Αφηρημένο

Ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η κύρια αιτία των θανάτων από καρκίνο που σχετίζονται με όλο τον κόσμο και παραμένει η πιο διαδεδομένη. Αλληλεπίδραση μεταξύ PI3K /ΑΜΡΚ /ΑΚΤ και ΜΑΡΚ είναι ένα κρίσιμο τελεστή στην ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου του πνεύμονα. Αυτές οι κινάσες πρωτεΐνης σήματα μεταγωγής χρησιμεύσουν ως καλή θεραπευτικοί στόχοι για μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC), η οποία περιλαμβάνει έως και 90% των καρκίνων του πνεύμονα. Εδώ, θα περιγραφεί το αν 21α-Methylmelianodiol (21α-MMD), ένα ενεργό παράγωγο τριτερπενοειδείς του

Poncirus τρίφυλλα

, μπορεί να εμφανίσει αντικαρκινικές ιδιότητες ρυθμίζοντας αυτά τα σήματα και να ρυθμίζουν την εμφάνιση της ανθεκτικότητας σε πολλά φάρμακα στα κύτταρα NSCLC. Βρήκαμε ότι 21α-MMD ανέστειλε την ανάπτυξη και την αποικία σχηματισμό του καρκίνου του πνεύμονα κυττάρων χωρίς να επηρεάζουν το φυσιολογικό φαινότυπο πνεύμονα. 21α-MMD κατήργησε επίσης την μεταστατική δραστηριότητα των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα μέσω της αναστολής της μετανάστευσης των κυττάρων και εισβολή, και προκαλούμενη από G

0 /G

1 κύκλου κυττάρου με αυξημένη παραγωγή ROS ενδοκυτταρική και απώλεια της ακεραιότητας της μιτοχονδριακής μεμβράνης. 21α-MMD ρύθμισε τις εκφράσεις του PI3K /AKT /ΑΜΡΚ και ΜΑΡΚ σηματοδότησης που μας οδήγησε να αξιολογήσει περαιτέρω τη δραστηριότητά της σχετικά με την ανθεκτικότητα σε πολλά φάρμακα (MDR) σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα, καθορίζοντας σε P-γλυκοπρωτεΐνης (P-gp) /MDR1-σύνδεσης. Χρησιμοποιεί τις καθιερωμένες πακλιταξέλη-ανθεκτικά κύτταρα Α549 (Α549-PacR), βρήκαμε ακόμη ότι 21α-MMD προκάλεσε μια δραστηριότητα αντιστροφή MDR μέσω της αναστολής της P-gp /εκφράσεις MDR1, τη λειτουργία και τη μεταγραφή με ανέκτησε ευαισθησία πακλιταξέλη που μπορεί να εξαρτώμενο συσχετίζονται με η ρύθμιση της οδού /σηματοδότησης mTOR PI3K. Στο σύνολό τους, τα ευρήματα αυτά καταδεικνύουν, για πρώτη φορά, η μηχανιστική αξιολόγηση

in vitro

της 21α-MMD εμφανίζοντας αύξηση αναστολής δυναμικό με επιρροή στην αντιστροφή MDR στα ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα.

Παράθεση : Aldonza MBD, Χονγκ JY, Bae SY, Τραγούδι J, Kim WK, Ω J, et al. (2015) Καταστολή της ΜΑΡΚ σηματοδότηση και την αναστροφή της mTOR που εξαρτώνται MDR1-Associated πολυφαρμακευτική αντίσταση από 21α-Methylmelianodiol σε κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα. PLoS ONE 10 (6): e0127841. doi: 10.1371 /journal.pone.0127841

Επιμέλεια: Javier Σ Castresana, Πανεπιστήμιο της Ναβάρα, Ισπανία

Ελήφθη: 28, Αυγούστου του 2014? Αποδεκτές: 21 του Απρίλη του 2015? Δημοσιεύθηκε: 22, Ιουνίου του 2015

Copyright: © 2015 Aldonza et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η έρευνα υποστηρίχθηκε από την επιχορήγηση (2005 και 12172MFDS989) του Υπουργείου Τροφίμων και Φαρμάκων για την Ασφάλεια και το Εθνικό Ίδρυμα Ερευνών της Κορέας (NRF) επιχορήγηση που χρηματοδοτείται από η κυβέρνηση της Κορέας (MEST) (Νο 2.009 – 0.083.533)

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η πιο κοινή μορφή καρκίνου σε όλο τον κόσμο εδώ και δεκαετίες, και αντιπροσωπεύει περίπου 1.380.000 θανάτους κάθε χρόνο τόσο για τους άνδρες και τις γυναίκες στις Ηνωμένες Πολιτείες μόνο. Η πρόγνωση σχετίζεται με την ασθένεια είναι πολύ κακή καθυστερεί την διάγνωση μέχρι αργά είναι περιορισμένες προχωρημένα στάδια και τις επιλογές θεραπείας, καταλήγοντας σε ποσοστό θανάτου σχεδόν το 90% οφείλεται σε αποτυχία της θεραπείας που προκαλείται από απαρατήρητα εξέλιξη μετάσταση [1]. έχουν Φυσικά προϊόντα έχουν χρησιμοποιηθεί ως ιατρικά θεραπευτικά για αιώνες με όσο το 70% όλων των φαρμάκων που έχουν εγκριθεί για κλινική χημειοθεραπείας, καθώς και για τη θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα μεταξύ 1981 και 2002 που αποτελούνται από είτε φυσικά προϊόντα ή χημικά και συνθετικά παράγωγα που βασίζονται σε φυσικά προϊόντα. [2]. Ωστόσο, ο μηχανισμός με τον οποίο τα περισσότερα φυσικά προϊόντα επιδεικνύουν το θεραπευτικό τους δυναμικό είναι λιγότερο καλά κατανοητές. έχουν τριτερπενοειδή ήδη λάβει μια αυξανόμενη προσοχή τα τελευταία χρόνια στην θεραπευτική του καρκίνου του πνεύμονα, λόγω των αναφερθέντων chemopreventive τους και θεραπευτικές δυνατότητες τόσο

in vitro

και

in vivo

[3,4]. 21α-Methylmelianodiol (21α-MMD) είναι ένα φυσικό τριτερπενοειδείς και ένα ισομερές του 21-methylmelianodiols απομονώθηκε για πρώτη φορά από τους καρπούς του

Poncirus trifoliata

(Rutaceae), το οποίο έχει χρησιμοποιηθεί από καιρό στην ασιατική ιατρική ως θεραπεία για την αλλεργία φλεγμονή. Σε πρόσφατες εκθέσεις, 21α-MMD εμφανίζεται λειτουργική αντι-φλεγμονώδεις δραστηριότητες [5]. Ωστόσο, δεν έχει υπάρξει καμία έκθεση, περαιτέρω αξιολόγηση των αντικαρκινικών το δυναμικό της και το μηχανισμό δράσης στον καρκίνο του πνεύμονα.

Καρκίνος επιβίωσης που σχετίζονται με μονοπάτια σηματοδότησης, συμπεριλαμβανομένων φωσφοϊνοσιτίδη 3-κινάση (PI3K) /AKT /στόχος της ραπαμυκίνης στα θηλαστικά (mTOR ) και ενεργοποιείται από μιτογόνο κινάσης πρωτεΐνης (ΜΑΡΚ) και του καρκίνου οδών ΑΜΡΚ μετάσταση σχετιζόμενη παίζουν καθοριστικό ρόλο στην ρύθμιση της που προκαλείται από φάρμακα λειτουργικές δραστηριότητες όπως DNA βλάβη επαγόμενη απόπτωση, αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης, και αντι-μεταστατική κοινής ωφέλειας /εξέλιξη [6 , 7], με έντονη κρίσιμη λειτουργική ρυθμιστική δραστηριότητα στον πολλαπλασιασμό του καρκίνου του πνεύμονα και επιβίωση κυττάρου [8]. Οι ακριβείς μοριακοί μηχανισμοί υπεύθυνοι για τις περισσότερες από τις αντικαρκινικές δραστηριότητες τριτερπενοειδείς επαγόμενη αφορούν αυτά της κλασικής οδούς δεν έχουν ακόμη διευκρινιστεί λεπτομερώς να ενσωματώσει περαιτέρω θεραπευτικών στρατηγικών για καλύτερα αποτελέσματα.

Μια άλλη περιστροφική αιτία αποτυχίας της θεραπείας στον καρκίνο του πνεύμονα είναι η εμφάνιση αντοχής πολυφαρμάκου (MDR), ο κύριος μηχανισμός με τον οποίο πολλοί καρκίνοι καθίστανται ανθεκτικά σε ένα ευρύ φάσμα των χημειοθεραπευτικών. ΡΙ3Κ /ΑΚΤ και MAPKs σηματοδότηση έχουν ευρέως εμπλέκονται στην ανάπτυξη του MDR στον καρκίνο του πνεύμονα. Η διέγερση αυτών των οδών καθιστά πνευμονικά κύτταρα όγκου ανθεκτικά σε κυτταροτοξικά χημειοθεραπευτικά φάρμακα όπως είναι η πακλιταξέλη, προς περαιτέρω επηρεάσουν την κυτταρική λειτουργία [9,10]. Ευαισθησία σε διαφορετικά χημειοθεραπευτικά ποικίλλει ευρέως από ασθενή σε ασθενή. Ωστόσο, ένας μοριακός μηχανισμός μπορεί να επισημανθεί για να σχεδιάσουν αποτελεσματικά σκεπτικό χημειοθεραπευτικών θεραπείες συνδυασμού, δηλαδή με στόχο την MDR1 (ABCB1) γονίδιο που κωδικοποιείται P-γλυκοπρωτεΐνης (P-gp), υπεύθυνος για την άντληση μια ποικιλία ξενοβιοτικών ουσιών και των ενδογενών ουσιών από το εσωτερικό με την εξωκυτταρική περιοχή των κυττάρων [11]. Πρόσφατες αποδείξεις έχουν τονίσει την αλληλεπίδραση μεταξύ mTOR σηματοδότησης και της P-gp /MDR1 μεσολάβηση MDR στο ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα και του παχέος εντέρου [12,13]. Αυτό το είδος των ενώσεων οδήγησαν να χαρακτηρίσει λειτουργικά του δυναμικού ρυθμιστικού μηχανισμού στόχευσης του PI3K /AKT και ΜΑΡΚ οδό και μετέπειτα απομείωση της δραστηριότητας της P-gp [14,15]. Επιπλέον, ένας αριθμός μελετών έχουν επίσης προτείνει την ανάπτυξη φαρμάκων που βασίζονται από φλαβονοειδή και τριτερπενοειδή που μπορούν να στοχεύσουν αυτά τα σήματα σε επακόλουθη μορφή μια κατηγορία των αναστολέων της Ρ-gp και να ενισχύσει τη δραστηριότητα αρκετών αντικαρκινικά φάρμακα, όπως η πακλιταξέλη και η δοξορουβικίνη [16 -18].

Ο σκοπός της μελέτης αυτής, ως εκ τούτου, ήταν να προσδιορίσει μηχανιστικά τον τρόπο δράσης του 21α-MMD σε ανθρώπινα κύτταρα NSCLC και περαιτέρω αφορούν ρυθμιστικού μηχανισμού του στην κυτταρική ανάπτυξη και σήματα επιβίωσης σχετίζονται όπως η PI3K /AKT /ΑΜΡΚ και ΜΑΡΚ με P-gp /MDR1 που σχετίζονται με MDR εμφάνιση σε ένα φαινότυπο του καρκίνου του πνεύμονα. Χαρακτηρισμός των μηχανισμών δράσης των 21α-MMD μπορεί να οδηγήσει σε νέες ιδέες θεραπευτικών ανάπτυξης για την καταπολέμηση της ανάπτυξης, η μεταστατική δραστηριότητα, καθώς επίσης και την εμφάνιση των MDR σε ανθρώπινους καρκίνους του πνεύμονα.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια

τριχλωροξικού οξέος (TCA), (3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου (ΜΤΤ), σουλφοροδαμίνη Β (SRB), ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ ), RNase Α, πακλιταξέλη, 5-φθοριοουρακίλη (5-FU), μονοκλωνικό ποντικού αντι-β-ακτίνης αντίσωμα, διχλωρο-διυδρο-φλουορεσκεΐνη διοξεικό (DCFH-DA), ροδαμίνη-123, κρυσταλλικό ιώδες, Ν-ακετυλο-L- κυστεΐνη (NAC), και άλλα αντιδραστήρια εκτός αν υποδεικνύεται διαφορετικά αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, ΜΟ, USA). RPMI 1640, ορό εμβρύου μόσχου (FBS), διάλυμα αντιβιοτικού-αντιμυκητιασικό, και θρυψίνη-ΕϋΤΑ αγοράστηκαν από την Invitrogen (Grand Island, ΝΥ, USA). ποντικού μονοκλωνικό αντι-φωσφο-ΕΚΚ (Tyr 204), αντι-c-myc, και πολυκλωνικά κουνελιού αντι-κυκλίνης Α, αντι-κυκλίνης Β1, αντι-κυκλίνη Ε, αντι -CDK2, αντι-CDK4, αντι-Rb και αντι-φωσφο-Rb, αντι-ERK 1/2, αντι-ρ38 ΜΑΡΚ, αντι-φωσφο Akt, αντι-Akt, αντι-φωσφο-mTOR, αντί-mTOR αγοράστηκαν από Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Mouse μονοκλωνικό αντι-φωσφο-ΙΝΚ /SAPK (Thr 183 /Tyr 185), αντι-ΙΝΚ /SAPK, αντι-φωσφο-ρ38 (Thr 180 /Tyr 182), αντι-ΑΜΡΚ, αντι-φωσφο-AMPKα (Thr 172), αντι-ΡΙ3Κ, και αντι-φωσφο-ρ85 ΡΙ3Κ (Tyr 458) αγοράστηκαν από την Cell Signaling Technology (Danvers, ΜΑ, USA). Alexa Fluor 488-σημασμένο κοτόπουλο IgG αντι-κουνελιού αγοράστηκε από την Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Mouse μονοκλωνικό αντι-Ρ-gp και ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC) -σημασμένου μονοκλωνικό αντι-Ρ-gp αγοράστηκε από την Abcam (Cambridge, ΜΑ, USA). Το κατιονικό λιπόφιλη βαφή τετραμεθυλοροδαμίνης αιθυλεστέρα (TMRE) αγοράστηκε από Molecular Probes (OR, USA). ON-TARGETplusTM (SMARTpool) mTOR και αγωνίζομαι siRNAs αγοράστηκαν από την Thermo Scientific-Dharmacon RNAi Technologies (Suwanee, GA, USA). Η ένωση δοκιμής, 21α-MMD, απομονώθηκε από τους καρπούς του

Poncirus trifoliata

όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19] και από τον Dr. S.H. Lee, ένας συν-συγγραφέας, στο Κολέγιο Φαρμακευτικής, Πανεπιστήμιο Yeungnam, την Κορέα.

Γραμμές κυττάρων και συνθήκες καλλιέργειας

Ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα (Α549, Η460, Η1299 Η358 και Η292) , ανθρώπινα φυσιολογικά κύτταρα του πνεύμονα (L132 και MRC-5), τα ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του μαστού (MDA-MB-231), ανθρώπινη πόρου επιθηλιακά κύτταρα μαστού όγκου (T47D), ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα ήπατος (SK-HEP-1), και ανθρώπινο γαστρικό καρκινικά κύτταρα (SNU-638) δόθηκαν από την κορεατική Κυτταρική Γραμμή Τράπεζα (Σεούλ, Κορέα). Η πακλιταξέλη ανθεκτικά Α549 κύτταρα (Α549-PacR) αναπτύχθηκαν από την ομάδα μας από μητρικά κύτταρα Α549 μέσω της συνεχούς έκθεσης σε σταδιακά αυξανόμενες συγκεντρώσεις του paclitaxel διατήρηση της συνεχούς ανάπτυξης και πρόστιμο γονική μορφολογία παρόμοια [20]. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ (για MRC-5, MDA-MB-231, και τα κύτταρα 1 SK-HEP-) και RPMI-1640 (για Α549, Α549-PacR, Η358, Η1299, Η460, Η292, T47D, και SNU -638 κύτταρα) συμπληρωμένο με 10% θερμο-απενεργοποιημένο FBS και αντιβιοτικά-αντιμυκητιακά (PSF? 100 μονάδες /ml πενικιλλίνης G νάτριο, 100 μg /mL στρεπτομυκίνη, και 250 ng /mL αμφοτερικίνη Β). Τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C και 5% CO

2 σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα.

Δοκιμασίες Κυτταρικού Πολλαπλασιασμού

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας ΜΤΤ χρωματομετρική δοκιμασία εκτός για την προκαταρκτική διαλογή του αντι-πολλαπλασιαστική δράση του

P

.

trifoliata

δραστικές ενώσεις που διεξήχθη με δοκιμασία SRB. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα 3 έως 5 χ 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκες 96 φρεατίων με συνολικό όγκο 200 μL /φρεάτιο και αφέθηκαν να ξαναβάλουν τη διάρκεια της νύχτας. Μετά από 24 κύτταρα επώαση ώρες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις του 21α-MMD, H

2O

2, τα ναρκωτικά, ως μεμονωμένα ή σε συνδυασμό, ή τον έλεγχο DMSO συνεχώς στις υποδεικνυόμενες χρονικές πορείες. Μετά την επεξεργασία, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με διάλυμα 10% TCA και υποβλήθηκαν για SRB ή ΜΤΤ δοκιμασίες. Για τη δοκιμασία ΜΤΤ, τα κύτταρα επωάστηκαν σε ΜΤΤ (0,5 mg /mL) που περιέχει μέσο καλλιέργειας στους 37 ° C για 4 ώρες. Το υπερκείμενο μέσο απομακρύνθηκε και DMSO (200 μL) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και αναμίχθηκε πλήρως για να διαλυθεί ΜΤΤ. Για τη δοκιμασία SRB, τα κύτταρα επωάστηκαν με διάλυμα SRB 0,4% για 30 λεπτά. Το μη συνδεδεμένο SRB απομακρύνθηκε γρήγορα με έκπλυση των φρεατίων πέντε φορές με 1% οξικό οξύ και στη συνέχεια ξηραίνεται στον αέρα. 100 μL ρυθμιστικό διάλυμα Tris (0,01 Μ, ρΗ 10,4) προστέθηκε και ανακινήθηκε ελαφρά για 5 λεπτά σε μηχανικό αναδευτήρα. Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 570 nm για προσδιορισμό ΜΤΤ, ενώ 515 nm για προσδιορισμό SRB με κοινό υπόβαθρο αφαίρεση στα 650 nm (μηδέν ημερών ή αναπαράγουν ελέγχου) με VERSAmax μικροπλάκα αναγνώστη (Molecular Devices Inc., Toronto, Canada). Οι τιμές απορρόφησης εκφράστηκαν ως ποσοστό του ότι για το μη επεξεργασμένο ή DMSO κύτταρα ελέγχου, και η συγκέντρωση των δοκιμαζόμενων φαρμάκων, που υπολογίστηκε από τον τύπο% βιωσιμότητα = ((Λ Abs.Drug-Ave.Abs.Zero Ημέρα) /(Ave. Abs.Control-Ave. Abs.Zero Ημέρα)) χ 100. το IC

50 τιμές υπολογίστηκαν ως το φάρμακο που αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων κατά 50% σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, χρησιμοποιώντας ανάλυση μη γραμμικής παλινδρόμησης (ποσοστό επιβίωσης έναντι της συγκέντρωσης) . Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας τέσσερις επαναλήψεις και επαναλήφθηκε τουλάχιστον τρεις φορές με παράλληλο τρόπο σε κάθε φαρμάκου /συγκέντρωση ένωσης.

Αποικίας Δοκιμασία Σχηματισμού

Μονοστιβάδες κυττάρων υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για 20 ώρες με 21α- MMD σε διάφορες συγκεντρώσεις, και στη συνέχεια συλλέχθηκαν, μετρήθηκαν, και σπάρθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων σε πυκνότητα 1500 κυττάρων ανά φρεάτιο. Μετά από μία έως ενάμισι εβδομάδες, προσκολλημένα μακροσκοπική αποικίες πλύθηκαν με PBS, σταθεροποιήθηκαν με χρήση 2% παραφορμαλδεΰδη και χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες (0.5% β /ο) και στη συνέχεια μετρήθηκαν οπτικά ή με τη χρήση του λογισμικού Image J.

συνδυασμού φαρμάκων Ανάλυση

τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα 5 χ 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκες 96 φρεατίων με αυξανόμενες συγκεντρώσεις 21α-MMD, πακλιταξέλη, και 5-FU είτε μόνες είτε σε συνδυασμό με ισοδύναμη γραμμομοριακή αναλογία τους ταυτόχρονα. ανασταλτική δράση αύξησης των συνδυασμών μετρήθηκε με ανάλυση ΜΤΤ. Τα συνδυασμένα αποτελέσματα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το διάμεσο μέθοδος ανάλυσης αποτέλεσμα και με τον υπολογισμό του δείκτη συνδυασμού (CI) χρησιμοποιώντας την εξίσωση: CI = D

1 /(D

x)

1 + D

2 /(D

x)

2, όπου D

1 και D

2 είναι οι συγκεντρώσεις των συνδυασμένων ένωση και φάρμακο που πέτυχε το αναμενόμενο αποτέλεσμα, και (D

x)

1 και (D

x)

2 είναι οι συγκεντρώσεις που έχουν παρόμοια αποτελέσματα όταν οι ενώσεις χρησιμοποιούνται μόνες. 50% αναστολή επελέγη ως δείκτης της αποτελεσματικότητας. Η υπολογιζόμενη CI συγκρίθηκε στη συνέχεια με αναφερόμενες τιμές αναφοράς [21].

τηλέφωνα Ανάλυση Κύκλου και Δοκιμασία Ενσωμάτωσης BrdU

Ανάλυση σχετικά με τις επιπτώσεις της 21α-MMD σχετικά με την κατανομή του κυτταρικού κύκλου έγινε με τη μέθοδο περιγράφηκε προηγουμένως [22]. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς 21α-MMD για 24 ώρες σε 10% FBS συμπληρωμένο μέσο. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν, πλύθηκαν δύο φορές, και σταθεροποιήθηκαν σε 70% για όλη τη νύχτα κρύα αιθανόλη σε -20 ° C. Αιθανόλη στερεωμένα κύτταρα σφαιροποιήθηκαν, πλύθηκαν με παγωμένο PBS, και επαναιωρήθηκαν σε διάλυμα χρώσης που περιείχε 50 μg /mL ΡΙ, 0.1% Triton-X-100, 0.1% κιτρικό νάτριο, και 100 μg /mL RNase. Μετά από 1 ώρα επώασης σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι, τα κύτταρα ενεργοποιημένων με φθορισμό διαλέχθηκαν και το περιεχόμενο κυτταρικό DNA αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας το κυτταρόμετρο ροής FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) εφοδιασμένο με λέιζερ αργού και τα δεδομένα αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας CellQuest 3.0.1 λογισμικό (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Τουλάχιστον 20.000 κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για κάθε ανάλυση. Αλλαγές στο ποσοστό της κατανομής των κυττάρων σε κάθε φάση του κύκλου του κυττάρου προσδιορίσθηκαν και τα αποτελέσματα εμφανίζονται σαν ιστογράμματα. Η αναλογία των κυττάρων σε διαφορετικές φάσεις του κυτταρικού κύκλου στην συνέχεια καταγράφηκε με τουλάχιστον εις τριπλούν και εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD. Επιπλέον, μια δοκιμασία ενσωμάτωσης BrdU χρωματομετρική (Abcam) διεξήχθη για να μετρηθεί ο ρυθμός της σύνθεσης του DNA. Εν συντομία, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς 21α-MMD για 24 ώρες στο ίδιο μέσο όπως παραπάνω. BrdU προστίθεται σε κύτταρα καλλιεργημένα σε μικροπλάκες που ακολουθείται από 4 ώρες επώασης να ενσωματώσει BrdU στο DNA των πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων. υπερκείμενο καλλιέργειας αφαιρέθηκε ακολούθησε καθήλωση. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με αντι-BrdU αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση. Bound BrdU ανιχνεύεται με μια αντίδραση υποστρώματος και ποσοτικοποιείται με μέτρηση της απορρόφησης στα 350 nm.

Μέτρηση Ενδοκυττάρια ROS

Η ενδοκυτταρική ROS μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής (Becton Dickinson, FACSCalibur) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [ ,,,0],23]. Εν συντομία, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα 1 χ 10

4 κύτταρα /ml σε αποστειρωμένο τρυβλίο 60 mm για 24 ώρες και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς 21α-MMD για 24 ώρες για να ανιχνεύσει ROS αλλάζει. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και πλύθηκαν δύο φορές και κηλιδώνονται με 1 mL DCFH-DA σε συγκέντρωση 10 μΜ, το οποίο χρησιμοποιήθηκε ως ανιχνευτής για την εκτίμηση της παραγωγής ROS. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν στους 37 ° C για 40 λεπτά και της κορυφής μήκους κύματος διέγερσης για οξειδωμένη DCFH-DA στα 488 nm με εκπομπή στα 525 nm αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. παραγωγή ROS εκφράστηκε ως μέση ένταση φθορισμού (MFI) που υπολογίζεται μέσω του λογισμικού Cell Quest. Ανίχνευση ROS εξετάστηκε επίσης από μικροσκόπιο φθορισμού. Εν συντομία, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα 5 χ 10

4 κύτταρα /mL σε καλυπτρίδες από πιάτα και επωάζονται όλη τη νύκτα για προσκόλληση. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με διάφορες συγκεντρώσεις του 21α-MMD ή NAC, μεμονωμένα ή σε συνδυασμό, για 24 ώρες στους 37 ° C. Οι καλυπτρίδες απομακρύνθηκαν από τα πιάτα και τα κύτταρα βάφτηκαν με 40μΜ DCFH-DA για 40 λεπτά. Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS δύο φορές για να απομακρυνθεί η περίσσεια του χρώματος. Οι καλυπτρίδες τοποθετήθηκαν σε γυάλινες πλάκες και ελήφθησαν εικόνες χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φθορισμού σε μεγέθυνση 200Χ.

Μέτρηση μιτοχονδριακής διαμεμβρανικό δυναμικό (Δѱm)

Οι αλλαγές στο μιτοχονδριακό δυναμικό αξιολογήθηκαν με χρήση του φθορίζοντος ποτενσιομετρική TMRE βαφής. Το κατιονικό λιπόφιλη χρωστική TMRE λειτουργεί με την είσοδο του κυττάρου στη μορφή ενός εστέρα, ο οποίος στη συνέχεια υδρολύεται και μετατρέπεται σε τετραμεθυλροδαμίνη, η οποία είναι αντιστρεπτά συσσωρεύεται στο αρνητικά φορτισμένο μιτοχονδριακή μήτρα ανάλογα με το μιτοχονδριακό διαμεμβρανικό δυναμικό που παρουσιάζουν δυναμικό εξαρτώμενη συσσώρευση στα μιτοχόνδρια. Για την ανάλυση της Δѱm μετά 21α-MMD θεραπεία, τα κύτταρα αύξηση σε πυκνότητα 1 χ 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο για 24 ώρες σε 24 φρεατίων πλάκα καλλιέργειας αποστειρωμένου σε επεξεργασία με ή χωρίς 25 μΜ 21α-MMD για 24 h. Είκοσι λεπτά πριν από το τέλος της περιόδου επώασης, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και TMRE χρωστικής σε 100 ηΜ φορτώθηκε επί 10 λεπτά στους 37 ° C. Τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και συλλέχθηκαν με ψυχρό PBS που ακολουθείται από την μέτρηση της έντασης φθορισμού με κυτταρομετρία ροής (Becton Dickinson, FACSCalibur) και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας CellQuest 3.0.1 λογισμικού.

κυτταρική μετανάστευση και εισβολή Δοκιμασίες

οι αλλαγές στην κυτταρική μετανάστευση προσδιορίστηκε και Transwell δοκιμασίες χωρίς την ενσωμάτωση του matrigel. Για τη δοκιμασία Transwell μετανάστευση, τα κύτταρα σπάρθηκαν επί των άνω θαλάμους τρυβλίων transwell 24 με 200 μΙ μέσου χωρίς ορό (χωρίς FBS). Μετά τη θεραπεία με διάφορους παράγοντες, τα κύτταρα αφέθηκαν να μεταναστεύσουν υπερωρίες στους κάτω θαλάμους που περιέχουν μέσο 800 μL με 10% FBS για να επάγει χημειοταξία. Τα κύτταρα που μετανάστευσαν ορατά με χρώση με κρυσταλλικό ιώδες (0.5% β /ο) μετά το πλύσιμο με PBS και στερέωση με μεθανόλη. Εικόνες ελήφθησαν και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Juli FL μικροσκόπιο βοήθεια με το λογισμικό J Image. δοκιμασία κυττάρων εισβολή διεξήχθη σε πλάκες transwell 24 φρεατίων με πολυανθρακικό (PVDF) φίλτρων (μέγεθος 8 μm πόρου, Corning, USA). Matrigel αραιώθηκε στο 1 mg /ml με μέσο καλλιέργειας χωρίς ορό και εφαρμόστηκε επί του ενθέτου στους άνω θαλάμους της πολλές εκβαθύνσεις για πλάκα δοκιμασίας εισβολή. Κύτταρα με πυκνότητα 2 χ 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο εμβολιάστηκαν σε άνω θάλαμο της μονάδας transwell σε 200 μι μέσου καλλιέργειας χωρίς ορό. Το κάτω θαλάμου της μονάδας προστέθηκαν με μέσο 800 μL καλλιέργειας συμπληρωμένο με 10% FBS για την επαγωγή χημειοταξίας. Μετά την επώαση με ή χωρίς 21α-MMD (5 μΜ? & Lt? IC

50) για 24 ώρες στους 37 ° C, το μέσο στον ανώτερο θάλαμο αναρροφάται, και ένα μάκτρο βάμβακος χρησιμοποιείται για την αφαίρεση των κυττάρων από την άνω πλευρά της μεμβράνης. Κύτταρα που εισέβαλαν στην κάτω πλευρά της μεμβράνης υπέστησαν χρώση με κρυσταλλικό ιώδες (0.5% β /ο) και οπτικοποιήθηκε και σημείωσε κάτω από Juli FL μικροσκόπιο. Όλα τα αποτελέσματα εκφράζονται ως το ποσοστό του μετανάστευσαν ή εισβολή κυττάρων σε σύγκριση με τον έλεγχο (μη επεξεργασμένα κύτταρα).

ροδαμίνη-123 (Rho-123) Συσσώρευση Δοκιμασία

Αλλαγές στη λειτουργία εκροή του Ρ-σρ σε κύτταρα Α549-PacR προσδιορίστηκαν παράλληλα με τις αλλαγές στη συσσώρευση του Rho-123 βαφή. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε δίσκους 30 mm σε πυκνότητα 1 χ 10

5 κύτταρα ανά δίσκο. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις 21α-MMD για 24 και 48 ώρες. 0,5% DMSO χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Μετά την προεπεξεργασία, τα κύτταρα επωάστηκαν με 1 μg /mL του Rho-123 βαφή σε μέσο καλλιέργειας στους 37 ° C και 5% CO

2 στο σκοτάδι για 90 λεπτά. Μετά τη συσσώρευση Rho-123, τα κύτταρα σε επεξεργασία με θρυψίνη από την ταπήτιο μονοστιβάδα κυττάρων σε δίσκους καλλιέργειας, και το κυτταρικό σφαιρίδιο πλύθηκε δύο φορές με παγωμένο PBS. Τα κύτταρα στη συνέχεια αναλύθηκαν αμέσως χρησιμοποιώντας FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) εξοπλισμένο με ένα λέιζερ αργού 488 nm. Η συγκέντρωση του Rho-123 σε κάθε δείγμα προσδιορίστηκε από τις μετρήσεις φθορισμού από την κατασκευή του Rho-123 πρότυπη καμπύλη. Η συγκέντρωση του ενδοκυτταρικού Rho-123 ομαλοποιήθηκε με την ποσότητα της πρωτεΐνης και εκφράζονται ως nmol /g πρωτεΐνης. Το πράσινο φθορισμού του Rho-123 μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα φίλτρο διέλευσης ζώνης 530 nm [24]. Η λειτουργία εκροής της P-gp παρακολουθήθηκε από την άποψη της μείωσης των εξαγωγών της Rho-123 με την ενσωμάτωση των γονικών κυττάρων Α549 χρησιμοποιείται ως αρνητικός μάρτυρας.

Ανοσοκυτοχημεία

P-gp εντοπισμού, ανοσοφθορισμού, και DNA παρατήρηση φθορισμού σε κύτταρα Α549 /Α549-PacR παρατηρήθηκαν χρησιμοποιώντας Zeiss LSM 780 ApoTome μικροσκόπιο (Carl Zeiss, Jena, Germany). Τα Α549 /Α549-PacR απλώθηκαν σε 30 χιλιοστά πιάτα με διαφάνειες και επωάζονται όλη τη νύχτα. Τα κύτταρα προ-αγωγή με διάφορες συγκεντρώσεις του 21α-MMD ή φάρμακο μέσο χωρίς επί 48 ώρες. Όλες οι πλύσεις έγιναν με PBS και όλες οι επωάσεις ολοκληρώθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου εκτός αν ορίζεται διαφορετικά. Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές. Μετά την επώαση θεραπεία, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη (σε PBS) για 15 λεπτά και στη συνέχεια μπλοκαρίστηκαν με 1% BSA (σε PBS) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου, τα κύτταρα επωάστηκαν με πρωτογενές αντίσωμα Ρ-γλυκοπρωτεΐνης σε 4 ° C όλη τη νύκτα, στη συνέχεια πλύθηκε δύο επιπλέον φορές. Η διαπερατότητα με Triton Χ-100 δεν είχε συμπεριληφθεί αφού η πρωτεΐνη-στόχος, Ρ-gp, είναι μια διαμεμβρανική πρωτεΐνη. Μετά την ολονύκτια επώαση, τα κύτταρα επωάστηκαν με συζευγμένο με FITC δεύτερο αντίσωμα για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. ΫΑΡΙ (0,5 μg /ml) χρησιμοποιήθηκε για να αιματοξυλίνης τους πυρήνες και αποθηκεύεται στους 4 ° C πριν μικροσκοπία.

Protein Κυτταρολύματα, Western Blotting, και Ανοσοκαταβύθιση

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε αποστειρωμένο 100 mm δίσκους για 24 ή 48 ώρες και εκτέθηκαν σε διάφορες συγκεντρώσεις 21α-MMD. Για τον προσδιορισμό των επιπέδων της πρωτεΐνης-στόχου εκφράσεων, εκχυλίσματα ολόκληρων κυττάρων παρασκευάστηκαν. Επεξεργασμένα ή μη επεξεργασμένα κύτταρα λύθηκαν και τα ποσοτικοποιήσεις πρωτεΐνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας την δοκιμασία Bradford [25]. Οι πρωτεΐνες απομονώθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (Beyotime, Κίνα) [20 mmol /L Tris (ρΗ 7.4), 250 nmol /L NaCl, 2 mmol /L EDTA (ρΗ 8.0), 0.1% Triton Χ-100, 0,01 μg /mL απροτινίνη , 0.005 μg /mL λευπεπτίνη, 0,4 mol /L φθοριούχο φαινυλμεθυλσουλφονύλιο, και 4 mmol /L NaVO

4] που ακολουθείται από νηματοποίηση των προϊόντων λύσης στις 14.000 rpm για 10 min με τη χρήση Thermo Sorvall Legend Micro 21R ψυχόμενη φυγόκεντρος (Thermo Scientific, Waltham, ΜΑ, USA) για να απομακρυνθεί το αδιάλυτο υλικό και μετριέται χρησιμοποιώντας τη Nanodrop 1000 Φασματοφωτόμετρο (Thermo, USA). Τα κύτταρα διασπάστηκαν με υπερήχηση και εκχυλίζεται στους 4 ° C για 30 λεπτά. Τα ομογενοποιήματα φυγοκεντρήθηκαν στις 14.000 rpm για 30 λεπτά για να απομακρυνθούν τα μιτοχόνδρια και άλλα αδιάλυτα θραύσματα και τα υπερκείμενα στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν και πάλι όπως παραπάνω για να διασφαλισθεί η πλήρης απομάκρυνση των μιτοχονδρίων. Τα υπερκείμενα από λύματα ολόκληρων κυττάρων συλλέχθηκαν και διατηρήθηκαν στους -80 ° C. Η συνολική πρωτεΐνη (100 μg) σε κάθε προϊόν λύσης κυττάρου επιλύθηκε σε διάφορα ποσοστά γελών συνδυάζεται με τα μοριακά βάρη των στόχων πρωτεΐνης με ηλεκτροφόρηση πηκτής δωδεκυλ θειικού νατρίου-πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) και ηλεκτρο-μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF νιτροκυτταρίνης. Οι μεμβράνες επωάστηκαν με ρυθμιστικό αποκλεισμού (5% άπαχο ξηρό γάλα σε ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο-0,1% Tween 20, PBST, ρΗ 8.0) για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου και επωάζονται περαιτέρω με ειδικά αντισώματα αραιωμένα σε TBST όλη τη νύκτα σε 4 ° C . Μετά από πλύση με TBST τρεις φορές, οι μεμβράνες επωάστηκαν με υπεροξειδάση (HRP), συζευγμένης δευτερεύοντα αντισώματα για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Οπτικοποίηση των ανοσοσυμπλεγμάτων διεξήχθη χρησιμοποιώντας το PowerOpti-ECL-kit (Animal Genetics Inc., Κορέα) και μια LAS 4000 Imager (Fuji Film Corp., Tokyo, Japan).

RNA Extraction και σε πραγματικό χρόνο Αντίστροφη Μεταγραφή-PCR

RT-PCR και πραγματικού χρόνου RT-PCR διεξήχθησαν για να αξιολογηθεί MDR1 mRNA, κυκλίνη Ε, και γονιδιακή έκφραση CDK2 mRNA μετά από αγωγή με ή χωρίς 21α-MMD ή siRNA όπως υποδεικνύεται. Τα κύτταρα σε πυκνότητα 1 χ 10

5 κύτταρα /τρυβλίο σε 100 mm δίσκους υποβλήθηκαν σε αγωγή με 21α-MMD για διάφορες χρονικές πορείες. Μετά την επώαση, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS, και στη συνέχεια λύθηκαν με αντιδραστήριο TRI για την αρχική RNA που απομονώθηκε βήμα. Το RNA εκχυλίστηκε με την προσθήκη χλωροφορμίου, και το απομονωμένο RNA καταβυθίστηκε με ισοπροπυλική αλκοόλη. Τα σφαιρίδια RNA πλύθηκαν με 70% αιθανόλη, ξηραίνεται στον αέρα, και στη συνέχεια διαλύθηκε σε ύδατος άνευ νουκλεάσης. Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 260 και 280 nm για να προσδιοριστεί η συγκέντρωση και η καθαρότητα του RNA. Το συνολικό RNA (1 έως 2 μα) υπέστη αντίστροφη μεταγραφή χρησιμοποιώντας ΑΜν ανάστροφη μεταγραφάση και ολίγο (dT) 15 εκκινητή. Μια αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) διεξήχθη σε ένα μίγμα αντίδρασης που περιέχει cDNA, 0.2 mM dNTP μείγμα, 10 pmol του στόχου-ειδικών εκκινητών με αλληλουχίες παρατίθενται ως εξής: MDR1 (προς τα εμπρός: 5′-CCCATCATTGCAATAGCAGG-3′? Αντίστροφη: 5′ -GTTCAAACTTCTGCTCCTGA-3′), mTOR (εμπρός: 5′-ACTCGCTTCTATGACCAACTGA-3′? αντίστροφη: 5′-TTGAAGGTCTCAAACATGAT-3′), κυκλίνης Ε (εμπρός: 5′-CGGGTCCACAGGATGCGAAGGA-3′? αντίστροφη: 5′-CAGGTGTGGGGATCAGGGAGCA- 3′), CDK2 (προς τα εμπρός: 5′-CATTCCTCTTCCCCTCATCA-3′? αντίστροφη: 5′-CAGGGACTCCAAAAGCTCTG-3′), και 0.25 U Taq DNA πολυμεράσης με χρήση συστήματος GeneAmp PCR 2400 (Applied Biosystems, Foster, CA, USA) για να την ενίσχυση του cDNA. προσδιορίστηκαν Ο κύκλος κατωφλίου (Ct) τιμές. Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης του mRNA ομαλοποιήθηκαν είτε β-ακτίνης (εμπρός: 5′-AGGCACCAGGGCGTGAT-3′? Αντίστροφη: 5′-GCCCACATAGGAATCCTTCTGAC-3′) ή GAPDH (εμπρός: 5′-ATCCCATCACCATCTTCCAG-3′? Αντίστροφη: 5′ -CCATCACGCCACAGTTTCC-3 ‘), όπως υποδεικνύεται, διαιρώντας το από τις μέσες τιμές Ct του εσωτερικού ελέγχου για την εν λόγω δείγματος (Δ-CT). Τα κανονικοποιημένα επίπεδα μεταγραφής εκφράστηκαν σε σχέση με το δείγμα που ελήφθη από τον έλεγχο DMSO (ΔΔ – Ct), και το σχετικό επίπεδο έκφρασης RNA παρουσιάστηκε ως 2-Δ-Ct [26]. Τα προϊόντα PCR διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 2%. Η γέλη χρωματίστηκε με SYBR διάλυμα ασφαλής χρώσης 10.000-φορές-αραιωμένο και οπτικοποιούνται υπό υπεριώδες transilluminator (Άλφα ImagerYM, η Alpha Innotech Corp., USA). Real-time PCR διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα σύστημα MiniOpticon (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), χρησιμοποιώντας 5 μL του προϊόντος αντίστροφης μεταγραφής, 10 μL iQTMsupermix (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), 0,5 μί εκκινητών και ανιχνευτές σε ένα συνολικό όγκο 20 μL. Πρότυπες συνθήκες θερμοκυκλοποιητή χρησιμοποιήθηκαν ως ακολούθως: 95 ° C για 5 λεπτά πριν από τον πρώτο κύκλο, 95 ° C για 10 δευτερόλεπτα, 56 ° C για 30 δευτερόλεπτα, επαναλήφθηκε 40 φορές

παροδική διαμόλυνση μικρά παρεμβαλλόμενα RNA. (siRNA)

Η φίμωση του mTOR με siRNA (25 nM) επιτεύχθηκε με τη χρήση αντιδραστηρίων επιμόλυνσης DharmaFECT μετά το εκπαιδευτικό εγχειρίδιο για παροδική επιμόλυνση σε κύτταρα Α549-PacR. Scramble siRNA (25 ηΜ), χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος, επίσης παρέχονται. Το αντιδραστήριο μίγμα προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο ανά τρυβλίο που περιέχει 200 ​​μι μέσου χωρίς ορό και ελεύθερο από αντιβιοτικά για έναν συνολικό όγκο 300 μL και τα κύτταρα επωάστηκαν για 4 ώρες στους 37 ° C. Ένας ίσος όγκος μέσου προστέθηκε στη συνέχεια σε κάθε φρεάτιο. Μετά την επιμόλυνση για 24 ώρες μετά την επίστρωση, τα κύτταρα εμπλουτίζονται με 10% FBS, επωάζονται για άλλες 24 ώρες με 25 μΜ 21α-MMD και τα κύτταρα συλλέχθηκαν και υποβλήθηκαν σε ανάλυση. Η knockdown της έκφρασης mTOR εξετάστηκε με ανοσοκηλίδωση όπως περιγράφεται παραπάνω χρησιμοποιώντας αντι-mTOR αντίσωμα. Η ακολουθία mTOR siRNA ήταν 5′-AAGAAUCAAAGAGCAGAGUGC-3′.

Στατιστικές Αναλύσεις

Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SD για το δηλούμενο αριθμό ανεξάρτητα πραγματοποιήθηκαν πειράματα και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας t-τεστ του Student με μη παραμετρική δοκιμή Mann-Whitney U-test για τιμές που δεν ήταν κανονικά κατανεμημένες, μονόδρομη ANOVA, και Spearman rank δοκιμές συσχετισμού ενδεχομένως με GraphPad Prism λογισμικό v5.01 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Αξίες με

σ

& lt?. 0.05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές

Αποτελέσματα

Αντι-πολλαπλασιαστικές επιδράσεις των ενώσεων από

P

.

trifoliata

σε ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές

Οι κουμαρίνες και τριτερπενοειδή από τους καρπούς του

P

.

trifoliata

έχουν περιγραφεί προηγουμένως να επιδεικνύουν ισχυρή αντικαρκινική αποτελέσματα εναντίον μιας ποικιλίας μοντέλων καρκινικών κυττάρων [27-29]. Βάσει αυτών των πληροφοριών, οι

in vitro

κυτταροτοξική δραστηριότητα των 13 ενώσεων που απομονώνονται από τους καρπούς του

P

.

trifoliata

έναντι MDA-MB-231, Τ47ϋ, SNU-638, SK-HEP-1, και Α549 κυτταρικές σειρές ανθρώπινου καρκίνου αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας δοκιμασία SRB. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 1, τριτερπενοειδή έδειξε την πιο υπόσχεση με αναστολή ένα πάνελ καρκινικών κυττάρων με IC

50 τιμές σε λιγότερο από 50 μικρο-γραμμομοριακή εύρη. Μεταξύ των ενώσεων δοκιμής, τριτερπενοειδή 25-methoxyhispidol Α, 21α-methylmelianodiol (21α-MMD, Σχήμα 1Α), και 21α, 25-dimethylmelianodiol παρουσίασαν την πιο δραστική αντι-πολλαπλασιαστική δραστικότητα. Τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η αντι-πολλαπλασιαστική δραστηριότητα των 21α-MMD είναι ισχυρή όταν δοκιμάστηκε σε καρκινικά κύτταρα Α549 ανθρώπινου πνεύμονα, που μας κατευθύνεται προς την περαιτέρω μελέτη του μηχανισμού δράσης του σε μια μεγαλύτερη ομάδα μοντέλα κυττάρων NSCLC.

( Α) Η χημική δομή της 21α-Methylmelianodiol (21α-MMD), ένα φυσικό τριτερπενοειδείς απομονωθεί από τον καρπό του

Poncirus trifoliata

. (Β) κυτταρικές σειρές ανθρώπινου καρκίνου του πνεύμονα Η292 L132 ανθρώπινο φυσιολογικό πνεύμονα κυτταρικές σειρές MRC-5 και και Α549, Η460, Η358, Η1299, και απλώθηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων και υποβλήθηκαν σε αγωγή με διάφορες συγκεντρώσεις του 21α-MMD για 24 ώρες και κυτταρική ανάπτυξη αναλύθηκε με ανάλυση ΜΤΤ και σχεδιάζονται ως ποσοστό των βιώσιμων κυττάρων. Οι τιμές σε σύγκριση με την αντίστοιχη τιμή ελέγχου. (Γ) ανάπτυξη σχηματισμός Κλωνική του υποδεικνύεται καρκινικών κυττάρων του πνεύμονα διεξήχθη μετά από μια περίοδο ανάπτυξης 7 ημερών μετά από μία μόνο χορήγηση διαφόρων συγκεντρώσεων 21α-MMD. Εικόνες από την αριστερή εμφανίζονται είναι κρυσταλλικό ιώδες χρωματισμένο αποικίες, ενώ στα δεξιά είναι γραφικές παραστάσεις που αντιπροσωπεύουν μετρήσεις καταμέτρηση των αποικιών. (Δ και Ε) μικροσκοπία αντίθεσης φάσης πραγματοποιήθηκε σε κύτταρα μετά από έκθεση σε 25 μΜ 21α-MMD να εντοπίσει τις αλλαγές στη μορφολογία και το DNA παρατηρήθηκε με DAPI (κάτω αριστερά) και με PI (δεξιά) χρώση παρατηρήθηκε με ομοεστιακό μικροσκόπιο. (F) Η1299 και Α549 κύτταρα επωάστηκαν με 5 μΜ 21α-MMD για 24 ώρες που ακολουθείται από ανάλυση των κυττάρων εισβολή. Matrigel αραιώθηκε με μέσο καλλιέργειας χωρίς ορό και εφαρμόστηκε επί του ενθέτου στους άνω θαλάμους της πολλές εκβαθύνσεις και τα κύτταρα επωάστηκαν για να εισβάλουν. Λύματα ολόκληρων κυττάρων υποβλήθηκαν σε ανάλυση κηλίδος Western χρησιμοποιώντας αντι-ERK, αντι-ΙΝΚ, αντι-ρ38, αντι-Akt, αντι-mTOR, αντί-ΡΙ3Κ, αντι-ΑΜΡΚ και αντισωμάτων που σχετίζονται με φωσφορυλιωμένες μορφές τους. Η β-ακτίνη και φωσφο-πρωτεΐνη σχετική με τις συνολικές πρωτεϊνικές ζώνες επιβεβαίωσε την ακεραιότητα και την ίση φόρτωση του συνόλου των πρωτεϊνών και φωσφο-πρωτεΐνες, αντίστοιχα. Όλα τα επίπεδα πρωτεΐνης ομαλοποιήθηκε ως προς το β-ακτίνης επίπεδα. (Β και Γ) Επίδραση της mTOR νοκ ντάουν ιδρύθηκε για πρώτη φορά από παροδικής επιμόλυνσης mTOR siRNA σε κύτταρα Α549-PacR για 24 ώρες. Scramble siRNA χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος διαχωρίζεται από το ψευδο ελέγχου. mTOR και πρωτεΐνη /P-gp MDR1 και γονίδιο mRNA εκφράσεις εξετάστηκαν με κηλίδωση Western και ανάλυση PCR αντίστοιχα. (Δ και Ε) Κύτταρα διαμολύνθηκαν παροδικά με mTOR siRNA ή Scramble siRNA για 24 ώρες που ακολουθείται από μια έκθεση 24 h έως 25 μΜ 21α-MMD. πρωτεΐνης /P-gp MDR1 και τα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης mRNA επιβεβαιώθηκαν με κηλίδωση Western και ανάλυση PCR αντίστοιχα.