Αφηρημένο

Ο όγκος MUC1 σχετίζεται αντιγόνο εκφράζεται έντονα σε ένα ευρύ φάσμα των όγκων. ευρείας διανομής της σε πρωτοπαθείς όγκους και μεταστάσεις είναι ένας ελκυστικός στόχος για ανοσοθεραπεία καθιστά. Μετά τη σύνθεση MUC1 διασπάται, δίνοντας ένα μεγάλο διαλυτό εξωκυτταρικό άλφα υπομονάδα που περιέχει τη δίδυμες επαναλήψεις array (TRA) περιοχή ειδικώς συνδεδεμένο, μέσω μη-ομοιοπολική αλληλεπίδραση, σε μικρότερο βήτα υπομονάδα που περιέχει τη διαμεμβρανική και κυτταροπλασματική περιοχή. Μέχρι στιγμής, ασαφή αποτελεσματικότητα έχει αναφερθεί για αντι-MUC 1 αντισωμάτων που κατευθύνονται εναντίον του διαλυτή υπομονάδα άλφα. Στόχευση της δεσμευμένης κυττάρων βήτα υπομονάδα, μπορεί να παρακάμψει τους περιορισμούς που τίθενται από κυκλοφορεί τομείς TRA. πεπτίδιο σήματος MUC1 (SP) περιοχή συνδέεται αδιάκριτα πολλαπλούς MHC κατηγορίας II και κατηγορίας Ι αλληλόμορφα, τα οποία κατά τον εμβολιασμό, δημιουργούνται ισχυρά Τ-κυττάρου ανοσία έναντι MUC1-θετικών όγκων. Αυτή είναι μια πρώτη απόδειξη της μη-MHC συνδέονται, MUC1 ειδικά, επιφάνειες των κυττάρων παρουσία για τον τομέα MUC1 SP. Πολυκλωνικά και μονοκλωνικά αντισώματα που δημιουργούνται εναντίον του τομέως MUC1 SP δεσμεύονται ειδικά μια μεγάλη ποικιλία MUC1-θετικά ανθρώπινα στερεά και αιματολογικές καρκινικές κυτταρικές σειρές? κύτταρα MUC1-θετικά οστών που προέρχονται μυελού πλάσμα που λαμβάνεται από πολλαπλό μυέλωμα (ΜΜ) Για τους ασθενείς, αλλά όχι MUC1 αρνητικούς όγκους κύτταρα, και η κανονική αφελής πρωτογενούς αίματος και επιθηλιακά κύτταρα. Μεμβρανικές MUC1 SP εμφανίζεται κυρίως ως ανεξάρτητη οντότητα, αλλά και συν-εντοπισμένη με την πλήρη μόριο MUC1. MUC1-SP ειδική δέσμευση σε BM-κύτταρα προερχόμενα από το πλάσμα μπορεί να βοηθήσει στην επιλογή ασθενών που θα θεραπευθεί με αντι-MUC 1 SP θεραπευτικό εμβόλιο, ImMucin. Ένα θεραπευτικό δυναμικό των αντισωμάτων αντι-MUC 1 SP προτάθηκε από την ικανότητά τους να υποστηρίξουν από διαμεσολαβούμενη από συμπλήρωμα λύση των καρκινικών κυττάρων MUC1-θετικά αλλά όχι MUC 1 αρνητικά κύτταρα όγκου και φυσιολογικών αφελής πρωτογενή επιθηλιακά κύτταρα. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν μια νέα παρουσία στην κυτταρική επιφάνεια του τομέα MUC1 SP, ένα δυνητικό θεραπευτικό όφελος για αντι-MUC1 SP αντισωμάτων σε MUC1-θετικούς όγκους και ένα εργαλείο επιλογής για τους ασθενείς MM πρέπει να αντιμετωπίζονται με το εμβόλιο αντι-MUC1 SP, ImMucin.

Παράθεση: Kovjazin R, Χορν G, Smorodinsky NI, Shapira ΜΟΥ, Carmon L (2014) Cell Surface-Associated Anti-MUC1-παραγόμενο σήμα πεπτιδίων Αντισώματα: Συνέπειες για τον Καρκίνο Διάγνωση και θεραπεία. PLoS ONE 9 (1): e85400. doi: 10.1371 /journal.pone.0085400

Συντάκτης: Stefan Dübel, Τεχνικό Πανεπιστήμιο του Braunschweig, Γερμανία

Ελήφθη: 9 Οκτωβρίου 2013? Αποδεκτές: 5 Δεκεμβρίου 2013? Δημοσιεύθηκε: 8 Γενάρη του 2014

Copyright: © 2014 Kovjazin et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από μια επιχορήγηση Νο 48447 από την ισραηλινή επιστημονικού διευθυντή του Υπουργείου Βιομηχανίας Εμπορίου και Εργασίας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν διαβάσει την πολιτική του περιοδικού και έχουν τα ακόλουθα συγκρούσεις: Lior Carmon είναι η ιδρυτής και Διευθύνων Σύμβουλος και Riva Kovjazin, και είναι ένας ανώτερος επιστήμονας της Vaxil BioTherapeutics Ltd., μια νεοσύστατη εταιρεία που αναπτύσσει ImMucin, ένα αντι-MUC1 SP θεραπευτικό εμβόλιο κατά του MUC1-θετικούς όγκους. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών. Οι άλλοι συγγραφείς δηλώνουν δεν υπάρχει σύγκρουση συμφερόντων.

Εισαγωγή

MUC 1 είναι ένα βλεννίνη-όπως γλυκοπρωτεΐνη εκφράζεται έντονα σε μια σειρά από επιθηλιακά καρκινώματα, συμπεριλαμβανομένων των πνευμόνων, του μαστού, των ωοθηκών, του προστάτη και του παχέος εντέρου, όπως καθώς και στην επιφάνεια των αιματολογικών όγκων, όπως το πολλαπλό μυέλωμα (ΜΜ) [1], [2], [3], [4], [5], [6]. ευρεία κατανομή του τόσο πρωτογενούς όγκου και της μετάστασης, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου βλαστικών κυττάρων [7], έχει καθιερωθεί ως μια ευρέως διερευνηθεί στόχος για ανοσοθεραπεία [1], [8], [9], [10]. Στην πραγματικότητα, MUC1 εισήχθη από το πιλοτικό πρόγραμμα Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου ως η δεύτερη πιο ελπιδοφόρα στόχο από μια λίστα των 75 πιθανών αντιγόνων που σχετίζονται με όγκο (ΤΑΑ) [11].

MUC1 υπάρχει σε διάφορες ισομορφές [12 ], όπου το πιο εκτεταμένα μελετηθεί μορφή είναι η πολυμορφική διαμεμβρανική πρωτεΐνη τύπου Ι (MUC1-ΤΜ), που αποτελείται από ένα εξωκυτταρικό πεδίο που περιέχει 20-125 συστοιχίες 20-αμινοξέων μήκους διαδοχική επανάληψη (TRA) ακολουθούμενη από διαμεμβρανική περιοχή και μια σύντομη κυτταροπλασματική ουρά [13], [14]. MUC1 υφίσταται επεξεργασία σε εκκριτικό μονοπάτι, αποδίδοντας ένα μεγάλο εξωκυτταρικό άλφα υπομονάδα που περιέχει το πεδίο TRA, μη-ομοιοπολικά συνδεδεμένο με ένα μικρότερο βήτα υπομονάδα που περιέχει διαμεμβρανική του μορίου και κυτταροπλασματικής περιοχής [15]. Μέχρι σήμερα, ενώ τα περισσότερα αντι-MUC 1 αντισωμάτων στοχεύουν την περιοχή TRA της εξωκυτταρικής άλφα υπομονάδα [16], [17], [18], μελέτες έχουν δείξει αντικρουόμενα αποτελέσματα όσον αφορά την αποτελεσματικότητα ανοσοθεραπευτικό τέτοιων βασίζονται σε αντισώματα TRA-επίτοπο στόχευση [19 ], [20], [21], [22], [23], [24], [25], [26]. Αυτά τα αντιφατικά ευρήματα, προτείνεται να είναι η συνέπεια της μη ομοιοπολική σύνδεση του τομέα TRA στην επιφάνεια του κυττάρου του όγκου? το διαλυτό, που κυκλοφορεί μορφή ενεργεί ως δόλωμα για αντι-TRA αντισώματα, περιορίζοντας την ικανότητά τους να φθάσουν τα καρκινικά κύτταρα MUC1 εκφράζουν [23], [25]. Ως εκ τούτου, η στόχευση MUC1 noncirculating επιτόπων που εκφράζεται αποκλειστικά σε καρκινικών κυττάρων επιφάνειες θα μπορούσε δυνητικά να παρακάμψουν αυτούς τους περιορισμούς. Για το σκοπό αυτό, επίτοπους από τα εξωκυτταρικά και ενδοκυτταρικά τμήματα που περιβάλλουν την περιοχή MUC1 TRA, μαζί με επίτοπα εντός πεπτίδιο σήματος MUC 1 (SP) περιοχή, εντοπίστηκαν [20], [21], [27], [28].

SPs είναι σύντομες 13-50 αμινοξέων λιπόφιλες αλληλουχίες οξύ μήκους τυπικά βρίσκεται στο αμινο-τελικό άκρο των πρωτεϊνών που προορίζονται για έκκριση ή για ενσωμάτωση εντός των κυτταρικών μεμβρανών [29]. Μόλις μετάφραση πρωτεΐνη έχει ολοκληρωθεί, οι SPs ενσωματώνονται στο ενδοπλασματικό δίκτυο (ER) μεμβράνη αφαιρείται γενικά από την ώριμη πρωτεΐνη, αλλά μπορεί ακόμα να εισάγετε τις αυλό ER και δεσμεύουν τα μόρια MHC, είτε άμεσα, λόγω της μοναδικής δραστικότητας πρωτεάσης του ER-membrane- που σχετίζονται πεπτίδιο σήματος πεπτιδάσης (SPP) [29], ή έμμεσα, όπως και τα άλλα υποβαθμισμένη ακολουθίες, μέσω του μεταφορέα συνδέονται με την επεξεργασία του αντιγόνου (ΤΑΡ) μηχανήματα [30]. Ωστόσο, ER εντοπισμό και MHC ικανότητας δέσμευσης του ΚΕΕ [31] στηρίζεται τόσο στην υδρόφοβη φύση τους και συγκεκριμένη ακολουθία. Δηλαδή, παράλληλα με τη διατήρηση του συναινετικό μοτίβο απαιτείται ως σήμα στόχευσης, διαφορετικά SPs εμφανίζουν υψηλή μεταβλητότητα και την εξειδίκευση του αντιγόνου [29], [32], [33]. Κατά συνέπεια, SP περιοχές μπορούν να χρησιμεύσουν ως υποψήφιοι εμβολίων (VC), την επαγωγή αντιγονο-ειδικών ανοσοαποκρίσεων σε ένα μεγάλο μέρος του πληθυσμού.

Ο τομέας SP 21-μερές της MUC1 (MUC1 SP), εδώ ο MUC1- SP-L ή πεπτίδιο VXL100 ή ο τυποποιούνται θεραπευτικό εμβόλιο, ImMucin [28], επεξεργασία και παρουσιάζεται σε συνεργασία με πολλαπλούς MHC τάξης Ι και II στην κυτταρική επιφάνεια των δύο κυττάρων που παρουσιάζουν αντιγόνο και διάφορα κύτταρα όγκου MUC1-θετικά, τα οποία μπορούν να δημιουργήσουν εύρωστη Τ-κυττάρου ανοσία έναντι MUC1-θετικούς όγκους [28]. Επιπλέον, μια MUC1-ειδική χυμική απόκριση μπορεί να δημιουργηθούν έναντι MUC1 SP, όπως εκδηλώνεται από σημαντική αύξηση του φυσικού αυτοαντισωμάτων στην κυκλοφορία του αίματος των ασθενών mm αλλά όχι σε υγιείς δότες [34]. Από διαλυτό MUC1 SP δεν ανιχνεύθηκε στον ορό των ασθενών [34], είχε σκεφτεί ότι οι φυσικά παράγονται αυτοαντισώματα πληρώθηκαν με μη-MHC-περιορισμένο, MUC1-σχετίζονται με όγκους κυττάρων δεσμευμένη SP. Η τρέχουσα μελέτη διερεύνησε τη δυνατότητα αυτή με την παραγωγή ειδικών πολυκλωνικών και μονοκλωνικών αντισωμάτων για MUC1-SP-L. παρουσία κυττάρων-επιφάνεια του MUC1 SP ανιχνεύθηκε, με τη χρήση των αντισωμάτων έθεσε, σε κυτταρικές γραμμές όγκου και πρωτογενείς όγκους, αλλά όχι σε αφελείς πρωτογενή κύτταρα. Εκτός από την άμεση αντινεοπλασματική θεραπευτικό δυναμικό τους, αυτά τα αντισώματα μπορεί να βελτιώσει τα κριτήρια επιλογής των ασθενών ΜΜ προσπάθησε να αντιμετωπίζονται με την ImMucin αντι-MUC1 SP θεραπευτικό εμβόλιο.

Υλικά και Μέθοδοι

Σύνθεση πεπτιδίου

MUC1-SP-L, MUC1-SP-Μ, MUC1-SP-S1, MUC1-SP-S2, MUC1-SP-S3, MUC1-SP-S4, MUC1-SP-S5 και TB-Rv0476 /4941-SP-L συντέθηκαν με πλήρως αυτοματοποιημένο, στερεάς φάσης, σύνθεση πεπτιδίου χρησιμοποιώντας φθορενυλμεθυλοξυκαρβονυλ (Fmoc) /tBu-στρατηγική και ρητίνη Rink-αμίδιο-πολυστερίνης (EMC Microcollections, Γερμανία και Almac Sciences, UK). MUC1-TRA-L και BAGE-SP-L συντέθηκαν χρησιμοποιώντας την ίδια μεθοδολογία (ΓΠ Biochem, Κίνα). Η καθαρότητα του πεπτιδίου και η ταυτότητα ήταν & gt?. 95%, όπως προσδιορίζεται με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης και φασματομετρία μάζας αναλύσεις

Tumor κυτταρικές σειρές και Υβριδώματα

Τα ανθρώπινα Β-λεμφοκυτταρικής λευχαιμίας γραμμές Raji και Ramos , ο ανθρώπινες κυτταρικές σειρές ΜΜ U266, και RPMI8226 και η γραμμή ανθρώπινης λευχαιμίας PC ARH-77 αναπτύχθηκαν σε εναιώρημα σε RPMI-1640 μέσο συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS), 2 mM L-γλουταμίνη, 1 mM πυροσταφυλικό νάτριο, 1% μη-ουσιώδη αμινο-οξύ, 1 mM HEPES και 50 μg /ml γενταμυκίνη. Η γραμμή ανθρώπινου καρκινώματος ωοθήκης OVARCAR-3 αναπτύχθηκε ως μια προσκολλημένη μονοστιβάδα σε RPMI-1640 συμπληρωμένο με 20% FBS, 2 mM Ε-γλουταμίνη, 1 mM πυροσταφυλικό νάτριο και 50 μg /ml γενταμυκίνη. Η γραμμή ανθρώπινου καρκινώματος ωοθήκης ES-2, γραμμή μελανώματος SK-MEL-28 οι καρκίνου του μαστού κυτταρικές γραμμές MCF7, MDA-231 και MDA-453, και αναπτύχθηκαν ως προσκολλημένες μονοστιβάδες και η ανθρώπινη γραμμή μελανώματος SK-MEL-1 αναπτύχθηκε σε εναιώρημα σε DMEM, συμπληρωμένο με 10% FBS, 2 mM Ε-γλουταμίνη, 1 mM πυροσταφυλικό νάτριο και 50 μg /ml γενταμυκίνη. Όλες οι κυτταρικές σειρές αγοράστηκαν από την ATCC (Manassas νΑ, USA). Όλα τα υβριδώματα που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη αναπτύχθηκαν σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% ορό αλόγου, 2 mM Ε-γλουταμίνη, 1 mM πυροσταφυλικό νάτριο και 50 μg /ml γενταμυκίνη. Όλα τα αντιδραστήρια καλλιέργειας αγοράστηκαν από την Biological Industries, (Bet-Haemek, Ισραήλ).

Αντισώματα

Η αντι-MUC1 TRA mAb H23, έθεσε ενάντια στον καρκίνο των κυττάρων του μαστού σειρά ανθρώπινου T47D, [35 ] αναγνωρίζει την μη-γλυκοζυλιωμένη APDTRP MUC1 επίτοπο, χρησίμευσε ως θετικός έλεγχος. Mouse αντί-κατσίκας ή κουνελιού αντι-ποντικού IgG-FITC (Jackson ImmunoResearch, USA) χρησίμευσε ως αναλύσεις ένας αρνητικός μάρτυρας για FACS. Κανονική IgG αντισώματα ποντικού ή κουνελιού (Chemicon, Millipore, USA) χρησιμοποιήθηκαν για εξαρτώμενη από συμπλήρωμα κυτταροτοξικότητα (CDC) αναλύσεις.

Ζώα

ποντίκια οκτώ εβδομάδων ηλικίας θηλυκών BALB /c (Tel Πανεπιστήμιο Αβίβ εγκατάσταση εκτροφής) και δύο μηνών κουνέλια (Harlan, Ιερουσαλήμ, Ισραήλ) διατηρήθηκαν στην πανεπιστημιακή έρευνα μονάδα ζώων.

Όλες οι πειραματικές διαδικασίες που αφορούν τα ποντίκια και κουνέλια έχουν εγκριθεί από το Πανεπιστήμιο Φροντίδα ζώων Τελ Αβίβ Επιτροπή.

ασθενής μυελού των οστών (ΒΜ) αναρροφήματα και Πρωτοβάθμια Αφελής υγιή κύτταρα

BM αναρροφήσεις (2-3 ml) καταρτίστηκαν από τέσσερις ασθενείς (ηλικίας 50-75) με αργούς ρυθμούς προχωρούν, ασυμπτωματική MM, ο οποίος είχε υποβληθεί σε έλεγχο για την εγγραφή σε φάση ImMucin του Ι /ΙΙ των κλινικών δοκιμών (πρωτόκολλο VAXIL-001). Η μελέτη εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Hadassah, στην Ιερουσαλήμ, Ισραήλ το Υπουργείο Υγείας ισραηλινών και καταχωρήθηκε στο PRS ως NCT01232712. Η ανάλυση των ΒΜ-προερχόμενο PC πραγματοποιήθηκε στο πλαίσιο της διαδικασίας ελέγχου της μελέτης και γραπτή συγκατάθεση από τους ασθενείς MM λήφθηκε για τη χρήση το δείγμα τους για την έρευνα. Φρέσκα κανονικά ανθρώπινα ΒΜ (Cat. Νο 1 Μ-105) και της ανθρώπινης NHEC (Cat. Νο CC-2251), αγοράστηκαν από την Lonza βιολογικής έρευνας (Somerset, NJ, USA). Φυσιολογικά ανθρώπινα λευκά αιμοσφαίρια απομονώθηκαν από δείγματα φλεγμονώδη πλακούντα δωρεά από τον ισραηλινό Εθνική Τράπεζα Αίματος, από 3 αφελείς δωρητές.

παραγωγή των αντι-MUC1 SP Πολυκλωνικά Αντισώματα

Τέσσερα κουνέλια (R22, R23, R32 και R33) ανοσοποιήθηκαν υποδορίως τέσσερεις φορές, σε διαστήματα δύο εβδομάδων, με 500 ug αιμοκυανίνη πεταλίδας (KLH), συζευγμένης MUC1-SP-M, γαλακτωματοποιημένο σε πλήρες ανοσοενισχυτικό του Freund στην πρώτη ανοσοποίηση και σε μη πλήρες ανοσοενισχυτικό του Freund σε επακόλουθες ανοσοποιήσεις. ΚΕΗ-πεπτίδιο σύζευξη διεξήχθη με Adar Biotech (Rehovot, Ισραήλ) με τη βοήθεια γλουταραλδεΰδης με γνώμονα διασταύρωσης. Επτά ημέρες μετά την τελική ανοσοποίηση, οι οροί κουνελιών εξετάσθηκαν ως προς την παρουσία του MUC 1-SP-M-ειδικά αντισώματα? θετικοί οροί (τίτλος 1:12,800) συλλέχθηκαν και συνενώθηκαν. κλάσματα IgG του κουνελιού R23, που ονομάζεται R23IgG, χρησιμοποιείται για όλες τις ανοσολογικές δοκιμασίες, υποβλήθηκαν θειικό αμμώνιο (40%) κατακρήμνιση πριν από τη χρήση, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [36].

παραγωγή αντι-MUC1 SP mAbs

Τέσσερα ποντίκια BALB /c ανοσοποιήθηκαν υποδορίως όπως περιγράφεται παραπάνω. Δύο εβδομάδες μετά την τελική ανοσοποίηση, οι ποντικοί οροί αξιολογήθηκαν για την παρουσία του MUC 1-SP-M-ειδικά αντισώματα. Σπληνικά κύτταρα από την υψηλότερη θετική ποντίκι οροί που φέρει συλλέχθηκαν και συντήχθηκαν με ποντικού κυτταρική γραμμή μυελώματος NSO εταίρος, χρησιμοποιώντας πολυαιθυλενογλυκόλη (μοριακό βάρος 1500) (Roche Diagnostics GmbH, Germany). Υβριδώματα επιλέχθηκαν για 2 εβδομάδες σε μέσο ανάπτυξης υβριδώματος συμπληρωμένο με 2% υποξανθίνη-αμινοπτερίνη-θυμιδίνη και καλλιεργήθηκαν περαιτέρω σε μέσο ανάπτυξης υβριδώματος συμπληρωμένο με 2% υποξανθίνη-θυμιδίνη. ELISA πραγματοποιήθηκε σε υπερκείμενα καλλιέργειας οθόνη για την παρουσία αντι-MUC1 SP-M-IgG Abs. Τα θετικά δείγματα υποβλήθηκαν σε νέα διαλογή με ELISA και περαιτέρω υποκλωνοποιήθηκαν και να επεκταθούν. Η μεγάλης κλίμακας παραγωγή Ab επιλεγμένων κλώνων επετεύχθη με καθαρισμό mAbs χρησιμοποιώντας στήλη αγαρόζης αντι-ποντικού IgG (Sigma, Ισραήλ?. Cat Νο A6531). Ισοτύπου των mAbs εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ Isostrip (Roche?.. Cat Νο 1493027).

ELISA που βασίζεται Διαλογή Mouse Υπεράνοσος Sera και Αντι-MUC1-SP-M που παράγουν IgG Υβριδώματα

πλάκες ELISA (F96 Maxisorp, Nunc, Δανία) ενεργοποιήθηκαν για 1 ώρα με 0.1% γλουταραλδεϋδη (Sigma, Ισραήλ) σε ανθρακικό ρυθμιστικό, ρΗ = 9. στη συνέχεια, οι πλάκες επικαλύφθηκαν με 50 μλ πεπτίδιο (5 μg /ml), σε ρυθμιστικό διάλυμα ανθρακικού (όλη τη νύκτα, 4 ° C), ακολουθούμενη από το κλείδωμα (2 ώρες, θερμοκρασία δωματίου) με PBS συμπληρωμένο με 5% FBS και 0,04% Tween 20 (ICN Biomedical Inc, USA). δείγματα Οροί από MUC1-SP-M-ανοσοποιημένοι ποντικοί στη συνέχεια αραιώθηκαν στο ρυθμιστικό διάλυμα μπλοκαρίσματος, ενώ τα δείγματα από καλλιέργειες υβριδώματος δεν αραιώθηκαν. Όλα τα δείγματα επωάστηκαν (2 ώρες, θερμοκρασία δωματίου), πριν από την εκτεταμένη πλύση και κατεργασία (1 ώρα, θερμοκρασία δωματίου) με HRP-συζευγμένο αντι-ποντικού IgG (Jackson ImmunoResearch, USA? 50 αϊ /οπή), μετά από αραίωση 1:10,000 σε ρυθμιστικό αποκλεισμού. Μετά από εκτεταμένη πλύση, οι πλάκες αναπτύχθηκαν με ΤΜΒ διάλυμα /E (Chemicon, Millipore, USA), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Για δοκιμασίες ανταγωνισμού πεπτιδίου αντίσωμα, υπεράνοσων ορών και μέσο ανάπτυξης υβριδώματος επωάστηκαν με 1 μg /καλά πεπτίδια σε 96-φρεατίων πλάκες ELISA (F96 Maxisorp, Nunc, Δανία) ενεργοποιήθηκε με γλουταραλδεΰδη. Το υπόλοιπο του ποσοτικού προσδιορισμού έγινε όπως περιγράφεται παραπάνω. Μια μείωση τουλάχιστον 50% στην OD θεωρήθηκε θετικό αποτέλεσμα.

κυτταρομετρίας ροής και IMAGESTREAM

Για να επιβεβαιώσετε επιφάνεια χρώσης του MUC 1 σε κυτταρικές σειρές όγκων και συν-έκφραση των δεικτών ΜΜ και MUC1 επί ΒΜ αναρροφήσεις, τα κύτταρα πλύθηκαν και επωάστηκαν για 30 λεπτά σε ρυθμιστικό διάλυμα χρώσης, που αποτελείται από PBS, συμπληρωμένο με 3% FBS, 10% ανθρώπινο ορό ΑΒ και 0,1% αζίδιο του νατρίου. BM «μεγάλα κύτταρα» αρχικά περιφραγμένη από την πλευρά έναντι πρόσθιας σκέδασης. Στη συνέχεια, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με ένα ή περισσότερα από τα ακόλουθα: αντι-ανθρώπινο CD138-APC εμπορικώς συζευγμένο Abs (IQ Products, Ολλανδία), αντι-ανθρώπινη κάππα ελαφριάς αλυσίδας-eFluor 450 και αντι-ανθρώπινης λάμδα ελαφριάς αλυσίδας-ΡΕ (eBioscience, USA) και /ή in-house-παρασκευάζονται FITC- ή ΡΕ-συζευγμένο αντι-ανθρώπινο MUC1 (αντι-MUC1-TRA H23), αντι-MUC1 SP R23IgG, SPmAb-6 και SPmAb-2,1 αντισώματα. FITC και ΡΕ σύζευξη πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (σύνδεσμος φωτισμού R-φυκοερυθρίνη Σύζευξη Kit, Innova Biosciences, USA). Τα επισημασμένα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές, σταθεροποιήθηκαν σε BD CellFIX (Becton Dickenson, USA), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή, και αποθηκεύεται στους 4 ° C μέχρι την ανάλυση. Τουλάχιστον 1 × 10

6, και 3 × 10

4 γεγονότα αποκτήθηκαν για κυτταρομετρία ροής και ροή εικόνας, αντίστοιχα. Για IMAGESTREAM ανάλυση, πυρήνες κυττάρων χρωματίστηκαν με διάλυμα χρώσης Hoechst (3030145), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (ΜΡ Biomedicals, CA, USA). Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής πραγματοποιήθηκε με τη LSR II (Becton Dickenson Immunocytometry Systems, USA) και τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό FlowJo (TreeStar, USA). ανάλυση colocalization έγινε με το IMAGESTREAM σύστημα (ImageStreamX κυτταρόμετρο ροής? Amnis Corp) και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας τις ιδέες ομοιότητα Bright χαρακτηριστικό Λεπτομέρεια (IDEAL 6.0? Amnis Corp). Το σκορ ομοιότητας είναι ένα μέτρο του βαθμού στον οποίο δύο εικόνες έχουν γραμμική σχέση.

μικροσκοπία ανοσοφθορισμού

προσκολλημένα κύτταρα (5 χ 104 κύτταρα /φρεάτιο) απλώθηκαν σε γυάλινες καλυπτρίδες (Marlenfeld GmbH & amp ? Co), σε 24-φρεατίων, επί 18 ώρες 37 ° C. Γυάλινες καλυπτρίδες πλύθηκαν δύο φορές με ψυχρό (4 ° C) PBS, μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη (20 λεπτά, θερμοκρασία δωματίου), μπλοκάρει και διαπερατά με PBS, συμπληρωμένο με 3% BSA και 0.1% Triton (1 h, θερμοκρασία δωματίου). Στη συνέχεια, τα κύτταρα χρωματίστηκαν (1 ώρα, θερμοκρασία δωματίου) με αντισώματα αραιώνεται στα 20 μg /ml σε διάλυμα χρώσης (1% BSA, 0.1% Triton σε PBS), και στη συνέχεια με δευτερογενές αντίσωμα, αραιωμένο 1:200, σε διάλυμα χρώσης συμπληρωμένου με DAPI (30 λεπτά, θερμοκρασία δωματίου). Διαφάνειες τοποθετήθηκαν με φθορισμού Τοποθέτηση μέσου (Χρυσή Γέφυρα Life Science, USA). Κύτταρα αναπτύχθηκαν σε εναιώρημα βάφτηκαν με πρωτογενή και δευτερογενή αντισώματα και στη συνέχεια σταθεροποιείται και επιστρώθηκαν σε γυάλινες καλυπτρίδες. Τα κύτταρα παρατηρήθηκαν με Zeiss 100 ×, NA 1.4, Yokogawa CSU-22, ή Zeiss πλήρως αυτοματοποιημένη ανεστραμμένο 200 Μ μικροσκόπιο, με στερεάς κατάστασης λέιζερ 473, 561 και 660 nm? πιεζοηλεκτρική ελεγχόμενη Z-στάδιο, όλα κάτω από την εντολή του Slidebook ™. Οι εικόνες ελήφθησαν με μια φωτογραφική μηχανή Evolve EMCCD (Φωτομετρικά? 100 × φακό, 1 × 1 binning, μέγεθος pixel: 0,16 microns).

CDC

Διάφορα γραμμές όγκου και HMEC (κύτταρα στόχοι) ( 1 × 10

6 κύτταρα /ml) επισημάνθηκαν με 2 uCi /ml 3 [Η] -θυμιδίνη (Amersham, UK), για 18 ώρες στους 37 ° C. Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές με PBS και επωάστηκαν (2 ώρες, θερμοκρασία δωματίου) με 100, 50 ή 10 μg /ml Η23, R23IgG, SPmAb-6 ή SPmAb-2,1 αντισώματα. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν με PBS, και 1 × 10

4 κύτταρα επωάστηκαν (5 ώρες, 37 ° C) σε 4 ml σωλήνες με 20 ul, 10 ul ή 5 ul ανθρώπινο συμπλήρωμα ορού (Sigma, Ισραήλ). Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν τρεις φορές με PBS, επαναιωρήθηκαν σε 300 μΐ PBS και εμβολιάζονται σε 100 μΙ καλά τριπλούν /, σε πλάκες 96-φρεατίων (Griner, De Groot, Germany). συγκομιδή των κυττάρων εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας Unifilter πλακών 96 φρεατίων (PerkinElmer, USA). Η ραδιενέργεια προσδιορίζεται σε ένα βήτα-μετρητή (PerkinElmer, IL, USA). Για αυθόρμητη λύση, τα κύτταρα επωάστηκαν κάτω από τις ίδιες συνθήκες, αλλά χωρίς προσθήκη συμπληρώματος. Για ολική λύση, το 10% Triton Χ100 προστέθηκε στα επισημασμένα κύτταρα. Το ποσοστό της ειδικής λύσης υπολογίστηκε ως εξής: α. (CPM σε πειραματικά καλά – CPM στην αυθόρμητη δείγματος) /(CPM σε συνολικό δείγμα – CPM αυθόρμητο δείγμα) × 100

Στατιστική Ανάλυση

Στατιστική σημαντικότητα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας έλεγχος τ. Σε όλες τις δοκιμές, το ελάχιστο επίπεδο σημαντικότητας για 2-tailed test ορίστηκε στο p & lt?. 0.01

Αποτελέσματα

Δημιουργία MUC1 SP-ειδικά αντισώματα

Για την προώθηση εξερεύνηση της φύσης, την ειδικότητα και τη θέση του αντιγόνου που οδηγούν στη δημιουργία αυτοαντισωμάτων σε MUC1-SP-L, η ΚΕΗ-συζευγμένου 17-μερές MUC1-SP-M πεπτιδίου (Πίνακας 1) χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία πολυκλωνικών και mAbs. MUC1-SP-M επιλέχθηκε με βάση ένα in silico πρόβλεψη για υψηλής πυκνότητας MHC Τάξης II και επιτόπων Β-κυττάρων και στη σημαντική συγκέντρωση των αυτοαντισωμάτων έναντι αυτού του πεπτιδίου, που βρέθηκαν στους ορούς των ασθενών MM [34]. Αντι-MUC1-SP-M πολύκλωνα αντισώματα (θετικοί οροί τίτλος στο ≤1:25,000) ελήφθησαν σε ποντίκια (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται) και σε δύο ανοσοποιημένα κουνέλια R23 και R32 (θετικός σε τίτλο ≤1:12,800) (Πίνακας 1 και Εικ . 1Α αριστερό πάνελ). Το αντι-MUC1 χυμική απόκριση καταδεικνύεται περιορισμένη διασταυρούμενη αντιδραστικότητα (τίτλοι & lt? 1:800 αραιώσεις) τόσο ευκαρυωτικό (BAGE-SP-L, Πίνακας 1 και το Σχήμα 1Α μεσαίο πλαίσιο.) Και προκαρυώτη (TB-Rv0476 /4941-SP- L, Πίνακας 1 και Εικ. 1Α δεξί πάνελ) ΚΕΕ. Οι MUC1-SP-M εσωτερικά επιτόπια που αναγνωρίζονται από τα περισσότερα R23 ήταν MUC1-SP-S1 και MUC1-SP-S2 (Πίνακας 1, Σχ. 1 Β), και οι δύο βρίσκονται στο MUC1 SP C-τελικό άκρο. δοκιμασίες ανταγωνισμού αξιολόγηση της ειδικότητας των πολυκλωνικών αντισωμάτων αποδεικνύεται & gt? 50% αναστολή τόσο R23- και R32-αντισωμάτων με MUC1-SP-M και το εσωτερικό επίτοπο MUC1-SP-S2 (Εικόνα 1C).. Αναστολή & lt? 10% επιτεύχθηκε με άλλα επιτόπια MUC1 SP, ιδίως MUC1-SP-S4 και MUC1-TRA-L, καθώς και από το BAGE SP τομέα BAGE-SP-L. Με βάση αυτά τα αποτελέσματα, η ελάχιστο επίτοπο του R23 και R32 βρίσκεται εντός των MUC1-SP-S1 και MUC1-SP-S2 αλληλουχίες, δηλαδή, τα αμινοξέα 12-21.

Η εξειδίκευση και ορίζεται ελάχιστο επίτοπο του το παραγόμενο αντι-MUC 1 SP πολυκλωνικά αντισώματα (Α-ο) και mAbs SPmAb-2.1 και SPmAb-6 (D-Ε) εκτιμήθηκαν έναντι του πεπτιδίου ανοσοποίησης MUC1-SP-M και εσωτερική επιτόπων της MUC1-SP-S1 έως S5, σε προσδιορισμούς ELISA. TRA επιτόπιο MUC1, το MUC1-TRA-L, και το μη-MUC1 SP τομέα BAGE-SP-L, χρησιμοποιήθηκαν σε αυτές τις δοκιμασίες ως αρνητικοί έλεγχοι.

Η

Μετά την κατάρτιση των MUC1-SP -Μ ανοσογονικότητα σε κουνέλια, επιλέξαμε να δημιουργήσει mAb σε ποντίκια. Οροί συλλέχθηκαν από MUC1-SP-M-ανοσοποιημένους ποντίκι Νο 1 (Μ1) δεσμεύεται σθεναρά την ανοσοποιητικό πεπτίδιο, MUC1-SP-Μ (& gt? 1:12,800 τίτλος) (Εικ 1D.), Σε μέτριο βαθμό MUC1-SP-S1, MUC1-SP-S2 και MUC1-SP-S3 (& gt? 1:1800-3600 τίτλοι) και ασθενώς δεσμευμένο MUC1-SP-S4 και MUC1-SP-S5 (& gt? 1:800 τίτλος). Οι οροί απέτυχαν να δεσμεύσει MUC1-TRA-L. Δεσμευτική πειράματα με ορούς από ποντίκι Νο 2 παρουσίασαν τον υψηλότερο τίτλοι (& gt? 1:1600) σε πεπτίδια MUC1-SP-S4 και MUC1-SP-S5 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Οι προσπάθειες κλωνοποίησης έδωσε δύο mAbs, ένα με ένα ισότυπο Ig-Gamma1, που ορίζεται SPmAb-2,1, και η δεύτερη με ένα ισότυπο Ig-gamma2a, που ορίζεται SPmAb-6. mAb ειδικότητα ελέγχθηκε με σύνδεση και δοκιμασίες ανταγωνισμού (Εικ. 1 Ε) με διάφορα ελεύθερα πεπτίδια (Πίνακας 1). MUC1-SP-S2 πιο ισχυρά ανέστειλε SPmAb-2.1, ενώ η πρόσδεση MUC1-SP-S4 πιο αποτελεσματικά ανέστειλε SPmAb-6, τόσο για τον καθορισμό των ελάχιστες επιτόπια των αντίστοιχων αντισωμάτων.

Anti-MUC1 SP αντισώματα συνδέονται με MUC1 -θετικό κύτταρα όγκου

Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής απέδειξε μέτρια-υψηλή SPmAb-2,1, SPmAb-6 και δεσμευτική R23IgG να MUC1 εκφράζουν στερεών και αιματολογικών όγκων (Πίνακας 2). Το αντι-MUC1 TRA mAb Η23 [35], η οποία χρησίμευσε ως θετικός έλεγχος MUC1, έδειξε αντιδραστικότητα αδιαμφισβήτητη, με δεσμευτική ισχύ παρόμοια με εκείνη των αντισωμάτων R23IgG. Σε αντίθεση, MUC1-αρνητικά μελανώματος κυτταρικές σειρές, SK-MEL-28 και SK-MEL-1, και ο MUC1-αρνητικών ωοθηκών κυτταρική γραμμή, ES-2, επανειλημμένα αποτύχει να αντιδράσει (χαμηλή γεωμετρικός μέσος) με όλες τις δοκιμασμένες αντισώματα (Πίνακας 2), καταδεικνύοντας εκλεκτικότητα αντίσωμα σε MUC1 SP. Περαιτέρω υποστήριξη του κύτταρο- όγκου και MUC1 SP-ειδικότητα των αντισωμάτων, παρεσχέθη από την απουσία δέσμευσης του SPmAb-2,1, SPmAb-6 mAbs και αντισώματα R23IgG στα ανθρώπινα λευκά αιμοσφαίρια, και ειδικότερα, να CD3

+ T β-κύτταρα, CD20

+ Β-κύτταρα και CD14

+ μυελοειδή κύτταρα, όπως επίσης και σε παρθένα φυσιολογικά ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα μαστού (HMEC) (Πίνακας 2).

η

Anti-MUC1 SP αντισώματα Localize στις μεμβράνες του MUC1-θετικών Κυττάρων όγκου

Ο εντοπισμός του αντιγόνου που αναγνωρίζεται από τα διαφορετικά αντισώματα MUC1 SP προσδιορίστηκε μέσω ανάλυσης IMAGESTREAM. παρουσία MUC1 SP παρατηρήθηκε, με χρήση ΡΕ-συζευγμένο SPmAb-2,1, SPmAb-6 mAb και APC-συζευγμένη H23 MUC1 TRA mAb, στην κυτταρική επιφάνεια του MUC1-θετικού κυττάρου ωοθήκης γραμμή OVCAR-3, ενώ δεν παρατηρήθηκε έκφραση στο MUC 1 -αρνητική κυτταρική γραμμή ωοθηκών ES-2 (Σχ. 2Α). Οι συγχωνευμένες εικόνες των 30.000 κυττάρων δείχνουν ότι MUC1 SP και MUC1 TRA εντοπίζονται κυρίως μόνος επί της μεμβράνης των κυττάρων. MUC1 SP παρατηρήθηκε ως ανεξάρτητη μεμβρανικού τομέα, όπως αποδεικνύεται από μία μόνο ΡΕ

φωτεινό μεμβρανικού χρώση, σε 47% και 56% των αναλυθέντων κυττάρων, κατά την κατεργασία με SPmAb-6 και SPmAb-2.1, αντιστοίχως. Συνεντόπισης των μορίων MUC1 SP και MUC1 TRA, αποδεικνύεται από ένα διπλό ΡΕ

φωτεινό /APC

φωτεινό μεμβρανικού χρώση, ήταν ελάχιστη, και παρατηρήθηκε σε 18% και 27% των κυττάρων που εκτίθενται σε SPmAb-6 και SPmAb- 2.1, αντίστοιχα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Μια υψηλή ομοιότητα μεταξύ MUC1 SP και χρώση MUC1 TRA (συντελεστές ομοιότητας & gt? 1,0) παρατηρήθηκε (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα), υποδεικνύοντας συνεντόπισης αυτών των μορίων σε πολύ λίγες επιλεγμένα κύτταρα. Πρόσθετες επιβεβαίωση της MUC1-ειδικότητα αυτών των αντισωμάτων ελήφθη με ειδική σύνδεση του αντι-MUC 1 SP mAb SPmAb-2.1 και το MUC 1 TRA mAb Η23 να ES 2-κύτταρα των ωοθηκών MUC1-αρνητικό μόνο μετά από διαμόλυνση τους με την έκφραση MUC 1-ΤΜ κατασκεύασμα (Σχήμα 2Β).

Η παρουσία κυτταρικής επιφανείας και της ομοιότητας ανάλυση του τομέα MUC1 SP και MUC1 TRA αξιολογήθηκε επί OVACAR-3 MUC1-θετικά και ES-2 MUC1-αρνητικές κυτταρικές γραμμές όγκου με IMAGESTREAM ανάλυση χρησιμοποιώντας ΡΕ- και APC-tagged αντι-MUC1 SP mAbs SPmAb-2,1, SPmAb-6, και αντι-MUC1 TRA H23 mAb (Α). ανάλυση μικροσκοπία φθορισμού πραγματοποιήθηκε επίσης για ES-2 κύτταρα ωοθηκών MUC1-επιμολυσμένα εναντίον των μητρικών MUC1-αρνητικά κύτταρα (Β). BF στάση για φωτεινό οπτικό πεδίο και δευτεροβάθμιας στάση για αντισώματα IgG αντι-ποντικού.

Η

Anti-MUC1 SP αντισώματα δεσμεύουν MUC1 κυττάρων που εκφράζουν MM πλάσματος σε φρέσκο ​​Μυελού των Οστών αναρροφήματα

Φρέσκο ​​λαμβάνονται οστών μυελού (BM) αναρροφήσεις των τεσσάρων ασθενών ΜΜ χρησιμοποιήθηκαν για να διερευνήσει κατά πόσον R23IgG αντισώματα δεσμεύουν επιλεκτικά πρωτογενή κύτταρα όγκου σε ένα ex-vivo, ετερογενή ρύθμιση. Υποψία κύτταρα του πλάσματος (PC) έχουν περίφραξη (Εικ. 3 στήλη Α) και ο φαινότυπος τους επαληθεύθηκε με χρώση για κάππα ελαφρές αλυσίδες και λάμδα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Η περίφραξη πληθυσμός επόμενο αναλύθηκαν για έκφραση του MUC 1 TRA (Εικ. 3 στήλη C) και MUC1 SP (στήλη Εικ. 3 Ε) επί CD138-θετικά κύτταρα. αντισώματα ελέγχου ειδών αντιστοίχιση για χρώση MUC1 χρησιμοποιήθηκαν για κάθε πείραμα (Εικ. 3 στήλες Β και D). Το CD138-θετικά PC του ΒΜ αναρρόφησης των ασθενών ΜΜ # 1, # 2 και # 3 δεσμεύεται R23IgG (78,2%, 66,3%, 95,9%, αντίστοιχα, του αναλυόμενου κυτταρικού πληθυσμού) και Η23 (78,3%, 59,2%, 93,2% , αντίστοιχα, του αναλυόμενου κυτταρικού πληθυσμού) (Σχ. 3 στήλες C και Ε). Σε αντίθεση, η τέταρτη αναρρόφησης (Ρ # 4) έδειξε χαμηλή αντιδραστικότητα τόσο Η23 και R23IgG (0,37% και 0,45%, αντίστοιχα, του ανέλυσε πληθυσμού), παρά μέτρια έκφραση CD138 (74.9% και 39.9% των κυττάρων, αντίστοιχα) σε αυτή την αναρρόφηση. Ως μάρτυρας, τρέξαμε μια παρόμοια ανάλυση κυτταρομετρίας ροής σε αναρρόφηση BM προέρχεται από μια αφελή, υγιή δότη. Τα κύτταρα σε αυτή την ανάλυση ήταν περιφραγμένη για κάπα και λάμδα έκφρασης, καθώς η έκφραση CD138 ήταν αρνητική (Εικ. 3 στήλες F). Τα αποτελέσματα (Σχ. 3 στήλες G και Η) επιβεβαίωσε ελάχιστη σύνδεση του ~ 1% τόσο για MUC1-TRA και MUC1 SP στις δύο κάπα και λάμδα αλυσίδες. Συνοπτικά, αυτά τα ευρήματα καταδεικνύουν ότι R23IgG και H23 αναγνωρίζουν ειδικά κακοήθη PC, καθιστώντας MUC1 SP ένα αντιγόνο κατάλληλο για την επιλογή της θεραπείας και την παρακολούθηση.

Η επιφάνεια των κυττάρων παρουσία του πεδίου MUC 1 SP αξιολογήθηκε με ανάλυση FACS με περίφραξη επί PC κύτταρα σε φρέσκο ​​αναρροφήσεις ΒΜ που λαμβάνονται από ασθενείς MM (Α-Ε) και η κανονική αφελείς δείγμα (F-Η). Πολυκλωνικά αντι-MUC 1 SP (R23IgG) χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η έκφραση MUC1 SP? έκφραση τομέα MUC1 TRA προσδιορίστηκε με H23 mAb. Για κάθε πείραμα, χρησιμοποιήθηκαν είδη αντιστοίχιση αντισώματα ελέγχου για χρώση MUC1: είτε φυσιολογικού ποντικού IgG-FITC (Β), ή κανονική IgG κουνελιού-ΡΙΤΟ (D). Anti-MUC1 SP mAb (SPmAb-2.1) χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η έκφραση MUC1 SP? έκφραση τομέα MUC1 TRA προσδιορίστηκε με H23 mAb.

Η

φιλοφρόνηση κυτταροτοξικότητα εξαρτώμενη από διαμεσολαβείται από Anti-MUC1 SP Αντισώματα

Η μεταφρασιμότητα αντιγόνου και του όγκου ιδιαιτερότητες των αντι-MUC1 SP αντισωμάτων σε λειτουργικές ανοσοθεραπευτικό δυναμικό επιδείχθηκε από την αποτελεσματική λύση κυττάρων MUC1 εκφράζουν με R23IgG (Σχ. 4Α), SPmAb-2.1 και SPmAb-6 (Σχ. 4Β), υποδεικνύοντας το δυναμικό τους ως τελεστές κατά του όγκου. R23IgG αντισώματα διαμεσολαβείται 60-100% λύση του στερεού κυττάρων των ωοθηκών OVACAR-3, και αιματολογικών, U266, RPMI 8226, ΜΜ, ARH-77 και κύτταρα όγκου Ramos λευχαιμίας. Κατά παρόμοιο τρόπο, SPmAb-2.1 και SPmAb-6 προκάλεσε υψηλά ειδική λύση των & gt? 90% και 60-80%, αντίστοιχα, από τις ίδιες κυτταρικές γραμμές. Σε σύγκριση, Η23 προκαλούμενη λύση 80-90% των εξετασθέντων κυτταρικών πληθυσμών (Εικ. 4Β). Λύση που προκαλείται από όλους τους αντι-MUC 1 αντισωμάτων ήταν πολύ σημαντική (ρ & lt? 0.001 σε t-test του Student) σε MUC1-κυτταρικές σειρές που εκφράζουν όγκου, σε σύγκριση με την κυτταρική γραμμή ωοθηκών ES-2, η κυτταρική σειρά μελανώματος SK-MEL-1 και NHEC, τρία MUC1-αρνητικές κυτταρικές γραμμές. Σε γενικές γραμμές, CDC αποτελεσματικότητα λύσεως συσχετίζεται έντονα με τα επίπεδα έκφρασης επιφανείας κυττάρου MUC 1, αξιολογήθηκε με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής (Πίνακας 2), με την εξαίρεση των SPmAb-6 mAb, η οποία κατέδειξε υψηλή κυτταρική επιφάνεια παρουσία αλλά μέτρια CDC.

Η κυτταροτοξικές ιδιότητες του αντι-MUC 1 SP πολυκλωνικό R23IgG (Α) και μονοκλωνικό SPmAb-2,1, SPmAb-6 mAb (Β) αξιολογήθηκαν με ανάλυση CDC χρησιμοποιώντας διάφορες στερεό, μη-στερεό, MUC1-θετικά και -αρνητικοί όγκους και HMEC. Η MUC1 TRA συγκεκριμένους τομείς mAb Η23, NMS και NRS και δεν (/O W) αντισώματα αξιολογήθηκαν ως μάρτυρες.

Η

Συζήτηση

Παρά την εκτεταμένη έρευνα σχετικά με την ανοσοθεραπευτική δυναμικό της MUC1 , δεν υπάρχει ακόμα καμία άδεια προϊόντος έναντι αυτού του στόχου. Η αποτυχία για την απομόνωση των κυττάρων-δεσμευμένο, αδιάλυτο επιτόπια MUC1 έχει παρεμποδίσει την ανάπτυξη μιας αποτελεσματικής ανοσοθεραπευτικό παράγοντα MUC1 σχετίζονται. Σημαντική πρόοδος έγινε από Rubinstein και οι συνεργάτες του [37] και, πιο πρόσφατα, από Pichinuk και οι συνεργάτες του [24], οι οποίοι παρήγαγαν αντισώματα κατά της άλφα /βήτα διασταύρωση των κυτταρικών MUC1s. Αυτά τα αντισώματα παρουσίασαν εξαιρετικά επιλεκτική δεσμευτικός MUC1 και επαγόμενη κυτταροτοξικότητα του MUC1-θετικών όγκων, όταν συνδέεται με μια τοξίνη [24]. Με βάση τις προηγούμενες παρατηρήσεις μας με φυσικό τρόπο δημιουργούνται αυτοαντισώματα αντι-MUC1 SP σε ασθενείς MM, αλλά όχι σε αφελείς υγιείς δότες, [34], η παρούσα μελέτη υιοθέτησε μια διαφορετική στρατηγική για να στοχεύσετε το αδιάλυτο τομέα MUC1 SP. Οι R23IgG, SPmAb-2.1 και SPmAb-6 αντισώματα θέσαμε, ειδικά δεσμεύεται MUC1 SP, χωρίς να δεσμεύουν άσχετα ΠΙ (Εικ. 1Α) και MUC1-TRA επιτόπια (Εικ. 1Β-Ε). Οι ελάχιστες επίτοποι που αναγνωρίζονται από αυτά τα αντισώματα που βρίσκονται στην καρβοξυ-τερματικό του MUC1 SP (Σχ. 1C και 1 Ε).

Προηγούμενες παρατηρήσεις δείχνουν ότι οι τομείς SP θα μπορούσε δυνητικά να κατευθύνουν πρωτεΐνες είτε στην κυτταρική μεμβράνη ή το εξωκυτταρικό διαμέρισμα [33]. Διασπασμένο domains SP, όπως στην περίπτωση των αναστολέων πρωτεάσης, όπως αναστολέα-2 ενεργοποιητή πλασμινογόνου [38], ή όρνιθας ομόλογο του, ωολευκωματίνη [39], να καθοδηγεί την πρωτεΐνη στην ER και αποτυγχάνει να υποστηρίξει σύνδεσης μεμβράνης, αποδίδοντας έκκριση του άθικτη πρωτεΐνη. Στην περίπτωση του ιού της λεμφοκυτταρικής χοριομηνιγγίτιδας (LCMV) πρόδρομο γλυκοπρωτεΐνης C, η εισαγωγή της πρωτεΐνης εντός της μεμβράνης ER διαμεσολαβείται από μια ασυνήθιστη 58 αμινοξέων μήκους SP φέρει μια εκτεταμένη Ν-τερματική περιοχή. Αν και η SP αποσχίζεται από Spase, παραμένει μη ομοιοπολικά συνδέονται με το γλυκοπρωτεΐνη χωρίς να υποβάλλονται σε επεξεργασία από SPP.