Abstract

Tumor καταστολέα ρ53, η οποία ενεργοποιείται από διάφορα στρες και ογκογονιδίου ενεργοποίησης, είναι ένας στόχος για την ανάπτυξη φαρμάκων κατά του καρκίνου. Σε αυτή τη μελέτη, με διαλογή πάνελ των αναστολέων πρωτεϊνικής κινάσης και αναστολείς πρωτεΐνης φωσφατάσης, εντοπίσαμε 5-Iodotubercidin ως ένα ισχυρό ενεργοποιητή ρ53. 5-Iodotubercidin είναι παράγωγο πουρίνης και χρησιμοποιείται ως αναστολέας για διάφορες κινάσες συμπεριλαμβανομένων κινάσης αδενοσίνης. Βρήκαμε ότι το 5-Iodotubercidin θα μπορούσαν να προκαλέσουν βλάβη του DNA, επαληθεύεται από επαγωγή διαλείμματα DNA και πυρηνική εστίες θετικό για γH2AX και TopBP1, η ενεργοποίηση των ΑΤΜ και Chk2, και φωσφορυλίωση S15 και αυξητική ρύθμιση της ρ53. Ως τέτοια, 5-Iodotubercidin επάγει διακοπή κύκλου G2 κυττάρου σε ρ53-εξαρτώμενο τρόπο. ITU προκαλεί επίσης τον κυτταρικό θάνατο σε p53-εξαρτώμενη και ανεξάρτητη από τρόπους. διαλείμματα του DNA ήταν πιθανό δημιουργούνται με ενσωμάτωση της 5-Iodotubercidin μεταβολίτη στο DNA. Επιπλέον, 5-Iodotubercidin έδειξαν αντικαρκινική δραστικότητα, όπως θα μπορούσε να μειώσει το μέγεθος του όγκου σε καρκίνωμα μοντέλα ξενομοσχεύματος ποντικού σε ρ53-εξαρτώμενη και ανεξάρτητη από τρόπους. Τα ευρήματα αποκαλύπτουν 5-Iodotubercidin ως νέου γονοτοξικό φάρμακο που έχει χημειοθεραπευτικό δυναμικό

Παράθεση:. Zhang Χ, Jia D, Liu H, Zhu Ν, Zhang W, Feng J, et al. (2013) Ταυτοποίηση των 5-Iodotubercidin ως Γονοτοξική ναρκωτικά με Anti-Cancer δυναμικό. PLoS ONE 8 (5): e62527. doi: 10.1371 /journal.pone.0062527

Επεξεργαστής: Ο Carl G. Μάκη, του Πανεπιστημίου Rush Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 17, Δεκεμβρίου, 2012? Αποδεκτές: 22 Μαρ 2013? Δημοσιεύθηκε: May 7, 2013

Copyright: © 2013 Zhang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (81130039, 31071229 και 81121001), το Υπουργείο Επιστήμης και Τεχνολογίας της Κίνας (το Εθνικό Key Επιστημονικό Πρόγραμμα (2012CB966901, με BL)), Σαγκάη Pujiang Πρόγραμμα (10PJ1405000), Cheung Kong Πρόγραμμα Υποτρόφων του Υπουργείου Παιδείας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος είναι μία από τις κύριες αιτίες θνησιμότητας παγκοσμίως. Σύμφωνα με τα πρόσφατα κυκλοφόρησε δεδομένα, υπήρχαν 12,7 εκατομμύρια νέα κρούσματα καρκίνου και 7,6 εκατομμύρια ασθενείς με καρκίνο πέθανε το 2008, με τον καρκίνο του μαστού είναι πιο κοινή στις γυναίκες και ο καρκίνος του πνεύμονα πιο συχνή στους άνδρες [1]. θεραπεία του καρκίνου περιλαμβάνει χειρουργικές διαδικασίες για την αφαίρεση κακοήθη ιστό και τη χρήση των ακτινοθεραπεία και τη χημειοθεραπεία για να σκοτώσουν κακοήθη κύτταρα και /ή να περιορίσει την ανάπτυξη του όγκου. Χημειοθεραπευτικά φάρμακα κατατάσσονται σε αλκυλιωτικούς παράγοντες, αντι-μεταβολίτες, αναστολείς τοποϊσομεράσης, φυτικά αλκαλοειδή και τερπενοειδή, αντιβιοτικά κατά του όγκου, και άλλοι [2]. Μέχρι σήμερα, υπάρχει μια έλλειψη αστοχίες θεραπεία για τα περισσότερα είδη καρκίνου [3].

Αντι-μεταβολίτες είναι παράγωγα νουκλεοζιτών, συμπεριλαμβανομένων των αναλόγων πυριμιδίνης. π.χ., γεμσιταβίνη και ανάλογα πουρίνης, π.χ., φλουδαραβίνη [4]. Μπορούν να ενσωματωθούν στο DNA, οδηγώντας σε τερματισμό της εν τω γεννάσθαι επέκταση κλώνου DNA. Μερικά ανάλογα νουκλεοσιδίου μπορεί επίσης να αναστέλλουν τα ένζυμα που εμπλέκονται στη σύνθεση του DNA ή τα ένζυμα που διατηρούν δεοξυνουκλεοτιδίων ομοιόσταση, περαιτέρω παρεμβαίνοντας σύνθεση του DNA. Ως εκ τούτου, πολλά από αυτά τα ανάλογα νουκλεοζιτών προκαλέσουν βλάβη του DNA, συμπεριλαμβανομένων δίκλωνου DNA και ενιαία σπάει να ενεργοποιήσει τους εσωτερικούς μηχανισμούς άμυνας για να σκοτώσει ταχεία διαιρούμενα κύτταρα ή κύτταρα που υποβάλλονται σε ενεργή επιδιόρθωση του DNA, ή να προκαλέσει διακοπή του κυτταρικού κύκλου στην φάση S [4]. Αυτό είναι ένα σημαντικό μηχανισμό με τον οποίο τα περισσότερα αντι-μεταβολίτες εκτελούν αντικαρκινική δράση τους.

Σε κύτταρα, βλάβη του DNA ή γονιδιοτοξικές φάρμακο ενεργοποιεί μια οικογένεια ΡΙ3Κ όπως κινασών (PIKKs), συμπεριλαμβανομένων ΑΤΜ, ATR και τα DNA- PKcs στα διαλείμματα του DNA ή στασιμότητα πιρούνια αντιγραφή, όπου φωσφορυλιώνει διάφορες πρωτεΐνες συμπεριλαμβανομένων γH2AX, TopBP1, Chk1 /2 και p53. Η ολοκληρωμένη ενεργοποίηση αυτών των πρωτεϊνών τελεστών προκαλεί διακοπή του κυτταρικού κύκλου, κυτταρική γήρανση ή απόπτωση [5], [6]. Ως αποτέλεσμα, τα κύτταρα με ασταθή γονιδίωμα εξαλειφθεί, το οποίο εμποδίζει το σχηματισμό όγκων [7] – [11]. Η οδός Atm-p53 είναι μια σημαντική οδός καταστολής όγκων και είναι μεταλλαγμένο p53 σε περισσότερες από 50% των ανθρώπινων πρωτογενών όγκων [12] – [14].

ενεργοποιήσεως ρ53 προάγει διακοπή του κυτταρικού κύκλου, γήρανση και την απόπτωση. Η ενεργοποίηση ή αυξητική ρύθμιση της ρ53 σε όγκους έχει δειχθεί ότι αναστέλλει την ανάπτυξη του όγκου, για την ίδρυση ρ53 ως ένας στόχος για την ανάπτυξη φαρμάκων κατά του καρκίνου [13], [15]. Αρκετές ενώσεις μικρού μορίου έχουν αναπτυχθεί που στοχεύουν ειδικά αλληλεπίδραση Mdm2-p53, p53 σταθεροποιηθεί, και αναστέλλουν την ανάπτυξη του όγκου. Επιπλέον, ρ53 μπορεί να παραδοθεί σε όγκους με ιούς και αυτό έχει αποδειχθεί ότι έχει σημαντικές θεραπευτικές επιδράσεις [16]. Για την αναζήτηση νέων πιθανών φαρμάκων κατά των όγκων, μπορούμε διαλογή αναστολείς μικρού μορίου ενός πάνελ των πρωτεϊνικών κινασών και ένα πάνελ φωσφατασών πρωτεΐνης για ενώσεις που θα μπορούσαν να ενεργοποιήσουν p53 [17]. Εδώ αναφέρουμε την ταυτοποίηση των 5-Iodotubercidin (ITU) ως ενεργοποιητής p53. Itu χρησιμοποιείται ως γενικός αναστολέας κινάσης, ιδιαίτερα κινάση αδενοσίνης (ΑϋΚ) λόγω της συγγένειάς της με την ΑΤΡ-σύνδεσης θέσεις αυτών των ενζύμων και έχει αποδειχθεί ότι επηρεάζουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την επιβίωση. ΑϋΚ καταλύει τη μεταφορά της ομάδας γ-φωσφορικής ΑΤΡ προς αδενοσίνη, έτσι κάτω ρύθμιση των κυτταρικών επιπέδων των νουκλεοτιδίων αδενίνης [18] – [20]. ITU έχει μια δομή παρόμοια με αδενοσίνη και δείχθηκε εδώ για να δημιουργηθεί βλάβη του DNA, ενεργοποιούν το μονοπάτι Atm-p53, και επάγουν διακοπή του κυτταρικού κύκλου σε φάση G2 σε ρ53-εξαρτώμενη τρόπους. ITU επίσης προωθεί τον κυτταρικό θάνατο σε p53-εξαρτώμενη και ανεξάρτητη από τρόπους. Το πιο σημαντικό, το ITU βρέθηκε να έχει αντικαρκινική δραστικότητα, επίσης σε ρ53-εξαρτώμενη και ανεξάρτητη από τρόπους. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι ITU αποτελεί ένα δυνητικό χημειοθεραπευτικό φάρμακο με ιδιότητες διαφορετικές από τις περισσότερες άλλες αντι-μεταβολίτες. Από Itu εκτελεί αντικαρκινική δραστικότητα του κυρίως μέσω δημιουργίας βλάβη του DNA, η ITU μπορεί επίσης να προκαλέσει αστάθεια του γονιδιώματος σε φυσιολογικά κύτταρα και ενδεχομένως να οδηγήσει στην ανάπτυξη του καρκίνου. Έτσι, πρέπει να δίνεται προσοχή κατά τη χρήση της ITU για την πιθανή μη-καρκίνου που σχετίζονται με το θεραπευτικό σκοπό.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Τα πειράματα σε ζώα σε αυτή τη μελέτη, συμπεριλαμβανομένων των BALB /cASlac γυμνά ποντίκια, κανονική C57B /6 ποντίκια, ATM +/- ποντίκια, πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τις συστάσεις του Εθνικού Συμβουλίου Έρευνας Οδηγός για τη Φροντίδα και Χρήση ζώων Εργαστηρίου, με τα πρωτόκολλα που εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Θεσμικών Ζωικά Φροντίδα και Χρήση της Σαγκάης , China [SYXK (SH) 2011-0112]. Όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιηθεί η ταλαιπωρία των ποντικών

Πολιτισμός τηλέφωνα

Το έμβρυο ινοβλαστών πρωτοβάθμια ποντίκι (ΥΠΟΙΟ) κυττάρων (από C57B /6 ποντίκια) και ΑΤΜ -. /- ΠΜΑ (από 129 ποντίκια ) δημιουργήθηκαν στο εργαστήριο όπως περιγράφηκε προηγουμένως [11]. Η HCT116 ανθρώπινου καρκίνου κόλου κυτταρικές γραμμές (p53 + /+) και HCT116 (ρ53 – /-) ήταν ένα δώρο από εργαστήριο Β Vogelstein του [21], [22]. Αυτά τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε DMEM συμπληρωμένο με 10% θερμο-απενεργοποιημένο ορό εμβρύου μόσχου (Hyclone) στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα με 5% CO

2.

Ανάλυση Western Blot

τα κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό ΤΝΕΝ (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,5% ΝΡ-40, και 0.1% Triton Χ-100) συμπληρωμένο με 1 mM NaF, Na

2VO

3, 1 mM PMSF, και 1 μg /ml του απρωτινίνης, λευπεπτίνης, και πεπστατίνη Α συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία Bio-Rad. Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες πολυβινυλιδενο διφθοριούχου (Millipore). Αντισώματα έναντι π-Atm, ρ-Chk2 (Thr68), Chk2, ρ-p53 (Ser15), ή ρ53 ελήφθησαν από την Cell Signaling. Αντισώματα έναντι Atm (GTX70103) ήταν από Genetex. Αντισώματα έναντι β-ακτίνης ήταν από την Santa Cruz Biotechnology.

RNA κατασιγάσει

RNA Μικρές παρεμβολή (siRNA) που στοχεύουν την ανθρώπινη ΑϋΚ ελήφθησαν από GenePharma εταιρεία και διαμολύνθηκαν σε κύτταρα HCT116 ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Κάτω ρύθμιση της ΑϋΚ αξιολογήθηκε με πραγματικό χρόνο PCR 72 ώρες μετά την επιμόλυνση. Οι ακολουθίες των siGENOME ΑΔΚ SMARTpool ήταν AGGGAGAGAUGACACUAUA? GGAGAGAUGACACUAUAAU? AAAGUUAU GCCUUAUGUUG? και GAGAGAUGACACUAUAAUG. Αρνητικός μάρτυρας UUCU CCGAACGUGUCACGUTT? ACGUGACACGUUCGGAGAATT.

ανοσοφθορισμού Histochemistry

Οι MEF ή κύτταρα HCT116 καλλιεργήθηκαν σε καλυπτρίδες πλύθηκαν με αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) δύο φορές και στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη (PFA), οι οποίες με διαπερατά 0,1% Triton Χ σε PBS για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα πρωτογενή αντισώματα αραιώθηκαν σε PBS με 1% BSA (1:200). Τα πλακίδια αποκλείσθηκαν (1% BSA σε PBS) για 60 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, επωάστηκαν με πρωτογενή αντισώματα όλη τη νύχτα στους 4 ° C, και ακολούθησε επώαση δευτερεύον αντίσωμα για 60 λεπτά σε RT. Οι πλάκες στη συνέχεια τοποθετούνται και παρατηρήθηκαν κάτω από μικροσκόπιο συνεστιακό.

RNA Εκχύλιση και Realtime PCR

RNAs από κύτταρα εκχυλίστηκαν χρησιμοποιώντας ΤπζοΙ (Invitrogen). cDNA συντέθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ Quantscript RT (Tiangen). Τα επίπεδα mRNA του ενδιαφέροντος προσδιορίστηκαν με PCR πραγματικού χρόνου, και ομαλοποιήθηκε ως προς τα επίπεδα του β-ακτίνης. Realtime PCR διεξήχθη χρησιμοποιώντας Applied Biosystems 7500 σύστημα.

Κυτταρικού Κύκλου Ανάλυση

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε δίσκους 35-mm και καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες, φθάνοντας 60-70% συρροή. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις Itu για 24 ή 48 ώρες, συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση, επαναιωρήθηκαν σε 200 μΐ PBS, και στερεώνονται σε 100% αιθανόλη όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Τα σταθεροποιημένα κύτταρα σφαιροποιήθηκαν με φυγοκέντρηση, επαναιωρήθηκαν σε 800 μΐ PBS που περιείχε ριβονουκλεάση Α (100 μg /ml) και επωάστηκαν για 30 λεπτά στους 37 ° C. Στη συνέχεια, ιωδιούχο προπίδιο 10 μΐ (ΡΙ, 4 mg /ml PBS) προστέθηκαν στα δείγματα, τα οποία αξιολογήθηκαν σε ένα FACSCalibur fl ow κυτταρόμετρο τη χρήση του λογισμικού Cell Quest (BD Bioscience).

Επιβίωση κυττάρων Δοκιμασία

για τη μέτρηση των ποσοστών επιβίωσης των κυττάρων μετά την αγωγή ΔΕΤ, κύτταρα απλώθηκαν σε 1 × 10

4 σε 96 πλάκες φρεατίων και καλλιεργήθηκαν για όλη την νύχτα, τα οποία στη συνέχεια υφίστανται κατεργασία με την ITU για 48 ώρες. Κυττάρων αντιδραστήριο πολλαπλασιασμός WST-1 (Roche) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και επωάστηκε περαιτέρω για 4 ώρες στους 37 ° C. Η απορρόφηση μετρήθηκε έναντι ενός ελέγχου με χρήση αναγνώστη μικροπλάκας στα 440 nm. Το μήκος κύματος αναφοράς ήταν 630 nm.

Μοντέλα Καρκίνωμα ξενομοσχεύματος ποντικού

Άντρας BALB /cASlac-γυμνά ποντίκια (ηλικίας 3 εβδομάδων) αγοράστηκαν από τη Σαγκάη Slac Εργαστήριο Ζώων Γ LTD. Οι ποντικοί διατηρήθηκαν στις εγκαταστάσεις ποντίκι SPF για 1 εβδομάδα πριν εμβολιαστούν με κύτταρα HCT116. HCT116 (ρ53 + /+ και p53 – /-) κύτταρα συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση, μετρήθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε PBS σε συγκέντρωση 5 × 10

7 /ml. Εμείς ενίεται υποδορίως 3 × 10

6 κύτταρα στην πλάτη BALB /cASlac γυμνά ποντίκια, με τα p53 + /+ κυττάρων από την αριστερή πλευρά και p53 – /- κύτταρα στη δεξιά πλευρά. Μετά από 2 εβδομάδες, τα ποντίκια χωρίστηκαν σε διάφορες ομάδες και υποβλήθηκαν σε αγωγή με την ITU ή διαλύτη (PBS). Οι ποντικοί ζυγίστηκαν και το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε. Το μήκος (L) και το πλάτος (W) του όγκου μετρήθηκαν με ένα ψηφιακό παχύμετρο και εκφράστηκε ως όγκος του όγκου (0.5L × W

2, mm

3).

Γενωμικό DNA Ανάλυση με HPLC-MS

ΥΠΟΙΟ κύτταρα και κύτταρα HCT116 σε σταθερή ή συνδεθείτε φάση υποβλήθηκαν σε θεραπεία με την ITU για διαφορετικές χρονικές περιόδους. Γενωμικό DNA εκχυλίστηκε με φαινόλη /χλωροφόρμιο, πλύθηκε καλά με 70% αιθανόλη, και στη συνέχεια υπέστη πέψη χρησιμοποιώντας μια προηγουμένως αναφερθείσα μέθοδο με τροποποιήσεις [23]. Εν συντομία, δείγματα γενωμικού DNA επωάστηκαν με 1 μλ DNase Ι (2 υ /μΙ, ΝΕΒ), 10 μλ δηλητήριο φιδιού φωσφοδιεστεράση (0,26 mU /μl, Sigma Aldrich), και 2 μΙ Ανταρκτικής φωσφατάση (5 υ /μΙ, ΝΕΒ) όλη τη νύκτα στους 37 ° C. Η πλήρης χώνευση δημιούργησε ένα μείγμα mononucleosides, κρίνεται με HPLC. Τα πέψη δείγματα DNA αναλύθηκαν σε ένα σύστημα HPLC-MS εξοπλισμένο με μια στήλη Agilent C18 (Agilent, San Jose, CA, USA). Ο διαλύτης Α ήταν νερό που περιέχει 0.5% (ν /ν) μυρμηκικό οξύ και ο διαλύτης Β ήταν μεθανόλη που περιέχει 0,25% (ν /ν) μυρμηκικό οξύ. Ένα προφίλ έκλουσης χρησιμοποιήθηκε από 2-20% Β επί 30 λεπτά με αύξηση σε 98% επί άλλα 20 λεπτά, στη συνέχεια 98% Β για 10 λεπτά, και τελικά επιστρέφει στο 2% Β επί 20 λεπτά. Ο ρυθμός ροής ρυθμίστηκε στα 20 μΐ /λεπτό και το έκλουσμα παρακολουθήθηκε στα 254 nm. Τυπικά, 5 μΙ από κάθε δείγμα εγχύθηκαν χρησιμοποιώντας το δειγματολήπτη καλά πλάκα.

Ανάλυση φασματογράφου μάζας των δειγμάτων σχηματίζουν το σύστημα HPLC διεξήχθη απ ‘ευθείας με ένα φασματόμετρο μάζας Agilent ESI-TOF. Μάζα φασματικά δεδομένα καταγράφηκαν σε τρόπο θετικού ιόντος επί όλη τη διάρκεια του τρεξίματος HPLC. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με τη χρήση QS Analyst (Agilent, San Jose, CA, USA).

Ανάλυση των επιπέδων Κυτταρικής dNTP

Μια προηγουμένως επικυρωθεί προσέγγιση LC-MS /MS χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των συγκεντρώσεων dNTP [24]. Πρότυπα διαλύματα dATP και dGTP (dCTP και dTTP αφέθηκαν έξω λόγω τεχνικών δυσκολιών χρησιμοποιώντας αυτό το σύστημα) σε συγκέντρωση 100 mmol /l χρησιμοποιήθηκαν για να κατασκευαστεί ένα 0, 19.5, 39, 312.5, 625, 1250 και 2500 ng /ml πρότυπη καμπύλη βαθμονόμησης.

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε 500 μΐ παγωμένου 60% μεθανόλη, στροβιλίζεται, και τοποθετούνται στους 95 ° C για 3 λεπτά και επεξεργασία με υπερήχους για 30 s σε ένα Branson Sonifier 450 ( Branson, Danbury, CT, USA). Τα εκχυλίσματα φυγοκεντρήθηκαν στα 16.000 g για 5 λεπτά στους 4 ° C για απομάκρυνση των κυτταρικών υπολειμμάτων και καταβυθίστηκε πρωτεϊνών και DNA. Τα προκύπτοντα υπερκείμενα πέρασαν μέσα προεξισορροπημένη Amicon Ultra-0,5-ml φυγόκεντρος φίλτρα στους 4 ° C για απομάκρυνση μακρομορίων ( έκφραση ρ53 ρυθμίζεται προς τα πάνω με διάφορα στρες και ενεργοποίηση ογκογονιδίου, ειδικά γενοτοξικό στρες [25]. Δεδομένου Itu είναι ένα ευρέως χρησιμοποιούμενο αναστολέα του ΑΔΚ, η οποία παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην ομοιόσταση της αδενοσίνης [26], [27], είναι πιθανό ότι Itu διαταράσσει την ομοιοστασία της αδενοσίνης, παρεμβαίνει με τη σύνθεση του DNA και προκαλεί βλάβες στο DNA και έτσι ενεργοποιεί την ρ53. Αν αυτό είναι αλήθεια, να χτυπήσει κάτω ΑΔΚ θα μιμούνται ΑΔΚ αναστολή με την ITU σε up-ρύθμισης p53. Χρησιμοποιήσαμε συγκεντρώνονται siRNA να γκρεμίσουμε ΑΔΚ σε HCT116 κύτταρα (Εικ. 1D, αριστερό πάνελ), και διαπιστώθηκε ότι η μείωση των επιπέδων ΑΔΚ, σε αντίθεση με την αναστολή της ΑΔΚ με την ITU, δεν μετέβαλε σημαντικά τα επίπεδα της πρωτεΐνης του p53 σε βασικό επίπεδο ( Εικ. 1D, δεξιά πλευρά), γεγονός που υποδηλώνει ότι η ITU-που προκαλείται από ρ53 πάνω ρύθμιση δεν είναι πιθανό να προκαλείται από την άμεση αναστολή της ΑΔΚ.

Itu προκαλεί βλάβη του DNA

ITU έχει μια δομή σε πουρίνες, όπως με «ΝΗ» αντικαθίστανται από «CI» στο 7

ου θέση της πουρίνης (Εικ. 1Α). Itu μπορούν να ενσωματωθούν στο DNA μετά να μετατραπεί ώστε να δεοξυριβόζη με ριβονουκλεοτιδικής αναγωγάσης [4]. Itu θεωρητικά θα μπορούσε να σχηματισθεί 2 δεσμούς υδρογόνου με θυμιδίνης σε δίκλωνο DNA (Σχ. S1). Ωστόσο, ITU-T σύζευξη μπορεί να προκαλέσει ένα πρόβλημα απόσταση ως «C-I» του Itu (θέση 7) είναι πολύ μεγαλύτερο από «Ν-Η» της αδενοσίνης, και το αλλοιωμένο δακτύλιος πουρίνης μπορεί να μην είναι αναγνωρίσιμα από DNA πολυμεράσες. Επιπλέον, «C-I» της ITU αποτελεί μάλλον ενεργή και ασταθής. ITU είναι επομένως πιθανό να μεταβολίζεται και στη συνέχεια ενσωματώθηκε στο DNA να προκαλέσει βλάβες στο DNA. Για να επιβεβαιωθεί αυτό, πρέπει πρώτα να ελεγχθεί εάν Itu θα μπορούσε να μεταβάλει τις καρυότυποι των κυττάρων HCT116. Τα κύτταρα πρώτα σε επεξεργασία με την ITU για 36 ώρες και στη συνέχεια με άτρακτο δηλητήριο κολχικίνη να συμπυκνώσει τα χρωμοσώματα. Ο αριθμός και η εμφάνιση των χρωμοσωμάτων αναλύθηκαν υπό μικροσκόπιο φωτός μετά από χρώση gimsa. Είναι προφανές ότι η θεραπεία Itu οδήγησε στην εμφάνιση των θραυσμάτων χρωμοσωμάτων σε 32% του ITU-κατεργασμένων κυττάρων σε σύγκριση με 0% σε μη επεξεργασμένα κύτταρα (Εικ. 2Α), γεγονός που υποδηλώνει ότι θα μπορούσε να προκαλέσει Itu δίκλωνο διαλείμματα DNA.

ΈΝΑ. Εκπρόσωπος εικόνες των καρυότυποι της HCT116 στην απουσία ή παρουσία της ITU. Β Ανίχνευση Itu παράγωγο στο γονιδιακό DNA σε πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα. HPLC-MS ανάλυση του Itu μεταβολιτών στο γονιδιωματικό DNA του ITU-κατεργασμένων κυττάρων. Γονιδιωματικό DNA απομονώθηκε από την ITU-επεξεργασμένα κύτταρα και χωνεύεται σε νουκλεοζίτες, τα οποία αναλύθηκαν με HPLC (αριστερό πλαίσιο), η οποία συνδέεται άμεσα με φασματόμετρο μάζας. MS ανάλυση του μορίου με το μέγεθος του DTU παρουσιάστηκε στο δεξί πλαίσιο. Γ Τα ενδοκυτταρικά dATP και dGTP πισίνες δεν επηρεάστηκαν από τη θεραπεία της ITU. Α και Α1 είναι παράγωγα των dATP και G, G1 και G2 είναι παράγωγα του dGTP.

Η

Μερικά από τα χημειοθεραπευτικά φάρμακα λειτουργούν μέσω παρεμβολής DNA (π.χ. δοξορουβικίνη) ή διασταυρώσεων DNA (π.χ., σισπλατίνη), ενώ ανάλογα νουκλεοζιτών παράγουν τα διαλείμματα του DNA με το να ενσωματωθούν στο DNA και τη διατάραξη νουκλεοτιδίων αντιστοίχιση. Για να ελεγχθεί αν Itu μπορεί να μεταβολίζεται και να ενσωματωθούν σε γενωμικού DNA κατά την αντιγραφή, αναλύσαμε άμεσα τα νουκλεοτίδια που προέρχονται από γενωμικό DNA που απομονώθηκε από την ITU-επεξεργασμένα κύτταρα που ήταν είτε στη στατική φάση ή τη φάση της καταγραφής, με φασματόμετρο HPLC μάζας. Η ταυτότητα των νουκλεοσιδίων επιβεβαιώθηκε με σύγκριση με την αντίστοιχη ουσία αναφοράς. ITU (MW 392.153) μπορεί να μεταβολίζεται σε δεοξυ-iodotubercidin (dITU, MW 376.154), τουμπερκιδίνης (TU (με την ασταθή -I αφαιρεθεί), MW 266.257), και δεοξυ-τουμπερκιδίνης (DTU, MW 250.257). Αρχικά συνέκριναν τις νουκλεοτίδια που προέρχονται από το γενωμικό DNA του HCT116 και ΠΜΑ και διαπίστωσε ότι HCT116 έδειξε μια πολύ πιο περίπλοκη φάσμα των νουκλεοτιδίων και των παραγώγων τους από εκείνα της ΠΜΑ, γεγονός που υποδηλώνει ότι ο μεταβολισμός νουκλεοτίδια ενδέχεται να μεταβληθεί σε καρκινικά κύτταρα. Στη συνέχεια αποφάσισε να χρησιμοποιήσει ΠΜΑ για να ελέγξετε εάν τα παράγωγα Itu ενσωματώνονται στο DNA. Βρήκαμε ότι DTU ήταν παρούσα στο γονιδιωματικό DNA του ITU-αγωγή λογαριθμική φάση κύτταρα αλλά όχι σε κύτταρα ή στατική μη επεξεργασμένα κύτταρα (Σχ. 2Β). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι Itu μεταβολίζεται (με -Ι αφαιρεθεί) και ενσωματώνεται στο DNA.

Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι τα ανάλογα πουρίνης όπως φλουδαραβίνη και κλοφαραβίνη θα μπορούσε να αναστείλει ριβονουκλεοτιδικής αναγωγάσης, ένα ένζυμο που καταλύει την μετατροπή της ριβονουκλεοτιδίων σε δεοξυριβονουκλεοτίδια, μειώνοντας έτσι τα επίπεδα της κυτταρικής dNTPs και παρεμβαίνει με τη σύνθεση του DNA [4]. Βρήκαμε ότι η αγωγή με ITU σε δόσεις επαρκείς για να ρυθμίζει αυξητικά ρ53 δεν έδειξε καμία επίδραση στα επίπεδα του mRNA της ριβονουκλεοτιδικής αναγωγάσης. Συγκρίναμε επίσης τις δεξαμενές dATP και dGTP, τα οποία είναι προϊόντα της ριβονουκλεοτιδικής αναγωγάσης, στον έλεγχο και ITU-κατεργασμένα κύτταρα με φασματομετρία μάζας μετά από καθιερωμένο πρωτόκολλο, και βρήκαν ότι η θεραπεία Itu δεν επηρέασε τις πισίνες των dATP ή dGTP στα κύτταρα ( Σχ. 2C). Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι Itu δεν αναστέλλει ριβονουκλεοτιδικής αναγωγάσης.

Για την επικύρωση αυτή τη διαπίστωση, θα αντιμετωπίζονται HCT116 και ΠΜΑ με την ITU για 8 ώρες και ανέλυσε το σχηματισμό του DNA των πυρηνικών εστίες ζημιά που προκαλείται, τα οποία υποτίθεται όπως βλάβες στο DNA και κέντρα επισκευής [28], [29]. Από τις πρώτες πρωτεΐνες συναρμολογούνται στα διαλείμματα του DNA είναι γH2AX, μια παραλλαγή της ιστόνης Η2Α που εκφράζεται παντού. Μπορεί να φωσφορυλιωθεί από τα μέλη Pikk όπως ΑΤΜ και Atr γρήγορα μετά από βλάβη του DNA [30]. Βρήκαμε ότι η θεραπεία Itu οδήγησε σε συσσώρευση των πυρηνικών εστιών θετικά για γH2AX τόσο HCT116 (10,39 ± 1,82% για τα μη κατεργασμένα κύτταρα έναντι 90,19 ± 2,21% για Itu κατεργασμένα κύτταρα) και ΠΜΑ (7,45 ± 0,29% για τα μη κατεργασμένα κύτταρα vs. 91,63 ± 0,73% για Itu κατεργασμένα κύτταρα) (Σχ. 3Α και 3Β). Επιπλέον, η θεραπεία Itu είχε επίσης ως αποτέλεσμα τη συσσώρευση των πυρηνικών εστιών θετικά για TopBP1, ένα άλλο εστίες-μεταφρασμένη πρωτεΐνη, σε HCT116 (14,25 ± 5,12% για τα μη κατεργασμένα κύτταρα έναντι 95,24 ± 1,39% για Itu κατεργασμένα κύτταρα) και ΠΜΑ (13.08 ± 5.15% για μη επεξεργασμένα κύτταρα έναντι 93,32 ± 2,70% της ITU επεξεργασμένων κυττάρων) (Εικ. 3Α και 3Β).

Α. Θεραπεία της HCT116 με 1 μΜ Itu για 8 ώρες επάγεται πυρηνικής εστίες θετικά για γH2AX, TopBP1, και ενεργοποιημένα Atm. θεραπεία καφεΐνη μείωσε το σχηματισμό αυτών των εστιών. κύτταρα HCT116 υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με καφεΐνη (5 mM) για 1 ώρα και στη συνέχεια Itu προστέθηκε στις καλλιέργειες για 8 ακόμη ώρες. Τα κύτταρα του σταθερού και βάφονται για γH2AX, TopBP1, ή ρ-Atm. B. Αντιμετώπιση των ΠΜΑ με 1 μΜ Itu για 8 ώρες που προκαλείται από την πυρηνική εστίες θετικό για γH2AX, TopBP1, και ενεργοποιείται Atm.

Η

Itu Ενεργοποιεί Atm

Εκτός από τις εστίες θετικά για γH2AX και TopBP1, η ITU θεραπεία οδήγησε επίσης σε πυρηνικές εστίες θετικά p-Atm (10,13 ± 2,88% για τα μη επεξεργασμένα κύτταρα έναντι 85,84 ± 4,63% για τα κύτταρα Itu θεραπεία) (φωσφορυλίωση S1981, μια ένδειξη της ενεργοποίησης Atm) (Εικ. 3Α και 3Β) [31], υποδεικνύοντας ότι Itu προκαλεί βλάβες στο DNA και ενεργοποιεί Atm. Συνεπής με αυτήν την παρατήρηση, ITU-επαγόμενη ρ-Atm και γH2AX εστίες σχηματισμό σε κύτταρα HCT116 μπορούσε να είναι ελαττωμένη (μέχρι 15.37 ± 1.15% και 9.00 ± 1.19%, αντίστοιχα) με κατεργασία με καφεΐνη, έναν αναστολέα της ΑΤΜ και Atr (Σχ. 3Α ). Για να τεκμηριώσει τη διαπίστωση ότι Itu ενεργοποιεί ΑΤΜ, χρησιμοποιήσαμε Western Blot για την ανάλυση φωσφορυλίωσης Atm S1981, καθώς και Atm μεσολάβηση Chk2 φωσφορυλίωσης. Παρά το γεγονός ότι Atm πιστεύεται ότι ενεργοποιείται μόνο από τα διαλείμματα διπλής έλικας του DNA [7], [31], [32], πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι ανάλογα νουκλεοζιτών μπορεί επίσης να ενεργοποιήσει Atm καθώς και οι μεταγενέστεροι μονοπάτια της [30], [33], [ ,,,0],34]. Atm βρίσκεται να είναι εντοπισμένη στο αδιέξοδο πιρούνια αναδιπλασιασμό και μπορεί να βοηθήσει στην πρόληψη της κατάρρευσης πιρούνι στα κύτταρα [30], [33]. Βρήκαμε ότι η θεραπεία Itu οδήγησε σε εξαρτώμενη από το χρόνο φωσφορυλίωση επί S1981 ΑΤΜ καθώς και φωσφορυλίωση Chk2 στο Thr68 σε κύτταρα HCT116 (Σχ. 4Α). θεραπεία Itu επίσης οδήγησε σε φωσφορυλίωση Ser15 σε ρ53 (Σχ. 4Α), η οποία διεξάγεται με PIKKs επίσης. Ομοίως, η ITU θα μπορούσε να τονώσει την φωσφορυλίωση ρ53 και φωσφορυλίωση Chk2 σε ΠΜΑ (Εικ. 4Β). Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν περαιτέρω το συμπέρασμα ότι Itu προκαλεί βλάβες στο DNA και ενεργοποιεί Atm.

Α. κύτταρα HCT116 υποβλήθηκαν σε αγωγή με 1 μΜ Itu για διαφορετικές χρονικές περιόδους και η ενεργοποίηση των ΑΤΜ, Chk2, και ρ53 εκτιμήθηκε με κηλίδα western χρησιμοποιώντας ειδικά φωσφο-αντισώματα. κύτταρα Β MEFs υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 1 μΜ Itu για διαφορετικές χρονικές περιόδους και ενεργοποίηση των ΑΤΜ, Chk2, και ρ53 εκτιμήθηκε με Western Blot χρησιμοποιώντας ειδικά φωσφο-αντισώματα.

Η

Itu Led σε S φάση επέκτασης και G2 /M σύλληψης σε ρ53-εξαρτώμενο τρόπο

Πολλά ανάλογα νουκλεοζιτών προκαλέσει διακοπή του κυτταρικού κύκλου στη φάση S με εξαιρέσεις όπως 20-C-κυανο-20-δεοξυ-1-β-D-αραβινο pentofuranosylcytosine (CNDAC), η οποία προκαλεί διακοπή του κυτταρικού κύκλου στην G2 φάση [4], [35]. Ενσωμάτωση των αναλόγων νουκλεοσιδίου τερματίζει την επιμήκυνση της εν τη γενέσει της έλικας DNA και οδηγεί σε στασιμότητα πιρούνια αντιγραφής. Για να ελέγξετε αν Itu ενεργοποιεί τα σημεία ελέγχου του κυτταρικού κύκλου, θα αντιμετωπίζονται p53 + /+ και p53 – κύτταρα HCT116 με διαφορετικές συγκεντρώσεις Itu για 24 ή 48 ώρες – /. Διαπιστώθηκε ότι το 24 hr-θεραπεία με υψηλότερες συγκεντρώσεις Itu οδήγησε σε μικρή αύξηση του ποσοστού των κυττάρων φάσης S, η οποία συνοδεύτηκε με μία μείωση του ποσοστού των κυττάρων φάσης G1, χωρίς να μεταβάλλεται σημαντικά το ποσοστό φάση G2 /M κύτταρα (Σχ. 5Α και 5Β). Όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις Itu για 48 ώρες, περισσότερο κύτταρα στη φάση G2, που συνοδεύεται από μια μείωση στην φάση G1 αλλά μη σημαντική μεταβολή στο ποσοστό των κυττάρων S φάσης (Σχ. 5C και 5D). Μια εξήγηση είναι ότι τα κύτταρα είχαν αρχικά κολλήσει στη φάση S, αλλά κατάφερε να περάσει μέσα φάση S και τελικά μπλοκαριστεί στην φάση G2 /M. Έτσι Itu ενεργοποιεί κυρίως την G2 σημείο ελέγχου. Αυτό έρχεται σε αντίθεση με τα περισσότερα από τα ανάλογα νουκλεοζιτών, τα οποία οδηγούν σε φάση S διακοπή του κυτταρικού κύκλου [4], και η ιονίζουσα ακτινοβολία (IR), η οποία επάγει διακοπή του κυτταρικού κύκλου στη G1 και G2 φάση και συνοδεύεται από μείωση της φάσης S σε κύτταρα HCT116 [21]. Εν απουσία ρ53, 24-hr-θεραπεία οδήγησε σε μία αρχική αύξηση στην S φάση σε υψηλότερες δόσεις (ITU Σχ. 5Α και 5Β), αλλά 48 ώρες μετά τη θεραπεία, η διαφορά μεταξύ ελέγχου και κατεργασμένα κύτταρα έγιναν ελάχιστη (Εικ . 5C και 5D), υποδεικνύοντας ότι η ρ53 – /- κύτταρα HCT116, αλλά όχι το ρ53 κύτταρα + /+ HCT116, υποβάλλονται σε σύλληψη φάσης S και ότι η ρ53 – /- κύτταρα κατάφεραν να διαφύγουν αυτό το σημείο ελέγχου. Επιπλέον, ρ53 – /- κύτταρα δεν έδειξαν σύλληψη φάση G2 (Εικ. 5Α και 5Β). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η ITU-που προκαλείται από τη σύλληψη φάση G2 απαιτεί την παρουσία p53.

Α. HCT116 (ρ53 + /+ και p53 – /-) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις Itu για 24 ώρες. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν, χρωματίστηκαν με ΡΙ, και αναλύθηκαν με FACS. Ποσοστό κυττάρων σε διαφορετικές φάσεις δείχθηκε. B. Αντιπροσωπευτικά προφίλ κυτταρικού κύκλου του p53 + /+ και p53 – /- HCT116 παρουσία 2,5 μΜ Itu για 24 ώρες. Γ HCT116 (ρ53 + /+ και p53 – /-) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις Itu για 48 ώρες. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν, χρωματίστηκαν με ΡΙ, και αναλύθηκαν με FACS. Ποσοστό κυττάρων σε διαφορετικές φάσεις δείχθηκε. Δ Αντιπροσωπευτικά προφίλ κυτταρικού κύκλου του p53 + /+ και p53 – /- HCT116 παρουσία 1.0 μΜ Itu για 48 ώρες

Η

Itu Προκαλεί ρ53-εξαρτώμενη και ανεξάρτητη από ΟβΙΙ Death

.

p53 έχει μια ισχυρή προ-αποπτωτικών ρόλο και έχει επίσης αποδειχθεί ότι η ζημία του DNA προκαλεί κυτταρικό θάνατο κυρίως μέσω της οδού Atm-p53. Στη συνέχεια δοκιμάστηκε η κυτταροτοξικότητα της ITU για HCT116 και τη συμμετοχή της ITU-που προκαλείται από ρ53 up-ρύθμιση. Itu θεραπεία οδήγησε σε θάνατο κυττάρου σε ρ53 κυττάρων + /+ HCT116 (EC50 = 1,88 μΜ), ακόμη ρ53 – /- κύτταρα HCT116 έδειξε αντοχή σε ITU-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο (EC50 = 7.8 μΜ) (Σχήμα 6Α.), Υποδηλώνοντας ένα σημαντικό ρόλο για ρ53 στην διαμεσολάβηση ITU-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο. Επιπλέον, η ανεπάρκεια ΑΤΜ, η οποία είναι γνωστό ότι μειώνει την επαγωγή ρ53, ανέστειλε επίσης ITU-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο σε ΠΜΑ (Εικ. 6Β) [36], σύμφωνα με την ευρέως αποδεκτές ρόλο στην προώθηση Atm κυτταρικό θάνατο κάτω από γενοτοξικό στρες. Το λιγότερο από την πλήρη διάσωση του κυτταρικού θανάτου από ανεπάρκεια p53 δείχνουν ότι Itu μπορεί να έχουν κυτταροτοξικότητα που είναι ανεξάρτητη από ρ53, για παράδειγμα, αναστέλλοντας την προ-σηματοδότησης επιβίωσης, όπως Εγκ2.

Α. κύτταρα HCT116 (ρ53 + /+ και p53 – /-) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις Itu για 48 ώρες και ο αριθμός των κυττάρων μετρήθηκε με WST -1 δοκιμασίας. * Ρ & lt? 0,05 όταν ρ53 – /- κύτταρα σε σύγκριση με p53 + /+ κύτταρα. B. Atm + /+ και ΑΤΜ – /- MEFs υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις Itu για 48 ώρες και ο αριθμός των κυττάρων μετρήθηκε με WST -1 δοκιμασίας. * P & lt? 0,05, όταν ΑΤΜ – /- κύτταρα σε σύγκριση με τα κύτταρα Atm + /+. Γ άγριου τύπου και p53 – /- HCT116 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με την ITU για 24 ώρες και ο αριθμός των κυττάρων μετρήθηκε με WST -1 δοκιμασίας. Itu δεν προκάλεσε κυτταρικό θάνατο όταν τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 0.1% ορό ή σε συρροή σε κύτταρα HCT116 άγριου τύπου. * Ρ & lt? 0,05, σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα

Η

Πολλά από τα ανάλογα νουκλεοζιτών απαιτούν ενσωμάτωση DNA να εκτελέσει κυτταροτοξική δράση του.. Για να δοκιμαστεί περαιτέρω η κυτταροτοξική δράση του Itu σε μη διαιρούμενα κύτταρα, καλλιεργήσαμε HCT116 είτε σε στάσιμη φάση ή με την παρουσία 0,1% ορού για 24 ώρες, με τα περισσότερα από τα κύτταρα να είναι στη φάση G1. Υπό αυτές τις συνθήκες, το ITU απέτυχε να σκοτώσει τα κύτταρα (Σχ. 6C), γεγονός που υποδηλώνει ότι Itu χρειάζεται να ενσωματωθεί στο DNA, προκειμένου να εκτελέσει κυτταροτοξική δράση του. Αυτό είναι συνεπές με την παρατήρηση μας ότι Itu μεταβολίτης είναι παρούσα στο γονιδιωματικό DNA των κυττάρων αντιγραφής (Σχ. 2Β).

Ωστόσο, κυτταρομετρία ροής προσδιορισμοί δεν αποκαλύπτουν μια σημαντική αύξηση στις υπο-G1 φάση κύτταρα, ένας ένδειξη των αποπτωτικών κυττάρων, μετά από 24 ή 48 ώρες από ITU-αγωγή με διάφορες δόσεις (Σχ. 5Β και 5D). Αυτό έρχεται σε αντίθεση με IR ή HADC MGCD0103 αναστολέα (αποακετυλασών ιστόνης), η οποία οδήγησε σε μια σημαντική αύξηση στην υπο-G1 φάση σε κύτταρα HCT116 [21], [37]. Επιπλέον, δεν σκάλες DNA παρατηρήθηκαν μετά την αγωγή (ITU δεδομένα δεν παρουσιάζονται).