Αφηρημένο

Σκοπός

ΡΡ2Α είναι μια φωσφατάση σερίνης /θρεονίνης κρίσιμη για φυσιολογικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της απόπτωσης . Κυττάρων διεισδυτική πεπτίδια είναι μόρια που μπορούν να μετατοπίζονται σε κύτταρα χωρίς να προκαλεί βλάβη μεμβράνης. Ο στόχος μας ήταν να αναπτύξουμε πεπτίδια κυτταρικής σύντηξης-διεισδυτικό σχεδιαστεί ειδικά για να διαταράξει το 9-κασπάσης αλληλεπίδραση /ΡΡ2Α και να αξιολογήσει το θεραπευτικό δυναμικό τους

in vitro

και

in vivo

.

Πειραματικός Σχεδιασμός

παράγεται ένα πεπτίδιο που περιέχει μια διεισδυτική αλληλουχία που σχετίζεται με το μοτίβο αλληλεπίδρασης μεταξύ της ανθρώπινης κασπάσης-9 και ΡΡ2Α (DPT-C9h), προκειμένου να στοχεύσουν την ένωσή τους. Χρησιμοποιώντας κυτταρικές γραμμές όγκου, πρωτογενή ανθρώπινα κύτταρα και πρωτογενή ανθρώπινα καρκίνο του μαστού (BC) ξενομοσχεύματα, ερευνήσαμε την ικανότητα των DPT-C9h να προκαλέσουν απόπτωση in vitro και αναστολή της ανάπτυξης του όγκου (TGI)

in vivo

. DPT-C9h έγινε ενδοπεριτοναϊκά χορηγήθηκαν σε δόσεις από 1 έως 25 mg /kg /ημέρα για 5 εβδομάδες. Σχετική όγκου Όγκος (RTV) υπολογίστηκε.

Αποτελέσματα

Έχουμε αποδείξει ότι DPT-C9h στοχεύουν ειδικά κασπάσης-9 /αλληλεπίδραση ΡΡ2Α

in vitro

και

in vivo

και επαγόμενη κασπάση-9-εξαρτώμενη απόπτωση σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου. DPT-C9h προκάλεσε επίσης σημαντική TGI π.Χ. ξενομοσχεύματα μοντέλα. Το ποντίκι-ειδικό πεπτίδιο DPT-C9 που προκαλείται επίσης TGI στον πνεύμονα (K-Ras μοντέλο) και του καρκίνου του μαστού (PyMT) μοντέλα. DPT-C9h έχει μια συγκεκριμένη επίδραση στην μετασχηματισμένα Β κύτταρα απομονώθηκαν από ασθενείς χρόνιας λεμφοκυτταρικής λευχαιμίας, χωρίς καμία επίδραση επί πρωτογενών υγιή κύτταρα. Τέλος, παρατηρήθηκαν ούτε τοξικότητα ούτε ανοσογόνες αποκρίσεις.

Συμπέρασμα

Χρησιμοποιώντας τα κυττάρου-διεισδυτική πεπτίδια αποκλεισμού αλληλεπιδράσεις κασπάσης-9 /ΡΡ2Α, δείξαμε ότι DPT-C9h είχε μια ισχυρή θεραπευτική δράση

in vitro

και

in vivo

σε μοντέλα ποντικών της εξέλιξης του όγκου

Παράθεση:. Arrouss Ι, Nemati F, Roncal F, Wislez Μ, Dorgham Κ, Vallerand D, et al. (2013) ειδική στόχευση της κασπάσης-9 /ΡΡ2Α Αλληλεπίδραση ως πιθανά νέα Anti-Cancer Therapy. PLoS ONE 8 (4): e60816. doi: 10.1371 /journal.pone.0060816

Συντάκτης: Μινγκ Tan, Πανεπιστήμιο της Νότιας Αλαμπάμα, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 12 Οκτ του 2012? Αποδεκτές: 3 Μαρτίου του 2013? Δημοσιεύθηκε: 23 Απρ 2013

Copyright: © 2013 Arrouss et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς ευχαριστώ τον Inserm και Institut Curie για τη χρηματοδότηση. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η απόπτωση είναι μια γενετικά προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο και την απορρύθμιση του σχετίζεται, μεταξύ άλλων παθολογιών, με καρκίνους. Αρκετές φωσφατάσες έχουν γίνει πρόσφατα ελκυστικούς στόχους για τη θεραπεία μιας ποικιλίας ασθενειών, που περιλαμβάνουν καρκίνους [1], [2], [3], [4]. Εντούτοις, οι μόνες κλινικές φάρμακα που στοχεύουν μια φωσφατάση είναι ο ανοσοκατασταλτικά κυκλοσπορίνη Α και FK506, τα οποία αναστέλλουν σερίνης /θρεονίνης φωσφατάσης 2Β (καλσινευρίνης) και ενεργοποίηση ΝΡΑΤ [5], [6], [7], [8], [9]. Αλλά μακροχρόνια χρήση αυτών των φαρμάκων μπορεί να οδηγήσει σε ανεπιθύμητες παρενέργειες [10].

Το Ser /Thr φωσφατάσες ΡΡ1 και ΡΡ2Α έχουν ενοχοποιηθεί τόσο στην επαγωγή κυτταρικού θανάτου μέσω 1) αποφωσφορυλίωση Bad [11 ] και κασπάσης-9 [12] 2) διέγερση του κυτοχρώματος

γ

απελευθέρωσης [13], και 3) αποφωσφορυλίωση της πρωτείνης ρετινοβλαστώματος [14], [15]. Ωστόσο, αυτές οι φωσφατάσες ελέγχουν κυρίως το επίπεδο φωσφορυλίωσης του Bcl-2 και κασπάσης-9, το οποίο καθορίζει τις λειτουργικές τους ιδιότητες [16], [17], [18]. Αντιστρόφως, η αναστολή της ΡΡ1 [19], ΡΡ2Α [20], ή PP2C [21] πυροδοτεί τον κυτταρικό θάνατο, υποδεικνύοντας επίσης μια πιθανή αντι-αποπτωτική λειτουργία αυτών των φωσφατασών, και που δείχνουν προς μια πολύπλοκη αλληλεπίδραση των δράσεων φωσφατάση. Έχουμε προηγουμένως δείξει μία αλληλεπίδραση μεταξύ της κασπάσης-9 και PP1α. Σε αυτό το συγκρότημα, ενεργοποιημένα PP1α επάγει κασπάσης-9 αποφωσφορυλίωση, και κατά συνέπεια, η ενεργοποίηση της που οδηγούν σε απόπτωση [12]. Έχουμε εντοπιστεί σε αυτό το συγκρότημα, εκτός από PP1αactivity, ένα άλλο οκαδαϊκό οξύ ευαίσθητη ενζυματική δραστηριότητα συμβατή με μια δραστηριότητα ΡΡ2Α, υποδηλώνοντας μια πιθανή αλληλεπίδραση μεταξύ της κασπάσης-9 και ΡΡ2Α που μπορεί να εμπλέκονται στη ρύθμιση του κυτταρικού θανάτου.

κυττάρων διεισδυτική πεπτίδια (CPP) είναι μόρια τα οποία μπορεί να μετατοπίσει σε κύτταρα χωρίς να προκαλεί ζημιά μεμβράνη, με αποτέλεσμα την προτεινόμενη χρήση τους ως φορέων για τη χορήγηση θεραπευτικών φορτίου [22]. Αυτά τα πεπτίδια μπορούν να διαπεράσουν τη μεμβράνη και να φτάσει το κυτταρόπλασμα ή /και τον πυρήνα [23]. Χρησιμοποιώντας CPP, έχουμε επίσης αναφερθεί στο παρελθόν πειραματική απόδειξη ως απόδειξη της αρχής για την τεχνολογία φωσφατάση φάρμακο (DPT), [24], [25].

Σε αυτές τις βάσεις, αποφασίσαμε να αναλύσουμε αν η διαμόρφωση της ΡΡ2Α και κασπάσης-9 αλληλεπίδραση μπορεί να έχουν επίπτωση επί της διέγερσης των κυττάρων του όγκου deathing χωρίς να επηρεάζει τα υγιή κύτταρα, και απέδειξαν DPT-C9h και DPT-C9 που αντιστοιχούν στις θέσεις σύνδεσης μεταξύ ανθρώπου και ποντικού κασπάσης-9 και ΡΡ2Α αντίστοιχα, έχουν μια συγκεκριμένη αντι επίδραση -tumour.

Υλικά και Μέθοδοι

κύτταρα και καλλιέργεια

Ανθρώπινο Daudi, κυτταρικές σειρές Jurkat και HeLa καλλιεργήθηκαν σε RPMI συμπληρωμένο με 10% FCS. LKR10 και LKR13 έχουν περιγραφεί προηγουμένως [26] και καλλιεργήθηκαν σε RPMI συμπληρωμένο με 10% FCS. Οι ανθρώπινου καρκίνου του μαστού (BC), uveal μελάνωμα (UM), καρκίνο του πνεύμονα μη μικρών κυττάρων, και καρκίνο του πνεύμονα μικρών κυττάρων κυτταρικές σειρές έχουν απομονωθεί από πρωτογενή ανθρώπινα ξενομοσχεύματα καρκίνου [27], [28], [29]. Οι τρεις κυτταρικές σειρές UM έχουν απευθείας λαμβάνονται από ασθενείς. κυτταρικές γραμμές BC καλλιεργήθηκαν σε DMEM ή RPMI μέσο συμπληρωμένο με 10% έως 20% του FCS, εκτός από HBCx-15, το οποίο συμπληρώθηκε με 10% ορό αλόγου. κυτταρικές γραμμές UM και τον καρκίνο του πνεύμονα καλλιεργήθηκαν σε RPMI συμπληρωμένο με 10% ή 20% του FCS, αντίστοιχα. Οι κυτταρικές γραμμές BC και UM άμεσα απομονωθεί από το αντίστοιχο όγκο. Οι κυτταρικές σειρές Daudi, HeLa και Jurkat ελήφθησαν από τη συλλογή του Τμήματος.

Ανοσοκαταβύθιση και δυτικές

κηλίδα

Η ανοσοκατακρήμνιση και στύπωμα western πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [12]. Οι αντι-κασπάση 9, και αντι-ΡΡ2Α αντισώματα αγοράστηκαν από την Santa Cruz, Cell σηματοδότηση, Sigma ή Abcam. Το αντι-Tim 23 και αντι Cyt c ελήφθησαν από την Transduction Laboratories.

σύνθεσης πεπτιδίου και αλληλουχία

Τα πεπτίδια συντέθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [30].

Ανίχνευση απόπτωσης με Annexin χρώση

η απόπτωση ανιχνεύθηκε με χρώση Annexin V-FITC σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (BD Bioscience).

κασπάση-9 δραστηριότητα

κασπάση-9 δραστικότητα ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ κασπάση-Glo 9 (Promega) και ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

Serum συνδεδεμένη με ένζυμο ανοσορροφητική δοκιμασία (ορός ELISA)

δοκιμή ELISA πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [31], [ ,,,0],32].

μεμβράνης Miochondrial δυναμικό

δοκιμασία

Για την ανίχνευση των αλλαγών στο δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης, χρησιμοποιήσαμε το κινητό μετρητή JC-10 κιτ δοκιμασίας μετά την κατασκευάζει για συστάσεις.

κυτταρικού κύκλου ανάλυση

Ένα σύνολο 1 × 10

6 κύτταρα μονιμοποιήθηκαν σε 70% αιθανόλη για 1 ώρα σε 4 ° C. Τα κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν και πλύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα χρώσης (DPBS /2% FCS). Μετά την πλύση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 50 μΙ RNAse (1 mg /ml απόθεμα) και επωάστηκαν για 30 λεπτά στους 37 ° C. Τα κύτταρα χρωματίστηκαν με 5 μg του propodim ιωδιούχου για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Κυτταρικό περιεχόμενο DNA αναλύθηκε με FACS.

Η απομόνωση του κλάσματος μιτοχόνδρια

Ένα σύνολο των 40 × 10

6 κύτταρα πλύθηκαν με παγωμένο PBS. Σβώλος κυττάρων επαναιωρήθηκε σε 5 όγκους παγωμένου ρυθμιστικού διαλύματος Α (20 mM Hepes-ΚΟΗ, ρΗ 7.5, 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl

2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, 0,1 mM PMSF , 250 mM σακχαρόζη) συμπληρωμένο με αναστολείς πρωτεάσης. Τα κύτταρα διασπάσθηκαν σε ένα ομογενοποιητή Dounce, οι πυρήνες φυγοκεντρήθηκαν (1000xg, 10 λεπτά, 4 ° C), και το υπερκείμενο περαιτέρω φυγοκεντρήθηκε (10,000, 10 λεπτά, 4 ° C), το μιτοχονδριακό ίζημα επαναιωρήθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα Α και αποθηκεύεται στους -80 ° C.

Απομόνωση των κυτταρικών πληθυσμών

Φρέσκο ​​αίμα από υγιείς δότες που συλλέγονται από την Etablissement Francais du Sang. Η χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία (ΧΛΛ) δείγματα ελήφθησαν από το Αιματολογικό Υπηρεσία του νοσοκομείου Pitié Salpêtrière. Μονοπυρηνικά κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMC) απομονώθηκαν από ασθενείς ή σε υγιείς δότες διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% FCS, 1% μη απαραίτητα αμινοξέα, 1% HEPES, 1% πυροσταφυλικό νάτριο και 1% γλουταμίνη. Β κύτταρα απομονώθηκαν χρησιμοποιώντας Dynal αρνητικό κιτ απομόνωσης (Invitrogene). Η καθαρότητα των απομονωμένων κυττάρων έφθασε έως και 98%. Ανθρώπινα λεμφοκύτταρα απομονώθηκαν χρωματίστηκαν με αντι-hCD19-AP και πρώιμα γεγονότα απόπτωσης προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας αννεξίνη-V-FITC.

In vivo

μοντέλα πρωτογενούς ξενομοσχευμάτων ανθρώπινου όγκου

Οι πρωτογενείς ανθρώπινου καρκίνου του μαστού (BC) ξενομοσχεύματα ελήφθησαν όπως περιγράφεται προηγουμένως [27], [28] Mouse όγκους του καρκίνου του μαστού ελήφθησαν χρησιμοποιώντας το διαγονιδιακό

πολυώματος Μέση-T

μοντέλο ποντικού PyMT [33]. Αυθόρμητα αναπτυσσόμενη όγκων του μαστού συμβαίνουν σε διαγονιδιακά ποντίκια ξενο-μεταμόσχευσις σε

ποντίκια nude

ανοσοανεπάρκεια να επιτρέψει φαρμακολογικές εκτιμήσεις, και διατηρείται από το

nude

ποντίκι για να

nude

ποντίκι διόδων σειριακά.

ποντίκι πρωτοπαθούς πνευμονικής αδενοκαρκίνωμα μεταλλαχθεί για

K-ras

Η

Το K-ras

LA1 ποντίκια δόθηκαν από τα μοντέλα NCI ποντίκι των ανθρώπινων καρκίνων Consortium (MMHCC) (NCI ποντίκι Repository /NIH, Rockville, MD). Φέρνουν μια λανθάνουσα

K-ras

αλληλόμορφο με δύο αντίγραφα του εξόνιο 1: ο ένας ήταν ο άγριου τύπου και το άλλο το μεταλλαγμένο G12D (Tyler Jacks). Η λανθάνουσα αλληλόμορφο στοχαστικά ενεργοποιείται σε κύτταρα μέσω ομόλογου ανασυνδυασμού, η οποία οδηγεί στη διαγραφή του αντιγράφου άγριου τύπου του εξονίου 1 και την έκφραση μιας ογκογόνου μορφής του

K-ras

γονίδιο. Πολυεστιακή αδενοκαρκινώματα πνεύμονα αναπτύσσουν αυθόρμητα σε 100% αυτών των ποντικών.

Θεραπευτικές δοκιμασίες

Για θεραπευτική πειραματικές δοκιμασίες σε υποδόρια ξενομοσχεύματα μεταμοσχεύονται (πρωτογενείς ανθρώπινους όγκους και όγκους PyMT), 5- έως ηλικίας 8 εβδομάδων Swiss ηυ /ηυ θηλυκοί ποντικοί έλαβαν υποδόρια μόσχευμα θραυσμάτων όγκου με ένα όγκο περίπου 15 mm

3 όπως περιγράφεται προηγουμένως [29].

Για θεραπευτική πειραματικές δοκιμασίες σε K-ras

ποντίκια LA1 , 16-εβδομάδων ποντίκια τυχαιοποιήθηκαν μεταξύ ελέγχου (n = 17) ή ομάδα θεραπείας (n = 16) για 4 εβδομάδες. Οι ποντικοί ζυγίστηκαν μία φορά την εβδομάδα. Στο τέλος της θεραπείας, αυτοψία εκτελέστηκε για το εικονικό φάρμακο ή θεραπεία ομάδες και οι όγκοι του πνεύμονα μετρήθηκαν. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως αριθμός των όγκων /ποντικό, μέση ± SEM.

όγκος

όγκου υπολογίσθηκε μετρώντας δύο κάθετων διαμέτρων με δαγκάνες. Κάθε όγκος του όγκου (V) υπολογίστηκε σύμφωνα με τους ακόλουθους τύπους: V = axb

2/2, όπου α και b είναι η μεγαλύτερη και η μικρότερη διάμετρος κάθετα όγκου. Σχετική όγκος του όγκου (RTV) υπολογίστηκε από τον ακόλουθο τύπο: RTV = (Vx /V1), όπου Vx είναι ο όγκος του όγκου την ημέρα Χ και V1 είναι ο όγκος του όγκου κατά την έναρξη της θεραπείας (ημέρα 1) ελήφθησαν καμπύλες .Growth με τεταγμένη ο μέσος όγκος RTV στον άξονα Υ έναντι του χρόνου (άξονας Χ, που εκφράζεται ως ημέρα μετά την έναρξη της θεραπείας), δραστικότητα κατά του όγκου αξιολογήθηκε σύμφωνα με όγκο παρεμπόδιση της ανάπτυξης (TGI), υπολογίζονται σύμφωνα με τους ακόλουθους τύπους: τοις εκατό GI = 100 -. (RTVt /RTVC) × 100, όπου RTVt είναι το μέσο RTV των ποντικών που έλαβαν και RTVC είναι η διάμεσος RTV των ελέγχων, τόσο σε ένα δεδομένο χρονικό σημείο, όταν η αντικαρκινική δράση ήταν η βέλτιστη

DPT- C9h και DPT-C9 πεπτίδια αραιωμένα σε νερό /γλυκόζη (1 έως 25 mg /kg) χορηγήθηκαν με ενδοπεριτοναϊκή διαδρομή 5 έως 7 ημέρες την εβδομάδα, σύμφωνα με τα πρότυπα και τις θεραπευτικές χρονοδιαγράμματα.

δοκιμασίες βιοφωταύγεια

κυτταρική γραμμή HBCx-12Α καθορίστηκε από το ξενομόσχευμα HBCx-12Α και διατηρήθηκαν σε RPMI, συμπληρωμένο με 20% ορό εμβρύου μόσχου και πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη. Τα κύτταρα μετάγονται με την λεντοϊού υπερκείμενο που περιέχει λουσιφεράση [19] και Ds-Red και ένα σύνολο 1.9 × 10

6 κύτταρα που εκφράζουν Ds-RED-Luc εμφυτεύθηκαν υποδορίως σε

γυμνούς

ποντικούς. της ανάπτυξης του όγκου ήταν μέτρηση με παχύμετρο και οπτικής απεικόνισης.

απεικόνισης βιοφωταύγεια έγινε με το σύστημα IVIS απεικόνισης (IVIS100, δαγκάνα Life Sciences, USA). Αναισθητοποιημένοι ποντικοί ενέθηκαν ενδοπεριτοναϊκώς με λουσιφερίνη σε 150 mg /kg. χρόνος απόκτησης Imaging ήταν από 1 s έως 1 λεπτό, ανάλογα με το σήμα βιοφωτισμός. Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του λογισμικού V. Ζώντας Εικόνα 2.50 (δαγκάνα Life Sciences).

Στατιστική δοκιμές

Για

in vivo

αναλύσεις πειράματα, η στατιστική σημαντικότητα των διαφορών που παρατηρούνται μεταξύ των επιμέρους RTVs που αντιστοιχεί στην ομάδα των ποντικών που υπέστησαν αγωγή και της ομάδας ελέγχου, στην οποία έχουν συμπεριληφθεί 9-10 ποντικούς ανά ομάδα, υπολογίστηκαν με t δοκιμασία κατά ζεύγη του Student [29]. Για K-ras

ποντίκια L1 μοντέλο, χρησιμοποιούμε το τεστ Mann Whithney

Πεπτίδια ακολουθία

DPT-Sh1:. VKKKKIKREIKI

Γ9: YIETLDGILEQWARSEDL

C9h: YVETLDDIFEQWAHSEDL

DPT-C9h: VKKKKIKREIKI YVETLDDIFEQWAHSEDL

DPC-C9: VKKKKIKREIKI YIETLDGILEQWARSEDL

DPT-C9h Μουτ: VKKKKIKREIKI YVETLDDIFEQAAHSEDL

Όλα τα πεπτίδια διαλυτοποιήθηκαν σε αποστειρωμένο νερό.

το πειραματικό πρωτόκολλο και ζωικών κατοικιών ήταν σύμφωνα με τις οδηγίες του ιδρύματος, όπως προτείνεται από την Επιτροπή γαλλική Δεοντολογίας (συμφωνία B75-05-18, Γαλλία). Δεν επιτρέπεται χρειαζόταν για τη μελέτη αυτή. Όλες οι χειρουργικές επεμβάσεις διεξήχθη υπό πλήρη zylazine /κεταμίνη αναισθησία και όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία.

Όλοι οι ασθενείς είχαν προηγουμένως δοθεί εν επιγνώσει συναίνεσή τους για την πειραματική έρευνα σχετικά με τις επικουρικές ιστό του όγκου διαθέσιμη μετά histophatologic και κυτταρογενετικές αναλύσεις. Τα δείγματα CLL είναι καρκινικό κατάλοιπα και οι ασθενείς που έλαβαν εν επιγνώσει συναίνεσή τους. Αυτή η έρευνα δεν διεξήχθη έξω από τη χώρα μας. Οι ηθική επιτροπές εγκρίνουν αυτή τη διαδικασία.

Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση ή την προετοιμασία του χειρογράφου.

Αποτελέσματα

DPT -C9h μπλοκ πεπτιδίου της κασπάσης-9 /PP2Ac αλληλεπίδρασης σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού

Έχουμε ήδη καθοριστεί τη θέση σύνδεσης του ανθρώπου και ποντικού κασπάσης-9 σε ΡΡ2Α (δίπλωμα ευρεσιτεχνίας PCT-EP2010 /054134, web site: espacenet com ή worlwide.espacenet.com, για πεπτιδική αλληλουχία, βλέπε Υλικά και Μέθοδοι) και συνδέονται αυτήν την αλληλεπίδραση μοτίβο σε ένα διαπερατό κύτταρο μεταφοράς [24], [25]. Προκειμένου να στοχεύσει την αλληλεπίδραση /PP2Ac κασπάσης-9, αποφασίσαμε να χρησιμοποιήσουμε την κατοχυρωμένη πεπτίδιο που περιέχει την προηγουμένως δημοσιευθείσα σειρά διεισδύει σχετίζεται με την τοποθεσία αλληλεπίδρασης του ποντικού (DPT-C9) ή ανθρώπου (DPT-C9h) κασπάσης-9. Ως έλεγχοι, δημιουργήσαμε το λεωφορείο μόνος DPT-SH1, τα πεπτίδια C9 και C9h, το οποίο δεν περιείχε το λεωφορείο και το πεπτίδιο DPT-C9h mut, με μια μετάλλαξη στο κασπάσης-9 /αλληλουχία πρόσδεσης ΡΡ2Α και ότι δεν δεσμεύει ΡΡ2Α (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

ενδιέφερε πρώτα για την επιβεβαίωση ότι ο συγκεκριμένος στόχος του πεπτιδίου DPT-C9h ήταν το σύμπλοκο της κασπάσης-9 /ΡΡ2Α. Για το σκοπό αυτό, αναλύσαμε το αν το ανθρώπινο πεπτίδιο DPT-C9h wasable να στοχεύσετε το

in vivo

και

in vitro

κασπάσης-9 αλληλεπίδραση /ΡΡ2Α. Για

in vivo

ανταγωνισμό, προϊόντα λύσης από τον έλεγχο άνευ αγωγής ή DPT-C9h-κατεργασμένων κυττάρων HBCx-12Α ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντι-κασπάση-9 αντισώματος και της παρουσίας του κασπάσης 9-σύμπλοκο /ΡΡ2Α αναλύθηκε με western blot . Το Σχήμα 1Α δείχνει ότι η ποσότητα του συμπλόκου ανιχνεύεται σε DPT-C9h-επεξεργασμένα κύτταρα ήταν έντονα μειωμένη σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου. Για το

in vitro

ανίχνευση ανταγωνισμού, προϊόντα λύσης από HBCx-8 κύτταρα ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντίσωμα αντι-κασπάση-9 και η αλληλεπίδραση με ΡΡ2Α ανταγωνίστηκε με το πεπτίδιο DPT-C9h (Σχήμα 1Α). PP2Ac ανιχνεύθηκε σε έλεγχο της κασπάσης-9 ανοσοκαθιζήματα, ενώ ήταν σχεδόν μη ανιχνεύσιμη μετά ανταγωνισμό με 1,5 mM του πεπτιδίου DPT-C9h. Και στις δύο, (

in vitro

και

in vivo

διαγωνισμούς), σύμπλοκο κασπάσης-9 /ΡΡ2Α δεν επηρεάζεται από το λεωφορείο DPT-Sh1 (Εικόνα 1Β). Αυτό υποδηλώνει σαφώς ότι το πεπτίδιο DPT-C9h στοχεύει ειδικά την αλληλεπίδραση μεταξύ της ανθρώπινης κασπάσης-9 και PP2Ac.

Α)

In vivo

ανταγωνισμού της κασπάσης-9 /PP2Ainteraction. Ο καρκίνος του μαστού κυτταρική γραμμή HBCx-12A καλλιεργήθηκε για 24 ώρες παρουσία ή απουσία (έλεγχος) του DPT-C9h (100 μΜ)? κύτταρα λύθηκαν και κυτταροπλασματικά εκχυλίσματα ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντι-κασπάση-9 αντίσωμα και ανοσοστυπώθηκαν με αντι-PP2Ac και αντι-κασπάση-9 αντισώματα.

In vitro

ανταγωνισμού της αλληλεπίδρασης κασπάσης-9 /ΡΡ2Α. Κυτταροπλασματικά προϊόντα λύσης από κύτταρα HBCx-12Α ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντι-κασπάση-9 αντίσωμα? η κασπάση-9 αλληλεπίδραση /PP2Ac ανταγωνίστηκε

in vitro

με 1,5 mM του πεπτιδίου DPT-C9h για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου? ανοσοϊζήματα πλύθηκαν και ανοσοστυπώθηκαν με αντι-PP2Ac και αντι-κασπάση-9, το τελευταίο ως εσωτερικός έλεγχος της φόρτωσης πρωτεΐνης. Β) Η κυτταρική γραμμή HBCx-12A καλλιεργήθηκε με την παρουσία ή απουσία (έλεγχος) του φορείου DPT-Sh1 (100 μΜ) για 24 ώρες και το

in vitro

και

in vivo

ανταγωνισμός της κασπάσης-9 αλληλεπίδραση /ΡΡ2Α αναλύθηκε ως ανωτέρω.

η

Τα πεπτίδια διεισδυτικό DPT-C9 και DPT-C9h επάγουν ειδική για το είδος της απόπτωσης

Αναλύσαμε την ικανότητα του δύο διεισδυτική πεπτίδια DPT-C9h και DPT-C9, καθώς και οι αρνητικές πεπτίδια ελέγχου C9, C9h και DPT-Sh1 να επάγει απόπτωση. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α, DPT-C9h απόπτωση, όπως ανιχνεύεται με χρώση Annexin-V σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές Daudi, Jurkat, και HeLa κατόπιν 20 ώρες της αγωγής, ενώ τα πεπτίδια C9 και C9h χωρίς σαΐτα και της σαΐτας και μόνο, δεν το έκανε διεγείρουν απόπτωση σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές. Ομοίως, το πεπτίδιο DPT-C9h δεν είχε καμία αποπτωτική επίδραση επί της κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα ποντικού LKR10 και LKR13, ενώ το πεπτίδιο DPT-C9, ειδικά για κασπάση-9 ποντικού, προκαλούμενη από απόπτωση σε δύο κυτταρικές σειρές κατόπιν 24 ώρες της θεραπείας ( Σχήμα 2Β). Επιπλέον, δεν παρατηρήσαμε κανένα αποπτωτικό αποτέλεσμα κατά την κατεργασία των κυτταρικών σειρών με το φορείο (Σχήμα 2Β). Το βασικό επίπεδο απόπτωσης σε μη κατεργασμένα κύτταρα ελέγχου δεικνύεται επίσης. Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν σθεναρά την εξειδίκευση είδους για τα δύο πεπτίδια DPT-C9 και DPT-C9h.

Α) κυτταρικές σειρές Daudi, Jurkat, και HeLa καλλιεργήθηκαν παρουσία DPT-C9h, DPT-Sh1, C9h, ή C9 πεπτίδια για 20 ώρες σε 100 μΜ και η απόπτωση εκτιμήθηκε με χρώση Annexin-V. Β) Καρκίνος του πνεύμονα Mouse κυτταρικές σειρές LKR10 και LKR13 καλλιεργήθηκαν παρουσία DPT-C9h, DPT-C9, ή DPT-Sh1 στα 100 μΜ. Μετά από 24 ώρες επώασης, η απόπτωση εκτιμήθηκε με χρώση Annexin. Το βασικό επίπεδο απόπτωσης ελέγχου μη-κατεργασμένα κύτταρα δείχνεται. Ρ τιμές παρουσιάζονται επίσης (* & lt? 0,05? ** & lt? 0.001? *** & lt? 0,0001). Γ) Μαστού, ραγοειδούς μελανώματος και καρκίνου του πνεύμονα κυτταρικές σειρές που απομονώνονται από πρωτογενή ανθρώπινα xenografs καλλιεργήθηκαν παρουσία ή απουσία πεπτιδίου DPT-C9h (100 μΜ) για 24 ώρες και η απόπτωση εκτιμήθηκε με Annexin V-FITC. Βασικό επίπεδο απόπτωσης χωρίς προσθήκη πεπτιδίου φαίνεται (γκρι χρώμα) είναι σ τιμές που εμφανίζονται. ΡΕ). Μαστού καρκινικές κυτταρικές σειρές που προέρχονται από τα πρωτογενή ανθρώπινα ξενομοσχεύματα, επωάστηκαν με C9h σε μέσο καλλιέργειας στα 150 μΜ και επαγωγή απόπτωσης εκτιμήθηκε σε διαφορετικούς χρόνους. Ε) Ο καρκίνος του μαστού κυτταρικές σειρές που απομονώθηκαν από πρωτογενή ανθρώπινα ξενομοσχεύματα BCX-3 και BCX-12 καλλιεργήθηκαν παρουσία ή απουσία (έλεγχος) του πεπτιδίου DPT-C9h για 24 ώρες και η απόπτωση εκτιμήθηκε.

Η

Χρησιμοποιώντας τις κυτταρικές γραμμές ανθρώπινου μαστού, uveal μελάνωμα, μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα και καρκίνο του πνεύμονα μικρών κυττάρων που λαμβάνονται από πρωτογενή μοντέλα ξενομοσχεύματος ανθρώπινου, ελέγξαμε την αποπτωτική δράση και των δύο πεπτιδίων DPT-C9h και C9h. Η απόπτωση αναλύθηκε επίσης σε εμπορικές κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού. Σε όλες τις κυτταρικές σειρές που αναλύθηκαν, DPT-C9h απόπτωση, κυμαινόμενη από 20 έως 75% κατά 24 ώρες καλλιέργειας (Σχ 2C), ενώ καμία επίδραση δεν παρατηρήθηκε μετά την αγωγή C9h του καρκίνου του μαστού κυτταρικές γραμμές (Σχήμα 2D). Η απόπτωση των ελέγχου μη-κατεργασμένα κύτταρα κυμαίνονταν από 3 έως 8%. Συμπληρωματική προσθήκη DPT-C9h πεπτίδιο 27h μετά την αρχική θεραπεία αύξησε σημαντικά το επίπεδο απόπτωσης (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Το σχήμα 2Ε δείχνει δύο αντιπροσωπευτικά οικόπεδα απόπτωση histogramme των δύο κυτταρικών σειρών που απομονώνονται από το ξενομόσχευμα καρκίνου του μαστού του ανθρώπου HBCx-3 και μοντέλα HBCx-12A αγωγή 24 ώρες με ή χωρίς (μάρτυρας) DPT-C9h πεπτιδίου. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν μια ισχυρή

in vitro

καταπολέμησης των όγκων του πεπτιδίου DPT-C9h σε διάφορες ανθρώπινες κυτταρικές σειρές.

Η αναστολή της δραστηριότητας της κασπάσης μπλοκ αποπτωτικό αποτέλεσμα DPT-C9h

Δεδομένου ότι εκκινητή κασπάσης-9 είναι ένας σημαντικός μεσολαβητής της απόπτωσης, αναλύσαμε την ικανότητα του DPT-C9h για την ενεργοποίηση της κασπάσης-9 στην κυτταρική σειρά ανθρώπινου καρκίνου του μαστού HBCx5. Τα κύτταρα επωάστηκαν με το πεπτίδιο και δραστικότητα κασπάσης-9 εκτιμήθηκε σε διαφορετικούς χρόνους. Έχουμε παρατηρήσει μια αύξηση της δραστικότητας κασπάσης-9 σε DPT-C9h αγωγή κυτταρική γραμμή (Σχήμα 3Α). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν με τη χρήση κυτταρικών σειρών του μελανώματος του χοριοειδούς χιτώνα και μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επιπλέον, με τη χρήση του αναστολέα της κασπάσης Ζ-VAD, παρατηρήσαμε μία μείωση στην δραστηριότητα της κασπάσης-9.

Α) HBCx-3 κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 3 ή 6 ώρες με μέσο (έλεγχος), 100 μΜ DPT- C9h ή 10 μΜ του αναστολέα κασπάσης Ζ-VAD (προ επώαση 1 ώρας) και 100 μΜ του DPT-C9h. δραστικότητα κασπάσης-9 υπολογίστηκε με χρήση φωτογονικό υπόστρωμα. Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύονται σε σχέση με τον έλεγχο της μη-επεξεργασμένα κύτταρα ως αυθαίρετες μονάδες. Οι τιμές P εμφανίζονται. Β) HBCx-3 κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες με μέσο (έλεγχος), DPT-Sh1 (100 μΜ), DPT-C9h (100 μΜ) ή Ζ-VAD (10 μΜ, προ επώαση 1 ώρας) και DPT-C9h ( 100 μΜ). Η απόπτωση εκτιμήθηκε με δέσμευση αννεξίνης-ν-ΡΙΤΟ. C) HBCx-3 κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία για διάφορες χρονικές περιόδους με DPT-C9h (100 μΜ) και στη συνέχεια επωάστηκαν για 30 λεπτά στους 37 ° C προστατευμένο από το φως με το φθορίζοντα ανιχνευτή JC-10. μετρήθηκαν πράσινο και κόκκινο φθορισμό. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύονται σχέση με τον έλεγχο μη-κατεργασμένα κύτταρα. Οι τιμές P εμφανίζονται. Δ) HBCx-12Α και HBCx-3 κυτταρικές γραμμές υποβλήθηκαν σε θεραπεία για 24 ώρες με 100 μΜ DPT-C9 h. Μιτοχονδριακό κλάσμα διαχωρίζεται από λύματα ολόκληρων κυττάρων και ανοσοαποτύπωση για το κυτόχρωμα

γ

. Η Παγκόσμια Τράπεζα επίσης σε υβριδισμό με το μιτοχονδριακό δείκτη Tim23 ως εσωτερικού ελέγχου της πρωτεΐνης φόρτωσης. Ε) HBCx-3 κύτταρα ήταν μη επεξεργασμένο (μάρτυρας) ή κατεργασία με 10 ή 25 μΜ DPT-C9h για 24 ή 48 ώρες και ο κυτταρικός κύκλος αναλύθηκε με FACS.

Η

Για να καθοριστεί εάν ενεργοποιημένης κασπάσης-9 εμπλέκεται στην αποπτωτική δράση του DPT-C9h, αναλύσαμε την επίδραση του αναστολέα κασπάσες Z-VAD στην κυτταρική απόπτωση ανιχνεύθηκε με δέσμευσης αννεξίνης-ν-ΡΙΤΟ. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Β, ο αναστολέας κασπάσης μειώνει σημαντικά την απόπτωση που επάγεται από το πεπτίδιο. Κατεργασία των κυττάρων με το λεωφορείο ή τον αναστολέα από μόνη της δεν διεγείρει απόπτωση (Σχήμα 3Β).

DPT-C9h επάγει μιτοχονδριακή αποπόλωση της μεμβράνης και κυτόχρωμα

γ

αποδέσμευσης χωρίς να επηρεάζει τον κυτταρικό κύκλο

για να χαρακτηριστεί DPT-C9h απόπτωση, διερευνήσαμε τη συμμετοχή των μιτοχονδρίων. Σε μία δοκιμασία με βάση φθορισμό, η έκθεση των HBCx-5 κύτταρα με το πεπτίδιο προκάλεσε μία αξιοσημείωτη μείωση του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης (Σχήμα 3C). Για να επιβεβαιώσετε το ρόλο των μιτοχονδρίων στην DPT-C9h απόπτωση, αναλύσαμε εάν η θεραπεία DPT-C9h που προκαλείται από το κυτόχρωμα

γ

απελευθέρωση. Χρησιμοποιώντας μιτοχονδριακών πρωτεϊνών από τον έλεγχο μη-επεξεργασμένα ή κύτταρα πεπτίδιο-αγωγή, παρατηρήσαμε την απελευθέρωση του κυτοχρώματος

γ

από τα μιτοχόνδρια στο DPT-C9h επεξεργασμένα κύτταρα ενώ στα μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου, το κυτόχρωμα

γ

διατηρείται στο μιτοχονδριακό κλάσμα (Εικ 3D). Η αναλογία του κυτοχρώματος

γ

/Tim 23 χρησιμοποιείται ως εσωτερικός έλεγχος για ομαλοποίηση και ποσοτικός προσδιορισμός του ποσού της απελευθερωμένης Cyt

γ.

Τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώνουν την μιτοχονδριακή εμπλοκή σε DPT-C9h απόπτωση .

Τέλος, αναλύσαμε εάν DPT-C9h πεπτίδιο θα μπορούσε να παρέμβει στην ακολουθία του κυτταρικού κύκλου. Τα κύτταρα ήταν μη επεξεργασμένο (μάρτυρας) ή επεξεργασμένα με διαφορετικές δόσεις πεπτιδίου για διάφορες χρονικές περιόδους και διανομή του κυτταρικού κύκλου αναλύθηκε (Σχ 3Ε). Χρησιμοποιώντας

in vitro

υπο-αποπτωτική δόση πεπτιδίου, δείξαμε ότι DPT-C9h δεν προκάλεσε συσσώρευση των κυττάρων όγκου σε κάθε φάση του κυτταρικού κύκλου, ανεξαρτήτως του χρησιμοποιούμενου συγκέντρωση και το χρόνο που αναλύθηκαν (Σχήμα 3Ε).

DPT-C9h έχει επίδραση στα κύτταρα των όγκων, αλλά όχι σε υγιή κύτταρα

η χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία (ΧΛΛ) χαρακτηρίζεται από τη συσσώρευση των μονοκλωνικών Β κύτταρα CD5 + σε αιμοποιητικά όργανα, η οποία αντανακλά ένα ελάττωμα στην απόπτωση. Προκειμένου να αξιολογηθεί η αποπτωτική επίδραση του πεπτιδίου DPT-C9h σε πρωτογενείς υγιή και καρκινικά κύτταρα παρόμοιας προέλευσης, χρησιμοποιήσαμε μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMC) από υγιείς δότες και ασθενείς με χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία (CLL). PBMC από υγιείς δότες ή ασθενείς με CLL υποβλήθηκαν σε αγωγή για 3 ώρες με το πεπτίδιο DPT-C9h, πλύθηκαν, επαναιωρήθηκαν σε πλήρες μέσο χωρίς πεπτίδιο για 6 ώρες και στη συνέχεια αναλύθηκαν για απόπτωση. Το σχήμα 4Α δείχνει ότι DPT-C9h έχει αποπτωτική επίδραση επί των Β κυττάρων από ασθενείς με CLL αλλά όχι σε Β κύτταρα από υγιείς δότες σε σχέση με τον έλεγχο μη επεξεργασμένα κύτταρα. DPT-C9h δεν έχει καμία επίδραση στην Τ, ΝΚ και μονοκύτταρα από υγιείς δότες ή ασθενείς με ΧΛΛ. Η σαΐτα DPT-Sh1 ή C9h πεπτίδια μόνος δεν είχε καμία επίδραση (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Τέλος, ένα παρόμοιο προ-αποπτωτικό αποτέλεσμα του πεπτιδίου DPT-C9h παρατηρήθηκε όταν Β κύτταρα απομονώθηκαν από μυελό των οστών των ασθενών με CLL (Σχήμα 4Β). Αυτό το αποτέλεσμα υποδηλώνει σαφώς ότι μόνο τα καρκινικά κύτταρα Β επηρεαστεί από τη θεραπεία DPT-C9h χωρίς καμία επίδραση στα κύτταρα από υγιείς δότες, υπογραμμίζοντας την ειδική επίδραση των όγκων του DPT-C9h.

Α) μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMC) από υγιείς δότες ή ασθενείς με CLL καλλιεργήθηκαν παρουσία DPT-C9h (150 μΜ) για 3 ώρες, στη συνέχεια πλένονται, μεταφέρονται σε πλήρες μέσο και την απόπτωση εκτιμήθηκε 6h αργότερα. Η επιλογή των Β κυττάρων έγινε με αντι-CD19 αντίσωμα πριν από τη χρώση αννεξίνης V-FITC. Μη επεξεργασμένα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος. Β) κύτταρα που απομονώνονται από το μυελό των οστών των ασθενών με CLL και υγιείς δότες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως στο Α και αναλύθηκαν για απόπτωση. Οι τιμές P φαίνονται.

Η

Η έλλειψη του ανοσοποιητικού δραστηριότητας και

in vivo

τοξικότητα του DPT-C9h και DPT-C9 πεπτίδια

Δεδομένου ότι οι τελικές ενδιαφέρον μας είναι να να αποδειχθεί μια επίδραση κατά του όγκου του DPT-C9h επί ανθρώπινων καρκίνων, αποφασίσαμε να αναλύσουμε το

in vivo

ανοσογονική δραστικότητα του πεπτιδίου.

Γυμνά ποντίκια Τ-κυττάρων

ανοσοανεπαρκείς υπέστησαν αγωγή πέντε ημέρες την εβδομάδα κατά τη διάρκεια 6 εβδομάδες με ενδοπεριτοναϊκές ενέσεις DPT-C9h. Οι οροί συλλέχθηκαν σε διαφορετικούς χρόνους και η παραγωγή των αντισωμάτων που κατευθύνονται έναντι DPT-C9h ή DPT-Sh1 αναλύθηκε. Χρησιμοποιώντας δοκιμή ELISA, δεν ανιχνεύουν οποιαδήποτε των αντισωμάτων έναντι DPT-C9h ή DPT-Sh1 όλη την κινητική αναλύθηκε σε δύο διαφορετικές δόσεις πεπτιδίου (Εικόνα 5Α). Ομοίως, η απόκριση αντισώματος αναλύθηκε επίσης με βάση ανοσοεπαρκή ποντίκια, δείχνοντας και πάλι η έλλειψη παραγωγής αντισωμάτων ούτε κατά DPT-C9h ούτε DPT-Sh1 πεπτίδια (Σχήμα 5Β). Αυτό το αποτέλεσμα υποδηλώνει σαφώς ότι το πεπτίδιο DPT-C9h είναι ανοσογόνος ακόμη και μετά από παρατεταμένη

in vivo

χορήγηση σε ανοσοεπαρκείς ή immunodefficient ποντίκι μοντέλα.

αντισώματα Α) ορού που λαμβάνονται από γυμνούς ποντικούς δεχθέντες αγωγή για διαφορετικές περιόδους χρόνος ανιχνεύθηκαν με ELISA σε δύο διαφορετικές συγκεντρώσεις πεπτιδίου DPT-C9h (10 και 50 μΜ). αντισώματα Β) Ορός από ποντικούς άγριου τύπου θεραπεία για διαφορετικές περιόδους για χρονικό διάστημα δοκιμάστηκαν με ELISA έναντι DPT-C9h και DPT-Sh1 (50 μΜ). C) DPT-C9h χορηγήθηκε ενδοπεριτοναϊκώς σε ποντικούς που φέρουν όγκους HBCx-12Α σε 1, 5, ή 25 mg /kg μία φορά την ημέρα για 5 εβδομάδες? Η διάμεση βάρος των ποντικών για κάθε πειραματική ομάδα εκπροσωπείται σε διαφορετικούς χρόνους. Ένα σύνολο από 10 ποντικούς συμπεριλήφθηκαν ανά ομάδα. Παρομοίως, DPT-C9h χορηγήθηκε ενδοπεριτοναϊκώς σε ποντικούς που φέρουν όγκους HBCx-8 στα 10 mg /kg δύο φορές ημερησίως για 4 εβδομάδες. DPT-C9 ήταν IP χορηγείται σε ποντίκια μοντέλο μοντέλο PyMT σε δόση 5 mg /kg. Το διάμεσο βάρος των ποντικών για κάθε πειραματική ομάδα εκπροσωπείται σε διαφορετικούς χρόνους. Δέκα ποντίκια συμπεριλήφθηκαν ανά ομάδα.

Η

Πριν από

in vivo

θεραπευτική αξιολόγηση, η τοξικότητα της DPT-C9h αξιολογήθηκε σε ποντίκια που φέρουν HBCx-8 και HBCx-12Α όγκους μετά από διάφορα προγράμματα χορήγησης, δηλαδή ενδοπεριτοναϊκές ενέσεις στα 1, 5, ή 25 mg /kg μία φορά την ημέρα, ή 10 mg /kg δύο φορές την ημέρα, για 4 έως 5 εβδομάδες. Όποια και αν είναι η δόση, δεν παρατηρήθηκαν παρενέργειες σε όλα τα ποντίκια έλαβαν, καθώς και μια πλήρη σταθερότητα βάρους των επεξεργασμένων ποντικών (Σχήμα 5C). Επιπλέον, κανένας θάνατος παρατηρήθηκε σε όλο το πείραμα. Τέλος, για να επιβεβαιωθεί η απουσία τοξικότητας του ειδικού πεπτιδίου ποντίκι, αξιολογήσαμε την ανοχή του πεπτιδίου DPT-C9 χορηγείται σε 5 mg /kg μία φορά την ημέρα στο διαγονιδιακό

πολυώματος Μέση-T

Ποντικοί PyMT (Σχ 5C) . Σε όλα τα πειράματα, δεν παρατηρήθηκαν ανεπιθύμητες ενέργειες, συμπεριλαμβανομένης της απώλειας βάρους.

DPT-C9h και DPT-C9 προκαλέσουν

in vivo

ανάπτυξη του όγκου αναστολή στον πνεύμονα και τον καρκίνο του μαστού μοντέλα

Για την πρώτη επιβεβαίωση το

in vivo

επαγωγή συγκεκριμένα είδη απόπτωση, αξιολογήσαμε την αποτελεσματικότητα του πεπτιδίου DPT-C9 στο ras K-

μοντέλο LA1 αδενοκαρκινώματος ποντικού και σε διαγονιδιακά

Πολύομα Μέση -Τ

Ποντίκια (PyMT). Χορηγήθηκαν ενδοπεριτοναϊκώς σε μία δόση των 5 mg /kg για 5 ημέρες /7 για 4 εβδομάδες, DTC-C9 προκάλεσε μια σημαντική μείωση στο φορτίο όγκου πνεύμονα ως ο αριθμός των όγκων ανά ποντικό ήταν 24,6 ± 2,8 (μέση τιμή ± SEM) στην ομάδα του εικονικού φαρμάκου σε σύγκριση με 15,4 ± 1,9 στην ομάδα θεραπείας (ρ = 0,01) (Εικ 6Α). Το Σχήμα 6Β δείχνει την ιστολογική ανάλυση του ιστού των πνευμόνων ελέγχου και DPT-C9h αγωγή εκπρόσωπος ποντικούς. Επιπλέον,

Nude

ποντικούς που φέρουν ξενομόσχευμα όγκων του μαστού PyMT ποντικού υποβλήθηκαν σε αγωγή ενδοπεριτοναϊκώς με το DPT-C9 πεπτίδιο ποντικού-ειδική σε ημερήσια δόση των 5 mg /kg. Παρά την ανάπτυξη πολύ γρήγορα αυθόρμητα όγκου, DPT-C9 προκάλεσε μια σημαντική TGI του 46% (p & lt? 0,03) (Σχήμα 6C). Ο όγκος σχετική όγκου (RTV) υπολογίστηκε όπως περιγράφεται λεπτομερώς στο Υλικά και Μέθοδοι.

Α) Το πεπτίδιο DPT-C9 χορηγήθηκε ΙΡ σε 5 mg /kg μία φορά την ημέρα, 5 ημέρες την εβδομάδα για 4 εβδομάδες σε K-RAS

LA1 αδενοκαρκινώματος μοντέλο ποντικού, που δείχνει μια σημαντική μείωση στο φορτίο όγκου πνεύμονα σε σύγκριση με τον έλεγχο διαμόρφωση ποντικούς υπό αγωγή με όχημα (ρ = 0.01). Β) Η ιστολογική ανάλυση των όγκων του πνεύμονα του ελέγχου έλαβαν μόνο με την διαμόρφωση του οχήματος και DPT-C9 υποστεί αγωγή ποντικούς. C) DPT-C9 χορηγήθηκε ΙΡ όπως και για την Κ-Ras

μοντέλο LA1 σε ποντικούς που φέρουν ξενομόσχευμα όγκων του μαστού PyMT ποντίκι, με σημαντική TGI από 46% μετά από 11 ημέρες θεραπείας σε σύγκριση με τους ποντικούς ελέγχου που έλαβαν θεραπεία με την διαμόρφωση του οχήματος.