Αφηρημένο

Τα εικοσανοειδή είναι βιοδραστικών μεσολαβητών λιπιδίων που προέρχονται από το αραχιδονικό οξύ

1 (AA), η οποία απελευθερώνεται από κυτοσολικής φωσφολιπάσης Α

2 (cPLA

2). ΑΑ μεταβολίζεται μέσω τριών κυρίων οδών, κυκλοοξυγενάσης (COX), λιποξυγενάσης (LO) και κυτόχρωμα Ρ450, για να παραχθεί μία οικογένεια εικοσανοειδών, τα οποία έχουν ξεχωριστά έχει αποδειχθεί ότι έχουν προ- ή αντι-ογκογόνο δραστηριότητες στον καρκίνο. Ωστόσο, η εξέλιξη του καρκίνου εξαρτάται πιθανόν σε πολύπλοκες αλλαγές σε πολλαπλές εικοσανοειδή που παράγονται από τα καρκινικά κύτταρα και με μικροπεριβάλλον του όγκου και συστηματική εξέταση του φάσματος των εικοσανοειδών στον καρκίνο δεν έχει πραγματοποιηθεί. Χρησιμοποιήσαμε υγρής χρωματογραφίας σε συνδυασμό με διαδοχική φασματομετρία μάζας (LC /MS /MS), για να ποσοτικοποιηθεί εικοσανοειδών που παράγονται κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του όγκου του πνεύμονα σε ένα ορθοτοπικό μοντέλο ανοσοεπαρκείς ποντικού καρκίνου του πνεύμονα, στην οποία το καρκίνωμα πνεύμονος Lewis Κύτταρα (LLC) με ένεση μέσα στους πνεύμονες του συγγενή ποντίκια . Η παρουσία του όγκου αυξήθηκε προϊόντων τόσο της κυκλοοξυγενάσης και της λιποξυγενάσης οδούς σε ένα χρονο-εξαρτώμενο τρόπο. Συγκρίνοντας όγκοι αναπτύχθηκαν σε cPLA

2 knockout vs ποντικών άγριου τύπου, αποδείξαμε ότι οι προσταγλανδίνες (PGE

2, PGD

2 και PGF

2 α) παρήχθησαν από αμφότερα τα καρκινικά κύτταρα και το μικροπεριβάλλον του όγκου ( TME), αλλά λευκοτριενίων (LTB

4, LTC

4, LTD

4, LTE

4) της παραγωγής που απαιτείται cPLA

2 έκφραση στο ΤΜΕ. Χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής, ανακτήσαμε τα ουδετερόφιλα που σχετίζονται με όγκους και 2 τύποι μακροφάγων που σχετίζονται με όγκους από τους πνεύμονες που φέρουν όγκο και ορίσαμε διακριτή εικοσανοειδών προφίλ τους με LC /MS /MS. Ο συνδυασμός της κυτταρομετρίας ροής και LC /MS /MS ξετυλίγεται την πολυπλοκότητα της παραγωγής εικοσανοειδών στον καρκίνο του πνεύμονα και παρέχει μια λογική για την ανάπτυξη θεραπευτικών στρατηγικών που στοχεύουν επιλέξτε κυτταρικών πληθυσμών να αναστέλλουν συγκεκριμένες τάξεις των εικοσανοειδών

Παράθεση:. Poczobutt JM , Gijon Μ, Amin J, Hanson D, Li H, Walker D, et al. (2013) εικοσανοειδών Profiling σε ένα ορθοτοπικό μοντέλο του Καρκίνου του Πνεύμονα Εξέλιξη από Φασματομετρίας Μάζας Επιδεικνύει Επιλεκτική παραγωγή λευκοτριενίων από φλεγμονώδη κύτταρα του μικροπεριβάλλοντος. PLoS ONE 8 (11): e79633. doi: 10.1371 /journal.pone.0079633

Επιμέλεια: Αντώνης Peter Sampson, του Πανεπιστημίου του Southampton της Ιατρικής Σχολής, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 20 Αυγούστου, 2013? Αποδεκτές: 4 Οκτώβρη του 2013? Δημοσιεύθηκε: 11 Νοεμβρίου 2013

Copyright: © 2013 Poczobutt et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Χρηματοδότηση ήταν που παρέχονται από ΝΙΗ R01 CA162226 R01 CA108610 P50 CA058187. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Τα εικοσανοειδή αντιπροσωπεύουν μια οικογένεια βιοδραστικών λιπιδίων που παράγεται μέσω του μεταβολισμού του αραχιδονικού οξέος. Το αραχιδονικό οξύ (ΑΑ) είναι ένα πολυακόρεστο λιπαρό οξύ, το οποίο ενσωματώνεται στη θέση sn-2 των φωσφολιπιδίων της μεμβράνης. Η οικογένεια του PLA

2 ένζυμα υδρολύουν φωσφολιπίδια μεμβράνης για την παραγωγή ελεύθερων λιπαρών οξέων και λυσοφωσφολιπίδια. Ενώ πολλαπλές μορφές PLA

έχουν ταυτοποιηθεί 2, κυτοσολική ΡΙΑ

2-α, που ορίζονται σε αυτή τη μελέτη ως cPLA

2, είναι ειδικό για φωσφολιπίδια αραχιδονοϋλ περιέχουν, και είναι το κύριο ένζυμο που εμπλέκεται σε ρυθμιζόμενη απελευθέρωση ΑΑ σε απόκριση προς την μιτογόνο ή φλεγμονώδη ερεθίσματα [1]. Δωρεάν AA μπορεί να μεταβολίζεται μέσω τριών μεγάλων οδών [2]. Οι κυκλοοξυγενάσες (COX-1, 2) παράγουν προσταγλανδίνες, συμπεριλαμβανομένων PGE

2 και PGI

2, καθώς και οι θρομβοξάνες, λιποξυγενάσες παράγουν υδροξυεικοσατετρανοϊκού οξέα (ΗΕΤΕ) και τα λευκοτριένια, και εποξυγενάσες κυτόχρωμα Ρ450 παράγουν εποξυγονωμένο λιπαρά οξέα (EETs). Πάνω από 100 διακριτές εικοσανοειδών είδη έχουν αναγνωριστεί [3]. Η πλειονότητα αυτών των μορίων εκκρίνονται από τα κύτταρα και δρουν με αυτοκρινή ή παρακρινή τρόπο μέσω μιας οικογένειας G-πρωτεΐνη υποδοχείς [4]. Το ρεπερτόριο των εικοσανοειδών που παράγονται από ένα συγκεκριμένο τύπο κυττάρου, θα διέπεται από την έκφραση των ενζύμων στην οδό, συμπεριλαμβανομένων ειδικών κατάντη συνθάσες. Για παράδειγμα, PGE

2 παραγωγή θα ρυθμίζεται από την έκφραση των ενζύμων κυκλοοξυγενάσης καθώς επίσης και προσταγλανδίνη συνθάσες Ε2, ενώ οι ειδικές λευκοτριένια, όπως LTC

4 απαιτούν έκφραση του 5-λιποξυγενάσης, καθώς επίσης και LTC

4 συνθάσης.

ο καρκίνος του πνεύμονα σχετίζεται με το μεγαλύτερο αριθμό των θανάτων από καρκίνο σε άνδρες και γυναίκες, υπογραμμίζοντας την ανάγκη για νέες θεραπευτικές και προληπτικές προσεγγίσεις [5]. Μελέτες σε μία ποικιλία καρκίνων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του πνεύμονα, έχουν εμπλέξει άτομο εικοσανοειδών ως μεσολαβητές για την έναρξη του καρκίνου, της εξέλιξης και μετάστασης. Πιο εκτεταμένα μελετηθεί είναι οι προσταγλανδίνες, ειδικά PGE

2. Μελέτες σε κυτταρικές σειρές καρκίνου έχουν δείξει αυξημένη παραγωγή της PGE

2 προκαλείται μέσω επαγωγής της COX-2 και cPLA

2 έκφραση [6] – [8]. Η αναστολή της παραγωγής προσταγλανδινών μέσω αποκλεισμού είτε cPLA

2 ή COX-2 αναστέλλει μετασχηματισμένα ανάπτυξη του μη-μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα κυττάρων (NSCLC), και την ανάπτυξη των όγκων σε ποντίκια σε ανταπόκριση προς χημικά καρκινογόνα [9]. Αποδείξαμε ότι τα ποντίκια που έχουν έλλειψη cPLA

2 (cPLA

2-KO) δείχνουν την αναστολή της έναρξης του όγκου πνεύμονα χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο χημικά καρκινογένεσης [10]. Σε αντίθεση, PGI

2, το οποίο επίσης παράγεται προς τα κάτω από τα ένζυμα COX, έχει αποδειχθεί ότι αναστέλλει την έναρξη του καρκίνου του πνεύμονα, καθώς επίσης και έχοντας αντι-μεταστατικό επιδράσεις [11]. Αυξημένη έκφραση της 5- και 12-λιποξυγενάσης έχει επίσης συσχετισθεί με όγκους, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του πνεύμονα [12]. Σε αντίθεση, η έκφραση του 15-λιποξυγενάσης-2 φαίνεται να χάνεται στον καρκίνο του πνεύμονα, και μπορεί να παίζει ένα αντι-ογκογόνο ρόλο [13]. προϊόντα λιποξυγενάσης έχουν άμεσες επιπτώσεις στα κύτταρα του όγκου, αλλά είναι επίσης ρυθμιστές της αγγειογένεσης και μπορεί να τροποποιήσει τη λειτουργία του ανοσοποιητικού [12]. Πρόσφατα epoxyeicosatrienoic οξέα (EETs) που παράγεται μέσω της οδού κυτοχρώματος Ρ450 έχουν ενοχοποιηθεί ως ρυθμιστές της μετάστασης, ενεργώντας τουλάχιστον εν μέρει μέσω ενδοθηλιακά-ειδικές επιδράσεις σε απομακρυσμένα όργανα [14]. Ενώ οι συνδυασμοί των αναστολέων της COX και λιποξυγενάσης έχουν χρησιμοποιηθεί ως θεραπευτικοί παράγοντες και έχουν επιδείξει ευεργετικά αποτελέσματα σε NSCLC [15], δεν έχουν εξεταστεί συνέπειες για μετάσταση. Εκτός από τις μελέτες επικεντρώθηκαν σε καρκινικά κύτταρα, αρκετές αναφορές έχουν ενοχοποιήσει εικοσανοειδών, ειδικά PGE

2, ως ρυθμιστές της μικροπεριβάλλον του όγκου (TME) [16], [17]. PGE

2 σηματοδότηση μέσω ΕΡ3 υποδοχείς /ΕΡ4 οδηγεί σε πρόσληψη του καρκίνου που σχετίζονται ινοβλάστες [18]. PGE

2 έχει επίσης δειχθεί ότι είναι κρίσιμη για την προώθηση του σχηματισμού των Τ-λεμφοκυττάρων ρυθμιστικών [19]. Έτσι, η εξέλιξη του καρκίνου είναι πιθανό να περιλαμβάνει σύνθετες αλλαγές σε πολλαπλές εικοσανοειδών με δυνητικά αντίθετες βιολογικές επιδράσεις. Αμφότερα τα καρκινικά κύτταρα και τα κύτταρα του μικροπεριβάλλοντος είναι ισχυροί παραγωγοί εικοσανοειδών, και την εξέλιξη του όγκου θα εξαρτηθούν από μια ολοκληρωμένη απάντηση σε ένα φάσμα των εικοσανοειδών που παράγονται σε μια χωροχρονική τρόπο.

Ένας περιορισμός στην έρευνα του καρκίνου του πνεύμονα είναι η έλλειψη κατάλληλα μοντέλα ποντικών του μεταστατικού καρκίνου του πνεύμονα. Πρόσφατα αναπτύξει ένα ανοσοϊκανά ορθοτοπικό μοντέλο στο οποίο οι ποντικού καρκίνου του πνεύμονα κύτταρα εμφυτεύονται απευθείας εντός του αριστερού λοβού συγγενών ποντικών [20], [21]. Αυτά τα κύτταρα σχηματίζουν ένα πρωτογενούς όγκου που για μια περίοδο 3-5 εβδομάδων μετάσταση σε λεμφαδένες, καθώς και το ήπαρ και τον εγκέφαλο. Χρησιμοποιώντας αυτό το μοντέλο, έχουμε αποδείξει ότι οι όγκοι που αναπτύσσονται σε ποντικούς σε παγκόσμιο επίπεδο ανεπαρκές σε cPLA

2 έχουν σημαντική βλάβη στην πρόοδο και μετάσταση [21]. Δεδομένου ότι τα εγχυθέντα κύτταρα όγκου εξέφρασαν άγριου τύπου cPLA

2, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η παραγωγή εικοσανοειδών από κύτταρα του μικροπεριβάλλον του όγκου είναι κρίσιμη για την εξέλιξη του καρκίνου του πνεύμονα και τη μετάσταση. Ωστόσο, οι κρίσιμες εικοσανοειδή μεσολαβούν αυτά τα αποτελέσματα δεν έχουν καθοριστεί.

Η έλευση της ανάλυσης φασματομετρίας μάζας των λιπιδίων έχει επιτρέψει την μέτρηση πολλαπλών εικοσανοειδών προϊόντων και από τις δύο κύτταρα και τους ιστούς [22]. Η τεχνική αυτή επιτρέπει τον ποσοτικό προσδιορισμό ενός μεγάλου αριθμού (& gt? 25) χωριστών προϊόντων. Ο στόχος της παρούσας μελέτης ήταν να εφαρμόσει προσέγγιση με φασματομετρία μάζας για να καθορίσει συστηματικά τις αλλαγές στο εικοσανοειδών κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου του πνεύμονα, και να καθορίσει το ρόλο των διακριτών κυτταρικών πληθυσμών στη δημιουργία αυτού του προφίλ. Χρησιμοποιώντας ανοσοϊκανά ορθοτοπικό μοντέλο σε άγριου τύπου και cPLA

2 ποντίκια knockout είμαστε σε θέση να εκτιμήσει τη συμβολή του μικροπεριβάλλον του όγκου της παραγωγής των επιμέρους εικοσανοειδών. Τα αποτελέσματά μας καταδεικνύουν ένα πολύπλοκο μοτίβο εικοσανοειδών στη διάρκεια της προόδου του όγκου, και τον προσδιορισμό συγκεκριμένων φλεγμονωδών κυττάρων στο ΤΜΕ που συμβάλλουν εκλεκτικά προς παραγωγή εικοσανοειδών.

Πειραματικές Διαδικασίες

Cells

λουσιφεράσης που εκφράζουν Lewis κύτταρα καρκινώματος πνεύμονα (LLC-Luc) ελήφθησαν από την ATCC και διατηρήθηκαν σε DMEM (Corning Cellgro # 19-017-CV) που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου, πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη και G418 (500 ng /ml).

ποντίκια

cPLA

2 νοκ-άουτ (cPLA

2-KO) ποντίκια σε C57BL /6 υπόβαθρο [21], [23] και άγριου τύπου C57BL /6 ποντίκια που εκτρέφονται και συντηρούνται το Κέντρο Συγκριτικής Ιατρικής στο Πανεπιστήμιο του Κολοράντο. Πειράματα έγιναν σε 12-16 εβδομάδες ποντικούς ηλικίας, δύο άνδρες και γυναίκες, με τα ποντίκια διαφορετικής ηλικίας και φύλου εκπροσωπούνται εξίσου σε όλες τις πειραματικές ομάδες. Όλες οι διαδικασίες πραγματοποιήθηκαν υπό πρωτόκολλα εγκεκριμένα από την Επιτροπή Θεσμικών Animal Care and Use (IACUC) στο Πανεπιστήμιο του Κολοράντο.

ορθοτοπική Ποντίκι μοντέλο

κύτταρα LLC-Luc (2 × 10

5) αιωρήθηκαν σε PBS που περιείχε 15% Matrigel (BD Biosciences) και εγχύεται στο παρέγχυμα του αριστερού λοβού του πνεύμονα μέσω του θώρακα χρησιμοποιώντας μια βελόνα 30G. Για να βλέπει κατ’ευθείαν τον πνεύμονα ένας 4-5 mm εντομή έγινε στο δέρμα κάτω από τον αριστερό ώμο και το λαρδί απομακρύνθηκε. Μετά τη διαδικασία, η τομή κλείσθηκε με τη χρήση κτηνιατρικών κόλλα. Πρωτογενής μέγεθος του όγκου μετρήθηκε με τη χρήση ψηφιακών καλίμπρες.

Εκχύλιση και μάζας μέτρηση φασματομετρία εικοσανοειδών

Τα ποντίκια θυσιάστηκαν σε 2 ή 3 εβδομάδες μετά την ένεση των καρκινικών κυττάρων και το σύνολο του λοβού του πνεύμονα αριστερά περιέχει ο όγκος ήταν αποκόπηκαν, ζυγίστηκαν και φλας-καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο. Κατεψυγμένα ιστοί ομογενοποιήθηκαν σε 1 ml ρυθμιστικού διαλύματος σακχαρόζης παγωμένου (250 mM σακχαρόζη, 50 mM HEPES, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA) που περιέχει αναστολείς πρωτεάσης χρησιμοποιώντας μηχανοκίνητη ομογενοποιητή. Δείγματα λήφθηκαν για τη μέτρηση της πρωτεΐνης. Το υπόλοιπο ομογενοποίημα αναμίχθηκε αμέσως με 2 όγκους παγωμένης μεθανόλης. Πρωτεΐνη μετρήθηκε χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Bradford (Bio-Rad).

Τα εικοσανοειδή εκχυλίσθηκαν και αναλύθηκαν ουσιαστικά όπως περιγράφηκε προηγουμένως, με ορισμένες τροποποιήσεις [24]. Μετά την προσθήκη των σταθερών εσωτερικών προτύπων ραδιοεπισημασμένες (2 ng κάθε, εκτός από τις cys-LTs, εκ των οποίων 5 ng προστέθηκαν) στα ομογενοποιήματα μεθανόλη που περιέχουν εικοσανοειδή εκχυλίστηκαν χρησιμοποιώντας φυσίγγια στερεάς φάσης (Strata-X 33 μm Πολυμερικά αντίστροφης Φάση, Phenomenex), εκλούεται με μεθανόλη, ξηράνθηκε και επαναιωρήθηκε σε 60 μί 2 όγκους διαλύτη Α (8,3 mM οξικό αμμώνιο, ρΗ 5,7) και 1 όγκο διαλύτη Β (ακετονιτρίλιο /μεθανόλη 65:35 ν /ν). Ένας 25 μι-υποπολλαπλάσιο συνέχεια αναλύθηκαν με LC-MS /MS χρησιμοποιώντας μία στήλη Ascentis C18 HPLC (150 χ 2 mm, 5 μm? Supelco) διασυνδέεται με την πηγή ηλεκτροψεκασμού ενός τριπλού τετραπολικό φασματογράφο μάζας (Sciex ΑΡΙ 3000? ΡΕ-Sciex , Thornhill, Οντάριο, Καναδάς). Δείγματα εκλούστηκαν σε ένα ρυθμό ροής 200 μΕ /λεπτό με μια γραμμική βαθμίδα από 25% έως 100% διαλύτη Β, η οποία αυξήθηκε από 25% σε 85% σε 24 λεπτά, έως 100% σε 26 λεπτά, και διατηρήθηκε στους 100 % για περαιτέρω 12 λεπτά. Ανάλυση φασματογράφου μάζας διεξήχθη με τον τρόπο λειτουργίας αρνητικού ιόντος χρησιμοποιώντας πολλαπλές παρακολούθηση της αντίδρασης από τα ακόλουθα ειδικά

m /z

transitions:

369.300→169.100TXB

2

369.300→163.1006-keto-PGF

1α

353.300→193.100PGF

2α

351.300→271.200PGE

2

351.300→233.200PGD

2

333.300→189.100PGA

2 και PGJ

2

315.300→203.20015deoxy-PGJ

2

351.300→217.200LXA

4

351.300→221.200LXB

4

335.300→195.100LTB

4

335.200→115.1005,6-diHETEs

365.300→195.10020-COOH-LTB

4

351.300→195.10020-OH-LTB

4

624.500→272.200LTC

4

495.400→177.100LTD

4

438.300→333.300LTE

4

319.300→115.1005HETE

335.300→203.2005HpETE

317.300→203.2005oxoETE

319.300→179.10012HETE

319.300→219.20015HETE

343.300→245.20017OH-DHAa

343.300→273.20017OH-DHAb

327.300→283.200DHA

303.300→205.200AA

319.200→191.1005,6-EET

319.200→155.1008,9-EET

319.200→208.10011,12-EET

319.200→175.10014,15-EET

373.300→173.100[

2H

4]-TXB

2

357.300→197.100[

2H

4]-PGF

2α

373.300→167.100[

2H

4]-6-keto-PGF

1α

355.300→275.200[

2H

4]-PGE

2

339.300→197.100[

2H

4]-LTB

4

629.500→272.200[

2H

5]-LTC

4

500.300→177.100[

2H

5]-LTD

4

443.300→338.300[

2H

5]-LTE

4

327.300→116.100[

2H

8]-5HETE

311.300→267.200[

2H

8]-AA

Quantitation διεξήχθη χρησιμοποιώντας πρότυπη αραίωση ισοτόπου όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25]

Παρασκευή εναιώρημα μεμονωμένων κυττάρων και τη διαλογή με κυτταρομετρία ροής

Τα ποντίκια θυσιάστηκαν σε 2,5 εβδομάδες μετά την ένεση των καρκινικών κυττάρων, η κυκλοφορία εγχύθηκε με PBS /ηπαρίνης (80 U /ml, Sigma), και αριστεροί πνευμονικοί λοβοί περιέχουν όγκοι αποκόπηκαν. Οι ιστοί από 4 ποντικούς ομαδοποιήθηκαν, μηχανικά διαχωρισμένα, επωάζονται στους 37 ° C για 40 λεπτά με κολλαγονάση Α (1 mg /ml, Roche) και ϋΝΑση Ι (40 μg /ml, Sigma), και υποβάλλονται σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας σωλήνες GentleMACS διαστάσεως C (Miltenyi Biotec). Με αποτέλεσμα αναστολές μονοκύτταροι διηθούνται μέσω 70 μm κυττάρων σουρωτήρια (BD), με την επιφύλαξη των ερυθρών αιμοσφαιρίων λύση χρησιμοποιώντας υποτονικό διάλυμα, και φιλτράρεται δεύτερη φορά μέσα από 40 μm σουρωτήρια κυττάρων. Πριν από την κηλίδωση, ΡογΚ μπλοκαρίστηκε με αντι-CD16 /CD32 (BD Biosciences) για 20 λεπτά. Τα κύτταρα χρωματίστηκαν για 1 ώρα στους 4 ° C με τα ακόλουθα αντισώματα: CD11b-FITC (κλώνος Μ1 /70, BD Biosciences), SiglecF-ΡΕ (Κλώνος E50-2440, BD Biosciences), Ly6G-ΡΕ-Cy7 (Κλώνος 1A8, BD Biosciences), F4 /80-APC (κλώνος CI: Α3-1, AbDSerotec), CD11c-APC-Cy7 (κλώνος HL3, BD Biosciences). Τα κύτταρα ταξινομούνται στο Πανεπιστήμιο του Κολοράντο Κέντρο Καρκίνου Κυτταρομετρία Ροής Πυρήνας χρησιμοποιώντας XDP-100 (Beckman Coulter). Η στρατηγική διαλογής που εμπλέκονται με εξαίρεση συντρίμμια και κυττάρων δυάδων από σκέδαση φωτός, και τα νεκρά κύτταρα με DAPI (1 μg /ml). Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό Καλούζα (Beckman Coulter)

Θεραπεία της κυτταρομετρίας ροής-διαχωρισμένα κύτταρα για τη μέτρηση της εικοσανοειδών

παραγωγής

Αμέσως μετά τη διαλογή, 1,5 -. 2,0 × 10

5 κυττάρων κάθε τύπου σφαιροποιήθηκαν, επαναιωρήθηκαν σε PBS χωρίς ορό και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ιονοφόρο ασβεστίου (Α23187, 0,5 μΜ) για 12 λεπτά. Οι αντιδράσεις τερματίστηκαν με την προσθήκη παγωμένης μεθανόλης.

ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR-

Ολικό RNA απομονώθηκε από κυτταρομετρία ροής-διαχωρισμένα κύτταρα χρησιμοποιώντας το κιτ RNeasy QIAshredder και Micro (Qiagen) . Εκχυλίστηκε RNA μετατράπηκε σε συμπληρωματικό DNA με το κιτ σύνθεσης cDNA iScript (BioRad). Real Time PCR διεξήχθη χρησιμοποιώντας το MyIQ Real Time Σύστημα Ανίχνευσης PCR (BioRad) με τους ακόλουθους εκκινητές: cPLA

2: Fwd 5′-GTGGTGGCCATTTTGGGTTC-3 ‘, 5′-Rev TCGGGGTGAGAGTACAAGGT-3′, COX-2: Fwd 5’-TGAGCAACTATTCCAAACCAGC-3 ‘, 5′-Rev CACGTAGTCTTCGATCACTATC-3′, COX-1: Fwd 5’-ATGGATACTGGCTCTGGGAA -3 ‘, 5′-Rev CTGAGTTGTAGGTCGGAGGG -3′, 5-LO: Fwd 5′-ACTACATCTACCTCAGCCTCATT-3 », Rev 5’-GGTGACATCGTAGGAGTCCAC-3 ‘, LTC4S: Fwd 5′-GTCTTCCGAGCCCAGGTAAA-3′, 5’-Rev CGCGCGTATCCCTGGAAATA-3 ‘, LTA4H: Fwd 5′-ATCTCTCTTCCCATCGCCCT-3′, 5’-Rev CTTTCGGGACAGACACCTCT-3 ‘ , TXAS1: Fwd: 5’-GCTTCCACCTTCTGTATCCC-3 ‘, Rev: 5′-TCTCGGTTCTTATTGGGCAG-3′, MAGL: Fwd: 5’-CGAACTCCACAGAATGTTCCCTA -3 ‘, Rev: 5′-ACAAAGATGAGGGCCTTGGGT – 3′, β-ακτίνη: Fwd : 5’-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3 ‘, 5′-Rev CCAGTTGGTAACAATGCCATG- 3′, GAPDH: Fwd 5’-CGTGGAGTCTACTGGTGTCTTC – 3 ‘, 5′-Rev CGGAGATGATGACCCTTTTGGC -3′ ουμπικουϊτίνη C: Fwd: 5’-CCACACAAAGCCCCTCAATC-3 ‘, Rev: 5’-AAAGATCTGCATCGTCTCTCTCAC-3 ‘

Στατιστική & amp?. Υπολογιστική Αναλύσεις

Χρησιμοποιήσαμε ανάλυση των δοκιμών Chi-Square του Friedman για να αξιολογηθεί η διαφορά μεταξύ των πνευμόνων που φέρουν όγκους από WT και cPLA

2-KO ποντίκια που συγκομίζονται σε 3 εβδομάδες. Rank βαθμολογίες, αντί των πρώτων μετρήσεων εικοσανοειδών επίπεδο, χρησιμοποιήθηκαν στη δοκιμή. Εφαρμόσαμε False Discovery Rate (FDR) έλεγχος των ρ-τιμές που λαμβάνονται από δοκιμή Chi-Square, προκειμένου να διορθωθούν για πολλαπλές συγκρίσεις. Οι τιμές του FDR θεωρείται «προσαρμοστεί» p-τιμές. Καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι μια ένωση είναι σημαντική όταν η τιμή FDR είναι μικρότερη από 0,05.

Αποτελέσματα

Πολλαπλές εικοσανοειδών αυξήθηκε σε ποντίκια που φέρουν όγκο

Χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο ποντικού ορθοτοπική ανοσοεπαρκών, στην οποία τα κύτταρα του όγκου εγχύθηκαν στους πνεύμονες των ποντικών, εμείς προηγουμένως έδειξαν ότι η απώλεια του cPLA

2 στο μικροπεριβάλλον του όγκου αναστέλλεται μετάσταση καρκίνου του πνεύμονα [21]. Αυτά τα αποτελέσματα οφείλονται προφανώς για να μεταβληθεί παραγωγή ειδικών εικοσανοειδών κρίσιμη για την εξέλιξη του όγκου και τη μετάσταση. Για τον καθορισμό του φάσματος των εικοσανοειδών που παράγονται κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του όγκου του πνεύμονα σε ορθοτοπικό μοντέλο καρκίνου του πνεύμονα χρησιμοποιήσαμε υγρής χρωματογραφίας σε συνδυασμό με διαδοχική φασματομετρία μάζας (LC /MS /MS)

κύτταρα Lewis του πνεύμονα (LLC-Luc:. 2 × 10

5), που προέρχεται από ένα αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα σε ένα C57BL /6 ποντίκι, εγχύθηκαν στα αριστερά λοβούς των πνευμόνων συγγενών ποντικών WT. Ολόκληρο το αριστερό πνευμονικό λοβό που περιέχουν όγκοι συλλέχθηκαν στις 2 και 3 εβδομάδες μετά την ένεση, μαζί με το αριστερό λοβούς από ποντίκια ελέγχου ενέθηκαν με PBS /Matrigel. Τα εικοσανοειδή που εξάγεται από τις συγκομίζονται πνεύμονες αναλύθηκαν με LC /MS /MS και ομαλοποιήθηκε ως προς την περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη του δείγματος. Παρακολουθήσαμε πολλά προϊόντα της κυκλοοξυγενάσης (COX), λιποξυγενάσες (LO), και μονοπάτια του κυτοχρώματος P450. Επιπλέον, μετρήθηκε ελεύθερο αραχιδονικό οξύ (ΑΑ) και το δοκοσαεξανοϊκό οξύ (DHA).

Σε WT ποντίκια τα επίπεδα των εικοσανοειδών ήταν γενικά αυξάνεται με την πρόοδο του καρκίνου, ωστόσο, με διάφορους βαθμούς της επαγωγής και διαφορετικές χρονικές πρότυπα (Πίνακας 1 και Εικ. 1). Έχουμε διαφοροποιημένα μια ομάδα των εικοσανοειδών που ήταν πάνω ρυθμισμένα 3-7 φορές κατά την προγενέστερη 2 εβδομάδων χρονικό σημείο (αρχές εικοσανοειδών): PGE

2, PGF

2α, LTC

4 και LTE

4 (Εικ. 1Α). Επίπεδα αυτού του υποσυνόλου των εικοσανοειδών αυξήθηκαν περαιτέρω σε 3 εβδομάδες. Σε σύγκριση με Matrigel ένεση ποντικούς, PGE

2 ρυθμίζεται αυξητικά 45-φορές, η οποία ήταν η υψηλότερη αύξηση όλων των εικοσανοειδών. LTC

4 και LTE

4 ήταν επίσης ιδιαίτερα αυξημένη, 12 και 13 φορές, αντίστοιχα. Τα επίπεδα του ΡΟΡ

2α δεν αύξησε περαιτέρω σε 3 εβδομάδες. Μια δεύτερη ομάδα περιελάμβανε εικοσανοειδών που δεν είχαν αυξημένη (& lt? 2-φορές) σε 2 εβδομάδες, αλλά αυξήθηκε σημαντικά σε 3 εβδομάδες (τέλη εικοσανοειδών, Σχήμα 1Β.). Μερικά από τα τέλη της δεκαετίας εικοσανοειδών: PGD

2, TXB

2 (ο σταθερός μεταβολίτης του ΤΧΑ

2) και ΑΑ έγινε ιδιαίτερα αυξητικά (7-10 φορές σε σύγκριση με Matrigel εγχύθηκαν), ενώ άλλοι (5-, 12-, 15-ΗΕΤΕ και DHA) έχουν αυξητικά μέτρια (3-4 φορές). LTB

4, η οποία ήταν μη ανιχνεύσιμο στο χρονικό σημείο 2 εβδομάδα, ανιχνεύθηκε στο 50% των ζώων σε 3 εβδομάδες. Δύο από τα εικοσανοειδών: LTD

4 και 6-κετο-PGF

1α (ο σταθερός μεταβολίτης της PGI

2), ήταν αμετάβλητη ή οριακά μόνο ρυθμίζεται προς τα πάνω κατά 2 ή 3 εβδομάδες (Εικ 1Γ.). Ούτε οι λιποξίνες ούτε τα προϊόντα του κυτοχρώματος P450 (5,6-EET, 8,9-EET, 11,12-EET, 14,15-ΕΕΤ), εντοπίστηκαν σε οποιαδήποτε χρονικά σημεία.

κύτταρα LLC-Luc ή Matrigel (μάρτυρας) εγχύθηκαν σε αριστερό πνευμονικό λοβό του WT C57BL /6 ποντίκια και φέρει όγκο και τον έλεγχο πνεύμονες συλλέχθηκαν 2 ή 3 εβδομάδες μετά την ένεση. Εικοσανοειδών επίπεδα αναλύθηκαν με LC /MS /MS και ομαλοποιήθηκε ως προς την περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη του δείγματος. Τα επίπεδα σε γραφήματα εκφράζονται ως φορές πάνω από τον έλεγχο. Α Πρόωρη εικοσανοειδών – επαγόμενη & gt? 3 φορές σε 2 εβδομάδες, και περαιτέρω αύξηση σε 3 εβδομάδες. B. Αργά εικοσανοειδών – δεν ρυθμίζεται προς τα πάνω (& lt? 2-φορές) σε 2 εβδομάδες, αλλά αυξήθηκε σε 3 εβδομάδες. Γ Αμετάβλητο εικοσανοειδών.

Η

Κατάργηση του cPLA

2 η TME επηρεάζει διαφορικά εικοσανοειδών

Από cPLA

2 είναι το περιοριστικό του ρυθμού ένζυμο στην εικοσανοειδών βιοσύνθεση, μετρήσαμε την παραγωγή εικοσανοειδών σε όγκους του πνεύμονα που καλλιεργούνται σε cPLA

2 -knockout ποντίκια. Για το σκοπό αυτό, κατά την ίδια στιγμή που οι ποντικοί WT ενέθηκαν, ενέθηκε επίσης οχήματος (Matrigel) ή κύτταρα LLC-Luc σε ποντικούς με ανεπάρκεια σε παγκόσμιο επίπεδο cPLA

2. Με αυτή τη πειραματική στρατηγική, cPLA

2 διαγράφεται σε όλα τα κύτταρα του μικροπεριβάλλον του όγκου, ενώ η έκφραση άγριου τύπου διατηρείται στα καρκινικά κύτταρα. Τα ζώα θυσιάστηκαν σε 2 και 3 εβδομάδες μετά την ένεση και εικοσανοειδών προφίλ σε φέροντα όγκο ή ελέγχου αριστερά λοβών του πνεύμονα προσδιορίστηκαν με LC /MS /MS.

Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Α, η αύξηση των πρωτογενών όγκων δεν ήταν διαφορετικό σε άγριου τύπου έναντι cPLA

2-KO ποντίκια, συνεπή με προηγούμενες παρατηρήσεις μας [21]. Ανάλυση εικοσανοειδών προφίλ (Πίνακας 2 και Εικ. 2Β) αποκάλυψε ότι βασικά επίπεδα εικοσανοειδών σε cPLA

2-KO ποντίκια ήταν εν γένει ελαφρώς χαμηλότερη, αλλά όχι στατιστικά διαφορετικό από ποντικούς ελέγχου WT. Με την εξέλιξη της όγκου πνεύμονα, εικοσανοειδών παραγωγή αυξήθηκε σε

2-KO ποντίκια τόσο WT και cPLA? Ωστόσο, η αύξηση ήταν σημαντικά αμβλύνθηκε σε όγκο που φέρουν cPLA

ποντίκια 2-KO. Το επίπεδο της αναστολής σε cPLA

ποντίκια 2-KO ποικίλουν ευρέως μεταξύ των διαφόρων αναλυτών, που κυμαίνονται από περίπου 25% έως πάνω από 90% αναστολή. Το αποτέλεσμα αυτό δείχνει ότι μπορεί κανείς να κάνει μια διάκριση μεταξύ των εικοσανοειδών που παράγονται κατά κύριο λόγο από το μικροπεριβάλλον (ανέστειλε πλήρως στον καθορισμό των cPLA

2 νοκ-άουτ), και εικοσανοειδή συνέβαλαν τόσο από μικροπεριβάλλον και τα καρκινικά κύτταρα (μειωμένη εν μέρει). Λεπτομερής ανάλυση των εικοσανοειδών προφίλ αποκάλυψε ότι το ΑΑ και DHA έδειξε την παραμικρή μείωση σχετίζεται με cPLA

ανεπάρκεια 2, περίπου 25% σε 3 εβδομάδες (Πίνακας 2). 5-, 12- και 15-ΗΕΤΕ ήταν κατά μέσο όρο μειώνεται κατά 50% σε cPLA

2-ΚΟ ποντικούς σε σύγκριση με ποντικούς WT (Πίνακας 2). Προϊόντα της COX οδού έδειξαν διάφορους βαθμούς αναστολής κατά τον καθορισμό των cPLA

2 ανεπάρκεια. Ενώ TXB

2 και 6kPGF

1α μειώθηκαν κατά 80% σε 3 εβδομάδες, οι άλλες προσταγλανδίνες (PGE

2, PGD

2 και ΤΕΣ

2α) ήταν κατά μέσο όρο 50% χαμηλότερα από ό, τι σε WT ποντικούς (Πίνακας 2 και Εικ. 2Β). Το μεγαλύτερο αναστολή σχετίζεται με cPLA

2-ανεπάρκειας στο μικροπεριβάλλον ανιχνεύθηκε στην ομάδα λευκοτριενίου (Πίνακας 2 και Εικ. 2Β). Η αύξηση στις αρχές του λευκοτριένια, LTC

4 και LTE

4, καθυστέρησε μέχρι 3 εβδομάδες σε cPLA

2-ΚΟ ποντίκια σε σύγκριση με τα ποντίκια WT, και τα επίπεδά τους μειώθηκαν κατά 90% για την ομάδα LTC

4 και 75% για το LTE

4. Το λευκοτριένιο LTB

4, η οποία προκλήθηκε σε 3wk WT πνεύμονες που φέρουν όγκους, δεν ανιχνεύθηκε σε cPLA

2-KO ποντίκια σε κάθε χρονικό σημείο. Τα επίπεδα της ΕΠΕ

4, ενώ δεν αυξάνεται με την εξέλιξη του όγκου, ήταν χαμηλότερες κατά 80% σε 3 εβδομάδων cPLA

2-KO όγκους.

κύτταρα LLC-Luc ή matrigel (έλεγχος) ήταν εγχέεται στο αριστερό λοβούς των πνευμόνων του WT ή cPLA

2-KO ποντίκια. Οι ενέσεις έγιναν σε 3 ξεχωριστές ημέρες με έλεγχο εναντίον των όγκων και WT εναντίον cPLA

2 ομάδες-KO εκπροσωπούνται ισότιμα ​​σε κάθε ημέρα. Αριστερά λοβούς που φιλοξενούν όγκους και οι πνεύμονες ελέγχου συλλέχθηκαν 2 ή 3 εβδομάδες μετά την ένεση, εικοσανοειδή αναλύθηκαν με LC /MS /MS και ομαλοποιήθηκε ως προς το περιεχόμενο πρωτεΐνης του δείγματος. Κάθε σημείο αναπαριστά έναν απλό ποντίκι. Μπάρες αντιπροσωπεύουν μέσους όρους. Α Βάρη του όγκου που φέρουν και τον έλεγχο των πνευμόνων B. Επιλέξτε εικοσανοειδών

Η

Διακριτές πληθυσμούς των φλεγμονωδών κυττάρων στο ΤΜΕ έχουν διαφορετικά εικοσανοειδών προφίλ

Η Toyota Ελλάς αποτελείται από πολλά κυτταρικών τύπων, συμπεριλαμβανομένων των φλεγμονωδών κυττάρων, ινοβλαστών και προσαρμοστική ανοσοκύτταρα. Προκειμένου να αρχίσει να καθορίσει ποια αυτών των κυτταρικών πληθυσμών παράγουν λευκοτριένια στη ρύθμιση της προόδου του όγκου, χρησιμοποιήσαμε κυτταρομετρία ροής για την απομόνωση φλεγμονωδών κυττάρων από πνεύμονες ποντικών που φέρουν όγκο. Χρησιμοποιώντας δείκτες που χρησιμοποιούνται προηγουμένως για τον χαρακτηρισμό φλεγμονώδη κύτταρα στον πνεύμονα, ορίσαμε ουδετερόφιλα (Neu, CD11b + /Ly6G +), καθώς και δύο πληθυσμούς των μακροφάγων, που ορίζεται ως MACA (SigF + /CD11c + /F480 + /CD11b χαμηλή) και MACB (F480 + /CD11b + /Ly6G- /SigF-), (Εικ. 3Α). Με βάση προηγούμενες μελέτες [26], [27], MACA αντιπροσωπεύουν κάτοικος κυψελιδικά μακροφάγα [27], ενώ MACB είναι μια ετερογενής πληθυσμός αποτελείται κυρίως από διηθητικά μονοκύτταρα και μακροφάγα, και περιέχει επίσης διάμεση μακροφάγα, και CD11b + δενδριτικά κύτταρα [27], [ ,,,0],28]. Στον καθορισμό των όγκων, ο αριθμός των κυττάρων MACB ήταν σημαντικά αυξημένη, ενώ ο πληθυσμός MACA δεν μεταβλήθηκε σημαντικά σε σύγκριση με ποντικούς ελέγχου που δεν ενίεται με καρκινικά κύτταρα (Σχ. 3Β).

κύτταρα LLC-Luc εγχύθηκαν σε αριστερό πνευμονικό λοβό του WT ή cPLA

ποντίκια 2-ΚΟ και των πνευμόνων που φέρουν όγκο συλλέχθηκαν 2,5 εβδομάδες αργότερα. Οι ιστοί από 4 ποντικούς ομαδοποιήθηκαν και φλεγμονώδη κύτταρα ανακτήθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Α στρατηγική διαδοχικών περίφραξη κυτταρομετρίας ροής χρησιμοποιείται για να ανακτήσει τα φλεγμονώδη κύτταρα: Neu: ουδετερόφιλα (CD11b + /Ly6G +), Maca μακροφάγα (SigF + /CD11c + /Ly6G-) και μακροφάγα MACB (F480 + /CD11b + /Ly6G- /SigF-). B. Οι αριθμοί των κυττάρων που ανακτώνται με κυτταρομετρία ροής από uninjected ή όγκο που φέρει αριστερά λοβούς των πνευμόνων των WT και cPLA

2-KO ποντίκια. Τα δεδομένα δείχνουν μέση από 3 ξεχωριστά πειράματα, με κάθε διαλογή πραγματοποιήθηκε σε μια δεξαμενή 4 ποντικών. Οι ράβδοι σφάλματος δείχνουν SEM

Η

Για τον προσδιορισμό του δυναμικού παραγωγής εικοσανοειδών από αυτές τις τρεις ομάδες των φλεγμονωδών κυττάρων, τους ανακτήθηκαν με κυτταρομετρία ροής από τους πνεύμονες των ποντικών που φέρουν όγκο, και εξετάσθηκαν η έκφραση του mRNA των ενζύμων στο εικοσανοειδών μονοπάτι με qRT-PCR. Η ανάλυση του mRNA αποκάλυψε σημαντικές διαφορές στην έκφραση των εικοσανοειδών ενζύμων οδού μεταξύ των διαφόρων φλεγμονωδών κυττάρων (Εικ. 4). Και οι τρεις πληθυσμοί εκφράζονται cPLA

2, αν και τα επίπεδα ήταν υψηλότερα στα κύτταρα Maca από ό, τι στο MACB ή ουδετερόφιλα. COX-1 εκφράζεται επίσης σε όλους τους 3 τύπους κυττάρων, και εμείς δεν ανίχνευσαν σημαντικές διαφορές στα επίπεδα της, γεγονός που υποδηλώνει ότι όλες αυτές οι πληθυσμοί μπορεί να παράγει προσταγλανδίνες. Ωστόσο, η COX-2 εκφράζεται εκλεκτικά στα ουδετερόφιλα, με χαμηλά επίπεδα σε MACB και σχεδόν μη ανιχνεύσιμες σε MACA. Επειδή φλεγμονώδεις κυτοκίνες επάγουν προσταγλανδίνες μέσω της αυξημένης έκφρασης της COX-2, θα προβλέψουμε ότι η προσταγλανδίνη παραγωγή θα διαμεσολαβείται σε μεγάλο βαθμό μέσω ουδετερόφιλα και MACB. Η θρομβοξάνη TXAS1 συνθάσης ανιχνεύθηκε επίσης σε όλους τους τρεις τύπους κυττάρων. 5-LO ήταν υψηλότερη στα κύτταρα Maca, ουδετερόφιλα εξέφρασαν 50-70% χαμηλότερα επίπεδα, και έκφραση σε MACB ήταν 90% χαμηλότερη από ό, τι στο Maca. Αυτό θα έδειχνε ότι η παραγωγή λευκοτριενίων στη ρύθμιση της εξέλιξης του όγκου σε μεγάλο βαθμό προέρχεται από μάκα ή ουδετερόφιλα, με το προσλαμβάνονται πληθυσμού MACB συμβάλλουν πολύ λίγο. LTA4H εκφράστηκε σε όλους τους τύπους κυττάρων 3, ενώ η έκφραση του LTC4S περιορίστηκε μόνο σε κύτταρα MACA. Όλα τα αναλύθηκαν ένζυμα εκφράστηκαν στα ίδια επίπεδα σε WT και cPLA

2-KO ποντίκια, με την εξαίρεση των cPLA

2, η οποία, όπως αναμενόταν, δεν ήταν ανιχνεύσιμη σε κύτταρα που προέρχονται από cPLA

2-KO . Επειδή δωρεάν ΑΑ μπορεί να απελευθερωθεί από τα ένζυμα εκτός από cPLA

2, όπως γλυκερόλη μονοακυλο λιπάσης (MAGL) [29] μετρήσαμε τα επίπεδα MAGL σε απομονωμένα κύτταρα. κύτταρα MACA καταδειχθεί υψηλά επίπεδα σε σύγκριση με MAGL είτε κύτταρα MACB ή ουδετερόφιλα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτό το αποτέλεσμα οδηγεί στην πρόβλεψη ότι cPLA

2 ανεπάρκεια θα έχει μικρότερο αντίκτυπο στην παραγωγή εικοσανοειδών από κύτταρα Maca παρά από MACB ή neutrophils.To επιβεβαιώνουν το δυναμικό για την παραγωγή εικοσανοειδών από Maca, MACB και των πληθυσμών των ουδετερόφιλων, τα κύτταρα ανακτήθηκαν από όγκο που φέρουν ποντίκια με κυτταρομετρία ροής και διεγείρονται με ιονοφόρο ασβεστίου Α23187. Παραγωγή εικοσανοειδών αξιολογήθηκε με LC /MS /MS (Εικ.5). Μαζί με τα ταξινομημένα κύτταρα, εξετάσαμε την παραγωγή εικοσανοειδών από καλλιεργημένα καρκινικά κύτταρα LLC-Luc. Το μεγαλύτερο ρεπερτόριο των εικοσανοειδών παρήχθη από κύτταρα MACA. Σε συμφωνία με την υψηλή έκφραση τους 5-LO και αποκλειστική έκφραση LTC4S, Maca ήταν οι μόνοι ικανοί να παράγουν κυστεϊνυλικά λευκοτριένια, LTC

4 και ΕΠΕ

4. Maca παρήγαγε επίσης LTB

4, αν και λιγότερο από ό, τι τα ουδετερόφιλα, 5-ΗΕΤΕ και 5oxoETE. Παρά τη χαμηλή έκφραση τους της COX-2, αλλά συνεπής με την έκφραση της COX-1, κύτταρα Maca ήταν σε θέση να παράγουν PGE

2 και TXB

2. Είναι ενδιαφέρον, την παραγωγή εικοσανοειδών από κύτταρα MACA από cPLA

2-ΚΟ ποντικών μειώθηκε σε σύγκριση με το WT, αλλά μόνο κατά περίπου 50%. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η πρόσθετη πορείες διαφορετικές από cPLA

2, όπως πράξη MAGL να παρέχει ΑΑ σε αυτά τα κύτταρα. κύτταρα MACB παράγονται χαμηλότερα επίπεδα εικοσανοειδών. Καθώς στερούνται 5-LO, MACB δεν ήταν ικανά να παράγουν λευκοτριένια. Παρά έκφραση των ενζύμων στην οδό κυκλοοξυγενάσης, MACB παράγεται μόνο τα χαμηλά επίπεδα της PGE

2 και TXB

2, οι οποίες μειώνονται κατά 80% κατά τον καθορισμό των cPLA

2-KO. Τα ουδετερόφιλα, τα οποία εκφράζουν 5-LO, αλλά όχι LTC4S, παράγονται LTB

4 σε επίπεδα 3 φορές υψηλότερες από MACA, αλλά δεν κυστεϊνύλ λευκοτριένια. Συνεπής με την υψηλή έκφραση τους από COX-2, τα ουδετερόφιλα που παράγονται PGE

2, σε επίπεδα 4 φορές υψηλότερη από MACA. Παρήγαγαν επίσης 5-ΗΕΤΕ και TXB

2, σε επίπεδα χαμηλότερα από τα κύτταρα MACA. Στον καθορισμό των cPLA

ανεπάρκεια 2, την παραγωγή ουδετερόφιλων εικοσανοειδών μειώθηκε πάνω από 90% σε σύγκριση με ποντίκια WT. Μεταξύ άλλων μεταβολιτών, 12-ΗΕΤΕ, ΤΕΣ

2α, 15-ΗΕΤΕ, ΑΑ και DHA έχουν παραχθεί από όλους τους τύπους 3 κυττάρων. Σε αντίθεση με τα μυελοειδή κύτταρα ανακτήθηκαν από τα κύτταρα TME, LLC-Luc παράγεται ένα περιορισμένο φάσμα των εικοσανοειδών. σημαντικό προϊόν τους ήταν PGE

2, ανιχνεύονται σε επίπεδα περίπου 10 φορές υψηλότερη από ό, τι σε μυελοειδή κύτταρα. Διαπιστώσαμε επίσης PGF

2α, 15-ΗΕΤΕ και σχετικά χαμηλά επίπεδα του DHA και ΑΑ. Δεν ανιχνεύθηκαν λευκοτριένια, συνεπής με in vivo δεδομένα μας δείχνουν ότι τα λευκοτριένια επιλεκτικά παράγεται από τον ΤΜΕ.

έκφραση Σχετική mRNA σε κύτταρα που ανακτώνται από τους πνεύμονες που φέρουν όγκο με κυτταρομετρία ροής. Η έκφραση αξιολογήθηκε με qRT-PCR, κανονικοποιημένη προς το γεωμετρικό μέσο όρο των β-ακτίνη, GAPDH, ουμπικιτίνη C και 18s, και εκφράζεται ως% μέγιστη μεταξύ των ομάδων αναλύθηκαν κυττάρων. Τα πειράματα διεξήχθησαν σε 2 ξεχωριστά ενέθηκαν και αναλύθηκαν πισίνες ποντικών (4 ποντίκια ανά ομάδα WT ή cPLA2-KO ανά πισίνα). Μαύροι κύκλοι – πισίνα # 1, ανοικτοί κύκλοι – πισίνα # 2, bar -. Μέση τιμή από τις πισίνες

Η

παραγωγή εικοσανοειδών στα κύτταρα που ανακτώνται από τους πνεύμονες που φέρουν όγκους με κυτταρομετρία ροής. Τα ανακτημένα κύτταρα διεγέρθηκαν με ιοντοφόρο Α23187 (0.5 μΜ) για 12 λεπτά. Εξάγεται εικοσανοειδών αναλύθηκαν με LC /MS /MS. Τα πειράματα διεξήχθησαν σε 2 ξεχωριστά ενέθηκαν και αναλύθηκαν πισίνες ποντικών (4 ποντίκια ανά ομάδα WT ή cPLA2-KO ανά πισίνα). Μαύροι κύκλοι – πισίνα # 1, ανοικτοί κύκλοι – πισίνα # 2, bar -. Μέση τιμή από τις πισίνες

Η

Συζήτηση

Τα εικοσανοειδή αντιπροσωπεύουν μια μεγάλη οικογένεια βιοδραστικών μορίων με ποικίλες και ενδεχομένως σηματοδότησης αντίθετες βιολογικές επιδράσεις. Ενώ πολύ δουλειά έχει επικεντρωθεί στις συγκεκριμένες εικοσανοειδών και ο ρόλος τους στον καρκίνο, δεν υπήρξε μια συστηματική προσπάθεια για να καθορίσει το φάσμα αυτών των μορίων στη ρύθμιση του καρκίνου. Ένα μεγάλο σώμα της λογοτεχνίας έχει καθορίσει δύο προ- και αντι-ογκογόνο ρόλους για τα προϊόντα και των δύο οδών κυκλοοξυγενάσης και λιποξυγενάσης [30], [31]. Οι μελέτες μας χρησιμοποιήθηκε μια ανοσοεπαρκείς ορθοτοπικό μοντέλο της εξέλιξης του καρκίνου του πνεύμονα, σε συνδυασμό με μια lipidomic προσέγγιση φασματομετρία μάζας για να αποδείξει ότι εξέλιξης του καρκίνου του πνεύμονα σχετίζεται με αυξήσεις σε πολλαπλά εικοσανοειδών προϊόντα που προέρχονται τόσο από την κυκλοοξυγενάση και οδών λιποξυγενάσης. Μεμονωμένα εικοσανοειδών έδειξε διαφορετικές εξαρτήσεις χρόνου, με ένα υποσύνολο αυξάνεται το νωρίτερο χρονικό σημείο αναλύθηκαν, ενώ ένα δεύτερο υποσύνολο φάνηκε να έχουν μια πιο καθυστερημένη πορεία της επαγωγής. Πολλά προϊόντα (π.χ. 6k-ΤΕΣ

1α) δεν άλλαξαν, και τα προϊόντα του Ρ450 οδού κυτοχρώματος ή λιποξίνες δεν ανιχνεύθηκαν στο μοντέλο μας.