Αφηρημένο

καρκίνος του παχέος εντέρου είναι η κύρια αιτία των θανάτων από καρκίνο που σχετίζονται με όλο τον κόσμο. Η ασθένεια είναι ιάσιμη όταν ανιχνεύεται σε πρώιμο στάδιο. Ωστόσο, το ποσοστό συμμόρφωσης με τις τρέχουσες συστάσεις διαλογής παραμένει φτωχή. Μια ακριβής, ελάχιστα επεμβατική εξέταση αίματος που έχει τη δυνατότητα για μεγαλύτερη συμμόρφωση του ασθενούς θα ήταν μια ευπρόσδεκτη προσθήκη στις τρέχουσες μεθόδους. Πρόσφατα στοιχεία έχουν δείξει ότι το προφίλ γονιδιακής έκφρασης των κυττάρων του περιφερικού αίματος μπορεί να αντανακλά νοσηρές καταστάσεις και έτσι έχουν διαγνωστική αξία. Σε αυτή τη μελέτη, το γονιδίωμα σε επίπεδο προφίλ γονιδιακής έκφρασης των κυττάρων του περιφερικού αίματος από 20 υγιείς μάρτυρες και 20 ασθενείς με καρκίνο του παχέος διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας τεχνολογία PAXgene ™ και μικροσυστοιχίες Affymetrix GeneChip®. Ταυτοποιήσαμε μια λίστα 1.469 γονίδια που εκφράζονται διαφορικά μεταξύ των υγιών μαρτύρων και ασθενών με καρκίνο. Γονίδιο σχολιασμό και ανάλυση λειτουργικών εμπλουτισμό αποκάλυψε ότι τα εν λόγω γονίδια που σχετίζονται κυρίως με τις ανοσοποιητικές λειτουργίες. Ιδιαίτερα, ένα σύνολο γονιδίων που ανήκουν στις οδούς ΤοΙΙ υποδοχέα ήταν επάνω ρυθμισμένη στους ασθενείς με καρκίνο του παχέος. Αυτά τα ευρήματα παρέχουν μια νέα κατανόηση του προφίλ γονιδιακής έκφρασης του αίματος σε καρκίνο του παχέος εντέρου. Το αποτέλεσμά μας μπορεί να χρησιμεύσει ως βάση για την περαιτέρω ανάπτυξη των βιοδεικτών αίματος για τη διάγνωση και τη θεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου

Παράθεση:. Xu Y, Xu Q, Yang L, Liu F, Ye Χ, Wu F, et al . (2013) Gene Expression Ανάλυση των κυττάρων περιφερικού αίματος αποκαλύπτει ΤοΙΙ υποδοχέα Pathway απορρύθμιση στον Καρκίνο του παχέος εντέρου. PLoS ONE 8 (5): e62870. doi: 10.1371 /journal.pone.0062870

Επιμέλεια: Frank T. Kolligs, Πανεπιστήμιο του Μονάχου, Γερμανία

Ελήφθη: 17 Σεπτεμβρίου του 2012? Αποδεκτές: 29, Μάρτη του 2013? Δημοσιεύθηκε: May 1, 2013

Copyright: © 2013 Xu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από bioMérieux εταιρείας. Η μελέτη αυτή υποστηρίζεται επίσης από τις επιχορηγήσεις από την κινεζική Εθνική Κλινική Key Πειθαρχία (2011-2012) και τη Σαγκάη Επιστήμης και Τεχνολογίας της Επιτροπής του Δήμου Σαγκάης (αριθμός 10DJ1400500). Όπως QX, FW, FL, XY, BM και XM είναι οι εργαζόμενοι της bioMérieux εταιρείας και έχουν συμβάλει σε αυτό το έργο, ως εκ τούτου, ως ένας από τους χρηματοδότες, bioMérieux εταιρία έπαιξε ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, απόφαση για τη δημοσίευση και την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Αρκετοί συγγραφείς (QHX, FW, FL, XY και XM) είναι οι υπάλληλοι του bioMerieux (Shanghai) Co. Ltd. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων να όλες οι PLoS One πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών. Άλλοι συγγραφείς δηλώνουν δεν υπάρχει σύγκρουση συμφερόντων.

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι η τρίτη πιο κοινή μορφή καρκίνου στους άνδρες και η δεύτερη πιο κοινή μορφή καρκίνου στις γυναίκες παγκοσμίως. Το 2008, περισσότερα από 1.234.000 περιπτώσεις είχαν πρόσφατα διαγνωστεί, και περισσότεροι από 608.000 άνθρωποι έχασαν τη ζωή τους από την ασθένεια [1]. Δεδομένης βραδεία ανάπτυξη του από αφαιρούμενα προκαρκινικών βλαβών και από τα πρώτα στάδια ιάσιμη, ο έλεγχος για CRC έχει τη δυνατότητα να μειώσει τόσο τη συχνότητα εμφάνισης και η θνησιμότητα της νόσου [2]. Τα διαθέσιμα εργαλεία διαλογής περιλαμβάνουν κοπράνων δοκιμή λανθάνουσας αιμορραγίας (FOBT), τεστ DNA κοπράνων, σιγμοειδοσκόπηση, CT colonography και κολονοσκόπηση. Διαφορετικές στρατηγικές ελέγχου είναι στη θέση τους σε διάφορες χώρες. Ωστόσο, η συμμόρφωση με τις τρέχουσες συστάσεις ελέγχου CRC παραμένει φτωχή. Το χαμηλό ποσοστό συμμετοχής στην CRC ελέγχου οφείλεται σε έναν αριθμό παραγόντων, συμπεριλαμβανομένης της χαμηλής ακρίβειας των σημερινών μεθόδων σκαμνί προσυμπτωματικό έλεγχο, δυσφορία του ασθενούς και η κακή αποδοχής για τις μεθόδους που βασίζονται ενδοσκόπηση. Μια ακριβής, ελάχιστα επεμβατική εξέταση αίματος που έχει τη δυνατότητα για μεγαλύτερη συμμόρφωση του ασθενούς θα ήταν μια ευπρόσδεκτη προσθήκη στις τρέχουσες μεθόδους. Όταν μια ανωμαλία έχει ανιχνευθεί από την εξέταση αίματος, περαιτέρω δοκιμές που περιλαμβάνουν κολονοσκόπηση και παθολογική εξέταση θα πρέπει να συνιστάται να επιβεβαιώσει αν η ανιχνεύθηκε ανωμαλία είναι CRC.

Εμείς και άλλοι στο παρελθόν έδειξε την πιθανή χρήση των προφίλ γονιδιακής έκφρασης των δείγματα ολικού αίματος για την ανίχνευση και τη διάγνωση του καρκίνου [3] – [9]. Πριν από την κλινική εκδήλωση της CRC, η οποία συνήθως διαρκεί αρκετά χρόνια, ο ξενιστής αντιδρά στην εμφύτευση των καρκινικών κυττάρων μέσω της ενεργοποιημένης ανοσοποιητικό σύστημα [10]. Η ενεργοποίηση του ανοσοποιητικού συστήματος αντανακλάται σε αλλαγές στο προφίλ γονιδιακής έκφρασης του ανοσοποιητικού ικανών κυττάρων του αίματος, και αυτές οι αλλαγές είναι ανιχνεύσιμα στο περιφερικό αίμα [11], [12]. Σε αυτή τη μελέτη, εκτελέσαμε προφίλ γονιδιακής έκφρασης των κυττάρων του περιφερικού αίματος με τη χρήση της τεχνολογίας PAXgene ™ και μικροσυστοιχίες Affymetrix GeneChip®. Εντοπίστηκαν Ένας μεγάλος αριθμός γονιδίων που εκφράζονται διαφορικά μεταξύ των ελέγχων και CRC ασθενείς. Ιδιαίτερα, έχουμε αναφερθεί τα προφίλ υπερέκφραση της Toll-Like Υποδοχέα (TLR) οδών σηματοδότησης που σχετίζονται με τα γονίδια στο CRC για να ανοίξει το δρόμο για περαιτέρω λειτουργικές μελέτες.

Υλικά και Μέθοδοι

Ασθενείς και συλλογή δείγματος

Αυτή η μελέτη πραγματοποιήθηκε στο Πανεπιστήμιο Fudan της Σαγκάης Cancer Center (FDUSCC), Σαγκάη, Κίνα. Η μελέτη εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας της FDUSCC για την κλινική έρευνα. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους συμμετέχοντες. Είκοσι ασθενείς CRC προσλήφθηκαν στο Τμήμα παχέος Χειρουργικής, FDUSCC. Κανένας ασθενής δεν έλαβε προεγχειρητική ακτινοθεραπεία ή χημειοθεραπεία. Οι ασθενείς που πάσχουν από κληρονομική CRC ή φλεγμονώδεις νόσους του εντέρου (νόσος του Crohn ή ελκώδη κολίτιδα) αποκλείστηκαν από τη μελέτη αυτή. Είκοσι υγιείς εθελοντές χωρίς γαστρεντερικά συμπτώματα (διάρροια και κοιλιακό άλγος) είχαν προσληφθεί μέσω FDUSCC. Όλοι οι συμμετέχοντες είχαν τη συλλογή αίματος τουλάχιστον επτά ημέρες μετά την κολονοσκόπηση εξέταση. Για κάθε συλλογή, 2,5 ml περιφερικού αίματος τραβιέται μέσα σε PAXgene ™ σωλήνα RNA Blood (PreAnalytiX GmbH, Hombrechtikon, CH) και αποθηκεύτηκε στους -80 ° C.

RNA Εκχύλιση και Microarray Πειράματα

Ολικό RNA εκχυλίστηκε με το ™ RNA Σύστημα Blood PAXgene (PreAnalytiX GmbH). Η ποσότητα του συνολικού RNA μετρήθηκε με ένα φασματοφωτόμετρο στα 260 νανόμετρα, και η ακεραιότητα του RNA αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ένα RNA 6000 Νανο LabChip® Κιτ ένα BioAnalyzer Agilent 2100 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA). Όλα τα δείγματα πληρούσαν το κριτήριο ποιότητας: RNA Ακεραιότητα Αριθμός & gt? 7.0 [13]. Πενήντα νανογραμμάρια ολικού RNA μεταγράφηκαν αντίστροφα και γραμμικά ενισχύθηκε ως μονόκλωνο cDNA χρησιμοποιώντας τεχνολογία ριβο-SPIA ™ με το WT-Ovation ™ RNA Amplification System (NuGEN Technologies Inc., San Carlos, CA, USA), και τα προϊόντα καθαρίστηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ καθαρισμού QIAquick ™ PCR (QIAGEN GmbH, Hilden, Germany). Δύο μικρογραμμάρια ενισχύεται και καθαρισμένου cDNA στη συνέχεια κατακερματισμένη με RQ1 RNase-Free DNase (Promega Corp., Fitchburg, WI, USA) και επισημάνθηκαν με βιοτινυλιωμένο τριφωσφορικών δεοξυνουκλεοζιτών χρησιμοποιώντας τερματική τρανσφεράση (Roche Diagnostics Corp., Indianapolis, ΙΝ, USA) και η Αντιδραστήριο GeneChip® DNA Labeling (Affymetrix Inc., Santa Clara, CA, USA). Το σημασμένο cDNA υβριδοποιήθηκε επί του 2,0 Array GeneChip® HG U133 Plus σε Hybridization Φούρνος 640 (Agilent Technologies) στους 60 περιστροφές ανά λεπτό στους 50 ° C για 18 ώρες. Μετά τον υβριδισμό, οι συστοιχίες εκπλύθηκαν και χρωματίστηκαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο Affymetrix EukGE-WS2v4 χρησιμοποιώντας ένα ρευστών Station GeneChip® 450 (Affymetrix). Οι συστοιχίες σαρώθηκαν με σαρωτή GeneChip® 3000 (Affymetrix). Τα δεδομένα μικροσυστοιχιών έχουν κατατεθεί στο δημόσιο αποθετήριο ArrayExpress [14] με τον αριθμό πρόσβασης E-Μπειραμ-3756.

Στατιστική Ανάλυση

αναλύσεις των δεδομένων γονιδιακής έκφρασης διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό R και πακέτα από το έργο Bioconductor [15] – [17]. Τα ανεπεξέργαστα δεδομένα που συλλέχθηκαν από τα αρχεία CEL και σε προεπεξεργασία, χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο Στιβαρή πολλαπλών ψηφίδων Μέση (RMA) για διόρθωση υποβάθρου, ποσοστημόριο εξομάλυνση και η διάμεση βερνίκι περιληπτική [18], [19]. Τα δεδομένα αισθητήρα-set-επιπέδου ήταν log2-μεταμορφωθεί. Επιπλέον, θα εφαρμοστεί μια προσέγγιση φιλτραρίσματος βιοπληροφορικής με βάση τη χρήση των πληροφοριών στη βάση δεδομένων Entrez Gene [20]. σετ καθετήρα χωρίς Εηίτεζ Gene ID σχολιασμό αφαιρέθηκαν. Για πολλαπλές καθετήρα θέτει χαρτογράφηση στο ίδιο Εηίτεζ Gene ID, μετρήστε μόνο σύνολα που δείχνει το μεγαλύτερο μεταξύ quantile φάσμα κρατήθηκαν, και οι υπόλοιποι αποκλείονται.

Σημασία Ανάλυση των μικροσυστοιχιών μέθοδο (SAM) [21] χρησιμοποιήθηκε για να ταυτοποιηθούν γονίδια εκφράζονται διαφορικά μεταξύ των ομάδων ελέγχου και CRC. Για μελέτες γονιδιακής έκφρασης που περιλαμβάνουν microarrays, έχει γίνει κοινή πρακτική να επικεντρωθεί στον έλεγχο του ρυθμού ψευδών ανακάλυψη (FDR), η οποία υπολογίζει το αναμενόμενο ποσοστό εσφαλμένων απορρίψεων από τις απέρριψε υποθέσεις [22], [23]. Για την ελαχιστοποίηση false positives, θέσαμε το όριο του FDR σε 0,01 για όλες τις συγκρίσεις. Γονιδιακή Οντολογία (https://www.geneontology.org) [24] και Panther ανάλυση μονοπατιού (https://www.pantherdb.org/pathway) [25] πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του εργαλείου βιοπληροφορικής GeneCodis [26] και το λογισμικό MetaCore ™ (GeneGo Inc., USA).

γονιδιακής έκφρασης Ανάλυση από ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR

Για κάθε δείγμα, 200 ng ολικού RNA μεταγράφηκε αντίστροφα σε cDNA χρησιμοποιώντας Prime Script ™ ανάστροφης μεταγραφάσης (Takara, Dalian, Κίνα). Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου πραγματοποιήθηκε με το σύστημα LightCyclerH 480 (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) σε 96-φρεατίων χρησιμοποιώντας SYBR Premix Εχ Taq ™ (Takara, Dalian, Κίνα). Primer αλληλουχίες των γονιδίων στόχων δόθηκαν στον Πίνακα S1.

CSNK1G2

(κινάση καζεΐνης 1, γάμμα 2) είχε προηγουμένως δειχθεί ότι εκφράζεται σταθερά σε ανθρώπινο πλήρες αίμα [27], και έτσι χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Η σχετική ποσοτικοποίηση της έκφρασης mRNA υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την μέθοδο που περιγράφεται από Vandesompele

κ.ά.

[28]. Συγκρίσεις των προφίλ γονιδιακής έκφρασης μεταξύ δύο δείγματα αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας δοκιμασία t του Welch του. Οι δοκιμές σημαντικότητας ήταν διπλής όψης, και

P

τιμή κάτω από 0.05 θεωρήθηκε σημαντική.

Αποτελέσματα

Η μελέτη μας περιελάμβανε 20 ασθενείς CRC και 20 υγιείς μάρτυρες. Όλοι οι συμμετέχοντες ήταν Κινέζοι, μεταξύ των οποίων 18 άνδρες και 22 γυναίκες με μέση ηλικία 58 έτη (εύρος, 42 έως 69 ετών). Οι κατανομές ηλικία και το φύλο ήταν ισορροπημένα μεταξύ των ομάδων ελέγχου και CRC. Οι όγκοι οργανώθηκαν σύμφωνα με την-Tumor Node-Μετάσταση συστήματος (TNM). Δύο από τους ασθενείς CRC ήταν σταδίου Ι, 7 ήταν σταδίου ΙΙ, 6 ήταν σταδίου ΙΙΙ, και 5 ήταν σταδίου IV. Οι λεπτομερείς προδιαγραφές των ασθενών περιγράφονται στον Πίνακα 1 και Πίνακα S2.

Η

Η πρόσφατη απελευθέρωση της μικροσυστοιχιών HG-U133plus2 προσφέρει 54.000 σύνολα ανιχνευτών για τη διαλογή 38.500 ανθρώπινα γονίδια. Αντιμέτωποι με μια τέτοια συντριπτική ποσότητα των πληροφοριών, ήταν αναγκαίο να μειωθεί ο συνολικός αριθμός των γονιδίων που αναλύεται σε ένα διαχειρίσιμο αριθμό γονιδίων με επαληθεύονται βιολογικά συστήματα σχολιασμού και τη χρήση απεικόνισης για να διευκολύνει την αναγνώριση των προτύπων στα δεδομένα [29]. Έτσι πραγματοποιείται μια διαδικασία φιλτραρίσματος βιοπληροφορικής που βασίζεται να συνοψίσει τα σύνολα ελέγχων σε επίπεδο γονιδίων και αποκλείει αυτά τα σύνολα καθετήρα με χαμηλού βαθμού βιολογική σχολιασμούς. Μετά από διήθηση, τα προφίλ έκφρασης του 9529 μοναδικά γονίδια σε 20 ασθενείς CRC και 20 έλεγχοι κρατήθηκαν για ανάλυση κατάντη.

Διαφορικό εκφραζόμενα γονίδια (βαθμούς με) μεταξύ των ομάδων ελέγχου και CRC ταυτοποιήθηκαν με την ανάλυση SAM (FDR = 0,01? type = «Δύο κατηγορία αταίριαστα»? στατιστικό τεστ = «t-στατιστικό στοιχείο»? αριθμός των μεταθέσεων = 1.000). Συνολικά, 881 και 588 γονιδίων βρέθηκαν να είναι πάνω και κάτω ρυθμίζονται στους ασθενείς CRC. Λειτουργική ανάλυση εμπλουτισμός των γονιδίων Οντολογία και την πορεία Panther διεξήχθησαν με ένα όριο σημαντικότητας 0,05 για το προσαρμοσμένο

P

αξία. Η ανάλυση οδός Panther αποκάλυψε μια λίστα των 22 κανονικών μονοπατιών που ήταν σημαντικά εμπλουτισμένη στη λίστα DEG. Όπως ήταν αναμενόμενο, μονοπάτια που σχετίζονται με συγκεκριμένες λειτουργίες του ανοσοποιητικού αντιπροσωπεύθηκαν καλά και πολύ σημαντική, συμπεριλαμβανομένης της ενεργοποίησης των Β κυττάρων, την ενεργοποίηση των Τ κυττάρων, μονοπάτι σηματοδότησης ιντερφερόνη-γάμμα, και ιντερλευκίνη μονοπάτι σηματοδότησης. Παράλληλα, αρκετές οδούς που σχετίζονται με αγγειογένεση, συμπεριλαμβανομένης της PDGF, VEGF και FGF μονοπατιών σηματοδότησης ήταν επίσης σημαντικά υπερεκπροσωπούνται. Τα δέκα κορυφαία σχετίζεται μοριακών οδών και των σχετικών γονιδίων φαίνονται στον Πίνακα 2. Εκτός από τον προσδιορισμό των σημαντικών κανονικά μονοπάτια, ελέγξαμε επίσης τα γονίδια που σχετίζονται με λειτουργικές κατηγορίες. Η ανάλυση Γονιδιακή Οντολογία αποκάλυψε συνολικά 74 Βιολογικών κατηγορίες Διαδικασία που ήταν σημαντικά υπερεκπροσωπούνται, συμπεριλαμβανομένων έμφυτη ανοσολογική απόκριση, μεταγωγή σήματος, πρωτεΐνη μεταφοράς, αποπτωτική διαδικασία, η φωσφορυλίωση των πρωτεϊνών και ιογενή αναπαραγωγής. Οι δέκα συνδέονται Βιολογικών Κατηγορίες διαδικασίας παρατίθενται στον Πίνακα 3.

Η

Αξίζει να σημειωθεί ότι, τα μονοπάτια σηματοδότησης TLR ήταν η πιο σημαντικά εμπλουτισμένη στοιχείο τόσο στην οδό Panther και GO ανάλυση (GO0002224: toll- όπως σηματοδοτικό μονοπάτι του υποδοχέα,

P =

1.7E-8? GO0002755: MyD88 που εξαρτώνται από τον υποδοχέα σηματοδότηση μονοπατιού διοδίων-όπως,

P =

1.1E-7? GO0034142: υποδοχέα ΤοΙΙ 4 μονοπάτι σηματοδότησης,

P =

1.1E-7 και Panther00054: μονοπατιού σηματοδότησης υποδοχέα Toll,

P =

1.1E-06). Η TLR οδούς από το λογισμικό MetaCore ™ σηματοδότησης απεικονίζονται γραφικά στο Σχήμα 1. Όπως παρατηρείται από το γράφημα, πολλαπλά TLRs (

TLR1, TLR2, TLR4, TLR6

και

TLR8

), καθώς και ως κατάντη τους στόχους, ήταν σημαντικά επάνω ρυθμισμένη στους ασθενείς CRC. Επιπλέον, ενδογενείς συνδέτες για TLRs εντοπίστηκαν επίσης, συμπεριλαμβανομένων

HSP70

και

HMGB1

, τα οποία έχουν δειχθεί ότι ρυθμίζουν

TLR2

και

TLR4

σε επιφάνειες των κυττάρων του όγκου και επάγουν την εξέλιξη του όγκου και τη μετάσταση [30], [31]. Τα ενεργοποιημένα TLRs τότε προσλαμβάνουν

MyD88

, οδηγώντας σε επακόλουθη ενεργοποίηση των κατάντη στόχων, συμπεριλαμβανομένων των

NF-κΒ

, μιτογόνα σχετίζεται πρωτεΐνης (ΜΑΡ) κινάσης και ιντερφερόνη ρυθμιστικούς παράγοντες [32].

Η εικονογράφηση μονοπάτι δημιουργήθηκε και που συνδέονται με τα διαθέσιμα πειραματικά δεδομένα στη σουίτα MetaCore ™. Δώδεκα γονίδια (

TLR1, TLR2, TLR4, TLR6, TLR8, MyD88, MD-2, Beclin 1, ΤΑΒ2, TAK1, IRAKM

και

ΙκΒ)

ότι μέχρι ρυθμίζεται στους ασθενείς CRC συνδέονται με Toll Like-υποδοχέων μονοπάτια σηματοδότησης και μπορούν να απεικονιστούν στο χάρτη ως στοιχεία θερμόμετρο-όπως. Up-Ward θερμόμετρα έχουν κόκκινο χρώμα και δείχνουν up-ρυθμίζονται τα επίπεδα της γονιδιακής έκφρασης στους ασθενείς CRC.

Η

Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου θεωρείται γενικά ως το «χρυσό πρότυπο» δοκιμασία για τη μέτρηση της γονιδιακής έκφρασης και χρησιμοποιείται συχνά για να επιβεβαιώσουν τα ευρήματα των μελετών μικροσυστοιχιών [33]. έτσι έχουμε επιλέξει έξι TLR οδούς σηματοδότησης που σχετίζονται με γονίδια (

IRAK3, MD2

,

TLR1, TLR2, TLR4

και

TLR8

) για την ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου επικύρωσης. Τα αποτελέσματα, όπως φαίνονται στον Πίνακα 4, έδειξε ότι τα προφίλ γονιδιακής έκφρασης προσδιορίζεται με υβριδισμό μικροσυστοιχιών και ποσοτική ανάλυση πραγματικού χρόνου ήταν εξαιρετικά συγκρίσιμα. Τα προφίλ υπερέκφραση της γονιδιακής στους ασθενείς CRC επιβεβαιώθηκαν στα δεδομένα PCR πραγματικού χρόνου.

Η

Συζήτηση

Η έγκαιρη ανίχνευση του CRC είναι ζωτικής σημασίας για την επιτυχή θεραπεία και την επιβίωση των ασθενών. Ωστόσο, η έλλειψη συμμόρφωσης παραμένει η μεγαλύτερη πρόκληση που περιορίζουν σήμερα την αποτελεσματικότητα ελέγχου CRC. Η πλούσια περιεκτικότητα των διαφόρων κυτταρικών και μοριακών στοιχείων στο αίμα, τα οποία παρέχουν πληροφορίες σχετικά με την κατάσταση της υγείας ενός ατόμου, είναι ένα ιδανικό χώρο για την ανάπτυξη μη επεμβατικές δοκιμασίες για την ανίχνευση CRC [34] κάνει. Σε αυτή τη μελέτη, εκτελέσαμε παγκόσμια προφίλ γονιδιακής έκφρασης των δειγμάτων περιφερικού αίματος που συλλέγονται από 20 ελέγχους και 20 CRC ασθενείς. Έχουμε εντοπίσει μια λίστα με 1.469 συναίνεση γονιδίων που εκφράζονται διαφορικά μεταξύ των ελέγχων και CRCs. Τα αποτελέσματά μας είναι συνεπή με προηγούμενες μελέτες [3], [5], [9] και δείχνουν ότι οι περισσότερες βαθμούς με εμπλέκονται σε ανοσοαποκρίσεις, καθώς και κυτταρική απόπτωση, μεταγωγή σήματος, τη μεταφορά πρωτεΐνης και ρύθμιση γονιδιακής έκφρασης.

Ίσως το πιο εντυπωσιακό αποτέλεσμα που θα προκύψει από τα δεδομένα είναι η υπερέκφραση της TLR σηματοδότηση γονίδια που σχετίζονται οδού σε ασθενείς CRC. TLRs, τα ομόλογα θηλαστικών της πρωτεΐνης διοδίων Drosophila, είναι η καλύτερη χαρακτηρισμένη οικογένεια υποδοχέων μοτίβο αναγνώρισης (PRRs) [35]. Μέχρι σήμερα, TLRs 1-10 έχουν εντοπιστεί σε ανθρώπους [36]. TLRs διαδραματίζουν κρίσιμο ρόλο στην έμφυτη ανοσοαπόκριση και την επακόλουθη επαγωγή της προσαρμοστικής ανοσοαποκρίσεων έναντι μικροβιακής μόλυνσης ή τραυματισμού των ιστών [37], [38]. Πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι οι λειτουργικές TLRs εκφράζονται όχι μόνο στα κύτταρα του ανοσοποιητικού αλλά επίσης σε καρκινικά κύτταρα, ενοχοποιώντας έτσι ένα ρόλο TLRs σε όγκο βιολογία [39], [40]. Ένας αυξανόμενος φορείς σώμα της στοιχεία έχουν δείξει ότι TLRs ενεργεί ως δίκοπο μαχαίρι στα καρκινικά κύτταρα [41]. Από τη μια πλευρά, TLRs παίζουν καθοριστικό ρόλο στην ενεργοποίηση της αντικαρκινικής ανοσολογικές αποκρίσεις με σκοπό την αναστολή της προόδου του όγκου. Από την άλλη πλευρά, απορρυθμισμένη TLR σηματοδότηση μπορεί να παρέχει ένα μικροπεριβάλλον που είναι απαραίτητη για τα καρκινικά κύτταρα να πολλαπλασιάζονται και να αποφύγει την ανοσολογική απόκριση [42].

Ειδικότερα, έχουν υπάρξει αρκετές μελέτες αναφέρουν σύνδεσης μεταξύ TLRs και του παχέος νεοπλασία. Fukata

et al.

Έδειξαν ότι TLR4 υπερεκφράστηκε σε ποντικό που σχετίζεται με φλεγμονή του παχέος νεοπλασία. Οι ποντικοί TLR4 με ανεπάρκεια ήταν σημαντικά προστατεύεται από καρκινογένεση κόλον [43]. Wang

et al.

Ανέφεραν υψηλά επίπεδα έκφρασης του TLR4 και MyD88 σχετίζεται με μετάσταση στο ήπαρ και πτωχή πρόγνωση σε ασθενείς CRC [44]. Επιπλέον, TLR4 και IL-6 έκφραση στο μικροπεριβάλλον του όγκου συσχετίστηκαν με την παρουσία του αδενοκαρκινώματος, και υψηλότερα επίπεδα έκφρασης TLR4 στο στρώμα του όγκου παρατηρήθηκαν με την εξέλιξη της νόσου [45].

Καθώς η πρώτη γραμμή του ανοσολογική άμυνα, κύτταρα περιφερικού αίματος έχει αποδειχθεί ότι εκφράζουν όλα τα TLRs και εμφανίζουν υψηλότερα επίπεδα TLR mRNAs σε σύγκριση με άλλους ιστούς [46]. Εμείς υποθέσουμε ότι η προς τα πάνω ρύθμιση των γονιδίων σηματοδότησης που σχετίζονται με TLR στο περιφερικό αίμα είναι πιθανόν να οφείλεται τόσο στην διείσδυση του TLR-εκφράζουν φλεγμονωδών κυττάρων και την προς τα πάνω ρύθμιση της έκφρασης του υποδοχέα σε αυτά τα κύτταρα που λαμβάνει χώρα σε απόκριση σε ερεθίσματα ανάπτυξης του όγκου. θα χρειαστεί περαιτέρω έρευνα για να κατανοήσουμε τη μηχανιστική σχέση και τις βιολογικές έννοιες της υπερέκφραση των οδών TLR σχετικών γονιδίων σε ασθενείς CRC. Δεδομένου η θεραπευτική χρήση των αγωνιστών TLR έχει διερευνηθεί σε διάφορα μοντέλα καρκίνου του [41], η συστηματική μελέτη των λειτουργιών TLRs »μπορεί να συμβάλει ουσιαστικά στην ανάπτυξη νέων στόχων για τη διάγνωση και τη θεραπεία της CRC.

Εν κατακλείδι , δείχνουμε ότι η παρακολούθηση γονιδιακής έκφρασης στα αποτελέσματα του αίματος σε διακριτές μεταγραφικό προφίλ μεταξύ των ελέγχων και των ασθενών CRC. Έτσι, μικροσυστοιχιών με βάση το προφίλ της γονιδιακής έκφρασης στο αίμα και πολλά υποσχόμενο για την ανάπτυξη νέων βιοδεικτών για την ανίχνευση CRC. Μελλοντικές μελέτες θα πρέπει να περιλαμβάνει περισσότερα δείγματα για τον προσδιορισμό και την επικύρωση των βιοδεικτών. Επιπλέον, δεδομένου ότι CRC θεωρείται ότι είναι ένας γενετικά και επιγενετικώς ετερογενής νόσος [47], θα ήταν επίσης ενδιαφέρον να διερευνηθεί το προφίλ γονιδιακής έκφρασης στο αίμα διαφορετικών υποτύπων, που μπορεί να παρέχει μια νέα αντίληψη της CRC.

Συμπληρωματικές πληροφορίες

πίνακα S1.

Primer ακολουθίες των TLR που σχετίζονται με τα γονίδια και

CSNK1G2

γονίδιο αναφοράς

doi:. 10.1371 /journal.pone.0062870.s001

(DOCX)

Πίνακας S2.

Λεπτομερείς κλινικές πληροφορίες του ελέγχου και CRC Ασθενείς

doi:. 10.1371 /journal.pone.0062870.s002

(DOCX)

Ευχαριστίες

Θα θέλαμε να ευχαριστήσουμε όλους των συμμετεχόντων σε αυτή τη μελέτη για τη συμβολή τους. Εκτιμούμε ιδιαίτερα τις προσπάθειες των Wencui Huang και οι συνεργάτες της στο Τμήμα παχέος Χειρουργικής, Πανεπιστήμιο Fudan της Σαγκάης Κέντρο Καρκίνου και την εξαιρετική δουλειά τους στην συλλογή του δείγματος.