Αφηρημένο

Το ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC) είναι ένα από τα κύριες αιτίες των θανάτων που σχετίζονται με τον καρκίνο σε όλο τον κόσμο. Χειρουργική εκτομή και συμβατική χημειοθεραπεία και ακτινοθεραπεία τελικά αποτυγχάνουν λόγω της επανεμφάνισης του όγκου και την αντίσταση HCC του. Η ανάπτυξη νέων θεραπειών κατά του HCC έτσι απαιτείται επειγόντως. Οι εξαρτώμενες από κυκλίνη κινάσης (CDK) οδούς είναι σημαντικές και καθιερωμένες στόχους για τη θεραπεία του καρκίνου. Ειδικότερα, CDK2 είναι ένας βασικός παράγοντας για τη ρύθμιση της G1 του κυτταρικού κύκλου σε μετάβαση S και ένα σήμα κατατεθέν για τους καρκίνους. Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε το λογισμικό σύνδεσης πρωτεΐνης-συνδετήρα ελεύθερο και ανοικτού κώδικα μας, idock, προοπτικά για τον εντοπισμό πιθανών αναστολέων CDK2 από 4.311 εγκεκριμένα από τον FDA φάρμακα μικρών μορίων χρησιμοποιεί μια στρατηγική που αναπροσανατολισμό και ένα σύνολο μεθοδολογία σύνδεσης. Ταξινόμηση κατά μέσος όρος idock, εννέα ενώσεις είχαν αγοραστεί και δοκιμαστεί

in vitro

. Μεταξύ αυτών, το αντι-ψυχωτικά φλουσπιριλένιο φάρμακο εμφάνισε την υψηλότερη αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση σε ανθρώπινο ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα HepG2 και Huh7 κύτταρα. Δείξαμε για πρώτη φορά ότι φλουσπιριλένιο θεραπεία αύξησε σημαντικά το ποσοστό κυττάρων στη φάση G1, και μειωμένη τις εκφράσεις των CDK2, κυκλίνη Ε και Rb, καθώς και τις φωσφορυλιώσεις των CDK2 επί Thr160 και Rb σε Ser795. Εξετάσαμε επίσης την επίδραση κατά του καρκίνου του φλουσπιριλένιο

in vivo

σε BALB /C ποντικούς υποδορίως γυμνούς ξενομόσχευμα με ανθρώπινα κύτταρα ηπατοκυτταρικού καρκινώματος Huh7. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η στοματική θεραπεία φλουσπιριλένιο ανέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου. Φλουσπιριλένιο (15 mg /kg) επέδειξε ισχυρή δραστικότητα κατά του όγκου, συγκρίσιμη με εκείνη από τις κορυφαίες φάρμακο κατά του καρκίνου 5-φθοριοουρακίλη (10 mg /kg). Επιπλέον, η θεραπεία με κοκτέιλ φλουσπιριλένιο και 5-φθοριοουρακίλη παρουσίασαν την υψηλότερη θεραπευτική επίδραση. Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν για πρώτη φορά ότι φλουσπιριλένιο είναι ένας δυνητικός αναστολέας CDK2 και ένα αντικαρκινικό φάρμακο υποψήφιος για τη θεραπεία του ηπατοκυτταρικού καρκινώματος ανθρώπινου. Εν όψει του γεγονότος ότι έχει φλουσπιριλένιο μια μακρά ιστορία ασφαλούς ανθρώπινη χρήση, η ανακάλυψη μας φλουσπιριλένιο ως πιθανό φάρμακο κατά του HCC μπορεί να υποβάλει άμεσα εφαρμόσιμες κλινική θεραπεία

Παράθεση:. Shi XN, Li H, Yao Η Liu Χ, Li L, Leung KS, et al. (2015)

in silico

Ταυτοποίηση και

In Vitro

και

In Vivo

Επικύρωση των αντιψυχωτικών φαρμάκων φλουσπιριλένιο ως πιθανή CDK2 αναστολέα και μια υποψήφια Anti-Cancer Drug. PLoS ONE 10 (7): e0132072. doi: 10.1371 /journal.pone.0132072

Επιμέλεια: Yu-Jia Chang, Ταϊπέι Ιατρικής του Πανεπιστημίου, Ταϊβάν

Ελήφθη: 20 του Ιανουαρίου του 2015? Αποδεκτές: 9, Ιουνίου 2015? Δημοσιεύθηκε: 6 Ιουλίου, 2015

Copyright: © 2015 Shi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από το ακαδημαϊκό εργασίας Hsiang-Κουνγκ Φου της Κουνμίνγκ Ιατρικό Πανεπιστήμιο, Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (NSFC) 81272549, Key Εργαστήριο έργο της Shenzhen (ZDSY20130329101130496) από την Κίνα, την άμεση επιχορήγηση από το κινεζικό Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, η GRF Grant (έργο Αναφορές 414413, 772910 και 470911) από το Συμβούλιο Κονδυλίων Έρευνας του Χονγκ Κονγκ.

Ανταγωνιστικά συμφέροντα : Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

το ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC) είναι ο πιο κοινός τύπος καρκίνου του ήπατος.. Μόνο το 30% έως 40% των ασθενών HCC είναι επιλέξιμα για ιαματικές θεραπείες, οι οποίες περιλαμβάνουν χειρουργική εκτομή ως πρώτη επιλογή, η μεταμόσχευση ήπατος και διαδερμική κατάλυσης. Ωστόσο, υπάρχει μια υψηλή συχνότητα υποτροπής του όγκου μετά από χειρουργική εκτομή, και οι περισσότεροι HCCs φαίνεται ανθεκτικά στη συμβατική χημειοθεραπεία και ακτινοθεραπεία. Ως εκ τούτου, η ανάπτυξη νέων θεραπειών κατά του HCC είναι μεγάλη ζήτηση.

Η αιτία του HCC περιλαμβάνει πολλαπλές οδούς. Οι οδοί εξαρτώμενη από κυκλίνη κινάση (ΟϋΚ) ως σημαντικοί θεραπευτικοί στόχοι για τη θεραπεία του καρκίνου έχουν εδραιωθεί. CDKs είναι ένζυμα που εμπλέκονται στην αντιγραφή των κυττάρων, και ο ρόλος τους στην ανάπτυξη του όγκου έχει από καιρό τους γίνει σε ελκυστικούς στόχους φαρμάκων. Αλλά στις αρχές της βιομηχανικής προσπάθειες στην αναστολή της CDKs για την αποκατάσταση της ανάπτυξης των κυττάρων σε φυσιολογικά θέματα τοξικότητας έχουν συναντήσει. Οι αναστολείς CDK πρώτης γενιάς ήταν μη-ειδική, αναστέλλοντας πολλά διαφορετικά CDKs (υπάρχουν περισσότερες από 20, πολλές από τις οποίες έχουν ενοχοποιηθεί σε διάφορους τύπους όγκων), και έχει ως αποτέλεσμα το είδος της τοξικότητας και σίγαση αποτελεσματικότητα που παρατηρείται με τα μεγαλύτερα χημειοθεραπείες.

Η εξαρτώμενη από κυκλίνη κινάση 2 (CDK2) είναι μία από τις πρωτεϊνικές κινάσες σερίνης /θρεονίνης. Παίζει καθοριστικό ρόλο στην ρύθμιση της μετάβασης του κυτταρικού κύκλου από G1 σε S φάση, και έτσι στον έλεγχο του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Ως εκ τούτου, οι αναστολείς CDK2 είναι δυνητικά αποτελεσματικοί παράγοντες κατά του καρκίνου. Αν και ένας αριθμός αναστολέων CDK2 έχουν περιγραφεί στη βιβλιογραφία [1], και μερικοί έχουν εισέλθει φάσεις κλινικής δοκιμής, π.χ. Η φλαβοπιριδόλη [2], η ροσκοβιτίνη [3] και ολομουσίνης [4], κανένα από αυτά δεν έχει εγκριθεί για κλινική χρήση οφείλεται σε διάφορους λόγους, όπως η τοξικότητα και η ειδικότητα multi-στόχου. Επιπλέον, κανένα από τα αναφερόμενα αναστολείς CDK2 είναι για τη θεραπεία του ηπατοκυτταρικού καρκινώματος.

Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε ελεύθερο και ανοικτού κώδικα λογισμικό idock σύνδεσης πρωτεΐνης-συνδετήρα μας [5, 6] στην οθόνη FDA-εγκριθεί μικρά μόριο φάρμακα κατά CDK2, αποφεύγοντας έτσι το πρόβλημα τοξικότητας. Υιοθετήσαμε το

in silico

προσέγγιση της δομής με βάση το εικονικό έλεγχο και σύνολο docking να επαναπροσδιορίσουν εγκεκριμένα φάρμακα για τη θεραπεία των καρκίνων που συνεπάγονται ρύθμιση CDK2, με μεγάλη έμφαση στην ανθρώπινο ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC). Δοκιμάσαμε εννέα υπολογιστικά ευνοείται ενώσεις

in vitro

σε κυτταρικές σειρές HCC HepG2 και Huh7, και με επιτυχία προσδιόρισε την αντι-ψυχωτικά φλουσπιριλένιο φάρμακο ως δυνητικό αναστολέα CDK2. Στη συνέχεια εκτελείται

in vivo

πειράματα σε γυμνά ποντίκια με κύτταρα Huh7, και έδειξε ότι φλουσπιριλένιο εμφάνισαν ισχυρή δραστικότητα κατά του όγκου συγκρίσιμη με εκείνη από τις κορυφαίες καρκίνο φάρμακο 5-φθοροουρακίλη, την περαιτέρω δημιουργία φλουσπιριλένιο ως υποψήφια αντι- φάρμακο για τον καρκίνο. Δείξαμε επίσης ότι η θεραπεία κοκτέιλ με τόσο φλουσπιριλένιο και 5-φθοριοουρακίλη θα μπορούσε να παράγει συνεργική θεραπευτική επίδραση. Τέλος, αναλύσαμε την προβλεπόμενη διαμόρφωση σύνδεσης των φλουσπιριλένιο και αποκάλυψε τις κρίσιμες διαμοριακές αλληλεπιδράσεις που ενδεχομένως διέπουν σύνδεση με CDK2 φλουσπιριλένιο.

Μέθοδοι και Υλικά |

Δήλωση Ηθικής

Αυτή η μελέτη ήταν που εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας πειραματόζωο της Κουνμίνγκ Ιατρικό Πανεπιστήμιο.

Ensemble σύνδεσης και ένωσης

επιλογή

υπάρχουν τόσο πολλοί όπως 346 επιλυθεί με ακτίνες Χ κρυσταλλογραφικές δομές της CDK2 από το ΠΣΠ (Protein Data Bank ) [7, 8] με UniProt ID της P24941 (S1 πίνακα). Μεταξύ αυτών, συλλέξαμε 44 κρυσταλλικές δομές των CDK2 σε σύμπλεγμα με ένα δεσμευμένο πρόσδεμα (Πίνακας 1? S1 Εικ). Αυτές επιλέχθηκαν 44 δομές, επειδή δεν περιέχουν μεταλλικά ιόντα, τα οποία μπορούν να επηρεάσουν την ακρίβεια σύνδεσης του idock [6], και επίσης επειδή περιέχουν ένα δεσμευμένο συνδέτη, του οποίου η συντεταγμένη βοηθά να ορίζει ένα χώρο αναζήτησης εύκολα. Μια προηγουμένως γραπτή σενάριο [6] επανεξελέγη χρησιμοποιείται για να ορίσει αυτόματα το χώρο αναζήτησης σύνδεσης με την εύρεση του μικρότερου κυβικό κουτί που καλύπτει ολόκληρο το συν-κρυσταλλώνεται συνδετήρα και στη συνέχεια την επέκταση του πλαισίου επί 10a σε όλες τις τρεις διαστάσεις. Οι 44 δομές CDK2 ήταν το χέρι που προέρχονται από το αντίστοιχο των συμπλοκών τους με τους συν-κρυσταλλώνεται συνδέτες και νερά απομακρύνονται, και στη συνέχεια μετατρέπεται από τη μορφή ΠΣΠ σε μορφή PDBQT χρησιμοποιώντας το prepare_receptor4.py σενάριο της AutoDockTools [9].

Η

για να ελέγξετε την ακρίβεια redocking της idock, οι συν-κρυσταλλώνεται συνδέτες επίσης με το χέρι που προέρχονται από αντίστοιχα σύμπλοκα τους και μετατρέπονται από τη μορφή ΠΣΠ σε μορφή PDBQT χρησιμοποιώντας το prepare_ligand4.py σενάριο της AutoDockTools [9]. Αυτοί οι σύνδεσμοι στη συνέχεια ελλιμενίζεται πίσω στην αντίστοιχη δομή CDK2 τους, και η ρίζα τους μέση τετραγωνική απόκλιση (RMSD) από την συν-κρυσταλλώνεται διαμόρφωση υπολογίστηκε.

Οι δομές της FDA-εγκεκριμένων φαρμάκων ελήφθησαν από την dbap και FDA καταλόγους της βάσης δεδομένων ZINC [10, 11], όπου η dbap κατάλογος περιλαμβάνει εγκεκριμένα φάρμακα που συλλέγονται από τη βάση δεδομένων DrugBank [12] και τον κατάλογο FDA περιλαμβάνει εγκεκριμένα φάρμακα που συλλέγονται μέσω του DSSTox έργου (Δομή-αναζήτησης Τοξικότητα Distributed). είχαν κατεβάσει το dbap κατάλογος έκδοση 19.03.2014 με 1.738 ενώσεις και τον κατάλογο FDA της έκδοσης 2012-07-25 με 3.176 ενώσεις. Μεταξύ αυτών των 4.914 ενώσεις, 4.311 ήταν μοναδική από την άποψη της ZINC ID. Αυτές οι 4.914 ενώσεις σε μορφή Mol2 στη συνέχεια μετατρέπεται σε μορφή PDBQT χρησιμοποιώντας το prepare_ligand4.py σενάριο της AutoDockTools [9].

ελεύθερο και ανοικτού κώδικα v2.1.2 idock λογισμικό σύνδεσης μας [6] Στη συνέχεια εκτελέστηκε για να προβλέψει οι δεσμευτικές διαμορφώσεων και οι συγγένειες δέσμευσης των ενώσεων 4914, όταν ελλιμενίστηκε έναντι των 44 δομών CDK2 χρησιμοποιώντας ένα σύνολο στρατηγικής σύνδεσης [13-15]. Για κάθε δομή της πρωτεΐνης, χωρίς ενεργειακό δίκτυο χάρτες με μια λεπτή διακριτότητα των 0,08 Å κατασκευάστηκαν παράλληλα, και για κάθε ένωση, 256 Monte Carlo καθήκοντα διαμορφωτική βελτιστοποίηση έτρεξαν παράλληλα σε πολλαπλές πυρήνες CPU.

Μετά σύνδεσης, idock εξάγεται ένα μέγιστο αριθμό εννέα προέβλεψε διαμορφώσεων για κάθε ένωση εισόδου. Η ελλιμενίζεται διαμόρφωση με την υψηλότερη βαθμολογία idock επιλέχθηκε επειδή προηγουμένως δείχθηκε ότι είναι η πιο πιθανή μία πλησιέστερα προς το κρύσταλλο διάπλαση με ποσοστό επιτυχίας redocking άνω του 50% σε τρία διαφορετικά σημεία αναφοράς [6]. Οι ενώσεις 4914 ταξινομήθηκαν στην αύξουσα σειρά τους μπορούν να προβλεφθούν δεσμευτικές ελεύθερης ενέργειας κατά μέσο όρο σε όλες τις 44 δομές CDK2, και τα top-σκοράροντας αυτά εξετάστηκαν οπτικά χρησιμοποιώντας IVIEW [16] στο πλαίσιο της CDK2 χρησιμοποιώντας την κρυσταλλική δομή ακτίνων Χ του υψηλότερη ανάλυση, δηλαδή ΠΣΠ ID 1GZ8 σε αυτή την περίπτωση (Πίνακας 1). Στη συνέχεια, εμπορικά διαθέσιμες ενώσεις ερωτηθούν και αγοράστηκαν μέσω της ιστοσελίδας Χημική βιβλίο https://www.chemicalbook.com/και στη συνέχεια να επικυρωθεί

in vitro

και

in vivo

.

Χημικές ουσίες, αντισώματα, κυτταρικές σειρές και κυτταρική καλλιέργεια

Οι επιλεγμένες χημικές ουσίες και η ηγετική του καρκίνου φάρμακο 5-φθοριοουρακίλη αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich, USA. Αντι-κυκλίνης D, Β1, Ε, CDK2, Rb, Pho-CDK2 (Thr160), τηλε-Rb (Ser795) και GAPDH ελήφθησαν από την Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, Μασαχουσέτη, ΗΠΑ.

κυτταρικές σειρές ηπατώματος HepG2 και Huh7 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, USA. Αυτές οι κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 που περιέχει 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS) (Invitrogen, Rockville, Maryland, USA) στους 37 ° C σε 5% CO

2 και 95% υγροποιημένο αέρα.

τα κύτταρα απλώθηκαν σε 96-, 24-, ή 6-φρεατίων με 0.125% μέσον FBS για 24 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 10% μέσου FBS που περιέχουν τις ενώσεις δοκιμής σε διάφορες συγκεντρώσεις των 1, 3, 10, 30

μ

Μ, και επωάστηκαν για 24, 48, ή 72 ώρες.

ΜΤΤ δοκιμασία

τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε μία αρχική πυκνότητα των 9 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο σε 96 φρεατίων και επωάστηκαν με 0.5 mg /ml 3- (4,5-μεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλο-τετραζόλιο για 4 ώρες. Το μέσο στη συνέχεια απορρίφθηκε και 200 ​​

προστέθηκε μ

l φορμαζάνης σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO). Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 570 nm σύμφωνα με το πρότυπο πρωτόκολλο. Το IC

50 τιμές υπολογίστηκαν με GraphPad Prism 5.

κυτταρικού κύκλου ανάλυση

HepG2 ή Huh7 κύτταρα (4 χ 10

4) σπάρθηκαν σε πλάκες 24-φρεατίων σε RPMI 1640 που περιέχει 0.125% FBS, και καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες. Τα κύτταρα επωάστηκαν σε μέσο που περιέχει 10% FBS και διάφορες δόσεις φλουσπιριλένιο (1, 3, 10, 30

μ

Μ) για 12, 24, 36 ώρες στους 37 ° C, στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν σε παγωμένο 70% αιθανόλη και χρωματίστηκαν με ένα κιτ Coulter DNA-Prep Αντιδραστήρια (Beckman Coulter, Fullerton, California, USA). Cellular περιεχόμενο DNA του 1 × 10

4 κύτταρα από κάθε δείγμα προσδιορίστηκε με τη χρήση ενός ροής EPICS ALTRA κυτταρόμετρο (Beckman Coulter). διανομής φάση του κυτταρικού κύκλου αναλύθηκε με το λογισμικό ModFit LT 2.0 (Verity Software House, Topsham, Μέιν, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής). Όλα τα αποτελέσματα ελήφθησαν από δύο ξεχωριστά πειράματα, καθένα από τα οποία έγινε εις τριπλούν.

κυτταρικής απόπτωσης ανάλυση

HepG2 και Huh7 κύτταρα απλώθηκαν σε πλάκες 24-φρεατίων με 0.125% μέσον FBS για 24 ώρα και έπειτα με 10% μέσου FBS που περιέχει φλουσπιριλένιο σε συγκεντρώσεις 3, 10 και 30

μ

M. Ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή για την ποσοτικοποίηση των αποπτωτικών κυττάρων, η εμφάνιση της απόπτωσης προσδιορίστηκε με χρώση των κυττάρων με αμφότερα αννεξίνη V και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) (Life Technologies). Εν συντομία, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν με 0,25% θρυψίνη σε απουσία αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξύ (EDTA). Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS δύο φορές και επανεναιωρήθηκαν σε 500

μ

l ρυθμιστικού σύνδεσης σε συγκέντρωση 2 χ 10

μέσα 5 – 10

6 κύτταρα /ml. Δύο μικρολίτρα αννεξίνη V-EGFP και 5

μ

l ΡΙ προστέθηκαν στο εναιώρημα που ακολουθείται από 5 έως 15 λεπτά επώασης στο σκοτάδι. Τα κύτταρα στη συνέχεια αναλύθηκαν με χρήση κυτταρομετρίας ροής (CyFlow Space /Partec, Germany).

κηλίδωση Western

HepG2 και Huh7 κύτταρα απλώθηκαν σε τρυβλία 6 φρεατίων με 0.125% μέσον FBS για 24 ώρες και στη συνέχεια με 10% μέσου FBS που περιέχει φλουσπιριλένιο σε συγκέντρωση 3, 10, 30

μ

M. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν μετά από 6 ώρες επώασης. Τα κύτταρα λύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα RIPA που περιέχει 1 mM PMSF και κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης στους 4 ° C για 30 λεπτά. Μετά από φυγοκέντρηση στις 13000 rpm για 15 λεπτά, τα υπερκείμενα ανακτήθηκαν και η συγκέντρωση πρωτεΐνης μετρήθηκε με BCA Protein Assay Kit (Thermo). Ίσες ποσότητες κυτταρολυμάτων επιλύθηκαν σε 10% SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης (Sigma). Μετά τον αποκλεισμό, οι μεμβράνες επωάστηκαν διαδοχικά με τα κατάλληλα αραιωμένου πρωτογενούς και δευτερογενούς αντισώματα. Οι πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν από το ενισχυμένο σύστημα ανίχνευσης χημειοφωταύγειας (Amersham, Piscataway, New Jersey, USA). Για να εξασφαλιστεί η ίση φόρτωση των δειγμάτων, οι μεμβράνες επανα-διερευνήθηκαν με αντι-GAPDH αντίσωμα (Cell Σηματοδότηση Technologies).

θεραπεία φλουσπιριλένιο

in vivo

Η

Γυναίκα BALB /C γυμνά ποντίκια, 4 έως 5 εβδομάδων από Vital ποταμό Εργαστήριο Τεχνολογίας Co Ltd, το Πεκίνο, η Κίνα, κρατήθηκαν υπό ειδικές συνθήκες χωρίς παθογόνα. Για τη δοκιμασία ξενομοσχεύτηκε ανάπτυξης όγκου, 1 × 10

6 /0,2 ml κύτταρα Huh7 PBS εγχύθηκαν υποδορίως στην δεξιά πλευρά των ποντικών. Το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε καθημερινά. Τρεις εβδομάδες μετά τον εμβολιασμό, όταν οι όγκοι αναπτύχθηκαν σε ένα όγκο 80 έως 100 m

3, οι ποντικοί διαιρέθηκαν τυχαία σε ομάδες των 5 ποντικών ανά ομάδα, και τροφοδοτείται από του στόματος καθετηριασμό με 0,5% CMC-NaCl που περιέχει φλουσπιριλένιο (15 mg /kg) και με ενδοπεριτοναϊκή ένεση 5-φθοριοουρακίλη (10mg /kg) ημερησίως για 21 ημέρες. όγκοι Καρκίνωμα μετρήθηκαν κάθε 3 έως 4 ημέρες μετά την εμφάνιση του όγκου. Ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε από τον τύπο

V

=

ab

2/2, όπου

μια

είναι το μακρύτερο άξονα και

b

είναι συντομότερη άξονα. Οι ποντικοί στη συνέχεια θυσιάστηκαν με αυχενική εξάρθρωση.

Στατιστική ανάλυση

Τα αποτελέσματα ελήφθησαν από τουλάχιστον τρία διαφορετικά πειράματα και εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD. Η στατιστική ανάλυση έγινε με το t τεστ του Student και οι διαφορές θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές εάν ρ 1GZ8-FDA.

Σχήμα 2 απεικονίζει την κατανομή του μέσος όρος βαθμολογίας idock των ενώσεων 4.914. 15 ενώσεις είχαν προβλέψει ελεύθερη ενέργεια -10 kcal /mol ή μικρότερη, με το καλύτερο που έχει -10.46 kcal /mol. Με βάση την εμπορική διαθεσιμότητα, 9 ενώσεις top-βαθμολόγησης (Πίνακας 2? Σχήμα 3? S4 Πίνακας) αγοράστηκαν για περαιτέρω έρευνες

842 και 783 ενώσεις ήταν σε σειρές των [-7.5, -8.0) και [. ,,,0],-7.0, -7.5), αντίστοιχα, που αποτελούν τους δύο μεγαλύτερους κάδους. 15 και 63 ενώσεις ήταν σε σειρές [-10,0, -10,5) και [-9.5, -10.0), αντίστοιχα, που αποτελούν τους δύο κάδους κατάλληλα για την επιλογή των υποψηφίων φαρμάκων.

Η

Ο αριθμός αυτός δημιουργήθηκε από τον RDKit (https://rdkit.org/).

η

φλουσπιριλένιο μειωμένη κυτταρική βιωσιμότητα του ηπατοκυτταρικού καρκινώματος

Είμαστε αξιολόγησε για πρώτη φορά την αντικαρκινική δράση των εννέα ενώσεις με δοκιμασία ΜΤΤ (Σχήμα 4). Όλες οι εννέα ενώσεις μειωμένη βιωσιμότητα των κυττάρων σε κύτταρα HepG2 και Huh7, αλλά είχε αποκλίνοντος κυτταροτοξικότητα σε διαφορετικές συγκεντρώσεις. Μεταξύ αυτών, φλουσπιριλένιο είχε τη χαμηλότερη IC

50, δηλαδή 4.017

μ

M για HepG2 και 3.468

μ

M για Huh7. Φλουσπιριλένιο παρουσίασαν την υψηλότερη κυτταροτοξικότητα σε σύγκριση με τον έλεγχο με στατιστική σημαντικότητα (ρ & lt? 0,05). Τέτοια επίδραση αναστολή ήταν δόση και το χρόνο-εξαρτώμενη. Σημαντική αναστολή παρατηρήθηκε σε 10

μ

Μ και 30

μ

Μ, αλλά καμία σημαντική επίδραση παρατηρήθηκε σε συγκεντρώσεις κάτω του 3

μ

Μ

(Α) Οι εννέα ενώσεις είχαν αποκλίνοντος κυτταροτοξικότητα σε κυτταρικές σειρές HepG2 και Huh7 σε διαφορετικές concentrationas, με φλουσπιριλένιο εμφανίζουν την υψηλότερη κυτταροτοξικότητα σε σύγκριση με τον μάρτυρα (ρ & lt? 0,05). (Β) φλουσπιριλένιο εμφάνισαν δόση και το χρόνο-εξαρτώμενη αναστολή στην βιωσιμότητα των κυττάρων σε κυτταρικές σειρές HepG2 και Huh7 σύγκριση με τον μάρτυρα (ρ & lt? 0,05).

Η

φλουσπιριλένιο θεραπεία συνελήφθησαν κυτταρικό κύκλο στη φάση G1

για να καταλάβετε αν φλουσπιριλένιο ανέστειλε τις δραστηριότητες CDK2 σε κύτταρα ηπατοκυτταρικού καρκινώματος, αναλύσαμε την επίδραση της φλουσπιριλένιο θεραπεία με συγκεντρώσεις 3, 10, 30

μ

M για 6, 12, 24 ώρες επί του κυτταρικού κύκλου προφίλ σε κύτταρα HepG2 και Huh7 με κυτταρομετρία ροής (σχήμα 5). θεραπεία φλουσπιριλένιο αύξησε σημαντικά το ποσοστό των κυττάρων στη φάση G1 σύγκριση με τον μάρτυρα (ρ & lt? 0,05) σε ένα δόση και το χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο. Στις 30

μ

Μ ή 10

μ

Μ συγκέντρωση, φλουσπιριλένιο θεραπεία συνεχή αύξηση του ποσοστού της φάσης G1 για 24 ώρες. Μετά από 24 ώρες φλουσπιριλένιο θεραπείας, η αύξηση του G1 φάση συνοδεύτηκε από την ταυτόχρονη μείωση της φάσης S. Τα ποσοστά υπο-G1 παρέχονται στον Πίνακα S5. Οι αντιπροσωπευτικές ιστογράμματα του περιεχομένου DNA που παρέχονται στο S5 Σχ.

(Α) φλουσπιριλένιο τη δόση της θεραπείας και το χρόνο εξαρτώμενο από αύξησε το ποσοστό των κυττάρων στη φάση G1. Στις 30

μ

Μ ή 10

μ

Μ συγκέντρωση, φλουσπιριλένιο θεραπεία συνεχή αύξηση του ποσοστού της φάσης G1 για 24 ώρες. (Β) Η κατανομή κυτταρικού κύκλου στις 24 ώρες μετά τη θεραπεία φλουσπιριλένιο. Η αύξηση της G1 φάσης συνοδεύτηκε από την ταυτόχρονη μείωση της φάσης S.

Η

φλουσπιριλένιο που προκαλείται από τη θεραπεία κυτταρικής απόπτωσης

Ένα φάρμακο που μπορεί να προκαλέσει μόνο τη σύλληψη του κυτταρικού κύκλου δεν είναι αρκετό, διότι καλό οι όγκοι θα εύκολο να αυξηθούν εκ νέου, μετά την απόσυρση του φαρμάκου. Ως εκ τούτου, ερευνήσαμε επίσης αν φλουσπιριλένιο θα μπορούσε να προκαλέσει κυτταρική απόπτωση (Σχήμα 6). Φλουσπιριλένιο επεξεργασία στους 30

μ

Μ ή 10

μ

συγκέντρωση Μ αύξησε σημαντικά το ποσοστό απόπτωσης σε κυτταρικές γραμμές Huh7 και HepG2 σε σύγκριση με τον έλεγχο σε μία δόση και το χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο (p & lt? 0,05). Τα διαγράμματα διασποράς των PI εναντίον αννεξίνης V, εφόσον το S6 Σχ.

φλουσπιριλένιο θεραπεία στο 30

μ

Μ ή 10

μ

συγκέντρωση Μ αύξησε σημαντικά το ποσοστό της απόπτωσης σε κυτταρικές σειρές Huh7 και HepG2 σε σύγκριση με τον έλεγχο σε μία δόση και το χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο (ρ & lt? 0,05).

η

θεραπεία φλουσπιριλένιο μείωσε τις εκφράσεις των CDK2, Rb, κυκλίνη Ε, pho-CDK2 και pho-Rb, αλλά όχι κυκλίνη D1 και κυκλίνης Β1

Ερευνήσαμε την επίδραση των φλουσπιριλένιο στις εκφράσεις των κρίσιμων πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην G1 προς S μετάβαση σε κύτταρα HepG2 και Huh7 με κηλίδωση Western (Σχήμα 7) . θεραπεία φλουσπιριλένιο μείωσε τις εκφράσεις των CDK2, Rb, pho-CDK2, pho-Rb και η κυκλίνη Ε Σε αντίθεση, τα επίπεδα έκφρασης της κυκλίνης D1 και κυκλίνης Β1 παρέμειναν αμετάβλητες. Τα αποτελέσματα αυτά συμφωνούν με αυτά που αναμένονται από έναν αναστολέα CDK2.

θεραπεία φλουσπιριλένιο μειώθηκαν οι εκφράσεις των CDK2, Rb, κυκλίνη Ε, pho-CDK2 και pho-Rb, αλλά όχι κυκλίνη D1 και κυκλίνης Β1.

επίσης, παρατηρείται ότι φλουσπιριλένιο θεραπεία μειώθηκε majorly την έκφραση και όχι η φωσφορυλίωση της CDK2. Προτείνουμε ότι οι διαφορές αυτές είναι λογικές υπό την έννοια ότι μετά δεσμευτική, συγκροτήματα CDK2-φλουσπιριλένιο μπορούν να υποβληθούν άμεσα υποβάθμιση, ως εκ τούτου, με αποτέλεσμα μεγαλύτερη μείωση της έκφρασης CDK2 από φωσφορυλίωση. Επιπλέον, φλουσπιριλένιο μπορεί να προσδεθεί σε CDK2 με υψηλή συγγένεια, αλλά μετά CDK2 είναι φωσφορυλιωμένη, η σύνδεση του φλουσπιριλένιο μπορεί να επηρεαστεί και η συγγένεια σύνδεσης θα μπορούσε έτσι να αποδυναμωθεί.

Η καθημερινή θεραπεία από το στόμα φλουσπιριλένιο ανάπτυξη μειώνεται όγκου

in vivo

η

αξιολόγησε την επίδραση του φλουσπιριλένιο επί της ανάπτυξης ηπατοκυτταρικού καρκινώματος

in vivo

σε BALB /C γυμνά ποντίκια υποδορίως με ένεση με κύτταρα Huh7 (Σχήμα 8). Την ημέρα 21 μετά την αγωγή, φλουσπιριλένιο (15 mg /kg) είχε ως αποτέλεσμα σημαντική μείωση του βάρους του όγκου και του όγκου σε σύγκριση με τον μάρτυρα (ρ & lt? 0,05), ενώ κάνει καμία σημαντική μεταβολή στο σωματικό βάρος. Η δραστικότητα κατά του όγκου των από του στόματος φλουσπιριλένιο (15 mg /kg) ήταν συγκρίσιμη με εκείνη του 5-φθοριοουρακίλη (10 mg /kg). Είναι σημαντικό ότι, η συνδυασμένη θεραπεία τους εμφάνισαν το υψηλότερο θεραπευτικό αποτέλεσμα. Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν για πρώτη φορά ότι φλουσπιριλένιο είναι ένας δυνητικός αναστολέας CDK2 και ένα φάρμακο υποψήφιος αντικαρκινικό για τη θεραπεία του ανθρώπινου ηπατοκυτταρικού καρκινώματος.

Η δραστικότητα κατά του όγκου των από του στόματος φλουσπιριλένιο (15 mg /kg) ήταν συγκρίσιμη με αυτή της 5-φθοριοουρακίλη (10 mg /kg). Επιπλέον, η θεραπεία με κοκτέιλ τους παρουσίασαν συνεργιστική θεραπευτική επίδραση

Η

Δομική ανάλυση της προβλεπόμενης δέσμευσης διαμόρφωση του φλουσπιριλένιο

Το σχήμα 9 απεικονίζει την προβλεπόμενη διαμόρφωση του φλουσπιριλένιο σε σύμπλεγμα με CDK2 (ΠΣΠ ταυτότητας.: 1GZ8) χρησιμοποιώντας IVIEW [16]. Φλουσπιριλένιο είχε προβλεφθεί να δεσμεύει μέσα στο ΑΤΡ-δέσμευσης τσέπη του CDK2 και να αλληλεπιδρούν με CDK2 κυρίως μέσω δεσμών υδρογόνου, υδρόφοβων επαφών και κατιόντα

π

αλληλεπιδράσεις. Υποθετικά, το άτομο Η8 σχηματίζει ένα δεσμό υδρογόνου με το σκελετό οξυγόνο του Ile10, και το άτομο Η32 σχηματίζει άλλους δύο δεσμούς υδρογόνου με τη σπονδυλική στήλη του οξυγόνου Leu83 και His84. Οι πλευρικές αλυσίδες του Ile10, Ala31 και Leu134 καθιερώσει ένα υδρόφοβο σήραγγα για την υδρόφοβη ουρά του φλουσπιριλένιο να θάψει μέσα. Ένας από τους δύο αρωματικούς δακτυλίους που βρίσκεται στην ουρά του φλουσπιριλένιο σχηματίζει κατιόντα

π

αλληλεπίδραση με το θετικά φορτισμένο πλευρικής αλυσίδας της Lys33. Όλες αυτές οι υποθετικές δεσμούς υδρογόνου, υδρόφοβες επαφές και κατιόντα

π

οι αλληλεπιδράσεις απλώνονται πάνω από τα κεφάλι, μέση και ουρά θραύσματα φλουσπιριλένιο, έτσι κρατώντας σταθερά φλουσπιριλένιο στην προβλεπόμενη θέση και τον προσανατολισμό του. Σε σύγκριση, ο γνωστός αναστολέας CDK2 2-αμινο-6- (3′-μεθυλ-2′-οξο) butoxypurine (με την κωδική ονομασία ΜΒΡ για συντομία), η οποία είναι ένα O (6) -υποκατεστημένο παράγωγο γουανίνης, είναι γνωστή για τη δημιουργία τεσσάρων υδρογόνο δεσμούς με Lys33, Glu81 και Leu83 (S2 σχήμα).

τα υπολείμματα CDK2 αποδίδονται ως γραμμές χρωματίζεται από τον τύπο ατόμου. Φλουσπιριλένιο αποδίδεται ως ραβδιά χρωματίζεται από τον τύπο ατόμου. Οι αλληλεπιδρούν άτομα και τα υπολείμματα επισημαίνονται. Το κυανό, πράσινο και ροζ διακεκομμένες γραμμές αντιπροσωπεύουν δεσμούς υδρογόνου, υδρόφοβες επαφές και

π

αλληλεπιδράσεις, αντίστοιχα. Ο αριθμός αυτός δημιουργήθηκε από IVIEW [16].

Η

Είμαστε επιθεωρούνται περαιτέρω την προβλεπόμενη διαμόρφωση του φλουσπιριλένιο παρουσία μοριακής επιφάνειας CDK2 (S3 Εικ). Σε σύγκριση με την γουανίνη παράγωγο ΜΒΡ (S4 Σχήμα), φλουσπιριλένιο καταλαμβάνει ένα πολύ μεγαλύτερο τμήμα του θύλακα σύνδεσης, και το σχήμα του ταιριάζει σωστά ότι της κοιλότητας δέσμευσης. Με βάση αυτή την δομική ανάλυση, μαζί με μας

in vitro

και

in vivo

πειράματα, μπορούμε να συμπεράνουμε ότι φλουσπιριλένιο μπορεί φυσικά συνδέονται με CDK2.

Συζήτηση

πρόοδο του κυτταρικού κύκλου είναι διαδοχικά και αυστηρά σε επεξεργασία μέσω των αλληλεπιδράσεων των CDK και κυκλινών [17]. Διαφορετικά σύμπλοκα κυκλίνης-CDK ενεργοποιούνται σε διάφορες φάσεις του κυτταρικού κύκλου. Όταν ο κυτταρικός κύκλος περνά από G1 προς S φάση, η κυκλίνη D1-CDK4 /6 και κυκλίνη σύμπλοκα E-CDK2 είναι ordinally ενεργοποιούνται και η πρωτεΐνη ρετινοβλαστώματος (pRB) είναι υπερ-φωσφορυλιωμένη επί υπολοίπων σερίνης και θρεονίνης [18]. Η υπερ-φωσφορυλιωμένη pRB προάγει την απελευθέρωση των παραγόντων μεταγραφής E2F, ο οποίος με τη σειρά του διευκολύνει την μεταγραφή πολλών γονιδίων που απαιτούνται για την G1 στην S μετάβαση και την εξέλιξη της φάσης S [19]. Από το φάρμακο προοπτική, CDK2 έχει από καιρό ένα κλασσικό και σημαντικός στόχος για θεραπεία καρκίνου.

Αν και ένας αριθμός αναστολέων CDK2 έχουν εισέλθει φάσεις κλινικής δοκιμής, κανένας δεν έχει επίσημα εγκριθεί για κλινική χρήση, πιθανώς λόγω της τοξικότητάς τους και ειδικότητα multi-στόχου. Δεδομένου του εμποδίου ότι η ανάπτυξη ενός νέου φαρμάκου

de novo

είναι μια επίπονη και δαπανηρή προσπάθεια, αναπροσανατολισμό τοξικότητα χωρίς παλαιά φάρμακα για νέες χρήσεις είναι μια ευνοϊκή στρατηγική.

Η ισχυρή συνέργεια του

in silico

μεθόδους σε αναπροσανατολισμό των ναρκωτικών από τη δομή που βασίζεται σε εικονικό διαλογής (SBVS) τονίστηκε σε πολλές πρόσφατες δημοσιεύσεις [20]. Για να αναφέρουμε μερικές επιτυχημένες περιπτώσεις αναπροσανατολισμό από SBVS, [21] ξαναβρήκε 2,4-διχλωροφαινοξυ οξικό οξύ, ένα πολύ γνωστό αυξίνης των φυτών, ως ένα νέο αντι-φλεγμονώδη παράγοντα μέσω

in silico

μελέτες μοριακής μοντελοποίησης και σύνδεσης μαζί με την σύνθεση φαρμάκου και

in vivo

αντι-φλεγμονώδη επιθεώρηση? [22] προσπάθησαν να repurpose FDA-εγκεκριμένων φαρμάκων από μια ολοκληρωμένη προσέγγιση SBVS και ανέφεραν την ανακάλυψη πιπερακιλλίνη 1 ως ένας αναστολέας του ενζύμου που Nedd8-ενεργοποίησης (ΝΑΕ) σε συστήματα άνευ κυττάρων και με βάση κύτταρα με υψηλή εκλεκτικότητα.

Εκτός από SBVS, συνδέτη με βάση το εικονικό διαλογής (LBVS) διαπιστώνει επίσης επιτυχημένες εφαρμογές της στην αναπροσανατολισμό. [23] χρησιμοποιείται Ultrafast Shape Αναγνώρισης (USR) [24] για αναζήτηση για ενώσεις με παρόμοιο σχήμα με ένα προηγουμένως αναφερθεί αναστολέας της πρωτεΐνης δεϊμινάσης αργινίνης τύπου 4 (PAD4), ένα νέο θεραπευτικό στόχο για την θεραπεία της ρευματοειδούς αρθρίτιδας, και προσδιόρισε μια νέα ένωση που έχει μια εντυπωσιακά διαφορετική δομή από τον αναστολέα πρότυπο ακόμα έδειξαν σημαντική αναστολή στην ενζυματική δραστηριότητα των PAD4.

Ενθαρρυμένος από αυτές τις επιτυχημένες ιστορίες, σε αυτή τη μελέτη υιοθετήσαμε τη στρατηγική αναπροσανατολισμό, και να χρησιμοποιηθεί η υπολογιστική μεθοδολογία SBVS με βάση σύνδεσης πρωτεΐνης-συνδέτη στα αγαπημένα υποψηφίων από εγκεκριμένο FDA-φάρμακα μικρών μορίων. Συγκεκριμένα, χρησιμοποιήσαμε γρήγορο πρόγραμμα σύνδεσης idock μας [5, 6] σε συνδυασμό με την άνετη IVIEW οραματιστής μας [16] για το έργο του ανακαλύπτουν εκ νέου τα υπάρχοντα φάρμακα, όπως οι αναστολείς CDK2. idock είναι μια συναρπαστική εξέλιξη, όχι μόνο επειδή έχει αποδειχθεί σθεναρά [6] για να ξεπεράσουν το λογισμικό σύνδεσης state-of-the-art ΑυΤΌϋΟΟΚ Vina [25] όσον αφορά την ταχύτητα σύνδεσης τουλάχιστον κατά 8,69 φορές και σε πιο 37,51 φορές, διατηρώντας παράλληλα συγκρίσιμα ποσοστά επιτυχίας redocking, αλλά και επειδή είναι δωρεάν και ανοικτού κώδικα κάτω από μια ειδική άδεια. Οι εν λόγω εγγυήσεις ότι οι χρήστες τόσο από τη βιομηχανία και τον ακαδημαϊκό κόσμο μπορούν να χρησιμοποιήσουν ελεύθερα idock στα δικά τους έργα που απαιτούν πρωτεΐνη-συνδέτη σύνδεσης.

Για να διευκολυνθεί η χρήση των idock, τα επιχειρήματα των εισροών της και τα αποτελέσματα της παραγωγής έχουν σχεδιαστεί επίτηδες να είναι παρόμοια με εκείνες των ΑυΤΌϋΟΟΚ Vina, ως εκ τούτου, οι υπάρχοντες χρήστες μπορούν εύκολα διαμετακόμιση προς idock και να επωφεληθεί από σημαντική επιτάχυνση στην απόδοση SBVS. Επιπλέον, για την προώθηση υποψήφιους SBVS από idock, ένας web server που ονομάζεται ISTAR [6] αναπτύχθηκε και διατίθενται ελεύθερα σε https://istar.cse.cuhk.edu.hk/idock, όπου υπάρχουν τόσο πολλοί όπως πάνω από 23 εκατομμύρια purchasable μικρού μορίου ενώσεις έτοιμος για σύνδεση έναντι οποιασδήποτε πρωτεΐνης που παρέχεται από το χρήστη. Από την 1η Μαΐου 2015, υπήρξαν περισσότερες από 1000 υποβολές εργασιών σύνδεσης από τους χρήστες από 98 χώρες. Τόσο idock [5] και ISTAR [6] θα συμπληρώσει αισίως τις προσπάθειες των φαρμακευτικών φαρμακεία στην έρευνα ανακάλυψη φαρμάκων. Εκτός για ερευνητικούς σκοπούς, ορισμένα πανεπιστήμια χρησιμοποιούν επίσης idock μας για τη διδασκαλία σκοπό στα μαθήματα βιοπληροφορική τους.

Όσον αφορά τα διαρθρωτικά δεδομένα κατά τη χρήση, μέχρι στιγμής δεν υπάρχουν τόσο πολλοί όπως 346 επιλυθεί κρυσταλλικές δομές ακτίνων Χ της CDK2 με UniProt ID του P24941 (S1 πίνακα). Να λογοδοτήσουν για τις διαρθρωτικές μεταβλητότητα τους και με τη δική μου γνώση από πολλαπλές δομές των CDK2, επιλέξαμε 44 ολο δομές της CDK2 σε δεσμευμένη κατάσταση με ένα συνδετήρα στο συγκρότημα να πραγματοποιήσει σύνολο σύνδεσης. Το τελικό σκορ για την ιεράρχηση των ενώσεων σκόπιμα σχεδιαστεί για να είναι ο μέσος όρος της εν λόγω ένωσης όταν είναι συνδεδεμένο με τις 44 επιλεγμένες δομές της CDK2 με τους συν-κρυσταλλώνεται συνδέτη απομακρύνονται με το χέρι πριν σύνδεσης.