Αφηρημένο

αναστολείς της HSP90 είναι σήμερα σε κλινική αξιολόγηση σε συνδυασμό με αντιμιτωτικά φάρμακα σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC), αλλά λίγα είναι γνωστά για τις κυτταρικές επιδράσεις αυτού του νέου συνδυασμού φαρμάκων. Συνεπώς, ερευνήσαμε το μοριακό μηχανισμό δράσης των ΙΡΙ-504 (retaspimycin HCl), ένας ισχυρός και εκλεκτικός αναστολέας της HSP90, σε συνδυασμό με το docetaxel στόχευσης μικροσωληνίσκων παράγοντα (MTA), σε προκλινικά μοντέλα NSCLC. Εντοπίσαμε ένα υποσύνολο των κυτταρικών σειρών NSCLC στην οποία τα φάρμακα αυτά δρουν σε συνέργεια για να ενισχύσει τον κυτταρικό θάνατο. Μοντέλα ξενομοσχεύματος NSCLC αποδειχθεί αναστολή της ανάπτυξης του όγκου, και σε ορισμένες περιπτώσεις, οπισθοδρόμηση σε απόκριση στην αγωγή συνδυασμού. Η θεραπεία με ΙΡΙ-504 ενίσχυσε τα αντιμιτωτικά αποτελέσματα της docetaxel που οδηγούν στην υπόθεση ότι απαιτείται η μιτωτική σημείο ελέγχου για την αντιμετώπιση συνδυασμού φαρμάκων. Υποστηρίζουν αυτή την υπόθεση, παρακάμπτοντας το σημείο ελέγχου με έναν αναστολέα της κινάσης Aurora μείωσε τη συνέργεια κυτταρικό θάνατο του IPI-504 και docetaxel. Για τη διερεύνηση της μοριακής βάσης της συνέργειας, μια αμερόληπτη σταθερή σήμανση ισοτόπου από τα αμινοξέα σε καλλιέργεια κυττάρων (SILAC) πρωτεομική προσέγγιση που χρησιμοποιείται. Αρκετές μιτωτική ρυθμιστικές αρχές, συμπεριλαμβανομένων των στοιχείων της ουμπικουϊτίνης λιγκάσης, ανάφαση προώθηση συγκρότημα (APC /C), ήταν ειδικά ρυθμισμένα προς τα κάτω σε απόκριση σε θεραπεία συνδυασμού. Απώλεια της APC /C με RNAi ευαισθητοποιημένα κύτταρα σε docetaxel και ενισχυμένη αντιμιτωτική τα αποτελέσματά της. Η θεραπεία με έναν αναστολέα PLK1 (BI2536) ευαισθητοποιημένα επίσης κύτταρα να IPI-504, υποδεικνύοντας ότι η επίδραση συνδυασμός μπορεί να είναι ευρέως εφαρμόσιμη σε άλλες τάξεις μιτωτικούς αναστολείς. Τα δεδομένα μας παρέχει μια λογική προκλινικές για τη δοκιμή του συνδυασμού του IPI-504 και ντοσεταξέλη στον NSCLC

Παράθεση:. O’Connell π.Χ., O’Callaghan Κ, Tillotson Β, Ντάγκλας Μ, Hafeez Ν, Δυτική KA, et al. (2014) HSP90 Αναστολή Βελτιώνει Αντιμιτωτική οφειλόμενοι στα ναρκωτικά μίτωσης και θάνατο των κυττάρων σε προκλινικά μοντέλα μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 9 (12): e115228. doi: 10.1371 /journal.pone.0115228

Επιμέλεια: Αντρέι Λ Gartel, Πανεπιστήμιο του Ιλινόις στο Σικάγο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 23 Ιούλη, 2014? Αποδεκτές: 20 Νοέμβρη 2014? Δημοσιεύθηκε: 26 Δεκ 2014

Copyright: © 2014 O’Connell et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:.. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα: Οι συγγραφείς θα ήθελαν να αποσαφηνιστεί ότι η φορά το έργο έγινε οι συγγραφείς ήταν εργαζομένων και των μετόχων της Infinity Pharmaceuticals, Inc. Αυτό δεν αλλάζει την προσήλωσή τους στις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

η μιτωτική, ή άξονα οδοφράγματος του συγκροτήματος βοηθά στη διατήρηση της γονιδιωματικής ακεραιότητας εμποδίζοντας την ανώμαλο διαχωρισμό των χρωμοσωμάτων. Ένα εξαιρετικά ενορχηστρωμένη σύστημα επιτήρησης αποτελείται από πολυάριθμες πρωτεΐνες ανιχνεύει ασύνδετος kinetochores, ή έλλειψη κατάλληλης έντασης κατά μήκος της μιτωτικής ατράκτου, προκαλώντας το λεγόμενο «σημείο ελέγχου απόκριση», το οποίο οδηγεί σε μιτωτική σύλληψη. Κανονική κυτταρική διαίρεση απαιτεί την επιτυχή διέλευση από τη μιτωτική σημείο ελέγχου. Η μη τήρηση οδοφράγματος απαιτήσεις σε σχετικά σύντομο χρονικό διάστημα (1-2 ημέρες) μπορεί να οδηγήσει σε ανευπλοειδία, μιτωτική καταστροφή ή μιτωτική ολίσθηση που ακολουθείται από μια ποικιλία κυτταρικών τύχες συμπεριλαμβανομένου του κυτταρικού θανάτου, γήρανση, ή ενδοαναδιπλασιασμό [1]. Αν και οι μηχανισμοί με τους οποίους η παρατεταμένη μίτωσης οδηγεί σε κυτταρικό θάνατο δεν είναι σαφείς, ένας ρόλος για τα αντι-αποπτωτικά μέλη της οικογένειας BCL2 έχει αναφερθεί [2]. Κατά τη διάρκεια της παρατεταμένης μιτωτική σύλληψη, κυκλίνη-κυκλίνη εξαρτώμενη κινάση (CDK) πρωτεΐνες φωσφορυλιώνει

BCL2

μέλη της οικογένειας, συμπεριλαμβανομένων BCL2, BCL-XL, και MCL1. Η φωσφορυλίωση των BCL2 και BCL-XL αποτέλεσμα την απελευθέρωση των προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών ΒΑΧ /ΒΑΚ? λαμβάνοντας υπόψη ότι η φωσφορυλίωση της MCL1 δημιουργεί μία θέση αναγνώρισης για την Ε3 λιγάση, APC /CDC20, με στόχο αυτό για την υποβάθμιση του πρωτεασώματος. Λειτουργική απολύσεων είναι πιθανό να υπάρχουν μεταξύ του

BCL2

μέλη της οικογένειας στη μεσολάβηση της ανταπόκρισης κυτταρικό θάνατο σε παρατεταμένη μίτωση.

αντιμιτωτικά φάρμακα που στοχεύουν τη δυναμική μικροσωληνίσκων (ΣΜΥ) χρησιμοποιούνται ευρέως στην κλινική για τη θεραπεία ένα ευρύ φάσμα καρκίνων. Αυτά περιλαμβάνουν μέσα σταθεροποίησης μικροσωληνίσκων, (ταξάνες, συμπεριλαμβανομένων ντοσεταξέλη και πακλιταξέλη, και εποθιλόνες) και παράγοντες μικροσωληνίσκων αποσταθεροποίηση (συμπεριλαμβανομένων αλκαλοειδή της βίνκα όπως βινκριστίνη και βινμπλαστίνη) [3]. Επιπλέον, Maytansines (DM1, DM4) και Auristatins (MMAE, MMAF) αλληλεπιδρούν με τη θέση δέσμευσης της βίνκα για τουμπουλίνης και χρησιμοποιούνται συνήθως ως η τοξίνη συνδέεται με προϊόντα σύζευξης φαρμάκου αντισώματος [4]. Ενώ διαιρούμενα καρκινικά κύτταρα είναι ευαίσθητα στην ΣΜΥ, άλλες κυτταρικές διεργασίες μικροσωληνίσκων-εξαρτώμενη, όπως η διακίνηση κυστιδίων, νευρωνική μεταφορά, και η ακεραιότητα του κυτταροσκελετού είναι επίσης διακόπτεται, οδηγώντας σε ανεπιθύμητες παρενέργειες συμπεριλαμβανομένης της νευροτοξικότητας και μυελοειδούς τοξικότητα [5]. Σε μια προσπάθεια να ξεπεραστούν αυτές τις παρενέργειες, αντιμιτωτικά φάρμακα που στοχεύουν τις πρωτεΐνες κινητήρας ατράκτου (KSP, Eg5) ή μιτωτική κινάσες (PLK1, Aurora κινάσης Α, κινάσης Aurora Β) που αναπτύσσονται, αλλά έχουν περιορισμένη επιτυχία μέχρι τώρα στην κλινική [6]. HSP90 είναι ένας μοριακός συνοδός που είναι υπεύθυνη για τη σωστή αναδίπλωση των πρωτεϊνών πολυάριθμων πελάτη, συμπεριλαμβανομένων πολλών ογκογόνων και μεταλλαγμένων καταστολέων όγκων [7]. Ο αναστολέας της HSP90 ΙΡΙ-504 απέδειξε αντινεοπλασματική δράση σε πολλά προκλινικά μοντέλα καρκίνου, παρέχοντας λογική για περαιτέρω κλινική ανάπτυξη του [7], [8], [9], [10], [11]. Είναι ενδιαφέρον, συνεργική δράση μεταξύ αναστολή της HSP90 και ταξάνες έχει παρατηρηθεί σε προκλινικά μοντέλα NSCLC [12] και οι αναστολείς της HSP90 έχουν αξιολογηθεί σε συνδυασμό με ντοσεταξέλη σε κλινικές μελέτες του NSCLC (NCT01646125, NCT01348126, NCT01798485, NCT01362400). Εντοπίσαμε ένα υποσύνολο των κυτταρικών σειρών NSCLC στην οποία IPI-504 και πράξη docetaxel σε συνέργεια για να ενισχύσει τον κυτταρικό θάνατο in vitro και αναστέλλει την ανάπτυξη του όγκου in vivo. Επειδή δεν έχει προσδιοριστεί η ακριβής μοριακή βάση για αυτή την συνέργεια, ερευνήσαμε το μοριακό μηχανισμό δράσης (ΜΟΑ) του IPI-504 σε συνδυασμό με docetaxel και άλλα αντιμιτωτικά. Οι μελέτες μας αποκάλυψαν μια ΜΟΑ περιλαμβάνει ένα σημείο ελέγχου εξαρτάται επιμήκυνση της μίτωσης. Περαιτέρω, εντοπίσαμε εξαρτήματα APC /C ως εν δυνάμει νέων πρωτεϊνών πελάτη HSP90, εν μέρει υπεύθυνη για τη συνέργεια των ναρκωτικών.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική δήλωση

Αυτή η μελέτη διεξήχθη σε σύμφωνα με τις συστάσεις στον οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση των ζώων Εργαστηρίου εκτυπώνονται από το Εθνικό Συμβούλιο Έρευνας του Εθνικού ακαδημαϊκοί. Το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την Επιτροπή Θεσμικών Animal Care and Use (IACUC) στο άπειρο Pharmaceuticals, Inc. Τα ζώα υποβλήθηκαν σε ευθανασία με CO

2 εισπνοής σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές IACUC. Κάθε προσπάθεια έγινε για να ελαχιστοποιηθεί η ταλαιπωρία των ζώων.

Οι κυτταρικές σειρές

κυτταρικές σειρές ανθρώπινου NSCLC Η292, Α549, Η522, H1993, Η1793 που ελήφθη από την American Type Culture Collection διατηρήθηκαν για αρκετά περάσματα κάτω από 5% CO

2 στους 37 ° C σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (Sigma-Aldrich).

μελέτες σε ζώα

πέντε έως έξι εβδομάδων αρσενικούς NCR ηυ /ηυ αθυμικοί ποντικοί αγοράστηκαν από την Taconic Farms. Τα ξενομοσχεύματα παρήχθησαν με υποδόρια εμφύτευση με 1 έως 5 × 10

6 κύτταρα στο δεξί πλευρό των ποντικών, και η θεραπεία ξεκίνησε όταν οι όγκοι έφθασαν έναν μέσο όγκο 120 σε 300 mm

3. ΙΡΙ-504 χορηγήθηκε ενδο-περιτοναϊκά δύο φορές την εβδομάδα σε μια δόση των 50 mg /kg. Docetaxel (McKeeson Pharmaceuticals) δοσολογήθηκε μία φορά την εβδομάδα σε 15 mg /kg (H1993, Α549 και Η292 μοντέλα ξενομοσχεύματος) ή 5 mg /kg (Η292 μοντέλο ξενομοσχεύματος) με ενδοπεριτοναϊκή ένεση.

Οι όγκοι μετρήθηκαν τρεις φορές ανά εβδομάδων με τη χρήση ψηφιακών δαγκάνες και ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον τύπο: (πλάτος χ μήκος

2) /2. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσος όρος όγκου του όγκου ± τυπικό σφάλμα του μέσου (SEM).

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε πυκνότητα 5000 κύτταρα /φρεάτιο 24 ώρες πριν στη θεραπεία με συνδυασμούς ΙΡΙ-504 και δοκεταξέλης, όπως υποδεικνύεται. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων μετρήθηκε με Alamar Blue (Life Technologies) ή κυττάρων Titer Glo (Promega). Ο θάνατος των κυττάρων μετρήθηκε με το ποσοστό των θετικών κυττάρων 7ΑΑΌ (γκουάβα Viacount Flex) ή με το ποσοστό των διασπασμένη κασπάση 3 θετικά κύτταρα σε μία δοκιμασία που βασίζεται φωταύγειας (Promega? κασπάση-Glo3 /7)

μελέτες Synergy

Συνδυασμός ευρετήρια (CI) προσδιορίστηκαν με τη μέθοδο των Chou και Talalay [13] με τη χρήση σταθερών και μη σταθερών αναλογιών των ναρκωτικών και του λογισμικού CalcuSyn (Biosoft). CI τιμές & lt? 1 δείχνουν συνέργεια, με τιμές & lt?. 0.5 δείχνει ισχυρή συνέργεια

Ανοσοαποτύπωσης /Ανοσοκαταβύθιση

Για την ανοσοαποτύπωση, τα κύτταρα λύθηκαν σε RIPA ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (Sigma-Aldrich) συμπληρωμένου με πρωτεάση αναστολείς (Roche) και αναστολείς φωσφατάσης (HALT? Thermo Fisher Scientific). Για HSP90 ανοσοκαθιζήσεις, σφαιρίδια κυττάρου συλλέχθηκαν επεξεργασία μετά φαρμάκου σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης χωρίς απορρυπαντικό (50 mM Tris ρΗ 7.4, 20 mM NaCl, 2 mM MgCl

2, 1 mM EDTA, 10% γλυκερόλη, δισκίο αναστολέα πρωτεάσης (Roche) και αναστολείς φωσφατάσης (Thermo Fisher Scientific)) που ακολουθείται από τρεις διαδοχικούς κύκλους πήξεως απόψυξης για λύση. Ανοσοκαταβυθίσεις διεξήχθησαν όλη τη νύχτα στους 4 ° C χρησιμοποιώντας ένα μονοκλωνικό αντίσωμα HSP90 (Santa Cruz) και σφαιρίδια Sepharose GammaBind G (GE Healthcare).

σταθερό ισότοπο Σήμανση Αμινοξέα σε καλλιέργεια (SILAC) επισήμανση και φασματομετρία μάζας

Μεταβολική σήμανση των κυττάρων Η292 διεξήχθη με φυσιολογική αργινίνη και λυσίνη ή βαρύτερα ισοτοπικές παραλλαγές των δύο αμινοξέων L-λυσίνη-ΗΟΙ [

13C

6], L-αργινίνη-ΗΟΙ [

13C

6

15N

4] χρησιμοποιώντας Invitrogen του SILAC-Flex Media kit και βαριά αργινίνη αγοράζονται από Thermo Fisher Scientific. Για να μειωθεί η πολυπλοκότητα του δείγματος, HSP90 ανοσοκατακρημνίσεις διεξήχθησαν σε κύτταρα επεξεργασμένα φάρμακο και πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με 1D-SDS-PAGE. Πρωτεΐνες από φέτες πηκτής υποβλήθηκαν σε πέψη χρησιμοποιώντας θρυψίνη χοίρου και αναλύθηκαν με LC-MS /MS. Τα πεπτίδια καθαρίζονται και συμπυκνώνονται χρησιμοποιώντας συμβουλές στάδιο C18 (Proxeon) και διαχωρίστηκαν με χρήση απευθείας ανάστροφου φάσεως C18 νανοκλίμακας σειρά υγρής χρωματογραφίας φασματομετρίας μάζας σε αντλία Surveyor MS συνδέεται με ένα LTQ-Orbitrap XL (Thermo Fischer Scientific) χρησιμοποιώντας μια γραμμική κλίση από 2 ώρες . Ο κατακερματισμός των κορυφαίων 10 πεπτίδια σε κάθε δείγμα έγινε από σύγκρουση που προκαλείται διάσπαση. Πρώτες MS αρχεία από LTQ-Orbitrap αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας MaxQuant (έκδοση 1.2.2.4) [14]. MS /MS φάσματα αναζήτηση ενάντια στο δόλωμα IPI-ανθρώπινη εκδοχή της βάσης δεδομένων 3.68 χρησιμοποιώντας τη μηχανή αναζήτησης της Ανδρομέδας. Ένα ποσοστό εσφαλμένης ανακάλυψη των 0,01 χρησιμοποιήθηκε και στα δύο επίπεδα πεπτιδίων και πρωτεϊνών.

μελέτες RNAi

Η292 κύτταρα επιμολύνθηκαν με 30 ηΜ siRNA χρησιμοποιώντας RNAimax (Invitrogen). siRNAs αγοράστηκαν από την Thermo Fisher Scientific ως ON-TARGET συν SMART πισίνες (μείγμα από 4 επιμέρους siRNAs ανά γονίδιο). SMART αλληλουχίες siRNA της πισίνας είναι: μη στόχευση (ομελέτα) έλεγχος: UGGUUUACAUGUCGACUAA, UGGUUUACAUGUUGUGUGA, UGGUUUACAUGUUUUCUGA, UGGUUUACAUGUUUUCCUA? ANAPC3: GGAAAUAGCCGAGAGGUAA, CAAAAGAGCCUUAGUUUAA, AAUGAUAGCCUGGAAAUUA, GCAUAUAGACUCUUGAAAG? και ANAPC4: GCCAGAAAGUUUACUCAUA, GAUGAACAGUGUAGUGCUA, ACACGUAGAUUGUUCAAAU, CGCUUUAGCUCCAGAGAUA. Τέσσερις ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα εμβολιάστηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων, σε επεξεργασία με ένα τιτλοποίηση της δόσης του docetaxel και συλλέχθηκαν για κυτταρομετρία ροής (ρΗ3) ή τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων (7AAD) 30 ώρες ή 72 ώρες μετά τη θεραπεία φαρμάκου, αντίστοιχα.

κυτταρομετρία ροής

οι σβώλοι κυττάρων συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση, μονιμοποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη στους 37 ° C για 15 λεπτά, τοποθετείται επί πάγου για 5 λεπτά, και στη συνέχεια σφαιροποιήθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε παγωμένο μεθανόλη για 30 λεπτά σε πάγος. Στη συνέχεια, τα σφαιρίδια κυττάρου πλύθηκαν σε 1% ορό αλβουμίνης βοός (BSA) σε PBS δυο φορές που ακολουθείται από επώαση με ένα συζευγμένο με FITC αντίσωμα ρΗ3 για 2 ώρες RT. Τα κυτταρικά ιζήματα πλύθηκαν δύο φορές με 1% BSA /PBS και επαναιωρήθηκαν σε 2 μg /mL Hoechst (Molecular Probes) /PBS στους 37 ° C για 15 λεπτά. Βιτρώ κύτταρα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μια ροή BD LSRII Fortessa κυτταρομετρητή. FITC θετικά κύτταρα μετρήθηκαν σε μήκος κύματος 488 nm, και το περιεχόμενο DNA μετρήθηκε με χρώση Hoechst χρησιμοποιώντας ένα λέιζερ UV. Η ανάλυση των δεδομένων έγινε με τη χρήση του λογισμικού FlowJo (V7.6.3).

Μικροσκοπία

εικόνες αντίθεσης φάσης συλλήφθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Nikon Eclipse TE2000-S μικροσκόπιο και το λογισμικό Spot για την απόκτηση της εικόνας (V4.7) .

μιτωτικά τινάξει-off

μιτωτικά κύτταρα συλλέχθηκαν με χειροκίνητο κτύπημα της φιάλης για να αποσπάσει μιτωτικά κύτταρα σε αναστολή. Μιτωτικές κύτταρα απομονώθηκαν από τα μέσα μαζικής ενημέρωσης με φυγοκέντρηση (1500 rpm, 5 λεπτά), υπέστησαν λύση σε ρυθμιστικό RIPA και επωάζονται παρουσία ή απουσία αλκαλικής φωσφατάσης (Sigma-Aldrich).

Αντισώματα και αντιδραστήρια

Τα αντισώματα για την HSP90 (Santa Cruz), HSP70 (Santa Cruz), κυκλίνη Β (BD Biosciences), Securin (Abcam), ANAPC3 (Bethyl Laboratories), ANAPC4 (Bethyl Laboratories), της κινάσης Aurora Β (Bethyl Laboratories), MCL1 ( Cell Signaling Technology), GAPDH (Cell Signaling Technology), υποδοχέα γλυκοκορτικοειδούς (Cell Signaling Technology), και FITC-S10 φωσφο-ιστόνης Η3 (Cell Signaling Technology) χρησιμοποιήθηκαν για ανοσοκαταβύθιση, ανοσοαποτύπωση και κυτταρομετρία ροής. αναστολέα /Β Aurora Α (ZM447439) αγοράστηκε από την EMD Millipore και ο αναστολέας PLK1 (BI2536) αγοράστηκε από SelleckChem. IPI-504 συντέθηκε στο άπειρο Pharmaceuticals, Inc.

Αποτελέσματα

IPI-504 και docetaxel στην ανάπτυξη του όγκου καταστολή συνδυασμό με NSCLC μοντέλα ξενομοσχεύματος όγκου

Για τον εντοπισμό κυτταρικών σειρών NSCLC αποδεικνύοντας in vivo ευαισθησία στο συνδυασμό του ΙΡΙ-504 και δοκεταξέλης, ποντίκια που φέρουν όγκους ξενομοσχεύματος (H1993, Α549, Η522 και Η292) υποβλήθηκαν σε θεραπεία με όχημα, 50 mg /kg ΙΡΙ-504 μόνο, 5 ή 15 mg /kg docetaxel μόνη της, ή ένας συνδυασμός των 50 mg /kg ΙΡΙ-504 και 5 ή 15 mg /kg docetaxel. Η θεραπεία με ΙΡΙ-504 μόνος παρεμπόδισε την ανάπτυξη του όγκου ως προς το όχημα σε ξενομοσχεύματα H1993, Α549, και Η292 (22-48%), αλλά δεν είχε δραστικότητα σε Η522 ξενομοσχεύματα (Εικ. 1). δραστηριότητα Single-παράγοντα παρατηρήθηκε κατά την αγωγή με docetaxel, με αποτέλεσμα την αναστολή της ανάπτυξης σε σύγκριση με όχημα H1993, Α549 και Η292 ξενομοσχεύματα (56-69%) (Σχ. 1Α-C). Σε αντίθεση με την δραστικότητα ως μονοθεραπεία, παρατηρήθηκε υποχώρησις όγκου σε απόκριση σε συνδυασμό ΙΡΙ-504 και docetaxel σε H1993 και τα μοντέλα ξενομοσχεύματος Α549 (Fig.s. 1Α και Β). αναστολή της ανάπτυξης όγκου ενισχύεται από το συνδυασμό σε σύγκριση με είτε απλός παράγων μόνη της σε όγκους ξενομοσχεύματος H292 (Εικ. 1 C). Λόγω της ισχυρής δραστικότητας μονοθεραπεία σε μοντέλο ξενομοσχεύματος Η522, η docetaxel δόση μειώνεται από 15 σε 5 mg /kg για τη μελέτη συνδυασμού. Ο συνδυασμός των 5 mg /kg docetaxel και 50 mg /kg ΙΡΙ-504 είχε ως αποτέλεσμα 71% αναστολή της ανάπτυξης του όγκου σε σύγκριση με το όχημα (Σχ. 1D). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν δυνητικές συνεργιστικές επιδράσεις του ΙΡΙ-504 και δοκεταξέλης στην αναστολή της ανάπτυξης σε προκλινικά μοντέλα NSCLC.

NCR ηυ /ηυ ομόζυγα αρσενικά ποντίκια εμφυτεύθηκαν υποδορίως με (Α) H1993, (Β) Α549, (C ) Η292 και (Δ) Η522 κύτταρα και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με φορέα DMSO (μαύροι κύκλοι), ΙΡΙ-504 (πράσινα τετράγωνα), DTX (μπλε διαμάντια), ή ο συνδυασμός του ΙΡΙ-504 και DTX (κόκκινα τρίγωνα). ΙΡΙ-504 χορηγήθηκε με ΙΡ ένεση σε δόση 50 mg /kg, δύο φορές την εβδομάδα για ένα σύνολο 6 δόσεις. DTX χορηγήθηκε στα 5 mg /kg (Η522) ή 15 mg /kg (H1993, Α549, Η292) με ένεση ΙΡ, εβδομαδιαίως για ένα σύνολο 3 δόσεων. Οι αριθμοί στις γραφικές παραστάσεις αντιπροσωπεύουν μέση εκατοστιαία αναστολή ανάπτυξης όγκου σε σχέση με βραχίονα υποστεί αγωγή με έκδοχο. Όπου ενδείκνυται, * υποδηλώνει στατιστική σημαντικότητα (p & lt? 0,05) μεταξύ της θεραπείας συνδυασμού και τα χέρια της θεραπείας DTX μετράται κατά την ημέρα 30 (H1993, H549, Η522) χρησιμοποιώντας έλεγχος τ

Η

IPI-504 και docetaxel. σε συνδυασμό δείχνουν in vitro συνέργεια σε NSCLC κυτταρικές σειρές

για να διερευνηθεί η MOA της ενισχυμένης ίη νίνο αναστολή όγκου με συνδυασμένη ΙΡΙ-504 και δοκεταξέλης, η επίδραση του συνδυασμού επί του κυτταρικού θανάτου και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων προσδιορίστηκε in vitro. Για μελέτες κυτταρικού θανάτου σε κύτταρα Η292, συνδυασμός δείκτες υπολογίστηκαν με τη μέθοδο της μη-σταθερή αναλογία φάρμακο Chou και Talalay, με τιμές CI & lt? 1.0 ενδεικτικό της συνέργειας [13]. Δόσεις IPI-504 (75 με 125 nM) αποτελεσματική για την αναστολή της ανάπτυξης (S1 Α Εικ.) Ήταν σε μεγάλο βαθμό αναποτελεσματική στην δίδοντας ένα κυτταροτοξική αντίδραση παραπάνω έλεγχο στα κύτταρα Η292 (Εικ. 2Α, αριστερό πάνελ). Ωστόσο, συνδυάζοντας IPI-504 (75 – 125 nm), 50 nM docetaxel αύξησε το θάνατο των κυττάρων Η292 από 24% (μονοθεραπεία με docetaxel) σε 61-68% (συνδυασμό) με τιμές CI ενδεικτική ισχυρή συνέργεια (CI & lt? 0,2). Ομοίως, συνδυάζοντας docetaxel (1 έως 4 ηΜ) με 2 μΜ ΙΡΙ-504 αύξησε το θάνατο κυττάρου Η292 από 37% (ΙΡΙ-504 μόνο) σε 63 έως 71% (συνδυασμό) με τιμές CI ενδεικτικές της συνέργειας (CI & lt? 0,5) ( Εικ. 2Α, δεξί πάνελ).

(Α) ο κυτταρικός θάνατος μετρήθηκε 48 ώρες μετά τη θεραπεία με αναλογία φαρμάκου συνδυασμούς IPI-504 και docetaxel (DTX) από 7ΑΑΌ μη σταθερή στα κύτταρα Η292. Δείκτες τιμών συνδυασμού (CI) υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό CalcuSyn (Biosoft) με τιμές & lt? 0,5 ​​ενδεικτική ισχυρή συνέργεια. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση (η = 4). Οι τιμές για όλες τις θεραπείες συνδυασμού ήταν στατιστικά σημαντική σε σύγκριση με τις θεραπείες απλού παράγοντα, όπως προσδιορίζεται με τη δοκιμασία t του Student (ρ & lt? 0,01). θάνατο (Β) των κυττάρων μετρήθηκε 30 ώρες θεραπείας μετά τα ναρκωτικά στην H1993 κύτταρα χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία φωταύγειας κασπάσης-Glo3 /7. Αντιπροσωπευτικά δεδομένα εμφανίζονται (n = 2). (C) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με σταθερή αναλογίες φαρμάκου της ΙΡΙ-504 και DTX για 72 ώρες? πολλαπλασιασμός κυττάρων μετρήθηκε με Alamar Blue. Εμφανίζονται κανονικοποιούνται ισοβολογραμμάτων. D = δόση, ED

50 = δόση που απαιτείται για την επίτευξη του 50% αναστολής της ανάπτυξης. Σημεία στο γράφημα αναφέρονται στην αναλογία D /ED

50 για DTX στον χ-άξονα έναντι D /ED

50 για ΙΡΙ-504 στον γ-άξονα. Τα σημεία δεδομένων που εμπίπτουν στη διαγώνιο αντιπροσωπεύουν προσθετικότητα? πάνω από τη διαγώνιο, ο ανταγωνισμός? κάτω από τη διαγώνιο, συνέργεια. (Δ) Η θεραπεία με αναστολέα PLK1 (BI2436) ευαισθητοποιεί τα κύτταρα Η292 σε IPI-504. κύτταρα Η292 υποβλήθηκαν σε αγωγή για 72 ώρες με μια τιτλοποίηση της δόσης του ΙΡΙ-504 μόνο (μπλε διαμάντια) ή σε συνδυασμό με 5 ηΜ BI2536 (κόκκινα τετράγωνα) που ακολουθείται από δοκιμασία κυτταρικού θανάτου (7AAD). Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση (n = 2).

Η

Σε H1993 κυττάρων, συνδυασμούς των χαμηλών (2 nM) ή υψηλή (20 nM) δόσεις docetaxel με δόσεις IPI-504 εκπροσωπεί το ΕΚ

20 (14 ηΜ), EC

50 (59 ηΜ), ή ΕΚ

80 (255 ηΜ) για την αναστολή της ανάπτυξης (S1A Σχ.) εξετάστηκαν για κυτταρικό θάνατο χρησιμοποιώντας δοκιμασία κασπάση-Glo3 /7. Αυξήσεις της τάξης του 2 έως 4 φορές σε δραστικότητα κασπάσης παρατηρήθηκαν με τον συνδυασμό φαρμάκων σε σχέση με αποκρίσεις μοναδικός παράγοντας για όλες εκτός από το συνδυασμό χαμηλότερης δόσης 14 ηΜ ΙΡΙ-504 και 2 ηΜ docetaxel (Εικ. 2Β).

Για τις μελέτες του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, ένα πάνελ κυτταρικών γραμμών υποβλήθηκε σε επεξεργασία με σταθερό αναλογίες φαρμάκου. Μία συνεργιστική απόκριση σε συνδυασμό φαρμάκου παρατηρήθηκε σε όλες τις τέσσερις κυτταρικές σειρές για τις οποίες συνδυασμού αποτελέσματα είχαν προηγουμένως παρατηρηθεί in vivo (Σχήμα 2C?. Α549, H1993, Η292, Η522 και). Δεν υπήρξε καμία ένδειξη συνεργιστική δράση του συνδυασμού φαρμάκου σε Η1793 κύτταρα, γεγονός που υποδηλώνει ότι ορισμένες κυτταρικές γραμμές που δεν μπορεί να ανταποκρίνεται σε αυτό το συγκεκριμένο συνδυασμό (Σχ. 2C). Δυστυχώς, επιβεβαιωτικές μελέτες ξενομοσχεύματος δεν ήταν δυνατόν με Η1793, καθώς τα κύτταρα δεν αναπτύχθηκαν σε είτε ανοσοκατεσταλμένους ποντικούς ηυ /ηυ ή NOD /SCID NCR. κύτταρα Η292 επιλέχθηκαν για την πλειοψηφία των επόμενων μηχανιστικές μελέτες, δεδομένου ότι εμφανίζεται το ισχυρότερο και πιο συνεπή συνεργιστική απόκριση σε συνδυασμό φαρμάκου in vitro, ωστόσο, άλλες κυτταρικές γραμμές μελετήθηκαν επίσης σε συγκεκριμένες περιπτώσεις. Συνολικά, αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι μερικές NSCLC κυτταρικές γραμμές δείχνουν αξιοσημείωτες μειώσεις στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και αυξάνει σε αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο με συνδυασμένη ΙΡΙ-504 και θεραπεία docetaxel σε σύγκριση με τις απλούς παράγοντες μόνο. ​​

Αναστολείς σχεδιασμένα να στοχεύουν μιτωτική κινάσες, όπως PLK1, αντιπροσωπεύουν μια εναλλακτική κατηγορία αντιμιτωτικά να ΣΜΥ. PLK1 είναι ένας σημαντικός ρυθμιστής της μίτωσης και μία πρωτεΐνη αλληλεπίδρασης γνωστό HSP90 [15]. Ένας αναστολέας ΡίΚ (BI2536) εμφανίζουν 10 φορές μεγαλύτερη εκλεκτικότητα για PLK1 σε σύγκριση με PLK2 ή PLK3 χρησιμοποιήθηκε για τη διερεύνηση επιπτώσεων συνδυασμό με IPI-504. Η επεξεργασία των κυττάρων Η292 με ΕΚ

50 δόση του ΙΡΙ-504 για την αναστολή της ανάπτυξης (175 ηΜ) αύξησε κυτταρικό θάνατο από 24% όταν συνδυάζεται με όχημα σε 45% όταν συνδυάζεται με μια ΕΚ

50 δόση του BI2536 για την ανάπτυξη αναστολή (5 ηΜ) (Σχ. 2D και S1B Εικ.). Αυτά τα δεδομένα είναι συνεπή με την υπόθεση ότι ΙΡΙ-504 συνδυάζει με διαφορετικές κατηγορίες αντιμιτωτικά να προάγουν θάνατο κυττάρου από ανεξάρτητους μηχανισμούς.

ΙΡΙ-504 και ο συνδυασμός docetaxel αγωγή έχει ως αποτέλεσμα τη συσσώρευση του μιτωτικά κύτταρα

Δεδομένου ότι οι αντιμιτωτικά αποτελέσματα της docetaxel είναι η μοριακή βάση για την τοξικότητά του, δοκιμάσαμε την πρόβλεψη που IPI-504 ενισχύει τα αντιμιτωτικά αποτελέσματα της docetaxel. Η μιτωτική πληθυσμός, επίσης γνωστή ως μιτωτικός δείκτης, μετρήθηκε σε Η292 κύτταρα επεξεργασμένα σε διάφορα χρονικά σημεία και δοσολογικές συνδυασμούς ΙΡΙ-504 και δοκεταξέλης. Ο συνδυασμός χαμηλής δόσης (2 ηΜ) docetaxel με ΙΡΙ-504 είχε ως αποτέλεσμα μια παροδική αύξηση στο μιτωτικό δείκτη (10% σε 8 h σε 26% στις 30 ώρες) πριν από την επιστροφή στα βασικά επίπεδα (4% στις 48 ώρες) (Σχ. 3Α). Σε αντίθεση, ο μιτωτικός δείκτης δεν ανέβηκε πάνω από την αρχική τιμή σε όλη τη διάρκεια του πειράματος σε κύτταρα κατεργασμένα με είτε ΙΡΙ-504 ή docetaxel σαν απλούς παράγοντες (Εικ. 3Α). Μια παρόμοια παροδική αύξηση στο μιτωτικό δείκτη που ακολουθείται από μια μείωση παρατηρήθηκε κατά την αγωγή Η292 κύτταρα με υψηλή δόση docetaxel (20 ηΜ) ως μονοθεραπεία (Σχ. 3Β, αριστερό πάνελ). Η προσθήκη του ΙΡΙ-504 προς docetaxel υψηλή δόση αύξησε το πλάτος και τη διάρκεια της μίτωσης (Σχ. 3Β, αριστερό πάνελ). Σε αντίθεση με τα κύτταρα Η292, μια αύξηση στο μιτωτικό δείκτη δεν παρατηρήθηκε κατά την αγωγή των κυττάρων Α549 με τη χαμηλή δόση (2 ηΜ) docetaxel και IPI-504 συνδυασμού (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα), υποδεικνύοντας ότι η απάντηση σε αυτό το συνδυασμό του φαρμάκου μπορεί να είναι κύτταρο πληκτρολογήστε συγκεκριμένες. Ωστόσο, η αύξηση του πλάτους και της διάρκειας της μιτωτικής σύλληψης παρατηρήθηκε σε κύτταρα Α549 σε επεξεργασία με το docetaxel υψηλή δόση (20 ηΜ) και IPI-504 συνδυασμός σε σχέση και μόνο για να docetaxel, συγκρίσιμη με εκείνη που παρατηρήθηκε σε κύτταρα Η292 (Σχ. 3Β, δεξιά πίνακας). Από τις μιτωτικής επιδράσεις που παρατηρούνται σε συνδυασμό με το IPI-504 ήταν συνεπείς σε πολλούς τύπους κυττάρων, docetaxel υψηλή δόση επιλέχθηκε για μεταγενέστερες μελέτες ΜΟΑ.

ΕΚ

50 δόσεις για IPI-504 προσδιορίστηκαν από 72 ώρες κυττάρων Ο τίτλος Glo (S1 Α Εικ.). Η292 (Α, Β αριστερό πάνελ) και Α549 (Β, δεξιός πίνακας) κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με DMSO (μπλε διαμάντια), IPI-504 (κόκκινα τετράγωνα), DTX (πράσινα τρίγωνα) ή-504 IPI /συνδυασμός DTX (μωβ κύκλοι) και συλλέχθηκαν στα δεικνυόμενα χρονικά σημεία για την παρουσία της μιτωτικής δείκτη, ρΗ3. Τα αντιπροσωπευτικά δεδομένα εμφανίζονται (n = 2).

Η

Η μιτωτική σημείο ελέγχου είναι εν μέρει υπεύθυνη για τις συνέπειες κυτταρικό θάνατο του IPI-504 και docetaxel

Η μιτωτική σύλληψη προηγείται κυτταρικό θάνατο σε IPI -504 και τα κύτταρα docetaxel έλαβαν πρότεινε ότι η ενεργοποίηση της μιτωτικής σημείο ελέγχου είναι ένας σημαντικός καθοριστικός παράγοντας της απόκρισης κυτταρικού θανάτου. Για να ελέγξει την υπόθεση αυτή, ένας εκλεκτικός αναστολέας της κινάσης Aurora A /Aurora Β (ZM447439) χρησιμοποιήθηκε για να παρακάμψετε την μιτωτική σημείο ελέγχου στα κύτταρα Η292 θεραπεία με το IPI-504 και ο συνδυασμός docetaxel. Κατεργασία Η292 κυττάρων με ZM447439 οδήγησε στην κατάργηση της ΙΡΙ-504 και δοκεταξέλης επαγόμενη μιτωτική σημείο ελέγχου διακοπής όπως προσδιορίζεται με μία αξιοσημείωτη μείωση στην μιτωτικός δείκτης (Εικ. 4Α, αριστερό πάνελ). εικόνες αντίθεσης φάσης παρέχεται οπτική επιβεβαίωση της στρογγυλοποιείται κύτταρα (μιτωτική), χαρακτηρίστηκε κυρίως σε καλλιέργειες από το IPI-504 και τα κύτταρα που έλαβαν docetaxel σε σύγκριση με την πιο πεπλατυσμένη μορφολογία του IPI-504, docetaxel, και ZM447439 επεξεργασμένα κύτταρα (Εικ. 4Α, δεξιά πίνακας). Για να αξιολογηθεί η επίδραση της μιτωτικής οδοφράγματος παράκαμψης, ο κυτταρικός θάνατος μετρήθηκε μετά από αγωγή των κυττάρων Η292 με ΙΡΙ-504 και docetaxel σε παρουσία ή απουσία ZM447439 (Εικ. 4Β). Ενώ οι επιδράσεις της Aurora αναστολής κινάσης επί θανάτου κυττάρου έδειξε μεταβλητά αποτελέσματα όταν συνδυάζεται με είτε ΙΡΙ-504 ή docetaxel σαν απλούς παράγοντες (S2 Σχ.), Η θεραπεία με ZM447439 διασώθηκαν μερικώς τη συνέργεια κυτταρικού θανάτου του ΙΡΙ-504 και δοκεταξέλης, μειώνοντας το ποσοστό των νεκρών κυττάρων από 40% έως 22% (Εικ. 4Β). Αυτό είναι συνεπές με την υπόθεση ότι ο μιτωτικός σημείο ελέγχου είναι εν μέρει υπεύθυνη για αυτή τη συνεργιστική δράση.

Η292 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για 30 ώρες (Α, C) ή 48 ώρες (Β) με συνδυασμούς υποδεικνυόμενη δόση του ΙΡΙ-504 (175 ηΜ), DTX (20 ηΜ) και ο αναστολέας κινάσης Aurora ZM447439 (9 μm). Τα κύτταρα συλλέχθηκαν για (Α) κυτταρομετρία ροής (ρΗ 3) και απεικόνιση αντίθεσης φάσης, (Β) θάνατος κυττάρων (7AAD), και (Γ) ανάλυση ανοσοκηλίδος. Ένα βέλος υποδηλώνει μια αργή μεταναστευτικών, φωσφορυλιωμένη μορφή της Securin. μπάρες σφάλματος για μιτωτικό δείκτη και τον κυτταρικό θάνατο αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση των επαναλήψεων από δύο ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Η ταυτόχρονη με μιτωτική σύλληψη, IPI-504 και συνδυασμούς δόση docetaxel οδήγησε σε μια συσσώρευση των πρωτεϊνών μιτωτικής Securin, Κυκλίνη Β, και AURKB (Εικ. 4C). Η εμφάνιση ενός αργή μορφή μεταναστευτική του Securin, πιστεύεται ότι αντιπροσωπεύουν την ενεργή, φωσφορυλιωμένη μορφή [16] παρατηρήθηκε ειδικώς σε κύτταρα που έλαβαν το συνδυασμό ΙΡΙ-504 και δοκεταξέλης (Εικ. 4C, βέλος). Η αργή μορφή μεταναστευτική μετατράπηκε στην ταχέως μεταναστεύουν μορφή κατά την κατεργασία φωσφατάσης, επιβεβαιώνοντας ότι η αργή μορφή μεταναστεύουσα αντιπροσωπεύει την φωσφορυλιωμένη μορφή (S3 Εικ.). Κατάργηση της ΙΡΙ-504 και δοκεταξέλης επάγεται πάνω ρύθμιση των μιτωτικών πρωτεϊνών Securin, κυκλίνη Β, και AURKB παρατηρήθηκε κατά τη συν-θεραπεία με ZM447439 (Εικ. 4C). Σε αντίθεση, συν-θεραπεία με ZM447439 δεν καταργεί IPI-504 που προκαλείται ανοδική ρύθμιση της HSP70, υποκατάστατος δείκτης για την αναστολή της HSP90 [17], υποδεικνύοντας ότι IPI-504 είναι ακόμα ενεργή σε αυτά τα κύτταρα.

έχει αναφερθεί ότι κατά τη διάρκεια παρατεταμένης μιτωτική σύλληψη, φωσφορυλίωση του αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη MCL1 από κυκλίνη Β-CDK1 εκκινεί APC /C-εξαρτώμενη καταστροφή του, οδηγώντας σε κυτταρικό θάνατο κατά τη διάρκεια της μίτωσης [18]. Είναι ενδιαφέρον ότι, τα κάτω ρύθμιση MCL1 πρωτεΐνης παρατηρήθηκε ειδικά σε Η292 κύτταρα επεξεργασμένα με την ΙΡΙ-504 και ο συνδυασμός docetaxel, μια επίδραση που ακυρώθηκε μετά από συν-θεραπεία με τον αναστολέα της κινάσης Aurora (Εικ. 4C).

ανάφαση Προώθηση των πολύπλοκων οι (/C APC) συνιστώσες εξαντλούνται συγκεκριμένα από την interactome HSP90 στην IPI-504 και τα κύτταρα που έλαβαν docetaxel

Μετά την αναστολή της HSP90, misfolded πρωτεΐνες πελάτης αποσυνδεθεί από την HSP90 και στη συνέχεια έχουν επιλεγεί για την υποβάθμιση πρωτεασώματος με τη μεσολάβηση [19]. Για τον εντοπισμό πιθανών πρωτεΐνες πελάτη που συμβάλλουν στη συνέργεια του ΙΡΙ-504 και δοκεταξέλης, SILAC διεξήχθη και HSP90 αλληλεπιδρούν πρωτεϊνών που περιλαμβάνουν την «interactome» ταυτοποιήθηκαν υπό συνθήκες της φαρμακευτικής αγωγής με φασματομετρία μάζας. Η interactome HSP90 για την προς τα εμπρός πείραμα στο οποίο Η292 κύτταρα επισημαίνονται με βαριά ισότοπα από λυσίνη και αργινίνη υποβλήθηκαν σε θεραπεία με τον συνδυασμό του ΙΡΙ-504 και δοκεταξέλης και Η292 κύτταρα επισημαίνονται με φυσιολογική λυσίνη και αργινίνη έλαβαν θεραπεία με όχημα μόνο εξετάστηκε και συγκρίθηκε με τα δεδομένα που λαμβάνεται από το αντίστροφο πείραμα στο οποίο Η292 κύτταρα επισημαίνονται με τα βαρέα ισότοπα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με όχημα μόνο και Η292 κύτταρα επισημαίνονται με τις κανονικές ισότοπα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με τον συνδυασμό του ΙΡΙ-504 και δοκεταξέλης (Εικ. 5Α). Όπως ήταν αναμενόμενο, Hsp70 ήταν έντονα τα πάνω ρυθμισμένη στο interactome HSP90 κατά ΙΡΙ-504 και θεραπεία docetaxel (Εικ. 5Β) [17]. Ομοίως, Glucocortocoid Receptor (GR), μία γνωστή πρωτεΐνη πελάτης HSP90, ήταν έντονα κάτω ρυθμισμένα από την interactome HSP90 κατά τον συνδυασμό θεραπείας (Εικ. 5Β) [20]. Αρκετές δυναμικό πρωτεΐνες πελάτη νέα HSP90 ταυτοποιήθηκαν ότι είχαν ρυθμισμένα προς τα κάτω σε απόκριση του συνδυασμού, ένας αριθμός των οποίων παίζουν ρόλο στην μιτωτική απόκριση σημείου ελέγχου (S1 πίνακα). Αυτές περιελάμβαναν δύο συστατικά του APC /C, ANAPC3 και ANAPC4 (Εικ. 5Β). Για την επιβεβαίωση των δεδομένων SILAC, πρωτεΐνη αφθονία προσδιορίστηκε με ανάλυση κηλίδας Western των προϊόντων λύσης συλλέγονται από Η292 κύτταρα επεξεργασμένα με ΙΡΙ-504 και docetaxel σε συνδυασμό (Σχήμα 5C?.. S4 Εικ). Παρόμοια με GR, ρύθμιση προς τα κάτω των δύο ANAPC3 και ANAPC4 παρατηρήθηκε κατά την αγωγή του Η292 με το συνδυασμό του ΙΡΙ-504 και docetaxel σύγκριση με το όχημα (Εικ. 5C). Η αυξητική ρύθμιση του Hsp70 επιβεβαιώθηκε κατά την επεξεργασία με ΙΡΙ-504 μόνο του ή σε συνδυασμό με ντοσεταξέλη (Εικ. 5C) .Η συμβολή του APC /C σε κυτταρικό θάνατο συνεργία με το συνδυασμό του ΙΡΙ-504 και δοκεταξέλης εκτιμήθηκε εξετάζοντας αν απώλεια των συστατικών APC /C θα μπορούσαν να αντικαταστήσουν IPI-504 στην ευαισθητοποίηση των κυττάρων με docetaxel. Η APC /C συστατικά ANAPC3 και ANAPC4 χτυπήθηκαν κάτω με siRNA μεμονωμένα ή σε συνδυασμό, και μετρήθηκαν οι επιδράσεις στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων μετά από θεραπεία docetaxel. Σε συγκεντρώσεις της docetaxel μεγαλύτερες από 5 nm, τα πλατώ του κυτταρικού θανάτου αυξήθηκε από 63% στο περιπλεγμένο ελέγχου siRNA, σε 73% με την ANAPC4 knockdown, και το 80% με την ANAPC3 knockdown μόνη ή σε συνδυασμό με ANAPC4 knockdown (Εικ. 5D, αριστερά πίνακας). Απώλεια των συστατικών APC /C ενίσχυσε τα αντιμιτωτικά αποτελέσματα της docetaxel, αυξάνοντας το μιτωτικό δείκτη από 17% με docetaxel (10 ηΜ) μόνο στο 33% όταν συνδυάζεται με απώλεια ANAPC3 /ANAPC4 (Σχ. 5D, δεξί πάνελ). ανάλυση Western blot επιβεβαίωσε αποτελεσματική εξουδετέρωση των συστατικών APC /C (Σχ. 5Ε).

(Α) σταθερό ισότοπο Σήμανση Αμινοξέα στον Πολιτισμό (SILAC) σχηματικό. Μεταβολικά σημασμένα Η292 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για 24 ώρες με το συνδυασμό των 300 ηΜ ΙΡΙ-504 και 10 ηΜ DTX ή όχημα (DMSO), ακολουθούμενη από την αναγνώριση του interactome HSP90 με φασματομετρία μάζας. (Β) τα ακατέργαστα δεδομένα από τη μελέτη SILAC. Τα σημεία δεδομένων στην πάνω δεξιά και κάτω αριστερά τεταρτημόρια αντιπροσωπεύουν πρωτεΐνες που ρυθμίζονται πάνω-κάτω-ρυθμίζονται, αντίστοιχα, στο interactome HSP90 κατά την κατεργασία με το συνδυασμό σε σύγκριση με το όχημα. Τα δύο βέλη στην άνω δεξιά τεταρτημόριο αντιπροσωπεύουν ανεξάρτητα θραύσματα πεπτιδίου με μοναδικές ακολουθίες στόχευσης HSP70. (C) Ανάλυση ανοσοαποτύπωσης επαληθεύει εξάντληση του ANAPC3 και ANAPC4 κατόπιν 24 ώρες επεξεργασία των κυττάρων Η292 με 300 ηΜ ΙΡΙ-504 και 10 συνδυασμό DTX ηΜ. GR = υποδοχέα γλυκοκορτικοειδούς. (Δ) Απώλεια συστατικά APC /C από RNAi ευαισθητοποιεί τα κύτταρα Η292 με DTX μεσολάβηση κυτταρικό θάνατο (72 ώρες, 7ΑΑΌ) (αριστερό πάνελ) και αυξάνει την μιτωτική δείκτη (30 h, ρΗ 3) (δεξιά πλευρά). κύτταρα Η292 επιμολύνονται με nontargeting ομελέτα siRNA (μπλε διαμάντια) ή ANAPC3 siRNA στόχευση (κόκκινα τετράγωνα), ANAPC4 (πράσινα τρίγωνα), ή ANAPC3 /συνδυασμό ANAPC4 (μωβ κύκλοι). ανάλυση (Ε) Ανοσοστύπωμα δείχνει knockdown αποδοτικότητα. Τα αντιπροσωπευτικά δεδομένα εμφανίζονται (n = 2).

Η

Συζήτηση

ΣΜΥ που διαταράσσουν τη δυναμική των μικροσωληνίσκων είναι μεταξύ των πλέον αποτελεσματικών αντιμιτωτικά θεραπείες για ένα ευρύ φάσμα καρκίνων. Δυστυχώς, MTA που σχετίζονται με τοξικότητα και την αντίσταση των ναρκωτικών εξακολουθούν να αποτελούν μείζονες προκλήσεις.