκιμάσθηκε και συγκρίθηκε με εκείνη των μη κατεργασμένων κυττάρων (Σχ. 3α). Η συγκέντρωση δοξορουβικίνης σε TLS11a-GC-Dox, TD05-GC-Dox και δωρεάν δοξορουβικίνη διατηρήθηκε σε 7.5 μΜ, και η αναλογία δοξορουβικίνης προς απταμερούς ήταν 25:1. Η συγκέντρωση απταμερούς στο TLS11a-GC, TD05-GC, TLS11a-GC-Dox, και των ομάδων TD05-GC-Dox κρατήθηκε στα 300 nm. Από τα δεδομένα που δείχνονται στο σχήμα 3α, TLS11a-GC και TD05-GC δεν είχε σημαντική επίδραση στη βιωσιμότητα των κυττάρων. Είναι προφανές ότι η θεραπεία με προϊόντα σύζευξης TLS11a-GC-Dox μειωμένη βιωσιμότητα των κυττάρων. Η αποτελεσματικότητα της κυτταρικής τοξικότητας ήταν δοξορουβικίνη & gt? TLS11a-GC-Dox & gt? TD05-GC-Dox. Ακόμη και αν η κυτταρική τοξικότητα του TLS11a-GC-Dox ήταν μικρότερη από εκείνη της ελεύθερης Δοξορουμπισίνης, η επίδραση τοξικότητα του TD05-GC-Dox ήταν πολύ φτωχότερη. Περαιτέρω πειράματα χρησιμοποιώντας Hu1229 ανθρώπινη φυσιολογική ηπατικά κύτταρα (Σχ. 3β) έδειξε ότι η ελεύθερη Dox είχε σημαντική τοξικότητα, ενώ TLS11a-GC-Dox και TD05-GC-Dox είχαν παρόμοιες και πολύ περιορισμένη τοξικότητα. Αυτά τα δεδομένα καταδεικνύουν ότι η εξειδίκευση του απταμερούς TLS11a-GC στα κύτταρα LH86 επιτευχθεί η τοξικότητα να στοχεύουν μόνο κύτταρα

(α) Σχετική βιωσιμότητα των κυττάρων του LH86 (κυτταρική σειρά στόχου).? (Β) Σχετική βιωσιμότητα κυττάρου των Hu1229 (ανθρώπινα κανονικά κύτταρα ήπατος)? (Γ) Hoechst 33258 χρώση για αποπτωτικά και τα νεκρά κύτταρα LH86 σε επεξεργασία με μία σειρά συγκεντρώσεων TLS11a-GC-Dox ή TD05-GC-Dox? (Δ) τα αποτελέσματα κηλίδος Western για διασπασμένης κασπάσης 3 σε κύτταρα LH86 σε επεξεργασία με μία σειρά συγκεντρώσεων TLS11a-GC-Dox ή TD05-GC-Dox.

Η

κυτταρικής απόπτωσης διερευνήθηκε χρησιμοποιώντας Hoechst 33258 χρώσης ( Σχ. 3γ). Από τις εικόνες φθορισμού, όταν η συγκέντρωση Dox ήταν 60 μΜ, υπήρχαν περισσότερα αποπτωτικά και τα νεκρά κύτταρα στην ομάδα TLS11a-GC-Dox (35.1%) από ότι στην ομάδα TD05-GC-Dox (13.7%), υποδεικνύοντας περαιτέρω την ειδικότητα συζυγών απταμερούς-Dox. Επιπλέον, η ενεργοποίηση της κασπάσης 3 παρακολουθήθηκε χρησιμοποιώντας στύπωμα Western (Σχ. 3d). Caspase 3 παίζει έναν σημαντικό ρόλο στην κυτταρική απόπτωση, και διασπασμένης κασπάσης 3 υποδεικνύει την ενεργοποίηση της. Από τα δεδομένα που δείχνονται, όταν η συγκέντρωση Dox ήταν 60 μΜ, η πυκνότητα του μπάντα διασπασμένη κασπάση 3 σε κύτταρα κατεργασμένα με TLS11a-GC-Dox ήταν 3,3 φορές υψηλότερη από ότι σε κύτταρα κατεργασμένα με TD05-GC-Dox.

In Vivo

Μελέτες

Τριάντα NOD. CG-Prikdc (SCID) IL2 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως περιγράφεται στο πειραματικό τμήμα. Το μέγεθος του όγκου του κάθε ποντικού μετρήθηκε κάθε δεύτερη ημέρα, και ο μέσος όγκος του όγκου υπολογίστηκε (Σχ. 4α). Τα δεδομένα δείχνουν ότι και οι δύο ελεύθερες Dox και πολύπλοκες TLS11a-GC-ϋΟΧ είχε προφανείς επιπτώσεις αναστολή όγκου σε σύγκριση με την ομάδα άνευ αγωγής. Επίσης, το συγκρότημα TLS11a-GC-ϋΟΧ είχε μια πιο αποτελεσματική δράση σε σύγκριση με την ελεύθερη Dox, υποδεικνύοντας ότι TLS11a-GC-Dox συζυγών στοχεύουν τα καρκινικά κύτταρα και επιτυγχάνεται υψηλότερη τοπική συγκέντρωση Dox στην θέση του όγκου σε σύγκριση με το ελεύθερο Dox. Επίσης, οι όγκοι του κάθε ποντικού συλλέχθηκαν και σταθεροποιήθηκαν χρησιμοποιώντας 10% φορμαλίνη για 24 ώρες. Στη συνέχεια, όλα τα δείγματα εστάλησαν στον πυρήνα παθολογίας εργαστήριο μοριακής για την H & amp? Χρώση Ε. Από την Η & amp? Ε χρώση διαφάνειες, το TLS11a-GC-ϋΟΧ συγκρότημα αγωγή των όγκων (Σχ. 4β, δεξιά) έδειξε σημαντική νέκρωση των κυττάρων του όγκου σε σύγκριση με το μη επεξεργασμένο όγκου (Σχήμα 4b, αριστερά).

(. α) Μέσος όγκος του όγκου των ποντικών που έλαβαν θεραπεία με τίποτα (μαύρο), δοξορουβικίνη (κόκκινο), ή TLS11a-GC-Dox (μπλε)? (Β) Μικροσκοπία εικόνες του Η &?. Ε χρώση διαφάνειες ιστό όγκου

Η

Συζήτηση

Το απταμερές TLS11a δημιουργήθηκε χρησιμοποιώντας καρκινικά κύτταρα ήπατος ποντικού, αλλά δείχνει επίσης υψηλή συγγένεια σύνδεσης για ανθρώπινο ήπαρ τα καρκινικά κύτταρα. Επιπλέον, TLS11a είναι το πρώτο απταμερές να αναγνωρίζονται ως ειδικά για ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του ήπατος. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι το μόριο στόχος της TLS11a είναι πολύ πιθανό μια πρωτεΐνη μεμβράνης η οποία μπορεί να εσωτερικοποιηθεί μέσα στα κύτταρα. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι TLS11a μπορεί να είναι ένα χρήσιμο απταμερούς για στοχευμένη παροχή φαρμάκου στη θεραπεία του καρκίνου του ήπατος.

Η δοξορουβικίνη διαδραματίζει έναν πολύ σημαντικό ρόλο στη θεραπεία του καρκίνου του ήπατος, και θεωρείται ότι είναι η πιο χρησιμοποιούμενη αντικαρκινικό φάρμακο σε όλο τον κόσμο. Dox είναι σε θέση να αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων μέσω παρεμβολής DNA στον πυρήνα του κυττάρου. Αρκετές αναφορές έχουν δείξει ότι οι ελεύθερες Dox είναι μεμβράνη διαπερατή και μπορεί να προσλαμβάνονται εκλεκτικά από τα κύτταρα μέσω ενός μηχανισμού παθητικής διάχυσης, ταχέως μεταφέρεται στους πυρήνες, και συνδέεται με το χρωμοσωμικό DNA. [29] Ως εκ τούτου, ενώ Dox είναι γενικά τοξικές για πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα, είναι επίσης τοξικό για κανονικά κύτταρα, περιορίζοντας έτσι τη θεραπευτική αποτελεσματικότητα του σε κλινική χρήση. Εδώ, κάνοντας χρήση τροποποίηση συγκεκριμένης απταμερούς καρκίνο του ήπατος και του ακινήτου παρεμβολή Dox, δημιουργήσαμε μια εύκολη, γρήγορη και αποτελεσματική μέθοδο για να παραδώσει Dox σε στοχευμένες καρκινικά κύτταρα. Κατά τη διάρκεια του

in vitro

πειράματα, αποδείξαμε την ειδική συγγένεια δέσμευσης του τροποποιημένου TLS11a-GC σε κύτταρα στόχους LH86, αλλά μη αναγνώριση στην ανθρώπινη φυσιολογική ηπατικά κύτταρα. Επιπλέον, αποδείξαμε την ειδική τοξικότητα του συμπλόκου TLS11a-GC-Dox σε κύτταρα στόχους, σε σύγκριση με κανονικά κύτταρα ήπατος, περιορίζοντας έτσι την τοξικότητα του μόνο σε κύτταρα-στόχους. Αυτή η στόχευση επιτεύχθηκε μέσω της ειδική συγγένεια δέσμευσης του απταμερούς TLS11a. Αν και TLS11a-GC-Dox επιτυγχάνεται καλή κυτταρική τοξικότητα σε σύγκριση με τον έλεγχο TD05-GC-Dox κατά τη διάρκεια δοκιμασίας MTS, μικρότερη τοξικότητα παρατηρήθηκε στην ομάδα TLS11a-GC-Dox σε σχέση με την ελεύθερη ομάδα Dox. Επίσης, λιγότερο εσωτερίκευση και την απελευθέρωση του Dox στην ομάδα TLS11a-GC-Dox σε σχέση με την ελεύθερη ομάδα Dox παρατηρήθηκε χρησιμοποιώντας συνεστιακή μικροσκοπία. η ίδια Dox είναι ένα μικρό μόριο το οποίο μπορεί να προσλαμβάνονται εκλεκτικά ταχέως από κύτταρα μέσω ενός μηχανισμού παθητικής διάχυσης. Μέσα σε 15 λεπτά, τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με ελεύθερη Dox δείχνουν έντονο κόκκινο φθορισμό στην πυρηνική περιοχή, υποδεικνύοντας ότι η ταχύτητα απορρόφησης είναι πολύ γρήγορη. [29] Ωστόσο, μόλις Dox ήταν παρεμβάλλονται στο DNA απταμερές για το σχηματισμό ενός πολύ μεγαλύτερου μορίου, η κυτταρική πρόσληψη του συμπλόκου απταμερούς-Dox ήταν εξαρτώμενη κυρίως από την απταμερούς και του στόχου κυτταρική μεμβράνη του. Επιπλέον, απταμερές εσωτερικοποίηση απαιτείται περισσότερος χρόνος (περίπου 2 ώρες) από το ελεύθερο Dox, επιβραδύνοντας έτσι την εσωτερικοποίηση του συμπλόκου απταμερούς-Dox και την απελευθέρωση του Dox από το συγκρότημα. Ως εκ τούτου, μικρότερη τοξικότητα παρατηρήθηκε στην ομάδα TLS11a-GC-Dox σε σχέση με την ελεύθερη ομάδα Dox κατά τη διάρκεια

in vitro

πειράματα. Κατά τη διάρκεια του

in vivo πειράματα

, TLS11a-GC-Dox είχε μειωθεί η ταχύτητα των κυττάρων εσωτερίκευσης σε σύγκριση με ελεύθερη Dox. Ωστόσο, λόγω της αναγνώρισης στόχου με TLS11a απταμερές, η τοπική συγκέντρωση του Dox ήταν αυξημένη, σε σύγκριση με την ελεύθερη Dox. Ως εκ τούτου, μεγαλύτερη αποτελεσματικότητα αναστολή όγκου επιτεύχθηκε στο TLS11a-GC-Dox αγωγή ομάδα ποντίκι.

Εν περιλήψει, κάνοντας χρήση της δυνατότητας των φαρμάκων ανθρακυκλίνης να παρεμβάλλονται μεταξύ των βάσεων των νουκλεοτιδίων, ένα νέο σχέδιο για την τροποποίηση απταμερούς TLS11a να TLS11a-GC και να Dox και των συζυγών TLS11a-GC διερευνήθηκε. Η εξειδίκευση και η αποτελεσματικότητα αυτού του προϊόντος σύζευξης για να χρησιμεύσει ως περαιτέρω καταδεικνύεται μια πλατφόρμα παροχής φαρμάκου

in vitro

και

in vivo

. Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι το τροποποιημένο απταμερές διατηρεί την ιδιαιτερότητά του και μπορεί να φορτώσει πολύ πιο Dox από το μη τροποποιημένο απταμερούς. Επίσης, τα προϊόντα σύζευξης απταμερούς-Dox είναι σταθερά σε μέσο κυτταρικής καλλιέργειας και μπορεί διαφορικώς κύτταρα στόχους LH86. Η ιδιαιτερότητα αυτού του συστήματος αποδείχθηκε περαιτέρω με κατεργασία των ανθρώπινων φυσιολογικών κυττάρων του ήπατος, τα οποία στερούνται του δεσμευτικού στόχου απταμερούς. Το συζυγές απταμερές-Dox αποτρέπει την μη ειδική πρόσληψη Dox και μειώνεται κυτταρική τοξικότητα στα κύτταρα μη στόχους. Επιπλέον, η

in vivo

πείραμα έδειξε καλύτερη αναστολή όγκου από την ομάδα TLS11a-GC-Dox σε σύγκριση με όλες τις άλλες ομάδες ελέγχου, υποδεικνύοντας την επιτυχή παράδοση των Dox με την τροποποιημένη απταμερές. Αυτή η ιδιαιτερότητα στόχευσης εξασφαλίζεται μια υψηλότερη τοπική συγκέντρωση Dox στον όγκο. Επιπλέον, απταμερούς-Dox συζυγή είναι μικρότερα από systemsand απελευθέρωσης φαρμάκου που βασίζονται σε αντισώματα κάποιο άλλο σύστημα παροχής, [30], [31] που επιτρέπει την ταχύτερη διείσδυση και λιγότερες ανοσοαντιδράσεις. Αναμένουμε ότι ο πρόσφατα σχεδιασμένη πλατφόρμα σύζευξη απταμερούς-Dox, η οποία βασίζεται στην παρεμβολή των ανθρακυκλινών, εντός των βάσεων των απταμερών, μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε διαφορετικούς τρόπους για την ανάπτυξη νέων στοχευμένων θεραπευτικούς τρόπους για πιο αποτελεσματική χημειοθεραπεία του καρκίνου.

έχουν υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture και αντιδραστήρια

LH86 κύτταρα έχουν περιγραφεί προηγουμένως. [21] Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε τροποποιημένο μέσο Eagle του Dulbecco (DMEM) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) (θερμοαπενεργοποιημένο) και 100 IU /mL πενικιλίνη-στρεπτομυκίνη στους 37 ° C σε υγρή ατμόσφαιρα με 5% CO

2. υδροχλωρική δοξορουβικίνη (Dox) αγοράστηκε από την Fisher Scientific (Houston, ΤΧ, USA). Όλα τα αντιδραστήρια για τη σύνθεση του DNA αγοράστηκαν από Glen Research. Εκτός αν σημειώνεται διαφορετικά, τα αντιδραστήρια, ρυθμιστικά διαλύματα και οι διαλύτες ελήφθησαν από το εμπόριο από την Fisher Scientific.

Σύζευξη του απταμερούς-Dox

Το απταμερές TLS11a (5′-

ACAGCATCCCCATGTGAACAATCGCATTGTGATTG TTACGGTTTCCGCCTCATGGACGTGCTG

-3 ‘ )? μια TD05 ακολουθία ελέγχου

(5′-CACCGGGAGGATAGTTCGGTGGCTGTTCAGGGTCTCCTCCCG ΟΤΟ-3 ‘).? τροποποιημένο απταμερούς TLS11A-GC (5’-

CGCGCGCGCGCGCGC GCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGACAGCATCCCCATGTGAACAATCGCATTGTGATTGTTACGGTTTCCGCCTCATGGACGTGCT G

-3 ‘)? και τροποποιημένη αλληλουχία ελέγχου TD05-GC (5’

CGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGAACACCGTGGAGGATAGTTCGGTGGCTGTTCAGGGTCTCCTCCCGGTG

-3 ‘) Συντέθηκαν σε ένα συνθετητή /RNA ABI3400 DNA (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Το συμπληρωμένο αλληλουχίες στην συνέχεια αποπροστατεύεται σε ΑΜΑ (υδροξείδιο του αμμωνίου /40% υδατικής μεθυλαμίνης 1:01) στους 65 ° C για 30 λεπτά και καθαρίστηκε περαιτέρω με αντίστροφης φάσης HPLC (ProStar, Varian, Walnut Creek, CA, USA) σε μια C -18 στήλη χρησιμοποιώντας 100 mM ρυθμιστικό οξικού τριμεθυλαμίνη (ΤΕΑΑ, ρΗ 7.5) και ακετονιτρίλιο ως κινητή φάση. Για να γίνει συζυγή απταμερούς-Dox, είτε TLS11a-GC ή TD05-GC αναμίχθηκε με δοξορουβικίνη σε ρυθμιστικό διάλυμα (PBS που περιέχει 5 mM MgCl

2, 4,5 mg /mL γλυκόζη, 0.1 mg /mL tRNA ζυμομύκητα, 1 mg /mL πρόσδεσης BSA) ή μέσα DMEM σε αναλογία 1:25 απταμερούς να Dox.

Παρακολούθηση Complex Σχηματισμός με φθορισμό

Φυσικές συζυγή μεταξύ απταμερούς (TLS11a ή TD05) και δοξορουβικίνη παρασκευάστηκαν σε 1 :28 μοριακή αναλογία του απταμερούς να δοξορουβικίνη (10 μΜ) σε ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης, και ο φθορισμός παρακολουθήθηκε στα 500-720 nm (1.5 mm σχισμή) για ένα Fluorolog-Tau-3 Spectrofluorometer (Jobin Υνοη) με διέγερση στα 480 nm.

Προσδιορισμός του απταμερούς Affinity

Τα κύτταρα LH86 αποκολλήθηκαν από πιάτα χρησιμοποιώντας μη ενζυματική λύση των κυττάρων διαστάσεως (Cellgro) και στη συνέχεια πλύθηκε με ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης (PBS που περιέχει 5 mM MgCl

2 και 4,5 mg /mL γλυκόζη). Η συγγένεια δέσμευσης του TLS11a προσδιορίστηκε με επώαση των κυττάρων LH86 (10

5) σε πάγο για 30 λεπτά με μια σειρά συγκεντρώσεων βιοτίνης επισημασμένο TLS11a σε ρυθμιστικό (100 μL) σύνδεση. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν δύο φορές με ρυθμιστικό διάλυμα πλύσεως (1,0 ml) και εναιωρήθηκε σε στρεπταβιδίνη επισημασμένη με φλουορεσκεΐνη (0,1 mL) για περαιτέρω επώαση (15 λεπτά σε πάγο). Πριν από την ανάλυση κυτταρομετρίας ροής, τα κύτταρα πλύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης δύο φορές και αιωρήθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα έκπλυσης (0.2 mL). Η μέση ένταση φθορισμού των κυττάρων χρησιμοποιήθηκε για να υπολογιστεί η σταθερά διάστασης ισορροπίας (Kd) της αλληλεπίδρασης κυττάρου TLS11a και LH86 με την τοποθέτηση του εξάρτηση της έντασης φθορισμού (F) σχετικά με την συγκέντρωση του επισημασμένου με βιοτίνη TLS11a (L) με την εξίσωση F = Bmax [L] /(Kd + [L]). Τα πειράματα σύνδεσης δοκιμασίας επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές.

Για την παρακολούθηση της συγγένειας δέσμευσης TLS11-GC, ένα πείραμα ανταγωνισμού διεξήχθη. Εν συντομία, 200 ηΜ TLS11a-GC επωάστηκε με κύτταρα LH86 για 20 λεπτά σε πάγο, και στη συνέχεια, 1 μΜ βιοτίνη-επισημασμένη TLS11a προστέθηκε επί 15 λεπτά περαιτέρω επώαση. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν δύο φορές με ρυθμιστικό διάλυμα πλύσεως (1,0 ml) και εναιωρήθηκε σε στρεπταβιδίνη επισημασμένη με φλουορεσκεΐνη (0,1 mL) για περαιτέρω επώαση (15 λεπτά σε πάγο). Πριν από την ανάλυση κυτταρομετρίας ροής, τα κύτταρα πλύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης δύο φορές και αιωρήθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα έκπλυσης (0.2 mL).

Αξιολόγηση των κυττάρων Πρόσληψη Dox με συνεστιακή μικροσκόπηση

Για συνεστιακή απεικόνιση, δοξορουβικίνη ή απταμερές -Dox συζυγή επωάστηκαν με ένα LH86 κυτταρική μονοστιβάδα σε ένα ποτήρι 35-mm τρυβλίο πυθμένα καλλιέργειας (Mat Tek Corp.) σε ϋΜΕΜ μέσο σε 37 ° C για 1 ώρα. Μετά το πλύσιμο μία φορά με τη χρήση μέσων, φρέσκα μέσα προστέθηκαν σε πιάτα για περαιτέρω 3 ώρες επώασης στους 37 ° C. Στη συνέχεια, τα πιάτα με τα κύτταρα τοποθετήθηκαν πάνω από ένα 40 × στόχος του Ολύμπου FV500-IX81 ομοεστιακό μικροσκόπιο (Olympus America Inc., Melville, ΝΥ). Α 5-mW, 488 nm-Ar + λέιζερ στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε για τη διέγερση των δοξορουβικίνη. Ο στόχος που χρησιμοποιείται για την απεικόνιση ήταν μια Ολύμπου LC σχέδιο F1 40X /0.60 ph 2 40 × στόχος.

MTS τηλέφωνα Βιωσιμότητας Δοκιμασία

χημειοευαισθησία της LH86 να Dox ή απταμερούς-Dox συζυγών προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το CellTiter δοκιμασία πολλαπλασιασμού των κυττάρων 96 (Promega, Madison, WI, USA). Εν συντομία, ένα δείγμα 100 μι κυττάρων LH86 (5 × 10

4 κύτταρα /mL) σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων (

n

= 3) και αφέθηκαν να αναπτυχθούν όλη τη νύκτα. Στη συνέχεια, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 100 μι: 1) απταμερούς έλεγχος TD05-GC, 2) απταμερούς TLS11a-GC, 3) Dox, 4) TD05-GC-Dox φυσική συζυγούς (25:1 δοξορουβικίνη να TD05-GC αναλογία mole) ή 5) TLS11a-GC-Dox φυσική συζυγούς (25:1 δοξορουβικίνη να TLS11a αναλογία mole) για 1 ώρα, πλύθηκαν και περαιτέρω επωάστηκαν σε φρέσκο ​​μέσο για συνολικά 48 ώρες. Για τη μέτρηση της κυτταροτοξικότητας, μέσα απομακρύνθηκαν από κάθε φρεάτιο, και στη συνέχεια το αντιδραστήριο CellTiter (20 μL) και μέσα (100 μί) προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο και επωάστηκαν για 3 ώρες. Χρησιμοποιώντας αναγνώστη πλακός (ανάγνωσης μικροπλάκας Tecan Safire, AG, Switzerland), η απορρόφηση καταγράφηκε στα 490 nm. Το ποσοστό της βιωσιμότητας των κυττάρων προσδιορίστηκε με σύγκριση Dox και απταμερούς-Dox συζυγούς-κατεργασμένα κύτταρα με το μη επεξεργασμένο μάρτυρα.

Hoechst 33258 χρώσης για αποπτωτικά κύτταρα

απόπτωση των κυττάρων προσδιορίστηκε με πυρήνα αλλαγή μορφολογία. LH86 κύτταρα σε εκθετική ανάπτυξη τοποθετήθηκαν σε μία πλάκα 48 φρεατίων σε τελική συγκέντρωση 1.5 × 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο. Μετά από 12 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις TD05-GC-Dox φυσική συζυγούς (25:1 δοξορουβικίνη να TD05-GC αναλογία mole) ή TLS11a-GC-Dox φυσική συζυγούς (γραμμομοριακή αναλογία TLS11a 25:1 Doxorubicin σε αυτά) για 1 ώρες, πλύθηκαν, και επωάστηκαν περαιτέρω σε φρέσκα μέσα για συνολικά 48 ώρες. Ακολούθως, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS και χρωματίστηκαν με Hoechst 33258 χρώσης λύση σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά από επώαση στους 37 ° C για 10 λεπτά, κυτταρικό πυρήνα κατακερματισμός /συμπύκνωσης ανιχνεύθηκε με μικροσκοπία φθορισμού. Ο αποπτωτικός κυτταρικός θάνατος αξιολογήθηκε με τον υπολογισμό του αριθμού των αποπτωτικών κυττάρων με συμπυκνωμένους πυρήνες, σε έξι έως οκτώ τυχαίως επιλεγμένες περιοχές. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται αντιπροσωπεύουν τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Western Blotting Ανάλυση

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και πλύθηκαν δύο φορές με αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό. Οι σβώλοι κυττάρων επαναιωρηματοποιήθηκαν σε ρυθμιστικό λύσης που περιέχει Nonidet Ρ-40 (10 mM HEPES, ρΗ 7.4, 2 mM EGTA, 0,5% Nonidet Ρ-40, 1 mM NaF, 1 mM NaVO

4, 1 mM φθοριούχο φαινυλμεθυλσουλφονύλιο, 1 mM διθειοθρεϊτόλη, /ml αναστολέα τρυψίνης 50 μg, 10 μg /ml απροτινίνη, και λευπεπτίνη) και επωάζονται επί πάγου για 30 λεπτά. Μετά από φυγοκέντρηση στα 12.000 χ g στους 4 ° C για 15 λεπτά, το υπερκείμενο μεταφέρθηκε σε ένα νέο σωλήνα, και η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε. Ισοδύναμα δείγματα (20 μα πρωτεΐνης) υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE σε 12% γέλες. Οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης και ανιχνεύθηκαν με τα υποδεικνυόμενα πρώτα αντισώματα (διασπάται αντίσωμα κασπάσης-3, Cell Signaling Technology, Inc.), που ακολουθείται από τις κατάλληλες δευτερεύοντα αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση (HRP, Santa Cruz Biotechnology, Inc.). Ανοσοαντιδραστικές ζώνες ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (ECL, Pierce). Τα μοριακά μεγέθη των πρωτεϊνών ανιχνεύθηκαν προσδιορίστηκαν με σύγκριση με προ-χρωματισμένους μάρτυρες πρωτεΐνη (Bio-Rad). Όλες οι πυκνότητες μπάντα υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ.

In vivo

Πείραμα

Το NOD. CG-Prkdc (SCID) IL2 αγοράστηκαν από Jackson Laboratory (Bar Harbor, ΜΕ) και στεγάζεται στις εγκαταστάσεις των ζώων στο Πανεπιστήμιο της Φλόριντα με τους θεσμικούς κανονιστική έγκριση (Θεσμικές φροντίδα των ζώων και την Επιτροπή Χρήσης). Αυτή η μελέτη εγκρίθηκε από Θεσμικών φροντίδα των ζώων και την Επιτροπή Χρήση με ID έγκριση IC00001331. Τριάντα NOD. CG-Prkdc (SCID) IL2 εγχύθηκαν υποδορίως με 7 χ 10

6

in vitro

-propagated κύτταρα LH86. Όταν οι όγκοι θα μπορούσε να δει εύκολα και να μετρηθεί, τα ποντίκια χωρίστηκαν σε τρεις ομάδες: (1) Ομάδα 1, χωρίς θεραπεία? (2) ομάδα 2, αντιμετωπίζονται με δωρεάν Dox? και (3) ομάδα 3, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με σύμπλοκο TLS11a-GC-DOX. Η δοσολογία δοξορουβικίνη διατηρήθηκε το ίδιο στις ομάδες 2 και 3 στα 2 mg /kg. Όλες οι θεραπείες συνεχίστηκαν επί 11 ημέρες. Φάρμακα εγχύθηκαν μέσω της φλέβας της ουράς τις ημέρες 1, 2, 3, 4, 5, 9, 10, και όλα τα δείγματα συλλέχθηκαν την ημέρα 11. Το μέγεθος του όγκου για κάθε ποντικό μετρήθηκε κάθε δεύτερη μέρα. Η καρδιά, πνεύμονα, ήπατος, νεφρού και όγκου κάθε ποντικού συλλέχθηκαν την ημέρα 11 και σταθεροποιήθηκαν χρησιμοποιώντας 10% φορμαλίνη για 24 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου, και στη συνέχεια χρώση αιματοξυλίνης και εοσίνης (Η &? Ε χρώση) πραγματοποιήθηκε

.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

Ομοεστιακή εικόνες χρώσης απταμερούς με καλλιεργημένα κύτταρα LH86. Τα κύτταρα επωάστηκαν με απταμερές συζευγμένο με βιοτίνη, και η εκδήλωση δέσμευσης παρατηρήθηκε με AlexaFluor 633-συζευγμένη στρεπταβιδίνη. Μη δεσμευτικές TD05 ακολουθία έδειξε τη δέσμευση φόντο. Απταμερή δείχνουν σημαντική δέσμευση πάνω από το σήμα υποβάθρου

doi:. 10.1371 /journal.pone.0033434.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2.