Αφηρημένο

Polycomb Κατασταλτικά Συγκρότημα 2 (PRC2) είναι μια επιγενετική ρυθμιστής που προκαλείται σε πολλούς καρκίνους. Θεωρείται ότι το αυτοκίνητο ογκογένεση από την καταστολή διαίρεση, βλαστική ικανότητα και /ή αναπτυξιακές ρυθμιστές. Καρκίνοι αποφύγει το ανοσοποιητικό ανίχνευση, και ποικίλες ανοσοποιητικό ρυθμιστές ενόχλησή σε διαφορετικούς όγκους. Δεν είναι σαφές πώς τέτοια συντονίζονται κυττάρου-ειδικά εφέ. Εδώ, δείχνουμε μια βαθιά και τον καρκίνο-επιλεκτική ρόλο για PRC2 στην καταστολή πολλαπλές οδούς κυτοκινών. Θεωρούμε ότι PRC2 καταστέλλει εκατοντάδες ΙΡΝγ διεγείρονται γονίδια (ISGs), κυτοκίνες και υποδοχείς κυτοκίνης. Αυτό το ρεπερτόριο στόχος διευρυνθεί σημαντικά το καρκίνο vs μη καρκινικά κύτταρα, και διακρίνεται σε διάφορους τύπους καρκίνου. PRC2 είναι συνεπώς μια υψηλότερη ρυθμιστής τάξης του ανοσοποιητικού προγράμματος σε καρκινικά κύτταρα. Αναστέλλοντας PRC2 είτε με αναστολείς RNAi ή ΕΖΗ2 ενεργοποιεί υποκινητές υποδοχέων κυτοκινών /κυτοκίνης που σημειώνονται με δισθενή χρωματίνης H3K27me3 /H3K4me3, και αυξάνει την ανταπόκριση σε διάφορες ανοσοποιητικό σήματα. PRC2 διασώσεις αναστολή ανοσοποιητικό επαγωγή του γονιδίου ακόμη και εν απουσία του SWI /SNF, ένα ογκοκατασταλτικό ελαττωματικό σε ~ 20% των ανθρώπινων καρκίνων. Αυτή η λειτουργία μυθιστόρημα PRC2 στα καρκινικά κύτταρα θα μπορούσε να επηρεάσει βαθιά το μηχανισμό δράσης και την αποτελεσματικότητα των αναστολέων ΕΖΗ2 στη θεραπεία του καρκίνου

Παράθεση:. Abou El Hassan Μ, Huang Κ, Eswara MBK, Zhao Μ, Τραγούδι L, Yu Τ , et al. (2015) Τα καρκινικά κύτταρα Κακόβουλες PRC2 να τροποποιήσουν πολλαπλές κυτταροκινών Pathways. PLoS ONE 10 (6): e0126466. doi: 10.1371 /journal.pone.0126466

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Srikumar Π Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center & amp? Research Institute, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 29η Δεκεμβρίου του 2014? Αποδεκτές: 3 Απρ 2015? Δημοσιεύθηκε: 1 Ιούν 2015

Copyright: © 2015 Abou El Hassan et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι διαθέσιμα από την βάση δεδομένων GEO, υπό τον αριθμό πρόσβασης GSE67766. Αυτό είναι ένας αριθμός superseries, και μέσα σε αυτό το σύνολο δεδομένων υπάρχουν μεμονωμένα αρχεία για όλες τις μικροσυστοιχιών, Chip-chip, και όλα τα στοιχεία RNAseq

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από τον RB: 703079 Καναδική Εταιρεία Καρκίνου (http: //www.cancer.ca/research), RB: MOP 74570 καναδικό Ινστιτούτο Έρευνας Υγείας (https://www.cihr-irsc.gc.ca/e/193.html), RB: KF12-02 Ίδρυμα Krembil (http : //www.krembilfoundation.ca/), JJ: R01GM103893 Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας (ΗΠΑ) ΝΙΗ (https://www.nih.gov/)

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα.

Εισαγωγή

Τα καρκινικά κύτταρα χρησιμοποιούν διάφορες στρατηγικές για να αποφύγει το ανοσοποιητικό σύστημα, συμπεριλαμβανομένης της ρύθμισης των κυτοκινών ή άλλων εκκρίνονται παράγοντες /υποδοχέων που ελέγχουν την ανοσολογική απόκριση [1]. Αξίζει να σημειωθεί ότι, το είδος, τη θέση και το βαθμό του ανοσοποιητικού διηθήματος σε έναν όγκο (η «Immunoscore») προβλέψουμε το αποτέλεσμα καλύτερο από ένα πλήθος παραδοσιακά χρησιμοποιούνται όγκου-centric παραμέτρους παθολογία, όπως είναι ο βαθμός του όγκου [2]. Οι παράγοντες που ελέγχουν το ανοσοποιητικό επιτήρησης ποικίλλουν συμφραζόμενα και οι λεπτομέρειες είναι περίπλοκες, διότι πράκτορες που προωθούν το ανοσοποιητικό κάθαρση σε μία κατάσταση προωθήσει ανοσοκαταστολή σε ένα άλλο (αναθεωρηθούν [3]). Μια ελκυστική ιδέα είναι ότι οι όγκοι θα μπορούσαν να χρησιμοποιούν ένα κοινό μηχανισμό για να χειραγωγήσουν την έκφραση του ανοσοποιητικού ρυθμιστικές αρχές, και ότι κάθε όγκου προσαρμόζει τη στρατηγική αυτή να ανταποκρίνεται στις προσωπικές τους περιβάλλον. Διαταράσσοντας ένα τέτοιο υψηλότερο κανονιστικό επίπεδο δικτύου θα μπορούσε να παρέχει μια γενική στρατηγική για την αύξηση του ανοσοποιητικού ανίχνευσης και εκκαθάρισης των πολλών μορφών καρκίνου. Ωστόσο, οι μηχανισμοί που ελέγχουν τη μυριάδα των γονιδίων του ανοσιακού συστήματος που επηρεάζουν την επιτήρηση δεν είναι καλά κατανοητοί.

Polycomb Κατασταλτικά Συγκρότημα 2 (PRC2) είναι η επιγενετική ρυθμιστή που οι καταθέσεις λυσίνη 27 (H3K27me3) τα σήματα τα κατασταλτικά της ιστόνης Η3 στην χρωματίνης. Δύο από τα βασικά συστατικά της περιλαμβάνουν την καταλυτική υπομονάδα ΕΖΗ2, και SUZ12, την πρωτεΐνη ικρίωμα που απαιτείται για την σταθερότητα του συμπλόκου [4]. PRC2 είναι μέρος της οικογένειας Polycomb των ρυθμιστικών αρχών που την αντιμετώπιση των θετικών μεταγραφική επιπτώσεις των μελών της οικογένειας Trithorax κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης, όπως το σύμπλεγμα αναδιαμόρφωσης χρωματίνης SWI /SNF [5]. PRC2, η οποία συχνά υπερεκφράζεται στον καρκίνο, θεωρείται ότι προάγει την ογκογένεση μέσω της ρύθμισης του κυτταρικού κύκλου, την αντιγραφή του DNA, την επιβίωση, τη γήρανση και /ή βλαστική ικανότητα [5-7]. Αν και σε ποιο βαθμό PRC2 θα μπορούσε να επηρεάσει το ανοσοποιητικό σύστημα σε όγκους δεν είναι σαφής.

Προηγουμένως, εμείς και άλλοι έδειξαν ότι BRG1, ο κινητήρας ΑΤΡ που οδηγεί SWI /SNF, απαιτείται για την ανταπόκριση της ΙΡΝγ διεγείρονται γονίδια (ISGs ) [8-11]. Στο

CIITA

τόπο, διαπιστώσαμε ότι BRG1 συντονίζει τη δράση πολλών άπω ενισχυτές. Ωστόσο, παρά το γεγονός ότι είναι ουσιώδη κατά την ενδογενή τόπο και ένα μεγάλο 190 kb δημοσιογράφος, BRG1 είναι διαθέσιμο και για ΙΡΝγ επαγωγή της μικρής

CIITA

δημοσιογράφους, που οδηγεί στην ιδέα ότι μπορεί να μετριάσει τις επιπτώσεις ενός απομακρυσμένου καταστολέα. Σε πρόσφατη εργασία, παράλληλα με την παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι PRC2 και H3K27me3 διακοσμήσετε το

CIITA

τόπο, τόσο σε υποκινητή και μεταξύ απομακρυσμένων ενισχυτές [12]. Αφαίρεση PRC2 μετριαστεί η απαίτηση για BRG1, και έτοιμη μια απομακρυσμένη -50 kb ενισχυτή, ακριβώς όπως φαίνεται με BRG1. Έχουμε αναρωτηθεί αν αυτός ο ανταγωνισμός μεταξύ BRG1 και PRC2 θα μπορούσε να επεκταθεί σε άλλους στόχους ΙΡΝγ. ΙΡΝγ παίζει ζωτικό ρόλο στο ανοσοποιητικό επιτήρησης [13-20]. Το 20% των ανθρώπινων καρκίνων στερούνται λειτουργικών SWI /SNF [21], και αυτό το ελάττωμα ή πάνω ρύθμιση του PRC2 θα μπορούσε να παρέχει ένα γενικό μηχανισμό για την ανοσολογική διαφυγή στον καρκίνο. Επιπλέον, η στόχευση των PRC2 σε διαφορετικές θέσεις θα μπορούσαν να βοηθήσουν sculpt το ειδικό ανοσοποιητικό πρόγραμμα που απαιτείται σε διαφορετικές μορφές καρκίνου.

Εδώ, δείχνουμε ότι PRC2 έχει ένα ευρύ ρόλο στην καταστολή ISGs, και απροσδόκητα ότι έχει επίσης μια δραματική και τον καρκίνο εκλεκτικό ρόλο στη ρύθμιση πολλών άλλων οδών κυτοκίνης. Αναστέλλοντας PRC2 με RNAi ή αναστολείς μικρού μορίου ΕΖΗ2 επανενεργοποιηθεί ISG ανταπόκριση, ακόμη και σε SWI /SNF ανεπάρκεια καρκινικά κύτταρα. Επιπλέον, εκτεταμένη ανάλυση RNAseq αποκάλυψε ότι διαταράσσουν PRC2 ενεργοποιεί πολλαπλές οδούς κυτοκινών και υποδοχέων κυτοκινών. Η λειτουργία αυτή διευρύνθηκε σημαντικά στον καρκίνο του

vs

. μη-καρκινικά κύτταρα, και θα μπορούσε να αποκλειστεί από φαρμακευτικά μέσα. PRC2 είναι έτσι μια υψηλότερη ρυθμιστής τάξης του ανοσοποιητικού οδών στον καρκίνο, κυτοκίνες στόχευσης, τους υποδοχείς τους, και κατάντη στόχους, και προσαρμόζει αυτό το πρόγραμμα ανάλογα με τον τύπο του καρκίνου. Κυτοκίνες έχουν πλειοτροπικές επιδράσεις στην καρκινογένεση [3,22], και θα μπορούσε να έχει σημαντική επίδραση στην αποτελεσματικότητα των αναστολέων ΕΖΗ2 στον ανθρώπινο καρκίνο.

Υλικό και Μέθοδοι

Cell Culture και αδενοϊοί

τα κύτταρα αναπτύχθηκαν όπως περιγράφεται [9] και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ανθρώπινο ΙΡΝγ (Invitrogen) σε συγκέντρωση 0,1 mg /ml. SW-13 κύτταρα σε μεταγωγή με αδενοϊό που εκφράζει GFP (Ad-GFP) ή πρωτεΐνη σύντηξης GFP-BRG1 (Ad-BRG1) περιγράφεται [9]. ιός AdBRG1 τιτλοδοτήθηκε έτσι ταιριάζει η έκφραση BRG1 ότι σε HeLa κύτταρα [9].

μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA)

siSUZ12, siEZH2 και siCtrl ελήφθησαν από Qiagen, και siBRM από Thermo Scientific . SW-13 κύτταρα σε 2×10

6 ανά 10-cm τρυβλίο διαμολύνθηκαν με 50 ηΜ siCtrl, siSUZ12 ή siEZH2 μόνο ή με 75 ηΜ siBRM για 3-4 ημέρες χρησιμοποιώντας DharmaFECT-1 (Thermo Scientific). Τα κύτταρα υπο-καλλιεργήθηκαν σε 2×10

6 ανά 10 cm τρυβλίου και υποβλήθηκαν σε ένα δεύτερο κύκλο διαμόλυνσης, εξασφαλίζοντας την καλύτερη εξάντληση H3K27me3. Ακολούθως, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με 0,1 mg /ml ανθρώπινης ΙΡΝγ για 6 ώρες.

Westerns

Westerns διεξήχθησαν όπως περιγράφεται [23]. Για αντισωμάτων βλέπε Πίνακα S4.

RT-PCR και συστοιχίες Έκφραση

RNA μεταγράφηκε αντίστροφα και αναλύθηκαν με ποσοτική PCR. Οι τιμές ομαλοποιήθηκαν σε β-ακτίνη [9]. Αστάρια είναι στον πίνακα S4. Για συστοιχίες έκφραση, την ποιότητα του RNA ελέγχθηκε χρησιμοποιώντας Bioanalyzer (Agilent Inc.), μετατράπηκε σε cDNA, που ακολουθείται από 2

nd σύνθεση κλώνου και παρασκευή cRNA με τη χρήση του κιτ Ambion (Applied Biosystems). cRNA ήταν στήλης-καθαρίζεται ποιότητα ελέγχεται χρησιμοποιώντας Agilent Bioanalyzer. 1.5 μg υβριδίστηκε σε συστοιχίες έκφραση ολόκληρου του γονιδιώματος Illumina. AdGFP /BRG1 και δείγματα siCtrl /siSUZ12 υβριδοποιήθηκαν BeadChips Ανθρώπου-WG6 έκφρασης και τα ανθρώπινα-ΗΤ-12 BeadChips έκφρασης, αντίστοιχα (Illumina, Inc.). Ανάλυση διαφορικής έκφρασης διεξήχθη χρησιμοποιώντας μέσο όρο κανονικοποίηση από το λογισμικό BeadStudio (Illumina Inc). Τρεις βιολογική επαναλήψεις συμπεριλήφθηκαν για κάθε ομάδα θεραπείας.

ChIP qPCR, τσιπ στο τσιπ, και το chip-επόμενα

τσιπ qPCR DNA πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται [10,24]. Αντισώματα και εκκινητές είναι σε S3 & amp? S4, αντίστοιχα. Αντισώματα είχαν προηγουμένως επικυρωθεί [25] και την περαιτέρω επαλήθευση H3K27me3 και H3K79me3 αντισώματα χρησιμοποιώντας κηλίδες τελεία. Για Chip-chip, ανοσοκατακρημνίσθηκε DNA ενισχύθηκε, επισημαίνονται, και υβριδοποιήθηκε σε συστοιχίες πλακάκια υποστηρικτής του Ανθρώπου 1Μ (Agilent). TileMap χρησιμοποιήθηκε για να καθορίσει τις περιοχές με σημαντικά εμπλουτισμένο H3K27me3 [26], και οι εντάσεις ομαλοποιήθηκαν σε εσωτερικά πρότυπα. Κορυφές κατατάσσονται ανάλογα με δοκιμή στατιστικά στοιχεία η αξία τους (μέγιστη TileMap-ΜΑ Στατιστική: MAXM /P [26]). Μέθοδοι για να ορίσετε ένα MAXM /P αποκοπής περιγράφεται στο S1 Κείμενο (συμπληρωματικές μέθοδοι). Για λεπτομέρειες σχετικά με την ανάλυση των στοιχείων τσιπ επόμενα, δείτε S1 Κείμενο (συμπληρωματικές μέθοδοι).

RNA-αλληλουχίας

ποιότητα του RNA ελέγχθηκε με τη χρήση BioAnalyzer (Agilent). σφαιρίδια ολιγο-dT χρησιμοποιήθηκαν για την απομόνωση πολυ (Α)

+ mRNA, και μετά τυχαία κατάτμηση ~ θραύσματα 300bp RNA χρησιμοποιήθηκαν για την παρασκευή πολυπλεγμένο βιβλιοθήκες cDNA χρησιμοποιώντας Illumina TruSeq RNA Kit προετοιμασία του δείγματος. αλληλούχιση υψηλής απόδοσης των βιβλιοθηκών διεξήχθη χρησιμοποιώντας Illumina HiSeq 2000 LTRI. Αλληλουχίας διαβάζει κάθε δείγματος σε fastq μορφή αξιολογήθηκαν με FASTQC, και την ποιότητα ανά βάση σειρά και ανά περιεχόμενο GC αλληλουχίας έδειξε υψηλή ποιότητα των δεδομένων. Δεδομένα χαρτογραφήθηκαν πάνω στο ανθρώπινο γονιδίωμα (hg19) χρησιμοποιώντας ΤΟΡΗΑΤ C 1.4.1 που επιτρέπει μέχρι δύο αναντιστοιχίες [27]. Μη μοναδική διαβάζει φιλτραρίστηκαν. Η διαβάζει καταμέτρηση (ή συναρμολόγηση) για κάθε γονίδιο υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας έναν αγωγό προσαρμοσμένο R-βάση ((https://www.r-project.org). Για περισσότερες λεπτομέρειες σχετικά με το πώς αξιολογήθηκαν ποιότητα των δεδομένων και διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων δείτε S1 Κείμενο (Συμπληρωματικές Μέθοδοι και αποτελέσματα)

Ανάλυση Γονιδιακή Ρύθμιση Εμπλουτισμός

Εμείς εξάγεται γονίδια με log

2Fold αλλαγή & gt?. 0 και απόκλιση των πιθανοτήτων & gt? 0,5 ​​και κατετάγη η SUZ12 καταστέλλεται γονιδίων με τη μείωση διαφορικές τιμές πιθανοτήτων. Χρησιμοποιήσαμε τη λειτουργία GSEA Preranked να αναλύσει τον εμπλουτισμό των κατετάγη γονίδια για τα σύνολα γονιδίου C2 εξάγονται από KEGG μονοπάτι έκδοση 3.1 με τα γονίδια στις σειρές γονιδίων που προσδιορίζονται από το σύμβολο του γονιδίου HUGO. Έχουμε επιλέξει εμπλουτισμένο οδούς με υψηλό Δείκτη εμπλουτισμός (ES) από αποκοπής ονομαστικής αξίας P (ΕΟΦ π-Val) & lt? 0.01 και FDR Q-Val & lt?. 0.05 Για την «αλληλεπίδραση υποδοχέα κυτοκίνης-κυτοκίνης» (CCRI) μονοπάτι, έχουμε περαιτέρω η εφαρμοσμένη ανάλυση αιχμής GSEA για να εξαγάγετε τα μέλη μονοπάτι που εξηγούν τον εμπλουτισμό. Είμαστε συγκεντρωμένοι τα γονίδια με πιθανότητα DE τους στις έξι κυτταρικές σειρές καρκίνου σε κοινές και επηρεάζονται διαφορετικά γονίδια σε διάφορα καρκινικά κύτταρα εντός της ίδιας οδού. Χρησιμοποιήσαμε το μονοπάτι χάρτη KEGG της οδού CCRI (https://www.genome.jp/kegg/pathway.html, χάρτης 04060) για να δημιουργήσει σχηματικές αναπαραστάσεις. ανάλυση ομαδοποίηση και οπτικοποίηση διεξήχθησαν με MeV (https://www.tm4.org/mev.html).

κυτοκίνης Ανίχνευση

Για Suz12 νοκ ντάουν, κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε θεραπεία για δύο κύκλους κατά τα ανωτέρω. Για την αναστολή του φαρμάκου ΕΖΗ2, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία για δύο ημέρες τέσσερις κύκλους με 2 υΜ GSK343 ​​ή UNC1999. Στο τέλος της κάθε θεραπείας, τα κύτταρα σπάρθηκαν @ 3×10

4 /φρεάτιο σε 96 φρεατίων. Τα κύτταρα αφέθηκαν να εγκατασταθούν για 4 ώρες και, στη συνέχεια, τις δεικνυόμενες συγκεντρώσεις των διαφόρων ερεθισμάτων προστέθηκαν (LPS, ΙΡΝγ, IL-1β και TNFa). Τα υπερκείμενα καλλιέργειας συλλέχθηκαν μετά από 24 ώρες και καταψύχθηκε μέχρι τη χρήση. ELISA πραγματοποιήθηκε εις διπλούν χρησιμοποιώντας IL6-, IL8- και κιτ CXCL10-ELISA Max Deluxe από Biolegend. Multiplex ανάλυση των κυτοκινών στα υπερκείμενα καλλιέργειας διεξήχθη χρησιμοποιώντας την Array ανθρώπινα πρωτογενή κυτοκίνης /χημειοκίνης Array 41-Plex δοκιμασία από την παραμονή Technologies Corporation, Καναδάς. Τρία ανεξάρτητα πειράματα. ανάλυση κηλίδος Western διεξήχθη για να διασφαλιστεί Suz12 χτυπήσει κάτω και προς τα κάτω ρύθμιση των H3K27me3 μετά από κάθε πείραμα.

Αποτελέσματα

Genome-Wide ανταγωνισμός μεταξύ BRG1 και PRC2 σε ΙΡΝγ Στόχοι

SWI /SNF ρυθμίζει ISGs [8-11,28-30], αλλά η λειτουργική σχέση με PRC2 είναι άγνωστη. Για τη σύγκριση των στόχων γονιδιώματος πλάτους SW-13 κύτταρα BRG1 ελλειμματικών μετήχθησαν με αδενοϊικούς φορείς που εκφράζουν BRG1 (Ad-BRG1) ή GFP (Ad-GFP), ή επιμολυσμένα με siCtrl ή siSUZ12, αφέθηκαν χωρίς θεραπεία ή ΙΡΝγ-διεγερμένα επί 6 ώρες και μικροσυστοιχίες χρησιμοποιούνται για την εκτίμηση των επιπέδων του mRNA. SUZ12 είναι μια βασική υπομονάδα του PRC2 και αποτελέσματα απώλειας της στην αποδόμηση της ενζυματικής υπομονάδος, ΕΖΗ2 [4]. Εστιάσαμε σε γονίδια στα οποία AdBRG1 ή siSUZ12 επαγόμενη έκφραση ≥ 2 φορές (για μια γενική περίληψη των δεδομένων, βλέπε διαγράμματα πίτας στην Εικόνα 1). Μια λεπτομερής συζήτηση των κατηγοριών δεδομένων και των γονιδίων παρέχονται στο S1 κειμένου (δείτε το πρώτο τμήμα του Συμπληρωματικού αποτελέσματα)? η τελευταία παρέχει εκτενείς λεπτομέρειες σχετικά με το βαθμό στον οποίο BRG1 και PRC2 ρυθμίζουν την έκφραση που προκαλείται από γονιδιακή βασική και ΙΡΝγ. Εντυπωσιακά, BRG1 ανασύσταση ή θεραπεία siSUZ12 ενισχυμένη επαγωγή του 87% (95/109) των ISGs, αλλά επηρεάζονται βασική έκφραση μόνο ~ 2% όλων των γονιδίων (Σχήμα 1). Επιπλέον, από το 2% του συνόλου των γονιδίων των οποίων βασική έκφραση επηρεάστηκε, 14% (48/342) ήταν συν-ρυθμίζονται από SWI /SNF και PRC2, ενώ το 34% (32/95) των ISGs ήταν συν-ρυθμίζονται. Η επίδραση της SWI /SNF και PRC2 σε συν-ρυθμιζόμενων γονιδίων ήταν ανταγωνιστική. Πραγματικού χρόνου PCR ανάλυση των 52 ISGs επιβεβαίωσε την κυρίαρχη BRG1 εξάρτηση σε αυτή την κατηγορία γονίδιο (Σχήμα Α στο S1 File), και siSUZ12 έσωσαν την ανταπόκριση στο 5/7 BRG1-εξαρτώμενη ISGs, ενώ BRG1-ανεξάρτητο ISGs ή γονίδια ελέγχου δεν επηρεάστηκαν (Εικ Β, Πίνακας Β σε S1 File). Μια δεύτερη SUZ12 siRNA επίσης διασωθεί BRG1-εξαρτώμενη ISGs (Σχήμα C σε S1 αρχείου). εξάντληση PRC2 οριακά επήγαγε την BRG1 πρωτεΐνη που σχετίζεται με BRM (Σχήμα Β, Πίνακας Α σε S1 File). Για να εκτιμηθεί κατά πόσον αυτή η μικρή επαγωγή θα μπορούσε να εξηγήσει την επαγωγή ορισμένων ISGs που γκρέμισε BRM. Αυτό το πρόσθετο βήμα είχε καμία ή μόνο μια μικρή επίδραση στη διάσωση των BRG1-εξαρτώμενη ISGs από siSUZ12 (σχήματα Β, D σε S1 αρχείου). Διάσωση του ISG-απόκρισης δεν ήταν επίσης λόγω της επαγωγής του ενδογενούς IFNs, επειδή η θεραπεία RNAi δεν είχε καμία επίδραση στα επίπεδα φωσφορυλίωσης STAT1 ή πρωτεΐνη IRF1, είτε σε κύτταρα SW13 [12], ή σε πολλαπλές άλλες κυτταρικές γραμμές (βλέπε παρακάτω).

μικροσυστοιχίες διεξήχθησαν με RNA από SW-13 κύτταρα για να εκτιμηθεί η επίδραση της BRG1-ανασύσταση ή SUZ12 knockdown σε βασική έκφραση όλων των γονιδίων (Α, 465 επηρεάζεται γονίδια) ή ΙΡΝγ ανταπόκρισης (Β, 109 ISGs). Οι θεραπείες που αναφέρονται σε κόκκινο και μπλε πάνω από κάθε heatmap, οι τάξεις γονιδίων που υποδεικνύεται από χρωματιστές μπάρες στα αριστερά του κάθε heatmap, και τα γραφήματα πίτας συνοψίζουν την% των γονιδίων σε κάθε κατηγορία (Στην (Α) γκρι = ανεπηρέαστη γονίδια). Ένα επιπλέον διάγραμμα στα δεξιά της heatmap στο (Α) ταξινομεί τα γονίδια που βασίζεται στα εξής: 1. ΙΡΝγ ανταπόκρισης (ISGs = 12), ή να πάτε όρους: 2. Ανάπτυξη (n = 118)? 3. κυτταρική σηματοδότηση (n = 64)? 4. Η μετανάστευση κυττάρων (n = 24). Γονιδιακή Τάξη Συντομογραφίες: EXPN: Έκφραση? Br: Brg1, Ζ: Suz12? S: Παρακινημένοι? R: Απωθημένα? Ι: Η ιντερφερόνη-γ? G:. Gene

Η

Αν PRC2 ρυθμίζει άμεσα ISGs, οι στόχοι αυτοί θα πρέπει να παρουσιάζει H3K27me3. Κατ ‘αρχάς, θα αντιμετωπιστεί αυτό το ζήτημα, χρησιμοποιώντας τσιπ qPCR, για τη θέσπιση αποκοπές για περαιτέρω ανάλυση του γονιδιώματος-ευρεία. Μελετήσαμε 30 προωθητές: 10 ISGs διασώθηκε από siSUZ12 ή BRG1, 6 ISGs διασώθηκε από siSUZ12 μόνο, 6 ISGs διασώθηκε από BRG1 μόνο, 3 ISGs ανεπηρέαστη από siSUZ12 ή BRG1, και 5 θετικοί έλεγχοι για H3K27me3. IRF1, ανεπηρέαστο από κάθε PRC2 ή BRG1, έλειπε H3K27me3 και ενεργούσε ως βασική γραμμή (Σχήμα Ε στο S1 αρχείου). H3K27me3 ανιχνεύθηκε σε 15/16 των siSUZ12 ρυθμίζονται ISG προαγωγούς, αλλά μόνο 4/9 των ISGs ανεπηρέαστη από siSUZ12 (Σχήμα Ε, Πίνακας Α σε S1 File) (ρ & lt? 0,05, Fisher exact test), και ήταν σημαντικά H3K27me3 υψηλότερη σε πρώην (Σχήμα Ε, Πίνακας Β S1 αρχείου).

Γονιδίωμα-ευρύ τσιπ τσιπ αποκάλυψε ~ 1/5

ου προαγωγών είχε κάποια H3K27me3 (τουλάχιστον ένα 100 bp bin 1.5x παραπάνω ελέγχου). Η μέση ένταση H3K27me3 κορυφώθηκε +/- 1 kb γύρω από το TSS όλων των γονιδίων (Εικ F Πλαίσια Α, Β S1 File), και τα επίπεδα H3K27me3 αντι-συσχετίζονται με βασική έκφραση (Εικ F, Πάνελ C, D σε S1 File), συνεπής με άλλους τύπους κυττάρων (που επισκοπείται στο [6]). Εστιάζοντας σε γονίδια στα οποία BRG1 ή /και siSUZ12 διεγείρονται έκφρασης, τα άτομα με τα υψηλότερα επίπεδα H3K27me3 είχαν κατασταλεί από PRC2 (BRS /ZRG & amp? ZRG? Σχήμα G, πάνελ Α-Ε στο S1 αρχείου). Το μέσο επίπεδο των H3K27me3 στο ISGs ήταν παρόμοια με εκείνη που παρατηρήθηκε σε όλα τα σιωπηλών γονιδίων (πρβλ σχήμα 2Α και 2F, Πίνακας Α σε S1 File). ~ 40% της ISGs είχε μερικά H3K27me3 (Σχήμα 2Β), η οποία είναι ~ 2x περισσότερο από όλα τα γονίδια (πρβλ σχήμα F, Πίνακας Β σε S1 File). Όπως σε όλα τα γονίδια, το επίπεδο και η συχνότητα των H3K27me3 συσχετίζονται με βασική έκφραση (Σχ 2C και 2D). Επιπλέον, σε basally σιωπηλή ISGs, το επίπεδο και η συχνότητα των H3K27me3 ήταν σημαντικά υψηλότερη σε τόπους όπου siSUZ12 αυξημένη ΙΡΝγ ανταπόκρισης (Σχ 2Ε-2Θ, ZR-ISGs, BRS /ZR-ISGs).

Γονιδίωμα-ευρύ ChIP δεδομένων -chip χρησιμοποιήθηκε για την εκτίμηση των επιπέδων H3K27me3 σε ISG υποστηρικτές. έντασης σήματος (Α) τσιπ chip ανά 100 κάδους bp εντός +/- 5 kb του TSS όλων των 109 ISGs ορίζεται στο Σχήμα 1Β. (Β) Ποσοστό H3K27me3 θετικών και αρνητικών ISG υποστηρικτές. (Γ) της έντασης του σήματος τσιπ τσιπ όπως στο (Α), αλλά ομαδοποιούνται σύμφωνα με ISG βασική έκφραση. (D) Ιστόγραμμα του ποσοστού των H3K27me3 θετικών και αρνητικών ISGs σε σχέση με βασική έκφραση του γονιδίου τους. κωδικός (Ε) Χρώμα basally σιωπηλή ISGs αναλύονται στο (F) – (Η). (F) Heatmap δείχνει βασική σήμα H3K27me3 τσιπ τσιπ μέσα σε +/- 1 kb του TSS των υποδεικνύεται basally σιωπηλή ISG τάξεις. ένταση του σήματος (G) τσιπ chip ανά 100 κάδους bp εντός +/- 1 kb της TSS του basally σιωπηλή ISGs. (H) Βιολί διάγραμμα δείχνει το επίπεδο του μέσου όρου σήματος τσιπ τσιπ. Οι αστερίσκοι υποδηλώνουν σημαντική διαφορά (P & lt? 0,05, Mann Whitney test) μεταξύ των υποδεικνύεται ομάδων. (Ι) ιστόγραμμα δείχνει το ποσοστό των θετικών H3K27me3 υποκινητών σε κάθε υποδεικνύεται ISG τάξη. *: Σημαντικά υψηλότερο% των H3K27me3 θετική ISGs μεταξύ της ενδεικνυόμενης ομάδων (P & lt? 0,05, Fisher exact test). Γονιδιακή Τάξη Συντομογραφίες: Br: Brg1, Ζ: Suz12? S: Παρακινημένοι? R: Απωθημένα? Ι: Η ιντερφερόνη-γ? G: Gene

Η

Μαζί, τα παραπάνω στοιχεία έκφρασης και της χρωματίνης δεσμευτική εκθέσει ένα εκτεταμένο, ανταγωνιστική ρόλο για SWI /SNF και PRC2 σε ΙΡΝγ ανταπόκριση

PRC2 καταστέλλει πολλαπλά μονοπάτια του ανοσοποιητικού σε.. καρκινικά κύτταρα

Για να εκτιμηθεί η γενική σχετικότητα των ευρημάτων μας, πραγματοποιήσαμε ανάλυση RNAseq μετά την εξάντληση PRC2 σε 8 καρκίνο και 3 μη καρκινικές κυτταρικές σειρές προερχόμενες (Καρκίνος: Α549, αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα? Panc.04.03 & amp? AsPC1 , παγκρεατικό αδενοκαρκινώματα? PC3, καρκίνο του προστάτη? MCF-7 & amp? MDA-MB-231, καρκίνους του μαστού, HeLa, τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας? και SW-13, τον καρκίνο του φλοιού των επινεφριδίων? μη καρκίνου: 184-Α1, του μαστού? ΒΡΗ-1 του προστάτη και Beas-2Β του πνεύμονα). Westerns αποκάλυψε ότι SUZ12, ΕΖΗ2 ή /και τα επίπεδα H3K27me3 τυπικώς αυξημένα σε σειρές καρκίνου σε σύγκριση με τις γραμμές μη-καρκίνου (Εικ Η στο S1 File). επίπεδα BRG1 /BRM κυμαινόταν μεταξύ του καρκίνου και μη καρκίνου γραμμές με τις χαμηλότερες στην Α549, AsPC1, Panc.04.03 και 184A1 (Εικ H σε S1 αρχείου). επίπεδα ΕΖΗ2 και SUZ12 συσχετίζονται μεταξύ τους, αλλά όχι με χύδην H3K27me3, και PRC2 και BRG1 ή BRM επίπεδα ήταν ασυσχέτιστα (Σχήμα Η, Πάνελ Β σε S1 File). Αυτές οι μεταβλητές ευρήματα υπογραμμίζουν τη σημασία των λειτουργικών μελετών για να συμπεράνουμε την επίδραση της PRC2 στη γονιδιακή έκφραση, επειδή απλά την εκτίμηση των επιπέδων του συγκροτήματος ή του σήματος αποκαλύπτει ελάχιστα για το ρόλο της στον καρκίνο ή μη-καρκινικά κύτταρα.

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με siCtrl ή siSUZ12 και αφεθεί χωρίς θεραπεία ή εκτεθεί σε φυσιολογικά σχετικές συγκεντρώσεις της ΙΡΝγ (0,2 ng /ml), συγκρίσιμη με εκείνη που εκκρίνεται από τα κύτταρα ΝΚ που εκτίθενται σε κύτταρα όγκου [31,32]. SUZ12-εξάντληση μειωμένη H3K27me3 σε όλους τους τύπους κυττάρων, και αυξημένη H3K27ac σε κάποια (HeLa, MDA-MB-231, PC3), αλλά δεν επηρέασε SWI /SNF υπομονάδες (Σχ Ι S1 File). Επόμενο προσδιορισμούς RNA-seq έτρεξαν να εκτιμηθεί η επίδραση της SUZ12 knockdown επί της βασικής ή ΙΡΝγ-επαγόμενη έκφραση γονιδίου (44 δοκιμασίες, 4 συνθήκες x 11 γραμμές), και τα αποτελέσματα επικυρώθηκαν χρησιμοποιώντας ανάλυση αρχή συστατικό και ανάλυση συσχέτισης. Το αποτέλεσμα του να χτυπήσει κάτω SUZ12 στη γονιδιακή έκφραση επιβεβαιώθηκε επίσης με μια εφεδρική siRNA εναντίον SUZ12. Για μια πλήρη συζήτηση ανατρέξτε στην ενότητα με τίτλο «Επικύρωση των δεδομένων RNAseq» σε S1 Κείμενο (Συμπληρωματική αποτελέσματα), η οποία αναφέρεται στα δεδομένα επικύρωσης στα σχήματα J-M στο S1 αρχείου, και Πίνακας S2.

Σύμφωνα με ένα ευρύ ρόλο για PRC2 σε ISGs, SUZ12-Απωθημένα ISGs (ZR-ISGs) παρατηρήθηκαν σε πολλαπλές κυτταρικές σειρές (Σχήμα 3, Σχήμα Ν στο S1 αρχείου, S2 πίνακα). Μεταξύ των δύο πιο άφθονα ISG κατηγορίες (ZR-ISGs και ISGs δεν επηρεάζονται από SUZ12 (Ν-ISGs)), υπήρχαν κυττάρου-ειδικές διαφορές σε απόλυτους αριθμούς ZR-ISGs (εύρος 13-152, σημαίνει 70, διάμεσος 43), αλλά siSUZ12 ενισχυμένη επαγωγή μεταξύ 13% και 77% (μέσος όρος 45%, διάμεσος 43%) σε 7/8 κυτταρικές σειρές (Σχήμα 3). Οι τιμές αυτές είναι συντηρητικές, καθώς υπήρχαν άλλες πιο σύνθετες τάξεις γονίδιο χαμηλότερη αφθονία όπου SUZ12 επηρεάζονται ISG έκφρασης (S1 πίνακα). Οι περισσότεροι Ν-ISGs (68%) και ZR-ISGs (72%) ήταν ειδικές για κάθε κυτταρικό τύπο (Σχ O σε S1 File), υποδεικνύοντας ότι, εκτός από ένα βασικό σύνολο, κάθε γραμμή επάγει μια ξεχωριστή ISG κοκτέιλ. Αυτό είναι σύμφωνο με το πλαίσιο-ειδική φύση της ανοσολογικής επιτήρησης [3], και με δεσμευτική κυττάρου-ειδικό χρωματίνη από PRC2 [33]? πράγματι από τα γονίδια που καταστέλλονται από SUZ12 μόνο (ZRG-Ν), 77% ήταν μοναδικά σε μία κυτταρική γραμμή (Σχ O σε S1 File). Επίσης, το κλάσμα των ZR-ISGs ήταν χαμηλότερη σε μη-καρκίνου σε σχέση με τις γραμμές του καρκίνου, με τις τρεις γραμμές μη-καρκίνου κατετάγη 7

ου, 8

ου, και 11

ου μεταξύ όλων των 11 γραμμών αξιολογείται ( S1 πίνακα).

Heatmaps δείχνουν την επίδραση των τεσσάρων θεραπειών (στήλες 1-4, κλειδί στον πίνακα προς τα δεξιά) για ISG έκφραση σε ένα πάνελ του πνεύμονα, του παγκρέατος, του μαστού, του τραχήλου της μήτρας, του φλοιού των επινεφριδίων και του προστάτη καρκινικών κυττάρων γραμμές. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με siCtrl ή siSUZ12 και αφεθεί χωρίς θεραπεία ή διεγείρονται με ΙΡΝγ για 6 ώρες. Οι ISGs ταξινομημένα σε SUZ12-καταπιεσμένη ISGs (Zr-ISGs, κίτρινο) και ISGs που δεν ρυθμίζονται από PRC2 (Ν-ISGs, πράσινο). Το ποσοστό των ZR-ISGs και Ν-ISGs εμφανίζονται σε διαγράμματα πίτας πάνω από κάθε heatmap, και ο συνολικός αριθμός των ISGs ανά γραμμή αναγράφεται κάτω από κάθε heatmap.

Η

Στη συνέχεια, στράφηκε προς την επίδραση της εξάντληση PRC2 επί της βασικής έκφρασης γονιδίου. ανάλυσης μικροσυστοιχιών μας στα κύτταρα του φλοιού των επινεφριδίων SW13 δεν αποκάλυψε μια εξέχουσα επίδραση στο ανοσοποιητικό γονίδια μέχρι να αντιμετωπίζονται με ΙΡΝγ (Σχήμα 1), αλλά αναρωτήθηκε αν θα μπορούσε να υπάρχει μια πιο εμφανή επίδραση στη βασική έκφραση του ανοσοποιητικού μονοπάτια σε άλλους τύπους καρκίνου. Για να αποκρυπτογραφήσει τα βασικά μονοπάτια που επηρεάζονται, χρησιμοποιήσαμε Gene Σετ Ανάλυση εμπλουτισμού (GSEA) [34]. Εντυπωσιακά, siSUZ12 επάγεται την βασική έκφραση πολλαπλών ανοσοποιητικού συστατικών σε 6/8 σειρές καρκίνου, της οποίας η «αλληλεπίδραση υποδοχέα κυτοκίνης /κυτοκίνης» (CCRI) σετ γονίδιο επηρεάστηκε σε όλες τις γραμμές 6 (Σχήματα 4 και 5), και 4 γραμμές η κατηγορία CCRI ήταν η κορυφή ή τη δεύτερη κατετάγη σετ γονιδίων (* σε σχήμα Π με S1 αρχείου). Τα ευρήματα αυτά επικυρώθηκαν για πολλαπλά γονίδια με δύο siRNAs κατά SUZ12 (S2 Πίνακας). Μεταξύ των έξι σειρές καρκίνου όπου προκλήθηκε το σύνολο γονίδιο CCRI, 61% των γονιδίων ήταν πάνω ρυθμισμένα ειδικά σε 1 ή 2 από τις κυτταρικές σειρές (Σχ Q στο S1 File). Έτσι, όχι μόνο PRC2 ρυθμίζει ISGs, αλλά η επίδρασή της επί του ανοσοποιητικού πρόγραμμα σε καρκινικά κύτταρα εκτείνεται σε πολλές κυτοκίνες και υποδοχείς κυτοκίνης, και παρόμοια με ISGs, επηρεάζει διαφορετικά γονίδια CCRI σε διακριτά πλαίσια του καρκίνου.

Περίληψη της GSEA ανάλυση των γονιδίων διαφορικά επάγεται από siSUZ12 σχέση με siCtrl σε 6 καρκίνο και 4 μη καρκινικές κυτταρικές γραμμές που παράγονται. Οι κυτταρικές γραμμές που περιλαμβάνονται στο heatmap υποδεικνύεται προς τα δεξιά? ένα σημαντικό μήνυμα υποδεικνύεται με γκρι χρώμα. Οι παρόμοιες βιολογικές πορείες ομαδοποιούνται, και τονίζεται με ένα ξεχωριστό χρώμα προς τα δεξιά, και γενικά το όνομα της κλάσης τους υποδεικνύεται προς τα αριστερά.

Η

Α. Θερμικός χάρτης των γονιδίων CCRI σημαντικά προκαλείται από siSUZ12 (Differential Πιθανότητες & gt? 0,9) σε 11 κυτταρικές σειρές (μη-καρκίνου του πράσινου, του καρκίνου μπλε). Για τα ονόματα κυτταρική γραμμή που αντιστοιχεί σε κάθε αριθμό Έδρα (F). Μπλε αστέρια σε αυτό και μετέπειτα πίνακες δείχνουν κυτταρικές σειρές στις οποίες το μονοπάτι CCRI σημαντικά εμπλουτίζεται σύμφωνα με GSEA. BE Heatmaps υποσυνόλων των δεδομένων στο (Α) που διαχωρίζονται από τύπο ιστού: Β Μαστού (184 μη καρκινικά

vs

MCF7 και ΜϋΑ-ΜΒ-231 καρκίνου.), Γ Lung (Beas-2Β μη -cancer

vs

. Α549 καρκίνος), Δ προστάτη (ΒΡΗ-1 μη καρκινικά

vs

. PC-3 καρκίνου), και Ε άλλα 4 κυτταρικές γραμμές καρκίνου του παγκρεατικού (Panc .04.03 και AsPC1), του τραχήλου της μήτρας (HeLa) και του φλοιού των επινεφριδίων (SW-13) προέλευσης. ΣΤ Συχνότητα προκαλείται από γονίδια CCRI σε όλα τα 271 γονίδια CCRI σε κάθε κυτταρική σειρά.

Η

Σε πλήρη αντίθεση με τις γραμμές του καρκίνου, siSUZ12 δεν εμπλουτίζουν για το ανοσοποιητικό σύνολα γονιδίων σε μη-καρκίνου του μαστού, του προστάτη και των πνευμόνων γραμμές (Σχήμα 4, Σχήμα Q σε S1 File). Για να επεκτείνετε την ανάλυση αυτή, χρησιμοποιήσαμε GSEA να αναλύσει τα δημοσιευμένα στοιχεία RNAseq από SUZ12-νοκ ντάουν σε ανθρώπινα κύτταρα ΗΕΚ-293Τ [35]. Αυτά είναι μη καρκινικά κύτταρα προερχόμενα νευρικής προέλευσης που εκφράζουν ιικά ογκογονίδια, αλλά μετατράπηκαν

in vitro

, ανεξάρτητα από το ανοσοποιητικό σύστημα [36]. GSEA αποκάλυψε ότι η εξάντληση PRC2 δεν επηρέασε σημαντικά CCRI ή άλλες ανοσοποιητικό οδών (Σχήμα 4). Έτσι, PRC2 μεταβληθεί πορείες CCRI σημαντικά σε 6/8 κυτταρικές γραμμές καρκίνου, αλλά 0/4 περιβάλλοντα μη καρκινικά. εξάντληση PRC2 επάνω ρυθμισμένη μερικά γονίδια CCRI σε παράγωγα μη καρκινικές κυτταρικές σειρές, αλλά λιγότερα από σε καρκινικά κύτταρα, ανεπαρκές για την επίτευξη σημασία GSEA, και οι επηρεαζόμενες γονίδια ήταν διαφορετικές σε καρκίνο vs γραμμές μη καρκινικά από ταιριάζουν ιστούς (Σχήμα 5) . Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ένα ευρύ ρόλο για PRC2 στη ρύθμιση του ανοσοποιητικού πρόγραμμα, το οποίο μεταβάλλεται και επεκτάθηκε σημαντικά στον καρκίνο.

SUZ12 Νοκ ντάουν Προκαλεί γονίδια με δισθενή υποψήφιοι

Για να ορίσετε αν PRC2 μεσολάβηση καταστολή siSUZ12 που προκαλείται από γονίδια, ιδιαίτερα η υποκατηγορία CCRI, είναι άμεση, είμαστε εξορύσσεται H3K27me3 τσιπ επόμενα διαθέσιμα στοιχεία για τον καρκίνο του πνεύμονα Α549 κύτταρα, και σε σύγκριση με τα δεδομένα RNAseq μας +/- siSUZ12 (Σχήμα 6Α). Παράλληλα, σε σύγκριση διανομής H3K4me3, η οποία σηματοδοτεί ενεργό ή έτοιμη υποστηρικτές. Χωρίς επίβλεψη ομαδοποίηση εντοπίστηκαν 10 διαφορετικά πρότυπα H3K27me3 /H3K4me3. Πιο πολύ προκαλείται από γονίδια siSUZ12, συμπεριλαμβανομένου του υποσυνόλου CCRI ήταν σε ομάδες 1-4, με εκτεταμένη κάλυψη H3K27me3 υποκινητή (Σχήμα 6Α-6D). Ωστόσο, τα περισσότερα γονίδια με υψηλή υποστηρικτής H3K27me3 δεν ανταποκρίνονται σε siSUZ12 (Σχήμα 6Α), υπογραμμίζοντας τη σημασία της μέτρησης του αποτελέσματος επί της γονιδιακής έκφρασης. Συγκεκριμένα, ο μέσος όρος του σήματος H3K4me3 ήταν σημαντικά υψηλότερη σε όλη siSUZ12 αποκρίνονται γονίδια, συμπεριλαμβανομένου του υποσυνόλου CCRI, σε σύγκριση με γονίδια που δεν επηρεάστηκαν από siSUZ12 ή 1000 τυχαία σύνολα γονιδίων (Σχήμα 6Ε). Έτσι, τα γονίδια που επάγονται εξής διαταραχή PRC2 έχουν μια δισθενή υπογραφή H3K27me3 /H3K4me3, και siSUZ12 προκαλούμενη γονίδια CCRI είναι τυπικές της ομάδας αυτής.

τσιπ επόμενα δεδομένα από κύτταρα Α549 χρησιμοποιήθηκε για την εκτίμηση σήματα χρωματίνη κατά siSUZ12 επαγόμενη από τα γονίδια. Α Ανεξέλεγκτη K-means clustering διεξήχθη σε σήματα H3K27me3 και H3K4me3, και καταγράφεται ως θερμικούς χάρτες γύρω από το TSS (για περισσότερες λεπτομέρειες βλέπε «τσιπ επόμενα ανάλυση δεδομένων στις S1 Κείμενο, συμπληρωματικές μέθοδοι). Οι 10 που προκύπτουν συστάδες (ID Cluster (CID) 1-10) που απεικονίζεται με σειρά μέση μεταβολή log2Fold στη γονιδιακή έκφραση μετά την αγωγή siSUZ12 όπως φαίνεται στα διαγράμματα στιγμών προς τα δεξιά. Από την τελεία πλοκή, όλα τα γονίδια (αριστερά) ή γονίδια CCRI (δεξιά) παρουσιάζουν αλλαγή log2Fold για κάθε γονίδιο? κόκκινες κουκκίδες υποδεικνύουν γονίδια σημαντικά προκαλείται από siSUZ12 (Differential πιθανότητα & gt? 0,9). Βασική έκφραση εμφανίζεται στο δεξιό άκρο (Ανοιχτό γκρι: χαμηλή? Γκρι: μέσο? Σκούρο γκρι: υψηλή). B. Εμφανίζει συστάδες γονιδίων αποκάλυψε στον πίνακα Α ποσοστό του συνόλου των γονιδίων που προκαλείται από siSUZ12 (κόκκινο) σε CIDs 1-4, ή 5-10 (όπως φαίνεται στα αγροτεμάχια τελεία στο Α). Γ Ποσοστό των γονιδίων οδού CCRI προκαλείται από siSUZ12 (κόκκινο) στην CIDs 1-4 (κόκκινο περίγραμμα) ή 5-10 (μπλε περίγραμμα). Δ Μέση H3K27me3 ChIP σήμα γύρω από το TSS για τις υποδεικνυόμενες ομάδες γονιδίων (Key προς τα δεξιά? ZR-Γονίδια: όλα τα γονίδια SUZ12 καταπιεσμένη? Ν-Γονίδια: δεν επηρεάζονται από siSUZ12? ZR-CCRI: γονίδια CCRI που είναι SUZ12-καταστέλλεται ? Ν-CCRI: γονίδια CCRI δεν επηρεάζονται από SUZ12? Rand: 1000 τυχαία σύνολα γονιδίων, n = διάμεσος των άλλων τεσσάρων γονιδίων σετ). E. Ίδια (D), εκτός από τα σήματα H3K4me3 τσιπ CIDs 1-4 (δηλαδή άτομα με υψηλή H3K27me3).

Η

μικρό μόριο ΕΖΗ2 Αναστολείς Επαυξημένης Πολλαπλές ανοσοποιητικού Pathways

Τα στοιχεία μας αυξήσει την πιθανότητα ότι τα φάρμακα που αναστέλλουν PRC2 μπορεί να ενισχύσει το ανοσοποιητικό ενεργοποίηση του μονοπατιού στα καρκινικά κύτταρα. Όταν τέσσερις καρκινικές κυτταρικές γραμμές υποβλήθηκαν σε αγωγή με 2 μΜ GSK343 ​​[37] ή UNC1999 [38], είτε φάρμακο σημαντικά μειωμένα επίπεδα H3K27me3 (Εικ R στο S1 File). RT-PCR ανάλυση αποκάλυψε ότι 8 SUZ12-καταπιεσμένη ISGs (ZR-ISGs) σε 4 κυτταρικές σειρές (32 περιπτώσεις) UNC1999 επαυξημένης ΙΡΝγ-αποκρισιμότητα σε 30 περιπτώσεις (94%) και GSK343 ​​το έκανε σε 15 (50%) (Σχ S στο S1 αρχείου). Η θεραπεία δεν είχε καμία επίδραση επί μη ISGs όπως

PITX2

ή

HPRT

ή επί του mRNA ή επίπεδα πρωτεΐνης του IRF1, ενός PRC2-ανεξάρτητο ISG (Σχήματα R, S σε S1 File). UNC1999 που προκαλείται mRNAs σε μεγαλύτερο βαθμό από ό, τι GSK343 ​​παρά φαινομενικά παρόμοιες συνέπειες για χύμα επίπεδα H3K27me3. Αυτό μπορεί να αντανακλά λεπτές διαφορές στην κινητική ή /και το συνολικό ποσό της εξάντλησης H3K27me3 σε συγκεκριμένες ενισχυτές ή προωθητές, οι οποίες δεν θα αποκαλυφθεί με ανάλυση Western του συνόλου H3K27me3. Ανεξάρτητα, αυτά τα στοιχεία δείχνουν ότι οι αναστολείς ΕΖΗ2, όπως siSUZ12, αυξάνουν την επαγωγή του mRNA της PRC2-κατασταλεί ISGs.

Τέλος, θα αξιολογηθεί κατά πόσον η αναστολή PRC2 ενισχύει επαγωγή κυτοκινών σε απόκριση σε άλλες ανοσοποιητικού σήματα και αν οι επιπτώσεις αυτές παρατηρούνται σε το επίπεδο της πρωτεΐνης. Για αυτό, αντιμετωπίζεται Α549 κύτταρα καρκίνου πνεύμονα με TNFa, IL-1β,

E

.

coli

λιποπολυσακχαρίτη (LPS), καθώς επίσης και ΙΡΝγ, και αξιολογούνται έκκριση των κυτοκινών CXCL10, IL6 και IL8 . Σε αντίθεση με επαγωγή mRNA, η αναστολή PRC2 μόνος δεν αυξάνει τα επίπεδα πρωτεΐνης αλλά όταν τα κύτταρα είχαν εκτεθεί σε μία από τις τέσσερις ανοσοποιητικού σήματα, siSUZ12 ή UNC1999 επαυξημένης επαγωγή πρωτεΐνη κυτοκίνης (σχήμα 7Α-7C, η Εικ Τ σε S1 File, S2 πίνακα). Αυτά τα δεδομένα είναι σύμφωνα με την καθιερωμένη, μετα-μεταγραφική ρύθμιση της παραγωγής κυτοκίνης για την πρόληψη ανεπιθύμητων ανοσολογικών αντιδράσεων, όπως η χρόνια φλεγμονή. Για παράδειγμα, εκτός από την μεταγραφή του γονιδίου (υπό τον άμεσο έλεγχο της PRC2), κυτοκίνες είναι επίσης αυστηρές ρυθμίσεις στο επίπεδο της σταθερότητας του mRNA ή /και μετάφραση μέσω μοτίβα όπως η Αφρικανική Ένωση-Rich Element (ARE), Καταστατική Decay Element (ΚΑΕ ), Κωδικοποίηση Περιφέρεια καθοριστικός παράγοντας της αστάθειας (CRD) και διάφορα άλλα [39]. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι PRC2 ρυθμίζει την μεταγραφική συστατικό, αλλά όχι το μετα-μεταγραφικό έλεγχο, η οποία απαιτεί ένα πρόσθετο σήμα από το ανοσοποιητικό σύστημα.