Αφηρημένο

Το φυσικά τριτερπενοειδείς betulinic οξύ (BA) δείχνει έντονη polypharmacology κυμαίνονται από αντι-φλεγμονώδη σε αντι-lipogenic δραστηριότητες. Πρόσφατα στοιχεία δείχνουν ότι μάλλον ποικίλα κυτταρικά γεγονότα σηματοδότησης μπορεί να αποδοθεί στην ίδια κοινή διακόπτη ανάντη του κυτταρικού μεταβολισμού. Στην παρούσα μελέτη, επομένως, εξέτασε τις μεταβολικές αλλαγές που προκαλούνται από την BA (10 μΜ) χορήγηση, με έμφαση στο μεταβολισμό της γλυκόζης κυτταρική. Έχουμε αποδείξει ότι η ΒΑ ανεβάζει τα ποσοστά της κυτταρική πρόσληψη γλυκόζης και αερόβια γλυκόλυση στο ποντίκι εμβρυϊκών ινοβλαστών με ταυτόχρονη μείωση της οξείδωσης της γλυκόζης. Χωρίς να προκαλεί εμφανή σημάδια της ΒΑ κυτταρικού θανάτου οδηγεί σε κίνδυνο μιτοχονδριακή λειτουργία, αυξημένη έκφραση των μιτοχονδριακών αποσύνδεσης πρωτεϊνών (UCP) 1 και 2, και το ήπαρ κινάση Β1 (LKB1) -εξαρτώμενη ενεργοποίηση AMP-ενεργοποιημένη κινάση πρωτεΐνης. ενεργοποίηση ΑΜΡΚ αντιπροσωπεύει την αυξημένη πρόσληψη γλυκόζης και γλυκόλυσης που με τη σειρά είναι απαραίτητα για την κυτταρική βιωσιμότητα κατά την κατεργασία ΒΑ. Συνολικά, δείχνουμε για πρώτη φορά μια σημαντική επίδραση της ΒΑ στην κυτταρική βιοενεργειακό που μπορεί να είναι ένας κεντρικός μεσολαβητής των πλειοτροπικές δράσεις της ΒΑ

Παράθεση:. Heiss EH, Kramer MP, Ατανάσοφ AG, Beres Η, Schachner D, Dirsch VM (2014) γλυκολυτικό Εναλλαγή σε απάντηση betulinic οξύ σε κύτταρα μη-καρκίνου. PLoS ONE 9 (12): e115683. doi: 10.1371 /journal.pone.0115683

Επιμέλεια: Μίκα Jekabsons, Πανεπιστήμιο του Μισισίπι, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 18 Ιουν 2014? Δεκτές: 1 Δεκ 2014? Δημοσιεύθηκε: 22, Δεκεμβρίου του 2014

Copyright: © 2014 Heiss et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Ταμείο αυστριακή Science (αριθμός επιχορήγηση 23.317) για να ΕΗΗ Herzfelder »sche Familienstiftung να ΕΗΗ. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

betulinic οξύ (3β-3-υδροξυ-lup-20 (29) -εν-28-ικό οξύ? BA) είναι ένα φυσικό πεντακυκλικόν τριτερπενοειδείς με πολύπλευρο προφίλ δραστηριότητας. Πολλαπλές μελέτες αποκάλυψαν μεταξύ άλλων αντι-ιικές, αντι-πολλαπλασιαστική, προ-αποπτωτικών, αντι-φλεγμονώδη, vasoprotective, καθώς και αντι-διαβητικοί και αντι-lipogenic ιδιότητες για ΒΑ και τα παράγωγά της και τα δύο

in vitro

και

in vivo

[1] – [11]. Σύμφωνα με την πληθώρα των αναφερθέντων βιοδραστικότητες αρκετές μοριακοί στόχοι έχουν προταθεί συμπεριλαμβανομένου του παράγοντα κΒ πυρηνικό – [12], η πρωτεΐνη σύνδεσης στερόλη ρυθμιστικό στοιχείο – [7], και το ενδοθηλιακό ΝΟ μονοπάτι συνθάσης [5], η μιτοχονδριακή διαπερατότητα μετάβαση πόρου (ΜΡΤΡ) [13], διακυλογλυκερόλη ακυλτρανσφεράσης [14], ο υποδοχέας Tgr5 χολικών οξέων [6], λιπάσες [15] ή φωσφατάσης τυροσίνης πρωτεΐνης 1Β [16].

έχει γίνει πρόσφατα όλο και περισσότερο αντιληπτό ότι η μεταβολική πρόγραμμα δεν είναι παθητικός θεατής αλλά ενεργός ρυθμιστής της μεταγωγής σήματος και του φαινοτύπου ενός κυττάρου [17]. Μια αλλαγή στο μεταβολικό πρόγραμμα μπορούν να επηρεάσουν ταυτόχρονα πολλαπλά και σε μονοπάτια σηματοδότησης άσχετα πρώτης όψεως, π.χ. με την παροχή ή τον περιορισμό κεντρικό υποστρώματα για αναβολισμός, κυτταροπροστασία ή μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις, και να θεωρηθεί ως ένα κεντρικό ανάντη καθοριστικός παράγοντας της κυτταρικής συμπεριφοράς [18].

Υποθέτοντας ότι ορισμένες από τις βιοδραστικότητες που ασκείται από την ΒΑ είναι συνέπεια αλλοιωμένης βιοενεργητική στόχος μας ήταν να διερευνηθεί η επίδραση της ΒΑ στο μεταβολισμό της γλυκόζης.

Υλικά και Μέθοδοι

Cells, χημικές ουσίες και αντισώματα

άγριου τύπου (WT) και ισογονικούς AMPKα

1 – /- ποντίκι εμβρυϊκών ινοβλαστών (MEF) και WT και LKB1 – /- MEF ήταν ευγενικό δώρα από Benoit Viollet, INSERM στο Παρίσι, Γαλλία και Ρούμπεν Shaw, Scripps Institute, La Jolla, ΗΠΑ, αναφέρεται στο [19] και [20] , αντίστοιχα. Ποντικού 3T3-L1, C2C12, RAW 264.7 κύτταρα από LGC /ATCC (Wesel, Γερμανία). Πρωτογενή ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα (HUVEC) ήταν από την Lonza (Braine-L’Alleud, Βέλγιο). Betulinic οξύ (καθαρότητα 99%) αγοράστηκε από Biosolutions Halle GmbH (Halle, Γερμανία). Τρίτιο με την ένδειξη 2-δεοξυγλυκόζης (DOG) παρασχέθηκε από ΝΕΝ (Βιέννη, Αυστρία). Η CellTiterGlo, το CaspaseGlo- και τα μη ραδιενεργά δοκιμασίες κυτταροτοξικότητας CytoTox96 προήλθε από την Promega (Mannheim, Germany). Mitotracker Πράσινο και MitoSox Red αγοράστηκαν από την Invitrogen (Βιέννη, Αυστρία). Ειδικές πλάκες κυτταρικής καλλιέργειας, φυσίγγια, το διάλυμα βαθμονόμησης καθώς και γλυκόλυση και μιτοχονδριακή στρες τεστ διατάχθηκαν από Seahorse Βιοεπιστημών. STO609 ήρθε από την Calbiochem. Πρωτογενής αντι-ΑΜΡΚ (# 2532), αντι-pAMPK (Thr172) (# 2535), αντι-PACC (Ser79) (# 3661), το αντι-LKB1 (# 3047) αντι-PDHE1 (# 2784), καθώς και η αντισώματα που κατευθύνονται εναντίον γλυκολυτικών ενζύμων (γλυκόλυση σετ δειγματολήπτη) προήλθε από τη Cell Signaling Technology (Frankfurt am Main, Γερμανία). Οι αντι-GLUT1 και GLUT3 αντισώματα προέρχονταν από Millipore (Βιέννη, Αυστρία) (# CBL242? # AB1344), το αντι-UCP1 ή 2 αντισώματα παραγγέλθηκαν από Abcam (Cambridge, UK) (# 10983, 77363), αντι-p -PDHE1 (Ser273) ήταν από Novus Biologicals (Cambridge, UK) (# NB11093479) και το αντίσωμα αντι-ακτίνης ήταν από mpbio (Eschwege, Γερμανία) (# 69100). Δευτερογενής υπεροξειδάση κρένου (HRP) -συζευγμένων αντισώματα αντι-κουνελιού και αντι-ποντικού προήλθαν από Cell Signaling Technology και mpbio, αντίστοιχα, και το αντίσωμα HRP-αντι-κατσίκας ήταν από την Santa Cruz (Χαϊδελβέργη, Γερμανία). Όλα τα άλλα χημικά ήταν από την Sigma-Aldrich (Βιέννη, Αυστρία). Όλες οι ενώσεις δοκιμής ή αναστολείς διαλύθηκαν σε DMSO, προστατευμένο από το φως όσο το δυνατόν περισσότερο, δειγματίστηκε και φυλάχθηκε στους -20 ° C. Για τα πειράματα κύτταρο, η τελική συγκέντρωση του DMSO διατηρήθηκε σταθερή σε όλα τα δείγματα και δεν υπερέβη ποτέ το 0,3% DMSO.

Καλλιέργεια κυττάρων

Εκτός από τα κύτταρα HUVEC σαν ρουτίνα υποκαλλιεργείται σε τροποποιημένο βασικό μέσο Dulbecco ( DMEM, 4,5 g /L γλυκόζη από την Lonza) συμπληρωμένο με 10% θερμοαπενεργοποιημένο βόειο εμβρυϊκό ορό (Invitrogen) και 2 mM γλουταμίνη (Lonza). HUVEC κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μέσο ανάπτυξης ενδοθηλιακού (EGM1) και τα συμπληρώματα που παρέχονται από την Lonza. Για τη διαφοροποίηση των κυττάρων 3Τ3-L1 να ωριμάσει λιποκυττάρων και των C2C12 μυοβλαστών να μυοσωληνάρια χρησιμοποιήθηκαν τυποποιημένα πρωτόκολλα, όπως περιγράφεται αλλού [21], [22]. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε εξετάσεις ρουτίνας, όπως το μυκόπλασμα-free και διατηρούνται σε καλλιέργεια & lt? 11 περάσματα (για την πρωτοβάθμια HUVEC & lt? 5).

Καθορισμός της κυτταρικής ρυθμό πρόσληψης γλυκόζης

Ο προσδιορισμός της κυτταρική πρόσληψη γλυκόζης ρυθμός διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [23]. Εν συντομία, τα κύτταρα παρασκευάζονται σε πλάκες 12 φρεατίων. Μετά την επεξεργασία όπως υποδεικνύεται κύτταρα εξισορροπήθηκαν σε πρότυπο Krebs Ringer Φωσφορικό HEPES (KRPH) ρυθμιστικό που περιέχει 0.2% αλβουμίνη βόειου ορού (BSA) για 20 λεπτά. Η πρόσληψη γλυκόζης άρχισε με προσθήκη 2-DOG εμβολιάζεται με 2-δεοξυ-D- (1H3) -Γλυκόζη (τελικές συγκεντρώσεις 0,1 mM και 0.45 μCi /mL). Μετά από 15 λεπτά η αντίδραση σταμάτησε με τρεις ταχείες εκπλύσεις με παγωμένο PBS. Ο ρυθμός πρόσληψης γλυκόζης προσδιορίστηκε με μέτρηση υγρού σπινθηρισμού (Perkin Elmer, Brunn am Gebirge, Αυστρία) των προϊόντων λύσης κυττάρου (λύση από 0,05 Ν ΝαΟΗ σε PBS), κανονικοποιημένη προς περιεκτικότητα πρωτεΐνης αξιολογήθηκε από το Rotiquant ™ (Carl Roth, Karlsruhe, Germany) δοκιμασία πρωτείνης και η πρόσληψη του χρόνου (για να ληφθεί η ενσωματωμένη ραδιενέργεια ανά mg πρωτεΐνης και λεπτά) και διορθώθηκε για την πρόσληψη γλυκόζης μη-μεταφορέα μεσολάβηση (η οποία δεν αναστέλλεται από συν-θεραπεία με κυτοχαλασίνη Β (10 μΜ) κατά τη διάρκεια της διαδικασίας πρόσληψης). Ολιγομυκίνη Α (2 μΜ, 4 h) χρησίμευσε ως θετικός έλεγχος για την αύξηση της πρόσληψης γλυκόζης βασικοκυτταρικό.

Εκτίμηση πιθανών κυτταροτοξικότητας μέσω προσδιορισμού του απελευθερωμένου γαλακτικής αφυδρογονάσης (LDH), τα επίπεδα ΑΤΡ, η διάσπαση της κασπάσης και της βιομάζας

οι MEF αναπτύχθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων (πυκνότητα σποράς 2,5 χ 10

4 κύτταρα /φρεάτιο). Μετά τη θεραπεία, όπως αναφέρεται προσδιορίσαμε την απελευθέρωση της LDH (μέτρο για την ακεραιότητα της μεμβράνης), τα επίπεδα ATP (μέτρο για τη βιωσιμότητα των κυττάρων) και η διάσπαση της κασπάσης (μέτρο για την επαγωγή απόπτωσης) με τη Δοκιμασία CytoTox96 μη ραδιενεργά κυτταροτοξικότητα, η βιωσιμότητα Δοκιμασία CellTiterGlo φθορισμού των κυττάρων και η CaspaseGlo 3/7 φθορισμού Δοκιμασία, αντίστοιχα. Όλα τα κιτ πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις παρεχόμενες πρωτόκολλα. Βιομάζα χρωματίστηκε με χύσιμο off μέσο και επώαση προσκολλημένα κύτταρα με διάλυμα κρυσταλλικού ιώδους (0,5% (w /v) κρυσταλλικό ιώδες /20% (ν /ν) MeOH) για 5-10 λεπτά. Μετά από επισταμένη στάδια έκπλυσης με νερό βρύσης (για να απαλλαγούμε από περίσσεια χρωστικής) και ξήρανση του δεσμευμένου βαφή διαλυτοποιήθηκε με αλκοολικό διάλυμα κιτρικού (0,05 Μ κιτρικό /50% (ν /ν) EtOH) και ποσοτικοποιείται με μετρήσεις απορρόφησης στα 595 nm. Απορρόφηση και φωταύγεια παρακολουθήθηκαν σε έναν αναγνώστη Tecan (Grödig, Αυστρία) Sunrise και την πλάκα GeniosPro, αντίστοιχα. Triton (1%), σταυροσπορίνη (1 μΜ) ή ένα συνδυασμό ολιγομυκίνη Α (2 μΜ) και DOG (10 mM) χρησίμευσαν ως θετικοί μάρτυρες για τις αντίστοιχες δοκιμασίες.

πυρηνικού παράγοντα Ε2 συγγενή παράγοντα 2 ( Nrf2) εξαρτώμενη γονίδιο αναφοράς δοκιμασία

Η εξαρτώμενη Nrf2 δοκιμασία γονιδίου αναφοράς βασίστηκε στην έκφραση λουσιφεράσης προκλήθηκε από το ενεργοποιημένο στοιχείο αντιοξειδωτικής απόκρισης (ARE) της γλουταθειόνη- ποντικού

S

-transferase και εκτελούνται όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24]. CDDO-IM, ένα συνθετικό τριτερπενοειδείς (100 ναυτικών μιλίων), χρησίμευσε ως θετικός έλεγχος και παρασχέθηκε ευγενώς από τον Michael Sporn, Geisel της Ιατρικής Σχολής του Dartmouth, Αννόβερο, NH, USA.

Εξωκυττάρια ροής ανάλυση για τον προσδιορισμό της γλυκόλυσης και αναπνευστική ικανοτήτων

MEF σπάρθηκαν σε κατάλληλες πλάκες επικαλυμμένες με κολλαγόνο καλλιέργειες 24 φρεατίων κυττάρου (από ιππόκαμπος Biosciences? Κοπεγχάγη, Δανία) κυτταρική πυκνότητα 2,7 χ 10

4 κύτταρα /φρεάτιο). Μετά την επεξεργασία όπως υποδεικνύεται κύτταρα διατηρήθηκαν σε μέσο ελεύθερο ορού (DMEM συν 2 mM γλουταμίνη, 0 mM γλυκόζη, 0 (δοκιμή γλυκόλυση στρες) ή 2 (μιτοχονδριακή stress test) mM πυροσταφυλικό, ρΗ 7,35-7,40) στους 37 ° C και περιβάλλοντος CO

2 για μία ώρα πριν υποβλήθηκαν σε γλυκόλυση (ανάγνωση: εξωκυτταρικό ρυθμό οξίνισης (ECAR) σε mph /min) και μιτοχονδριακή (ανάγνωση: ρυθμός κατανάλωσης οξυγόνου (OCR) σε ριποΐβ O

2 /λεπτό) τεστ αντοχής . Κατάλληλο τεστ προήλθε από Seahorse Βιοεπιστημών, διεξήχθησαν σύμφωνα με τις οδηγίες των κατασκευαστών και αναλύθηκαν σε Seahorse 24XF

e εξωκυττάριο αναλυτή ροής και του λογισμικού Wave (www.seahorsebio.com). Βελτιστοποιημένη συγκεντρώσεων αναστολέα για MEF ήταν 2 μΜ ολιγομυκίνη Α, 1,5 μΜ carbonylcyanid-ρ-trifluoromethoxyphenylhydrazon (FCCP), 1 μΜ ροτενόνη Α, 1 μΜ αντιμυκίνη Α, και 100 mM 2-DOG. Η κανονικοποίηση προς κυτταρική μάζα ρουτίνας με χρώση κρυσταλλικού ιώδους μετά την ανάλυση, προκειμένου να λαμβάνονται υπόψη διαφορές δυναμικού του αριθμού των κυττάρων.

Προσδιορισμός της εξωκυττάριας γαλακτικού ως δείκτης για γλυκόλυση

Οι MEF παρασκευάστηκαν πλάκες 24 φρεατίων. Μετά την επεξεργασία όπως υποδεικνύεται κύτταρα πλύθηκαν με PBS και στη συνέχεια επωάστηκαν με το πρότυπο Krebs Ringer Φωσφορικό HEPES (KRPH) ρυθμιστικό συμπληρωμένο με 0.2% BSA και 10 mM γλυκόζη επί 2 ώρες. Στη συνέχεια, τα υπερκείμενα αναλύθηκαν για περιεκτικότητα γαλακτικού τους μέσω μιας δοκιμασίας φθορισμού ένζυμο-συζευγμένο, και τα κύτταρα λύθηκαν και το περιεχόμενο τους σε πρωτεΐνες προσδιορίστηκε. Εν συντομία, ένας όγκος υπερκειμένου (συνήθως αραιωμένο 1:20) αναμίχθηκε με ένα ρυθμιστικό δοκιμασίας όγκος (ρυθμιστικό KRP με 10 μΜ Amplex Red, 1 U /mL γαλακτική οξειδάση και 2,5 U /mL περοξειδάση χράνου), επωάστηκαν για 10 λεπτά και στη συνέχεια, διαβάστε σε flourimeter σε μήκος κύματος διέγερσης 535 nm και μήκος κύματος εκπομπής 590 nm. Παράλληλη παρακολούθηση των λύσεων με γνωστές συγκεντρώσεις του γαλακτικού διευκόλυνε την τελική ανάγνωση των mol γαλακτικού /g πρωτεΐνης * min.

κυτταρομετρίας ροής προσδιορισμό του μιτοχονδριακού περιεχομένου και των μιτοχονδρίων αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) παραγωγή

MEF αναπτύχθηκαν σε 12 ή 6- φρεατίων (πυκνότητα σποράς 1,5 × 10

4 ή 3 × 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο) και υποβάλλεται σε επεξεργασία όπως υποδεικνύεται. Για τον προσδιορισμό των μιτοχονδριακών κύτταρα περιεχόμενο βάφτηκαν με 50 ηΜ Mitotracker Green (Invitrogen) για 20 λεπτά και στη συνέχεια αναλύθηκαν στο πράσινο κανάλι (FL1, ex 488 nm? Em 530/30 nm) του FACS Calibur (BD Biosciences, Schwechat, Αυστρία). Η αυθαίρετη μέση του πράσινου φθορισμού λήφθηκε ως μέτρο για την μιτοχονδριακή περιεχόμενο μετά τη διόρθωση για αυτοφθορισμό [25], [26]. Βαλινομυκίνη χρησίμευσε ως έλεγχος για την πιθανή ανεξαρτησία του Mitotracker πράσινο σήμα. Για τον προσδιορισμό του μιτοχονδριακού κύτταρα παραγωγής ROS επωάστηκαν με 5 μΜ MitoSox Red (Invitrogen) για 10 λεπτά και στη συνέχεια αναλύθηκαν για αυτοφθορισμό διορθωμένη ερυθρό φθορισμό τους (κανάλι FL2, ex 488 nm? Em 585/42 nm) στο κυτταρόμετρο ροής. Η αυθαίρετη μέση του κόκκινου φθορισμού λήφθηκε ως ένδειξη για παράγεται μιτοχονδριακή ROS. Αντιμυκίνη Α (2 μΜ) χρησίμευσε ως θετικός έλεγχος σε αυτόν τον προσδιορισμό.

εκχύλιση Protein, SDS-πολυακρυλαμιδίου ηλεκτροφόρηση και ανοσοστύπωμα ανάλυση

Οι MEF παρασκευάστηκαν σε τρυβλία 6 φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία όπως υποδεικνύεται. Ανοσοκηλιδώσεως ανάλυση συμπεριλαμβανομένης της εξαγωγής πρωτεϊνών, τρέξιμο γέλη, μεταφορά, ανοσοανίχνευση και πυκνομετρική αξιολόγηση διεξήχθησαν όπως περιγράφεται αλλού [23]. Για την ανίχνευση του GLUT1 και 3 δείγματα δεν έβρασαν πριν από την ηλεκτροφόρηση για να αποφευχθεί συσσωμάτωση και καθίζηση. Για την ανίχνευση των πρωτεϊνών παρόμοιου μεγέθους (π.χ. φωσφορυλιωμένη μορφή έναντι συνολικής πρωτεΐνης) δύο ίδιες μεμβράνες από τις ίδιες πρωτεΐνες παρασκευάζονται εκχυλίσματα και αξιολογούνται, προκειμένου να αποφευχθούν πιθανές αντικείμενα ή διφορούμενες σημάτων οφείλεται σε ελλιπή απογύμνωση.

Στατιστικά στοιχεία

Για στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν πειράματα τουλάχιστον τρεις φορές (n≥3? ανεξάρτητων πειραμάτων (βιολογικού επαναλήψεις)). ιστογράμματα απεικονίζουν μέση τιμή + SD. Δύο ομάδες συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας δοκιμασία t του Student, περισσότερες ομάδες αναλύθηκαν κατά ένα ή δύο κατευθύνσεων ANOVA ανάλογα με τον αριθμό των μεταβλητών στα σύνολα δεδομένων ερευνηθεί, ακολουθούμενη από δοκιμή Dunnett post hoc ή Bonferroni του. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις έγιναν με GraphPad Prism. Οι διαφορές με τιμές ρ & lt?. 0.05 θεωρήθηκαν ως σημαντικές και χαρακτηρίζονται με *

Αποτελέσματα

BA αυξάνει την κυτταρική πρόσληψη γλυκόζης

Πρώτα θα αξιολογηθεί το ποσοστό κυτταρική πρόσληψη γλυκόζης μετά θεραπεία με BA σε διαφορετικούς τύπους κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων πρωτογενή ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα (HUVEC), αθανατοποιημένα μακροφάγα ποντικού (RAW264.7), διαφοροποιημένη μυο ποντικού (C2C12) – και λιποκύτταρα (3T3-L1), καθώς και εμβρυϊκών ινοβλαστών ποντικού (MEF). Παρατηρήσαμε με συνέπεια μία αυξημένη πρόσληψη βασικοκυτταρικό γλυκόζης σε όλους τους τύπους κυττάρων κατά περίπου 50 έως 100% (Σχήμα 1Α). Με BA σε μια συγκέντρωση 10 μΜ (οιονεί βέλτιστη συγκέντρωση για όλους τους χρησιμοποιούνται κυτταρικές γραμμές όπως προσδιορίζεται με πειράματα συγκέντρωσης-απόκρισης? S1 Σύκο.). Ολιγομυκίνη Α, ένας αναστολέας της μιτοχονδριακής ΑΤΡ συνθάσης, χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. Αυτά τα ευρήματα πρότεινε μια γενική και τον τύπο κυττάρων ανεξάρτητη αύξηση της ενσωμάτωσης της γλυκόζης από την ΒΑ. Η προσθήκη συγκεντρώσεων κορεσμού της ινσουλίνης σε διαφοροποιημένα λιποκύτταρα και μυοκύτταρα, δύο μεγάλες ινσουλίνη ευαίσθητους τύπους κυττάρων γλυκόζη διάθεση, οδήγησε σε αυξημένη κυτταρική πρόσληψη γλυκόζης στο πάνω μέρος του αποτελέσματος BA (Εικ. 1Β) που δείχνουν προς μια ανεξάρτητη ινσουλίνης δράση της ΒΑ.

(Α) Διαφορετικοί τύποι κυττάρων (διαφοροποιημένα λιποκύτταρα (3T3-L1), διαφοροποιημένη μυοσωληνάρια (C2C12), ενδοθηλιακά κύτταρα (HUVEC), μακροφάγα (RAW264.7) και εμβρυϊκές ινοβλάστες ποντικού (MEF)) υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 10 μΜ ΒΑ (+) ή 0,1% DMSO (-) για 16 ώρες πριν από την ταχύτητα πρόσληψης γλυκόζης κυτταρική τους προσδιορίστηκε όπως περιγράφεται. Ολιγομυκίνη Α (ΕΓ, 2 μΜ για 4 ώρες) χρησίμευσε ως θετικός έλεγχος για την αύξηση της πρόσληψης γλυκόζης βασικοκυτταρικό. Το ραβδόγραμμα απεικονίζει γλυκόζη ρυθμούς πρόσληψης σε σχέση με τη μέση τιμή του αντίστοιχου ελέγχου DMSO (n = 3 (δηλαδή τρία ανεξάρτητα πειράματα, κάθε εις τριπλούν)? * Ρ & lt? 0,05 vs DMSO Ctrl, ANOVA). (Β) διαφοροποιημένα λιποκύτταρα (αριστερά) και μυοκύτταρα (δεξιά) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με BA (10 μΜ) για 16 ώρες πριν από την ορό ασιτίας και διέγερση της ινσουλίνης (15 λεπτά? 3T3-L1: 15 ηΜ ινσουλίνης? C2C12: 100 ηΜ ινσουλίνης). Στη συνέχεια, κυτταρική πρόσληψη γλυκόζης προσδιορίστηκε. γραφικές παραστάσεις Bar απεικονίζουν ποσοστά πρόσληψης γλυκόζης σε σχέση με τη μέση τιμή του αντίστοιχου μη διεγερμένων ελέγχου του οχήματος. (N = 3 (δηλαδή τρία ανεξάρτητα πειράματα, το καθένα εις τριπλούν)? Μέσος όρος + SD? * Ρ & lt? 0,05 vs μη διεγερμένα DMSO ctrl, ° π & lt? 0,05 έναντι ινσουλίνης διεγείρεται DMSO ctrl, αμφίδρομη ANOVA, Bonferroni). Ολιγομυκίνης Α (ΕΓ, 2 μΜ για 4 ώρες) χρησίμευσε ως θετικός μάρτυρας για την αυξημένη πρόσληψη γλυκόζης βασικοκυτταρικό.

Η

ΒΑ δεν προκαλεί κυτταρικό θάνατο στο ΥΠΟΙΟ

Καθώς η αυξημένη πρόσληψη γλυκόζης μπορεί να υποδεικνύει κυτταρικό στρες και κυτταροτοξικότητα, και ΒΑ έχει δειχθεί ότι εξασκούν προ-αποπτωτικά αποτελέσματα σε διάφορους τύπους (καρκίνου), έχουμε την επόμενη προσδιοριστεί αν η παρατηρούμενη αυξημένη πρόσληψη γλυκόζης συσχετίζεται με επακόλουθη κυτταρικό θάνατο. Εμείς αντιμετωπίζονται MEF, ο κυτταρικός τύπος που επιλέγεται για όλες τις περαιτέρω μελέτες, με 10 μΜ ΒΑ για 48 ώρες και προσδιορίζεται η σχετική απελευθέρωση της γαλακτικής αφυδρογονάσης (LDH? Αναλογία εξωκυτταρικού και σύνολο) ως ένδειξη για το κυτταρικό θάνατο και αποσύνθεση της μεμβράνης (Σχήμα 2Α). , ενεργοποίηση κασπασών ως ένδειξη για επαγωγή απόπτωσης (Σχ. 2Β), τα επίπεδα ΑΤΡ ως σημάδι της γενικής κυτταρικής βιωσιμότητας (Σχ. 2C) και σύνδεση του κρυσταλλικού ιώδους ως απλή κηλίδα βιομάζας (Σχ. 2D). BA στα 10 μΜ και 30 μΜ δεν προκάλεσε οποιεσδήποτε σημαντικές αλλαγές σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου DMSO-θεραπεία. Έτσι, η παρατηρούμενη αυξημένη πρόσληψη γλυκόζης κατά την έκθεση BA είναι απίθανο λόγω του επικείμενου θανάτου των κυττάρων. Επιπλέον, η ΒΑ δεν ενεργοποιούν την ενεργοποίηση του συγγενούς παράγοντα πυρηνικού παράγοντα παράγοντα μεταγραφής Ε2 2 (Nrf2), όπως φαίνεται σε μια δοκιμασία γονιδίου αναφοράς Nrf2-εξαρτώμενη. ενεργοποίηση Nrf2 είναι γνωστή ως δείκτης για κυτταρική απόκριση στρες κατά την έκθεση σε ξενοβιοτικές ουσίες (S2 Εικ.). Η έλλειψη τοξικότητας σε συγκεντρώσεις 30 μΜ θα μπορούσαν επίσης να επιβεβαιωθούν για τα ενδοθηλιακά κύτταρα, λιποκύτταρα και μυοκύτταρα (S3 Εικ.) Και υποστηρίζει την γενική έννοια του καρκίνου-εκλεκτική τοξικότητα της ΒΑ.

MEF υποβλήθηκαν σε θεραπεία με BA (10 μΜ και 30 μΜ) για 48 ώρες πριν από την υποβλήθηκαν σε προσδιορισμό της ακεραιότητας της μεμβράνης (% απελευθέρωση LDH) (Α), το δυναμικό του προαποπτωτικών γεγονότων (ενεργοποίηση της κασπάσης 3/7) (Β), των επιπέδων ΑΤΡ (C ) και η βιομάζα (D). ιστογράμματα απεικονίζουν σύνταξη των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων (που εκφράζεται ως πτυχή του DMSO μέση τιμή σε Β, Γ και Δ), το καθένα εις τετραπλούν (μέσος όρος + SD, * ρ & lt? 0,05, ANOVA, μετά τη δοκιμή του Dunnett έναντι DMSO ctrl). Σταυροσπορίνη (Σταυρό, 1 μΜ για 6 ώρες), triton (1% επί 1 ώρα) ή ένα συνδυασμό ολιγομυκίνη Α (ΕΓ? 2 μΜ) και DOG (10 mM? 5 ώρες) χρησίμευσαν ως θετικοί έλεγχοι στις δοκιμασίες

BA ανυψώνει αερόβια γλυκόλυση

στη συνέχεια ήμασταν ενδιαφέρονται για την μεταβολική τύχη της κατάποση γλυκόζης. Το γλυκολυτικό ρυθμό διερευνήθηκε με τη χρησιμοποίηση ανάλυσης εξωκυττάριο ροής. Παρατηρήσαμε ότι τα κύτταρα ΒΑ-αγωγή παρουσίασαν σημαντικά υψηλότερο ποσοστό εξωκυτταρικό οξίνισης (ECAR) κατά την προσθήκη της γλυκόζης από τους ομολόγους αγωγή με όχημα τους (Εικ. 3Α και Β). Σε μια συμπληρωματική ανάλυση προσδιορισμού εξωκυττάρια επίπεδα γαλακτικού οξέος που παρακολουθούνται συνεχώς αυξημένη παραγωγή γαλακτικού οξέος από τα κύτταρα ΒΑ-αγωγή (S4 Εικ.). Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ένα υψηλότερο ποσοστό γλυκολυτικό σε βα- επεξεργασμένα κύτταρα και απέκλεισε την επίδραση ενός υποτιθέμενου μεμβρανώδη V-ΑΤΡ με την παρατηρούμενη αύξηση της οξύτητας. Η μέγιστη χωρητικότητα γλυκολυτικά (ECAR μετά την προσθήκη ολιγομυκίνη και η αναστολή της μιτοχονδριακής παραγωγής ΑΤΡ) είναι συγκρίσιμη μεταξύ DMSO-κυττάρων και BA-θεραπεία. Κατά συνέπεια, τα κύτταρα BA-αγωγή κατέχουν μια σημαντικά μειωμένη ικανότητα γλυκολυτικό ανταλλακτικά (ΔECAR

maximal- ECAR

βασικοκυτταρικό) (Σχ. 3Β). Τα στοιχεία αυτά δείχνουν ότι η ΒΑ οδηγεί τα κύτταρα προς την πλήρη αξιοποίηση των γλυκολυτικό δυναμικό τους στη δυσμένεια της οξείδωσης της γλυκόζης (Σχ. 3C). Μια παρατηρείται αυξημένη φωσφορυλίωση της πυροσταφυλικής αφυδρογονάσης Ε1 (PDHE1) αναφέρθηκε περαιτέρω σε μια γλυκολυτικό διακόπτη κατά την αγωγή ΒΑ. Η φωσφορυλίωση καθιστά PDHE1 λιγότερο ενεργό και παρεμβαίνει οξειδωτική αποκαρβοξυλίωση του πυρουβικού άλατος σε ακετυλ-ΟοΑ που ευνοούν τη μείωση πυροσταφυλικού σε γαλακτικό (Σχ. 3D). Ωστόσο, θα απαιτηθούν περαιτέρω πειράματα για να αξιολογηθεί επακριβώς για το τι φωσφορυλίωση βαθμό PDHE συμβάλλει το σχεδόν μέγιστη γλυκόλυση στα κύτταρα BA-θεραπεία. Το επίπεδο έκφρασης αρκετών γλυκολυτικών ενζύμων ερευνήθηκε δεν άλλαξε (S5 Σχ.), Η οποία, ωστόσο, δεν αποκλείει μια αλλαγμένη ενζυμική δραστηριότητα οφείλεται σε ομοιοπολική ή αλλοστερικές τροποποίηση. Η έκφραση της γλυκόζης μεταφορέα GLUT1 ανυψώθηκε κατά την επεξεργασία της ΒΑ για 16 ώρες, ενώ τα επίπεδα της GLUT3 δεν μεταβλήθηκαν (Σχ. 3Ε). GLUT2 /4 δεν ήταν ανιχνεύσιμα σε MEF μας.

MEF υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 10 μΜ ΒΑ ή DMSO (0,1%) επί 16 ώρες πριν από την υποβλήθηκαν σε τεστ αντοχής γλυκόλυση όπως περιγράφεται στο «Υλικά και Μέθοδοι». Στο (Α) το εξωκυτταρικό ρυθμό οξίνισης (ECAR) απεικονίζεται κατόπιν έκθεση των κυττάρων διαδοχικά σε γλυκόζη (10 mM), ολιγομυκίνης Α (2 μΜ) και δεοξυγλυκόζη (DOG, 100 mM) (μέσος όρος + SD? Καταρτίζονται ακατέργαστα δεδομένα από τρία ανεξάρτητα πειράματα με τέσσερις τεχνικές επαναλήψεις το καθένα). Στο (Β), τα δεδομένα αυτά αναλύονται από την άποψη των βασικών (γλυκολυτικό ECAR μετά την προσθήκη της γλυκόζης), η μέγιστη (γλυκολυτικό ECAR μετά ολιγομυκίνη) και ανταλλακτικά (μέγιστη δραστηριότητα μείον βασική) γλυκολυτικό δραστηριότητα (μέσος όρος + SD, * ρ & lt? 0,05, t-test , DMSO εναντίον BA). Η ποσοτικοποίηση βασίζεται στην αξία στο τελικό χρονικό σημείο της κάθε συνθήκη θεραπείας. Στο (C) τιμές του OCR και ECAR (DMSO και κυττάρων BA-αγωγή (16 ώρες)) μετά την προσθήκη της γλυκόζης σχεδιάστηκαν έναντι μεταξύ τους για να απεικονίσει τη μετατόπιση από την οξείδωση της γλυκόζης προς γλυκόλυση. Η παρατηρούμενη μετατόπιση κατά την προσθήκη ολιγομυκίνη Α προστίθεται στο οικόπεδο ως αναφορά. (D) MEF υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMSO (0,1%, D) και 10 μΜ ΒΑ για τα υποδεικνυόμενα χρονικά διαστήματα πριν από συνολικά κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε αναλύσεις ανοσοστυπώματος για pPDHE1 (Ser273) και τη συνολική PDHE1 (μοριακό βάρος 43 kDa). Αντιπροσωπευτικά κηλίδες από τα τρία πειράματα που δείχνονται. Το παρακάτω διάγραμμα απεικονίζει καταρτίζονται πυκνομετρική τιμές του pPDHE /PDHE (n = 3? μέση τιμή + SD? * ρ & lt? 0,05? t-test? DMSO vs ΒΑ σε κάθε χρονικό σημείο). (Ε) MEF υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 10 μΜ ΒΑ ή DMSO (0,1%) επί 16 ώρες πριν από την υποβλήθηκαν σε ανάλυση ανοσοκηλίδας για GLUT1 (-50 kDa), GLUT3 (-55 kDa) και ακτίνη (42 kDa). Αντιπροσωπευτικά κηλίδες από τρία ανεξάρτητα πειράματα που δείχνονται. Το παρακάτω διάγραμμα απεικονίζει καταρτίζονται πυκνομετρική τιμές του GLUT1 /ακτίνης και GLUT3 /ακτίνης, αντίστοιχα (η = 3? μέση τιμή + SD? * ρ & lt? 0,05? t-test? DMSO vs ΒΑ σε κάθε χρονικό σημείο)

Η.

BA βλάπτει μιτοχονδριακή λειτουργία

Καθώς η αυξημένη αερόβια γλυκόλυση μπορεί να αντισταθμίσει μια μειωμένη παραγωγή ATP από οξειδωτική φωσφορυλίωση είμαστε δίπλα εξετάζονται λειτουργία των μιτοχονδρίων μετά από θεραπεία ΒΑ. Παρατηρήσαμε αυξημένη παραγωγή ROS μιτοχονδριακό (Σχ. 4Α) και αυξημένη έκφραση των πρωτεϊνών αποσύνδεση UCP1 και UCP2 στην BA-θεραπεία ΥΠΟΙΟ (Εικ. 4Β). Η συνολική μιτοχονδριακό περιεχόμενο παρέμεινε ανεπηρέαστη (Εικ. 4C). Altered μιτοχονδριακή λειτουργία επιβεβαιώθηκε σε μια μιτοχονδριακή τεστ κοπώσεως και εξωκυττάριο ανάλυση ροής. Κύτταρα εμφανίζεται ελαφρώς μειωμένος συντελεστής κατανάλωσης βασικής οξυγόνου (OCR), μειωμένη σύζευξη της κατανάλωσης οξυγόνου σε μιτοχονδριακή παραγωγή ATP (Δ (OCR

βασικοκυτταρικό-OCR

ολιγομυκίνη), μειωμένη μέγιστη αναπνοή (OCR μετά την απαγωγή της κλίσης πρωτονίων από FCCP), μειωμένη αναπνευστική πλεονάζουσα παραγωγική ικανότητα (Δ (OCR

μέγιστου OCR

βασικοκυτταρικό)), καθώς και η αυξημένη διαρροή πρωτονίων (Δ (OCR

ολιγομυκίνη – OCR

A + R) ) όταν κατεργάζονται με ΒΑ για 16 ώρες (Σχ. 4Ε και F). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η θεραπεία με BA παρεμβαίνει με μιτοχονδριακή λειτουργία, ωστόσο, ήπια καθώς δεν μείωση στην βιωσιμότητα των κυττάρων ενεργοποιείται από BA (βλέπε Σχ. 2). φυσικά Χρόνος πειράματα αποκάλυψαν ότι αποσυνδεθεί αναπνοή (εμφανής στη μείωση του OCR χρησιμοποιούνται για την παραγωγή ΑΤΡ σε S6a Σχ.) συσχετίζεται με την εξαρτώμενη από το χρόνο επαγωγής της UCPs (S6B Εικ.). Ωστόσο, τα ζητήματα αν η επαγωγή UCP αντιπροσωπεύει την παρατηρούμενη απόζευξη ή κατά πόσον η ίδια η ΒΑ ως μάλλον υδρόφοβο μόριο με τιμή pKa 5,5 είναι ένα ασθενές αποζεύκτης χρειάζεται περαιτέρω διερεύνηση. Αξίζει να σημειωθεί ότι, μετά από σύντομη επωάσεις με BA (1-3 h) βασικοκυτταρικό OCR τείνει να αυξηθεί σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου DMSO όπως αναμένεται για μη συζευγμένων μιτοχονδριακή αναπνοή (S6a Εικ.). Η μεταγενέστερη μείωση του OCR παρατηρείται σε κύτταρα BA-κατεργασία μπορεί να οφείλεται σε ακόμη ασαφείς προσαρμοστικό ή πρόσθετους μηχανισμούς που προκλήθηκε από την τριτερπενοειδείς όπως απαγωγή του δυναμικού μιτοχονδριακής μεμβράνης συναρτήσει του χρόνου ή μια διαταραγμένη ροή ηλεκτρονίων μέσω της αναπνευστικής αλυσίδας.

(Α) MEF υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 μΜ ΒΑ ή 0,1% DMSO για 16 ώρες πριν από την υποβλήθηκαν σε ανάλυση κυτταρομετρίας ροής της μιτοχονδριακής παραγωγής ROS με τη χρήση MitoSox Κόκκινο και αντιμυκίνη Α (2 μΜ, 1 ώρα) ως θετικό έλεγχο . (N = 3 (κάθε εις διπλούν ή τριπλούν)? Μέση τιμή + SD, * ρ & lt? 0,05, t-test). (Β) MEF υποβλήθηκαν σε αγωγή με DMSO ή 10 μΜ ΒΑ για 16 ώρες πριν από την συνολική κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε ανάλυση Western Blot για UCP1, UCP2 (ζώνη στα ~25-35 kDa) και ακτίνη (42 kDa) ως έλεγχος φόρτωσης. Αντιπροσωπευτικά στυπώματα τριών ανεξάρτητων πειραμάτων απεικονίζονται. Το παρακάτω διάγραμμα απεικονίζει καταρτίζονται πυκνομετρική τιμές του UCP1 /ακτίνης και UCP2 /ακτίνης, αντίστοιχα (η = 3? μέση τιμή + SD? * ρ & lt? 0,05? t-test? DMSO vs ΒΑ). (Γ) MEF υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 10 μΜ ΒΑ ή 0,1% DMSO για 16 ώρες πριν από την υποβλήθηκαν σε ανάλυση κυτταρομετρίας ροής της μιτοχονδριακής περιεχομένου χρησιμοποιώντας Mitotracker Green. Βαλινομυκίνη (200 ηΜ, 16 ώρες), ένα γνωστό διαταραχή του δυναμικού μιτοχονδριακής μεμβράνης χρησίμευσε ως έλεγχος για την πιθανή ανεξάρτητη σήματος Mitotracker Green. MEF υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 10 μΜ ΒΑ ή DMSO (0,1%) επί 16 ώρες πριν από την υποβλήθηκαν σε μιτοχονδριακή τεστ αντοχής, όπως περιγράφεται στο Υλικά. Στο (D) ο μέσος ρυθμός κατανάλωσης οξυγόνου (OCR) τριών ανεξάρτητων πειραμάτων απεικονίζεται κατόπιν έκθεση των κυττάρων διαδοχικά σε ολιγομυκίνη (2 μΜ), FCCP (1,5 μΜ) και αντιμυκίνη Α + ροτενόνη (Α + R? 1 + 1 μΜ). Στο (Ε) Τα δεδομένα αυτά αναλύονται από την άποψη του ρυθμού κατανάλωσης οξυγόνου υπό βασικές συνθήκες, η κατανάλωση οξυγόνου για τη σύνθεση του ΑΤΡ, μέγιστο αναπνευστικό ρυθμό, ανταλλακτικά αναπνευστική ικανότητα και διαρροή πρωτονίων (μέσος όρος + SD, * ρ & lt? 0,05, t-test, DMSO vs . ΒΑ).

η

BA ενεργοποιεί AMP-ενεργοποιημένη πρωτεϊνική κινάση (ΑΜΡΚ)

μειωμένη μιτοχονδριακή λειτουργία έχει συνδεθεί με την ενεργοποίηση της AMPK (αναθεωρούνται στο [27]), ένα κεντρικό μεταβολικό κύριο κόμβο. ενεργοποίηση ΑΜΡΚ μπορεί να εξηγήσει περαιτέρω μια αντισταθμιστική αύξηση της πρόσληψης γλυκόζης και γλυκολυτικό ρυθμό [28], [29]. Ως εκ τούτου, διερευνήθηκε αν η ΒΑ οδηγεί σε ενεργοποιημένο ΑΜΡΚ. Χρησιμοποιώντας ανάλυση ανοσοκηλίδος παρατηρήσαμε μία παροδική ώθηση της φωσφορυλίωσης ΑΜΡΚ σε θρεονίνη 172, ενδεικτικό της αυξημένα δραστηριότητα ΑΜΡΚ, σε βα- αγωγή έναντι κύτταρα ελέγχου (Σχ. 5Α). ενεργοποίηση ΑΜΡΚ Επιπλέον, επιβεβαιώθηκε από την αυξημένη φωσφορυλίωση της ακετυλ-ΟοΑ καρβοξυλάσης (ACC) σε σερίνη 79, ένα κοινό κατάντη στόχος της ΑΜΡΚ. Η χρήση των ισογονικών ομολόγους knockout WT MEF και ΑΜΡΚ αποκάλυψε ότι η αυξημένη πρόσληψη γλυκόζης, αυξημένη έκφραση του GLUT1 μεταφορέα γλυκόζης και αυξημένη μεταβολισμού της γλυκόζης μέσω γλυκόλυσης ήταν εξαρτάται από την παρουσία του ΑΜΡΚ (Εικ. 5Β, C, D). Ωστόσο, η ΒΑ προκάλεσε συγκρίσιμη μείωση της μιτοχονδριακής λειτουργίας (π.χ. μείωση της μέγιστης αναπνοής κατά περίπου 40% σε σύγκριση με τον έλεγχο DMSO) τόσο WT και ΑΜΡΚ – /- MEF. Το εύρημα αυτό τοποθετείται μιτοχονδριακή δυσλειτουργία ανάντη ενεργοποίησης ΑΜΡΚ (Σχ. 5Ε) ευρίσκεται σε ευθεία με την παρατηρούμενη ενεργοποίηση του ΑΜΡΚ, επαγωγή GLUT1, υπερυψωμένο πρόσληψη γλυκόζης και αυξημένη γλυκολυτικά ρυθμό με ήπια FCCP επέβαλε αποσύνδεση (S7 Εικ.). Αξίζει να σημειωθεί ότι, ΑΜΡΚ – /- κύτταρα παρουσίασαν γενικά χαμηλότερο ρυθμό κατανάλωσης οξυγόνου από ό, τι WT ΥΠΟΙΟ πιθανώς εν μέρει λόγω του μειωμένου αριθμού τους μιτοχόνδρια (S8 Εικ.). Συγκρίνοντας WT και τα κύτταρα ανεπάρκεια στο ήπαρ κινάσης Β1 (LKB1), η κινάση AMPK ανταποκρίνεται σε ένα τροποποιημένο αναλογία AMP /ATP [30], πρότεινε LKB1 ως κύρια κινάση AMPK συμμετέχουν: LKB1 – /- κύτταρα εμφάνισαν μειωμένη φωσφορυλίωση AMPK στον κατά την αγωγή BA (Εικ. 5F).

(Α) MEF υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMSO (0,1%) ή BA (10 μΜ) για τα υποδεικνυόμενα χρονικά διαστήματα. Σύνολο κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε Ανάλυση ανοσοκηλιδώσεως για pAMPK (Thr172) και τη συνολική ΑΜΡΚ (60 kDa) (αριστερός πίνακας) ή pAMPK (Thr172), PACC (Ser79) (~245 kDa) και ακτίνη (42 kDa) (δεξιός πίνακας). Αντιπροσωπευτικά κηλίδες από τρία ανεξάρτητα πειράματα απεικονίζονται. Οι γραφικές παραστάσεις παρακάτω απεικονίζουν καταρτίζονται πυκνομετρική τιμές του pAMPK /ΑΜΡΚ ή ​​ΡΑΟΟ /ακτίνης, αντίστοιχα (η = 3? Μέση τιμή + SD? * Ρ & lt? 0,05? T-test? DMSO vs ΒΑ σε κάθε χρονικό σημείο). WT και ΑΜΡΚ – /- MEF υποβλήθηκαν σε αγωγή με DMSO ή BA (10 μΜ) για 16 ώρες. Στη συνέχεια, εκτιμήθηκαν οι κυτταρικοί ρυθμούς πρόσληψης γλυκόζης (Β) (η = 3 (εις τριπλούν)? Μέση τιμή + SD, * ρ & lt? 0,05, ANOVA, μετά τη δοκιμή του Dunnett vs DMSO Ctrl), καθώς και τα επίπεδα έκφρασης του GLUT1 (50 kDa), ΑΜΡΚ (60 kDa) και ακτίνη (42 kDa) με ανάλυση Western blot (C). Μια κηλίδα εκπρόσωπος απεικονίζεται από τρία ανεξάρτητα πειράματα. Το παρακάτω διάγραμμα απεικονίζει καταρτίζονται πυκνομετρική τιμές του GLUT1 /ακτίνης, αντίστοιχα (η = 3? μέση τιμή + SD? * ρ & lt? 0,05? t-test? DMSO vs ΒΑ). Σε κύτταρα (D) υποβλήθηκαν σε προσδιορισμό της εξωκυτταρικής ρυθμού οξίνισης (ECAR) όπως περιγράφεται στο Σχ. 3. Αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα από τρία ανεξάρτητα πειράματα (με τρεις τεχνικές επαναλήψεις η κάθε μία) παρουσιάζονται (μέσος όρος + SD, * ρ & lt? 0,05, t-test). (Ε) WT και ΑΜΡΚ – /- MEF υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMSO (0,1%) ή BA (10 μΜ) για 16 ώρες πριν από την υποβλήθηκαν σε μιτοχονδριακό τεστ κοπώσεως και εξωκυτταρική ανάλυση ροής. Τα συγκεντρωμένα στοιχεία των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων απεικονίζονται (μέσος όρος + SD). (F) WT και LKB1 – /- MEF υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με BA (10 μΜ) για τα υποδεικνυόμενα χρονικά διαστήματα πριν από συνολικά κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε ανάλυση ανοσοκηλίδας για pAMPK (Thr172), ΑΜΡΚ (60 kDa), LKB1 (-50 kDa ) και ακτίνη (42 kDa). Αντιπροσωπευτικά κηλίδες από τρία ανεξάρτητα πειράματα απεικονίζονται. Το παρακάτω γράφημα απεικονίζει καταρτίζονται πυκνομετρικές τιμές της pAMPK /ΑΜΡΚ, αντίστοιχα (n = 3? μέσος όρος + SD? * ρ & lt? 0,05? ANOVA, Dunnett (έναντι 0 h θεραπεία με BA)

Η

Αυτά τα δεδομένα. προέκυψε ότι η BA και ήπια βλάβη της λειτουργίας των μιτοχονδρίων, ενεργοποιείται η ενεργοποίηση ΑΜΡΚ μέσω LKB1 το οποίο με τη σειρά του απέσπασαν αυξημένη πρόσληψη γλυκόζης και μετατόπισε το μεταβολισμό της γλυκόζης κυτταρικό από την οξείδωση σε αερόβια γλυκόλυση.

BA καθιστά τα κύτταρα εθιστεί σε γλυκόζη

Intrigued από το εύρημα ότι η ΒΑ οδηγεί τα κύτταρα σε ενισχυμένη γλυκολυτική δραστικότητα στη συνέχεια εξετάσαμε αν η ΒΑ τετηγμένα κύτταρα γλυκόζη εθιστεί. για αυτό αξιολογείται η βιωσιμότητα των κυττάρων (τα επίπεδα ΑΤΡ, βιομάζα) του MEF αγωγή με όχημα ή BA εν απουσία και παρουσία γλυκόζης για 48 ώρες . για τα κύτταρα γλυκόζης στερημένα προσθέσαμε μαννιτόλη ως ωσμωτική ισορροπία. κύτταρα μάρτυρες DMSO-αγωγή αντιμετώπισε καλά με εξάντληση της γλυκόζης, όπως φαίνεται από φυσική βιομάζα και τα επίπεδα ΑΤΡ σε σύγκριση με την κατάσταση «συν γλυκόζη». Λόγω της απουσίας γλυκόζης εκείνα τα κύτταρα ακόμη και έδειξε μια επαναλήψιμη τάση να αυξημένα επίπεδα ΑΤΡ η οποία μπορεί να εξηγηθεί από αναγκαστική μιτοχονδριακής οξείδωσης των υποστρωμάτων (π.χ. λιπαρών οξέων που περιέχονται στον ορό) με υψηλότερη απόδοση ΑΤΡ από γλυκόζη.