Αφηρημένο

Η πρωτεΐνη των οστών μορφογενετικών (ΒΜΡ) καταρράκτη σηματοδότησης ενεργοποιούνται ανωμάλως σε ανθρώπινο μη μικροκυτταρικό καρκίνο του καρκίνος του πνεύμονα (NSCLC), αλλά όχι σε φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα πνεύμονα, γεγονός που υποδηλώνει ότι το κλείδωμα ΒΜΡ σηματοδότηση μπορεί να είναι μια αποτελεσματική θεραπευτική προσέγγιση για τον καρκίνο του πνεύμονα. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι ορισμένοι ανταγωνιστές BMP, τα οποία δεσμεύονται σε εξωκυτταρικά προσδέματα BMP και να αποτρέψει την ένωσή τους με τους υποδοχείς ΒΜΡ, μείωσε δραματικά την ανάπτυξη όγκου πνεύμονα. Ωστόσο, η κλινική εφαρμογή των με βάση τις πρωτεΐνες ανταγωνιστών ΒΜΡ περιορίζεται από μικρό χρόνο ημίσειας ζωής, κακή διανομή εντός του όγκου, καθώς και αντίσταση που προκαλείται από πιθανές μεταλλάξεις κέρδος-of-λειτουργία στην κατάντη της οδού BMP. Μικρό μόριο αναστολείς της ΒΜΡ που στοχεύουν τα ενδοκυτταρικά καταρράκτες ΒΜΡ θα ήταν ιδανικό για την ανάπτυξη αντικαρκινικών φαρμάκων. Σε ένα zebrafish διάρθρωση και τη δραστηριότητα μελέτη εμβρυϊκής βάση, έχουμε ήδη εντοπίσει μια ομάδα άκρως εκλεκτικοί αναστολείς μικρού μορίου ειδικά ανταγωνίζεται την ενδοκυτταρική περιοχή της κινάσης των υποδοχέων που BMP τύπου. Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι DMH1, ένας από αυτούς τους αναστολείς, ισχυρά μειωμένη πολλαπλασιασμός των κυττάρων των πνευμόνων, που προωθείται κυτταρικό θάνατο, και μειωμένη κυτταρική μετανάστευση και εισβολή σε κύτταρα NSCLC μπλοκάροντας BMP σηματοδότησης, όπως υποδεικνύεται από την καταστολή της Smad 1/5/8 φωσφορυλίωση και γονιδιακή έκφραση ID 1, ID2 και Ιδ3. Επιπλέον, η θεραπεία DMH1 μείωσε σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου σε ανθρώπινο πνεύμονα μοντέλο ξενομοσχεύματος καρκίνου. Συμπερασματικά, η μελέτη μας δείχνει ότι μικρού μορίου αναστολείς του τύπου BMP υποδοχέων Ι μπορεί να προσφέρει μια πολλά υποσχόμενη νέα στρατηγική για τη θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα

Παράθεση:. Hao J, Lee R, Chang Α, Fan J, Labib C, Parsa C, et al. (2014) DMH1, ένα μικρό μόριο αναστολέα της ΒΜΡ Τύπου Ι Υποδοχείς, και καταστέλλει την ανάπτυξη εισβολή του καρκίνου του πνεύμονα. PLoS ONE 9 (3): e90748. doi: 10.1371 /journal.pone.0090748

Επεξεργαστής: Ο Carl G. Μάκη, του Πανεπιστημίου Rush Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 12 του Δεκέμβρη του 2013? Αποδεκτές: 5 Φεβ 2014? Δημοσιεύθηκε: 6 Μαρτίου 2014

Copyright: © 2014 Hao et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το ταμείο σπόρο του Κολεγίου κτηνιατρικής στο Πανεπιστήμιο Δυτικής Επιστημών Υγείας (JH), και τη Δυτική Πανεπιστήμιο Επιστημών Ταμείου Ανάπτυξης Τμήμα Υγείας (ΥΗ). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του πνεύμονα είναι ένας από τους πιο κοινούς τύπους καρκίνου και την κύρια αιτία των θανάτων από καρκίνο. Περίπου 228.190 περιπτώσεις καρκίνου του πνεύμονα αναμένεται να διαγνωστεί πρόσφατα το 2013, αντιπροσωπεύοντας το ~27% όλων των θανάτων από καρκίνο κάθε χρόνο στις ΗΠΑ [1]. Ο κύριος τύπος του καρκίνου του πνεύμονα, μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC), περιλαμβάνει περίπου 85% του συνόλου διαγιγνώσκονται καρκίνων του πνεύμονα. Παρά τις βελτιώσεις στη διάγνωση και τη χημειοθεραπεία, ποσοστό επιβίωσης 5 ετών για ασθενείς με ΜΜΚΠ εξακολουθεί να είναι πολύ χαμηλή. Πρόσφατα, έχουν μεγάλη προόδους έχουν γίνει στην κατανόηση των μοριακών μηχανισμών οδήγησης ανάπτυξη καρκίνου του πνεύμονα, το οποίο οδήγησε σε μερικές στοχευμένες θεραπείες [2]. Ωστόσο, οι ασθενείς που ανταποκρίνονται αρχικά πάντοτε υποτροπιάζουν. Υπάρχει ανάγκη για την ταυτοποίηση νέων στόχων για NSCLC.

μορφογενετικές πρωτεΐνες

Bone (ΒΜΡ) είναι μέλη της ΤΟΡ-β υπεροικογένειας και τη βιολογική δραστηριότητα τους επιτυγχάνεται με τη μεσολάβηση του σχηματισμού ετεροδιμερών συμπλοκών του τύπου Ι και τύπου BMP II σερίνης /θρεονίνης υποδοχείς. Μετά τη δέσμευση του συνδέτη, οι υποδοχείς Ι ΒΜΡ τύπου φωσφορυλιώνονται από τους υποδοχείς συστατικώς δραστικές τύπου II, που οδηγεί σε φωσφορυλίωση των ενδοκυτταρικών πρωτεϊνών Smad 1/5/8, το οποίο στη συνέχεια σχηματίζει ένα σύμπλοκο με Smad4 και μετατοπίζονται στον πυρήνα για τη ρύθμιση μεταγραφικής απόκρισης [3], [4]. Πάνω από 20 συνδέτες ΒΜΡ έχουν εντοπιστεί μέχρι σήμερα [5]. Η υπερέκφραση της ΒΜΡ-2 έχει συσχετιστεί με ~ 98% του NSCLC και άλλοι τύποι κακοήθειας [6], [7]. Επιπλέον, η αναγκαστική έκφραση της ΒΜΡ-2 σε κυτταρικές γραμμές NSCLC ενίσχυσε σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου σε ένα μοντέλο ποντικού καρκίνου του πνεύμονα μετά από ενδοφλέβια ένεση ουρά των κυττάρων όγκου [8]. Αντιστρόφως, η ΒΜΡ ανταγωνιστής νογκίνη και το εξωκυτταρικό spp24 ψευδο (εκκρίνεται φωσφοπρωτεΐνη 24 kD) μείωσε δραματικά την ανάπτυξη του όγκου του πνεύμονα σε υποδόρια μοντέλα ξενομοσχεύματος ποντικού [9], [10], υποδηλώνοντας ότι η αναστολή της σηματοδότησης ΒΜΡ μπορεί να είναι μια αποτελεσματική θεραπεία για τον καρκίνο του πνεύμονα . Ωστόσο, η πρωτεΐνη που βασίζεται ΒΜΡ ανταγωνιστές ή ψευδο spp24 κυρίως παρεμβαίνει η σύνδεση των εξωκυτταρικών συνδετήρων ΒΜΡ με τους υποδοχείς τους. κλινική εφαρμογή τους θα μπορούσε να περιοριστεί από πιθανές μεταλλάξεις κέρδος-of-λειτουργία στα κατάντη μέλη της ΒΜΡ καταρράκτη ή σύντομη ημι-ζωή και η κακή παράδοση σε όγκους που είναι κοινά προβλήματα που συνδέονται με τη θεραπεία με βάση τις πρωτεΐνες σηματοδότησης.

σε μια

in vivo

δομής-δραστικότητας μελέτης σχέση που βασίζεται σε ένα zebrafish μοντέλο της εμβρυϊκής ανάπτυξης, έχουμε ήδη εντοπίσει μια ομάδα άκρως εκλεκτικοί αναστολείς μικρού μοριακού BMP συμπεριλαμβανομένων DMH1 και DMH2, τα οποία εμποδίζουν ειδικά BMP σηματοδότησης με τη στόχευση της ενδοκυτταρικής κινάσης πεδίο των υποδοχέων ΒΜΡ τύπου Ι [11] (η δομή του DMH1 δείχνεται στο Σχήμα 1Α). Μια πολύ πρόσφατη μελέτη ανέφερε ότι DMH2, ένας από τους αναστολείς μας BMP, μειώθηκε αποτελεσματικά την ανάπτυξη και επαγόμενο κυτταρικό θάνατο των κυττάρων NSCLC

in vitro

[12]. Ωστόσο,

in vivo

μελέτη των μικρών μοριακών αναστολέων BMP στην αύξηση του όγκου NSCLC δεν έχει αναφερθεί. Όπως DMH1 εμφανίζει μια καλύτερη εκλεκτικότητα για BMP τύπου υποδοχείς μου από DMH2 [11], στην παρούσα μελέτη ερεύνησε τις επιπτώσεις της DMH1 στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και την εισβολή του κυττάρου NSCLC γραμμές

in vitro

καθώς και σχετικά με την ανάπτυξη του όγκου ξενομοσχεύματος πνεύμονα σε ποντικούς. Η μελέτη μας έδειξε ότι DMH1 ήταν σε θέση να μειώσει σημαντικά NSCLC κυτταρική ανάπτυξη, τη μετανάστευση και την εισβολή, και θα μετριάσει την ανάπτυξη καρκινικών όγκων ξενομοσχεύματος

in vivo

Η

Χημική δομή της DMH1.? (Β) κηλίδωση Western για φωσφορυλιωμένο Smad1 /5/8 σε κύτταρα Α549 σε επεξεργασία με DMH1 σε διάφορες συγκεντρώσεις (1, 3, και 5 μΜ)? αποτελέσματα (C) QPCR του ID 1, 2 και 3 σε κύτταρα Α549 σε επεξεργασία με DMH1 και όχημα DMSO. *:.

σ

-τιμή IS & lt? 0,05

Η

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταρικής καλλιέργειας και αντιδραστηρίων

Α549 και Η460 κύτταρα αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA), καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% FBS (Gibco) και 1% πενικιλίνη-στρεπτομυκίνη (Cellgro) σε ατμόσφαιρα 5% CO

2 στους 37 ° C.

κηλίδωση Western

τα κύτταρα λύθηκαν σε RIPA ρυθμιστικό διάλυμα λύσης κυττάρου (Santa Cruz, Santa Cruz, CA) συμπληρωμένο με κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Santa Cruz) και αναστολέα φωσφατάσης κοκτέιλ 2 (Santa Cruz). Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης προσδιορίσθηκαν με τη χρήση κιτ πρωτεΐνης BCA (Thermo Fisher), και κυτταρολύματος απομονώθηκε σε SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη PVDF. Αλφα-τουμπουλίνης και ρ-Smad1 /5 /τα 8 ανιχνεύεται με Odyssey συστήματος (Li-Cor Bioscience) μετά από επώαση με τα κατάλληλα πρωτογενή και δευτερογενή αντισώματα. Πρωτογενή αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν αντι-ρ-Smad1 /5/8 (Cell Signaling Tech, 1:1000 αραίωση) και αντι-άλφα-τουμπουλίνης ποντικού (Cell Signaling Tech, 1:1000 αραίωση). Τα δευτερεύοντα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν περιλαμβάνουν IRDye 680-συζευγμένο κατσίκας αντι-κουνελιού IgG (Li-Cor Bioscience, 1:5000 αραίωση) και IRDye 800CW-συζευγμένο αντίσωμα κατσίκας αντι-ποντικού IgG (Li-Cor Bioscience, 1:5000 αραίωση).

Κυττάρου γρατσουνιές πληγών Δοκιμασία

Α549 και Η460 κύτταρα σπάρθηκαν σε πιάτα 35 mm για να δημιουργήσει μια συρρέουσα μονοστιβάδα. Τα πιάτα αφέθηκαν να επωαστούν για μία νύχτα, ώστε να επιτραπεί στα κύτταρα να προσκολληθούν στον πυθμένα του πιάτου. Την επόμενη ημέρα, οι πληγές που δημιουργήθηκαν από μια ευθεία μηδέν από ένα ρύγχος πιπέτας στο κέντρο της καλλιέργειας. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με DMSO ή DMH1 σε 1 μΜ και 3 μΜ συγκεντρώσεις. Οι φωτογραφίες ελήφθησαν όταν δημιουργήθηκαν τραύματα και μετά από επώαση 24 ωρών χρησιμοποιώντας μικροσκοπία αντίθεσης φάσης, και οι αποστάσεις χάσμα ποσοτικά αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας ImageJ λογισμικού (ΝΙΗ). Το χάσμα αποστάσεις μετά από 24 ώρες επώασης ομαλοποιήθηκαν με την απόσταση διακένου στους 0 hr ως ποσοστά μετανάστευσης.

Κυτταρικού Πολλαπλασιασμού Προσδιορισμός

Περίπου 10.000 κύτταρα Α549 ανά φρεάτιο εμβολιάστηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων και επωάστηκαν για όλη τη νύχτα. Το μέσο καλλιέργειας στη συνέχεια άλλαξε σε φρέσκο ​​μέσο που περιέχει DMSO ή DMH1 σε διάφορες συγκεντρώσεις. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν για 48 ώρες και 96 ώρες πριν από τον τερματισμό της θεραπείας με αντικατάσταση του μέσου με 100 μL 10% τριχλωροξικού οξέος (Sigma) σε 1 χ PBS, ακολουθούμενη από επώαση στους 4 ° C για τουλάχιστον 1 ώρα. Στη συνέχεια, οι πλάκες πλύθηκαν με νερό και ξηραίνεται στον αέρα. Οι πλάκες βάφτηκαν με 50 μL 0,4% σουλφοροδαμίνης (SRB, Sigma) δοκιμασία σε 1% οξικό οξύ για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Χωρίς περιορισμούς χρωστική ξεπλυθεί με 1% οξικό οξύ. Μετά ξήρανση στον αέρα και διαλυτοποίηση της πρωτεΐνης δεσμευμένου βαφής σε 10 mM Tris διάλυμα, η απορρόφηση αναγνώστηκε σε μία συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών στα 565 nm.

Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου

Α549 και Η460 κύτταρα εμβολιάζονται σε πλάκες 6-φρεατίων σε πυκνότητα 3 × 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο υποβλήθηκαν σε αγωγή με DMSO ή DMH1 για 24 ώρες. Ολικό RNA εξήχθη χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. cDNA συντέθηκε χρησιμοποιώντας το High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems). Real-time PCR διεξήχθη με τη χρήση του κύριου μείγματος τροφοδοσίας SYBR Green PCR (Applied Biosystems) και με το Applied Biosystems 7300 PCR System. Όλοι οι έλεγχοι ενίσχυση και τα δείγματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. Οι αλληλουχίες των εκκινητών είναι διαθέσιμα κατόπιν αιτήματος.

Τροποποιημένο Boyden δοκιμασία θαλάμου

Η εισβολή των κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα 24-πολλαπλών Εισαγωγή Συστήματος (8 μεμβράνη μΜ, BD Biosciences) σύμφωνα με τις οδηγίες κατασκευής. Τα ένθετα κυτταρικής καλλιέργειας επικαλύφθηκαν με matrigel (BD Biosciences). Α549 κύτταρα σπάρθηκαν σε μια συγκέντρωση 3 χ 105 κύτταρα /θάλαμο, Μετά από 24-ώρες επώασης με ή χωρίς DMH1 (3 μΜ), τα κύτταρα που δεν είχαν μετακινηθεί στα κάτω φρεάτια αφαιρέθηκαν από την άνω όψη των φίλτρων χρησιμοποιώντας μπατονέτες , και τα κύτταρα που εισέβαλαν μέσω των Matrigel επικαλυμμένα-ένθετα μετρήθηκαν. Οι μέσες τιμές για τρία τυχαία επιλεγμένα πεδία ελήφθησαν για κάθε φρεάτιο. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις διπλούν. Οι μέσες τιμές για τα τρία τυχαία πεδία ελήφθησαν για κάθε φρεάτιο.

Ξενομοσχεύματος πνεύμονα ανάπτυξης του όγκου

Αυτή η μελέτη πραγματοποιήθηκε σε αυστηρά σύμφωνα με τις συστάσεις στον Οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση Ζώων Εργαστηρίου των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας. Το πειραματικό πρωτόκολλο ζώων εγκρίθηκε από την Western University of Health Sciences Θεσμικών φροντίδα των ζώων και των Επιτροπών Χρήση (IACUC). Όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιηθεί η ταλαιπωρία των ζώων. Υπο-συρρέοντα Α549 κύτταρα τρυψινοποιήθηκαν και μετά αιωρήθηκαν σε ελεύθερο RPMI 1640 ορού. Το κυτταρικό αιώρημα (1 χ 10

6 κύτταρα σε 100 μΐ μέσου για κάθε ένεση) εγχύθηκε υποδορίως σε αμφότερες δεξιά και αριστερά πλευρά των οκτώ εβδομάδων ποντικοί NOD ηλικίας SCID (Taconic, Hudson, ΝΥ) (n = 5 για κάθε ομάδα). Τα ποντίκια έλαβαν ενδοπεριτοναϊκή (ί.ρ.) ένεση του οχήματος (12,5% 2-υδροξυπροπυλ-β-κυκλοδεξτρίνη) ή 5 mg /kg DMH1 κάθε δεύτερη μέρα. Τα μεγέθη του όγκου μετρήθηκαν με παχύμετρο βερνιέρου από την έκτη ημέρα για την τέταρτη εβδομάδα μετά την εμφύτευση του όγκου. Ο όγκος του όγκου (V) υπολογίστηκε σύμφωνα με την τυποποίηση: Όγκος = (πλάτος) χ ∧2 μήκος /2. Οι ιστοί του όγκου αποκόπηκαν στο τέλος της μελέτης, και κόπηκαν και χρωματίστηκαν με Η &? Ε, και για ανοσοϊστοχημική ανάλυση.

δείγμα όγκου ανάλυση

Lung ιστούς όγκων τόσο από το όχημα και DMH1 ποντίκια με αγωγή αποκόπηκαν και σταθεροποιήθηκαν άμεσα σε φορμαλίνη και εγκλείστηκαν σε μπλοκ παραφίνης. Τα ενσωματωμένα όγκοι κόπηκαν σε 3 τμήματα πάχους μικρόν και χρωματίστηκαν με Η &? Ε για τον προσδιορισμό της μορφολογίας. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων στους όγκους διεξήχθη στους Pathology Inc. Laboratories (Torrance, California) ανιχνεύεται με ανοσοχρώση με ένα αντίσωμα προς Κί67 (Dako ΜΙΒ-1 κλώνος, Carpinteria, California), που χρησιμοποιείται στις 1:50 σχετικά με το σύστημα χρώσης Leica Bond III IHC. Οι τομές απεικονίστηκαν και φωτογραφήθηκαν με ένα σύστημα καταγραφής μικροσκόπιο εικόνας της Nikon (Nikon DS-Ri1) και το λογισμικό δημόσιο τομέα (ΝΙΗ Image v1.60).

Η στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± τυπικό σφάλμα. Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας NCSS 2007 (Kaysville, UT) μέσω t-test για σύγκριση δύο μέσων, ένας τρόπος ANOVA με post-hoc LSD του Fisher δοκιμή για τη σύγκριση πολλαπλών μέσων, και ΑΝΟνΑ επαναλαμβανόμενων μετρήσεων με Tukey-Kramer post-hoc test για τις

in vivo

ξενομοσχεύματος μελέτες. Τα δεδομένα παρίστανται γραφικώς και προσαρμογή καμπύλης αναλύθηκε με GraphPad Prism έκδοση 6 (La Jolla, CA). Για όλες τις στατιστικές αναλύσεις, μέσα υποδείχθηκαν να είναι στατιστικά διαφορετική όταν

σ

& lt?. 0.05

Αποτελέσματα

DMH1 μπλοκ BMP σηματοδότησης στα κύτταρα NSCLC

εξετάσαμε πρώτα εάν DMH1 μπορεί να εμποδίσει BMP σηματοδότησης στα κύτταρα NSCLC χρησιμοποιώντας κηλίδωση Western και ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου (qPCR). Κύτταρα Α549 NSCLC υποβλήθηκαν σε αγωγή με το όχημα (DMSO) ή DMH1 σε 1, 3, και 5 μΜ για 24 ώρες, αντίστοιχα. Ανάλυση Western blotting έδειξε ότι τα κύτταρα Α549 εμφανίζεται σχετικά υψηλό βασικό φωσφο-Smad 1/5/8 έκφραση, και θεραπεία DMH1 μπλοκάρει αποτελεσματικά Smad 1/5/8 φωσφορυλίωση με δοσοεξαρτώμενο τρόπο (Εικόνα 1Β). Δεδομένου ότι οι αναστολείς της σύνδεσης DNA /διαφοροποίησης (Id) τα μέλη της οικογένειας είναι άμεσες μεσολαβητές της ΒΜΡ σηματοδότησης [13], και εμπλέκονται σε εισβολή, τον πολλαπλασιασμό και τη μετάσταση των καρκινικών κυττάρων [14], μετρήσαμε την έκφραση γονιδίων ID1, ID2 και Ιδ3 σε Α549 με qPCR. Μετά από θεραπεία 24 ώρες, 3 και 5 μΜ DMH1 σθεναρά μείωσε την έκφραση και των τριών γονιδίων (Σχήμα 1 C). Στο σύνολό τους, DMH1 μπορεί να μπλοκάρει αποτελεσματικά BMP σηματοδότηση σε κύτταρα NSCLC.

DMH1 μειώνει τη μετανάστευση των κυττάρων και NSCLC εισβολή

Δεδομένου ότι η μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή είναι γνωστό ότι παίζουν ένα σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη της μετάστασης του καρκίνου , εξετάσαμε τις επιδράσεις της DMH1 για τη μετανάστευση των κυττάρων NSCLC και εισβολή

in vitro

. Χρησιμοποιήσαμε τη δοκιμασία γρατσουνιά-πληγή για να προσδιοριστεί η κυτταρική μετανάστευση NSCLC δημιουργώντας κενά του τραύματος στα καλλιεργημένα κύτταρα Α549 [15]. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με DMSO, μία από τις ΒΜΡ συνδέτες ΒΜΡ4 ή DMH1 για 24 ώρες αντίστοιχα, και οι αποστάσεις χάσμα στη συνέχεια κανονικοποιούνται με τα αρχικά μετρήθηκε αποστάσεις. ΒΜΡ4 χρησιμοποιήθηκε επειδή έχει μοιραστεί λειτουργία με ΒΜΡ2, αλλά με μεγαλύτερη ισχύ. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α και 2Β, ΒΜΡ4 κυρίως ταχεία κυτταρική μετανάστευση, ενώ DMH1 επιβραδύνθηκε δραματικά κάτω μετανάστευση με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Παρόμοια αποτελέσματα του ΒΜΡ4 και DMH1 για τη μετανάστευση των κυττάρων παρατηρήθηκαν επίσης σε μια άλλη κυτταρική γραμμή Η460 NSCLC (Σχήμα 2C). Επιπλέον, εξετάσαμε την επίδραση της DMH1 στην κυτταρική εισβολή χρησιμοποιώντας τροποποιημένη δοκιμασία θαλάμου Boyden. Α549 κύτταρα σπάρθηκαν σε θαλάμους επικαλυμμένα με Matrigel, που ακολουθείται από 24 ώρες επώασης με ή χωρίς DMH1. 3 μΜ DMH1 μειώνεται δραματικά εισβολή Α549 κυττάρου μέσω Matrigel επικαλυμμένων μεμβρανών κατά περίπου 52% σε σύγκριση με τους ελέγχους οχήματος (Σχήμα 2D).

Αντιπροσωπευτικές εικόνες από δοκιμασίες στις γρατσουνιές πληγή εκτελούνται στα καλλιεργημένα κύτταρα Α549 σε επεξεργασία με DMSO , ΒΜΡ4 και DMH1 (1 μΜ και 3 μΜ) για 24 ώρες. μεταναστεύσεις (Β) Κύτταρο Α549 κύτταρα ποσοτικοποιούνται με τα αποστάσεις χάσμα μετά 24ώρης κατεργασίας ομαλοποιήθηκε με τις αρχικές αποστάσεις κενό. μεταναστεύσεις (C) Cell κυττάρων Η460 προσδιορίστηκαν ποσοτικά με παρόμοιο τρόπο. (D) Η επίδραση της DMH1 (3 μΜ) επί Α549 κυττάρων εισβολή προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τροποποιημένη δοκιμασία θαλάμου Boyden σε 24 Multiwell Σύστημα Ένθετου (μεμβράνη 8 μΜ, BD Biosciences) επικαλυμμένα με Matrigel. *:

σ

-τιμή IS & lt? 0,05

Η

DMH1 μειώνει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων NSCLC και επάγει τον κυτταρικό θάνατο

Εξετάσαμε δίπλα τα αποτελέσματα της DMH1 σε NSCLC κυττάρων. πολλαπλασιασμό και την επιβίωση. Κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMH1 και το όχημα DMSO για 48 ώρες, και ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε με την δοκιμασία σουλφοροδαμίνης Β (SRB). Το αποτέλεσμα έδειξε ότι 5 μΜ DMH1 οδήγησε σε μείωση περίπου 10% στην ανάπτυξη των κυττάρων μετά από δύο ημέρες θεραπείας, γεγονός που υποδηλώνει ότι η αναστολή της σηματοδότησης από ΒΜΡ DMH1 μειώνει σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του καρκίνου του πνεύμονα

in vitro

(Σχήμα 3Α). Επιπλέον, εξετάσαμε την επίδραση της DMH1 στην επιβίωση των κυττάρων Α549, καθώς και. Κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMH1 ή φορέα DMSO επί 72 ώρες, και τα πλωτά και προσκολλημένα κύτταρα συλλέχθηκαν και χρωματίστηκαν με κυανούν τρυπανίου για να προσδιοριστεί ο αριθμός των νεκρών κυττάρων. Σε αντίθεση με την αγωγή του οχήματος, DMH1 αύξησε σημαντικά το ποσοστό των νεκρών κυττάρων στα 5 μΜ συγκεντρώσεις, υποδεικνύοντας ότι ανταγωνίζονται BMP σηματοδότησης από DMH1 αυξάνει σημαντικά τον καρκίνο του πνεύμονα κυτταρικό θάνατο (Εικόνα 3Β). Έτσι, η θεραπεία DMH1 μπορεί να μειώσει δραματικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και επάγει NSCLC κυτταρικό θάνατο

in vitro.

Η

κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMH1 (3 και 5 μΜ) ή DMSO για 48 ώρες και ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων ήταν καθορίζεται από την δοκιμασία σουλφοροδαμίνης Β (SRB). (Β) κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMH1 ή DMSO για 72 ώρες, και τα κύτταρα συλλέχθηκαν για τη δοκιμασία κυτταρικού θανάτου χρησιμοποιώντας κυανούν του τρυπανίου χρώση. *:

σ

-τιμή είναι & lt? 0,05

Η

DMH1 εξασθενίζει την ανάπτυξη του όγκου του πνεύμονα ξενομοσχεύματος σε ποντίκια

Στη συνέχεια εξετάσαμε την επίδραση της DMH1 στην καρκινικών κυττάρων του πνεύμονα. ανάπτυξη

in vivo

. Τα κύτταρα Α549 υποδορίως εμβολιάσθηκαν στις δύο πλευρές του κάτω πίσω πλευρές του σοβαρή συνδυασμένη ανοσοανεπάρκεια (SCID) ποντικούς. Η ενδοπεριτοναϊκή (ip) ενέσεις οχήματος (12,5% 2-υδροξυπροπυλ-β-κυκλοδεξτρίνη, η = 5) ή 5 mg /kg DMH1 (n = 5) άρχισαν την ίδια ημέρα της εμφύτευσης των καρκινικών κυττάρων και διεξήχθησαν κάθε δεύτερη ημέρα για 4 εβδομάδες. Οι όγκοι των όγκων μετράται τακτικά ξεκινώντας την έκτη ημέρα μετά την εμφύτευση. Η ανάπτυξη του όγκου χωρέσει σε μια εκθετική καμπύλη ανάπτυξης (Σχήμα 4Α) (R

2 = 0,87 και 0,84 για τις DMH1 αγωγή και τον έλεγχο ποντίκια, αντίστοιχα). Το αποτέλεσμα έδειξε ότι το ποσοστό για το διπλασιασμό του μεγέθους όγκου σε DMH1 αγωγή ποντικούς ήταν περίπου μία ημέρα περισσότερο από τους ελέγχους (5,6 έναντι 4,7 ημέρες στην DMH1 αγωγή και ποντίκια ελέγχου, αντίστοιχα) (Σχήμα 4Α). Δεδομένου ότι οι αρχικές όγκοι του όγκου ήταν παρόμοια, δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των δύο ομάδων μέχρι την ημέρα 25. Στο τέλος της θεραπείας 4 εβδομάδων, η θεραπεία DMH1 οδήγησε σε στατιστικά σημαντική μείωση του όγκου του όγκου κατά περίπου 50% σε σύγκριση με τον έλεγχο του οχήματος ομάδα (ρ-τιμή & lt? 0,05) (Σχήμα 4Β). Τα βάρη σώματος ποντικού μετρήθηκαν κάθε δεύτερη μέρα τη διάρκεια του πειράματος, και δεν παρατηρήθηκαν αξιοσημείωτες μεταβολές βάρους τόσο στον έλεγχο όσο και DMH1 αγωγή ομάδων, γεγονός που υποδηλώνει την απουσία DMH1 τοξική επίδραση σε χορηγούμενης δόσης (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Για να εξεταστεί περαιτέρω η επίδραση της DMH1 επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων του όγκου

in vivo

, δείγματα ιστού του όγκου τόσο από τον έλεγχο του οχήματος και των ομάδων θεραπείας DMH1 υποβλήθηκαν σε αιματοξυλίνη και ηωσίνη χρώση (Η &? Ε) και την ανθρώπινη ειδική χρώση Κί67 . Η &? Τμήματα Ε εξετάστηκαν για τις περιοχές που περιείχαν κύτταρα όγκου και στρωματικά, και το αποτέλεσμα έδειξε τόσο το όχημα και DMH1 αγωγή ομάδες αποτελούνταν από ένα μορφολογικά παρόμοιο διαφοροποιημένο αδενοκαρκίνωμα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ωστόσο, ανοσοϊστοχημική μελέτη έδειξε εμφανώς σημαντική μείωση του ανθρώπινου δείκτη πολλαπλασιασμού Ki67 στην DMH1 αγωγή εναντίον ομάδων του οχήματος, γεγονός που υποδηλώνει ότι η θεραπεία DMH1 μπορεί να μετριάσει τον καρκίνο του Α549 πολλαπλασιασμό των κυττάρων του ανθρώπου

in vivo

(Σχήμα 4C).

τα Α549 κύτταρα εμφυτεύθηκαν υποδορίως στα ποντίκια SCID που ακολουθείται από ενδοπεριτοναϊκή ένεση του οχήματος (12,5% 2-υδροξυπροπυλ-β-κυκλοδεξτρίνη) ή 5 mg /kg DMH1 κάθε άλλη ημέρα για 4 εβδομάδες. Οι όγκοι των όγκων μετρήθηκαν από την έκτη ημέρα για τέσσερις εβδομάδες μετά την ένεση. Τα (Β) Αντιπροσωπευτική ιστούς όγκων από ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με τον έλεγχο του οχήματος και DMH1 συγκρίνονται. (C) σε ιστούς όγκων χρωματίστηκαν για ανθρώπινη συγκεκριμένο δείκτη πολλαπλασιασμού Κί67. *:

σ

-τιμή IS & lt? 0,05

Η

Συζήτηση

Οι ΒΜΡ τα έκτροπα που εκφράζεται σε πολλούς τύπους καρκινικών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων του προστάτη, του πνεύμονα, του μαστού, του στομάχου. και των ωοθηκών [16], [17], [18], [19]. Για παράδειγμα, η υπερέκφραση του ΒΜΡ-2 συνδέεται με ~ 98% του NSCLC, αλλά μικρή ή καθόλου δραστικότητα της ΒΜΡ καταρράκτη σηματοδότησης ανιχνεύονται σε ενήλικες φυσιολογικούς ιστούς του πνεύμονα, γεγονός που υποδηλώνει ότι η παρεμπόδιση BMP μονοπάτι σηματοδότησης μπορεί να είναι μια αποτελεσματική προσέγγιση για τη θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα [3], [4]. Πράγματι, η ΒΜΡ ανταγωνιστής νογκίνης και οι εξωκυτταρικές spp24 ψευδο δείχθηκαν να μειώνουν την ανάπτυξη του όγκου του πνεύμονα σε υποδόρια μοντέλα ξενομοσχεύματος ποντικού [6], [7]. Αν και η πρωτεΐνη που βασίζεται ΒΜΡ ανταγωνιστές και εξωκυτταρικό pseudoreceptors μπορεί να είναι πολλά υποσχόμενη πηγές για την ανάπτυξη φαρμάκων καρκίνου των πνευμόνων, έχουν κάποια πιθανούς περιορισμούς όπως μικρούς χρόνους ημιζωής και δύσκολη την παράδοση στους όγκους [8]. Επιπλέον, τόσο νογκίνη και spp24 μπλοκ BMP σηματοδότησης παρεμβαίνοντας την δέσμευση της ΒΜΡ συνδέτες στους υποδοχείς τους σε εξωκυτταρικό επίπεδο, και την κλινική εφαρμογή τους θα μπορούσε να περιοριστεί από οποιαδήποτε πιθανά μεταλλάξεις κέρδους-of-λειτουργία στην κατάντη του καταρράκτη σηματοδότησης BMP. ανταγωνιστές Μικρό μόριο σαν DMH1 που στοχεύουν επιλεκτικά τα ενδοκυτταρικά κινάσης πεδία του τύπου ΒΜΡ υποδοχέων Θα ήταν ιδανικό παράγοντες για την αναστολή της ανάπτυξης καρκίνου του πνεύμονα και τη μετάσταση. Μια πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι DMH2, ένας από τους αναστολείς της ΒΜΡ που προσδιορίζονται στο ψάρι zebra μελέτη μας μειώθηκε αποτελεσματικά την ανάπτυξη και επαγόμενο κυτταρικό θάνατο των κυττάρων NSCLC

in vitro

[12]. Εδώ δείξαμε ότι μια πιο εκλεκτικός αναστολέας BMP, DMH1, μείωσε σημαντικά την κυτταρική ανάπτυξη NSCLC, τη μετανάστευση και εισβολή

in vitro

, και εξασθενημένων ανάπτυξης όγκου στο μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού NSCLC, υποδηλώνοντας ότι η αναστολή της ΒΜΡ οδού με ανταγωνισμό τύπο υποδοχείς Ι με μικρά μόρια μπορεί να είναι μια αποτελεσματική προσέγγιση για τη θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα.

Οι επιδράσεις της DMH1 επί εξασθένησης της ανάπτυξης όγκου πνεύμονα μπορεί να προκαλείται από πολλαπλούς μηχανισμούς, συμπεριλαμβανομένων διαταράσσοντας μικροπεριβάλλον του όγκου ή καρκίνου του πνεύμονα βλαστικά κύτταρα. Προηγούμενες μελέτες ανέφεραν ότι η ΒΜΡ-2 που προκαλείται από την νεοαγγείωση της ανάπτυξης όγκων και διεγείρονται σχηματισμό αιμοφόρων αγγείων σε όγκους Α549 που προέρχεται σε γυμνούς ποντικούς [20]. Η ΒΜΡ-2 ανταγωνιστής νογκίνης ακύρωσε ΒΜΡ-2 που προκαλείται αγγειογενετική απόκριση, και να χτυπήσει κάτω ΒΜΡ-2 μειωμένο σχηματισμό αιμοφόρων αγγείων στους προσδιορισμούς Matrigel [20]. Έτσι, η θεραπεία DMH1 μπορεί παρομοίως διασπούν μικροπεριβάλλον που απαιτούνται για την ανάπτυξη του πνεύμονα όγκου μέσω της αναστολής της αγγειογένεσης. Επιπλέον, BMP σηματοδότησης είναι γνωστή στη ρύθμιση των βλαστικών κυττάρων αυτο-ανανέωση και διαφοροποίηση, και μερικές μελέτες έχουν δείξει ειδικού πληθυσμού των καρκινικών κυττάρων του πνεύμονα εμφανίζουν βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν με ιδιότητες όπως αυτο-ανανέωση και διαφοροποίηση [21]. Μπλόκο BMP σηματοδότησης από DMH1 μπορεί να διακόψει πνεύμονα ανάπτυξης καρκίνου των βλαστικών κυττάρων, καταστέλλοντας έτσι την εξέλιξη του όγκου. Αυτή η υπόθεση υποστηρίζεται από μια πολύ πρόσφατη μελέτη ότι η αναστολή της ΒΜΡ σηματοδότηση κατέστειλε την ανάπτυξη του πληθυσμού των καρκίνων του πνεύμονα κυττάρων που εκφράζουν δείκτες αρχέγονων κυττάρων [22]. Επιπλέον, έχει αναφερθεί από πολλές μελέτες ότι η ΒΜΡ-ενεργοποιημένα Smad σηματοδότηση ή η οικογένεια γονιδίων Id έχουν τη δυνατότητα να προωθήσουν τη μετανάστευση και εισβολή σε διαφορετικούς τύπους καρκίνου [18], [23], [24]. Ως εκ τούτου, είναι πολύ πιθανό ότι η επίδραση της στόχευσης σηματοδότησης ΒΜΡ με DMH1 μπορεί να μειώσει εισβολή και μετάσταση όγκου σε ευρύτερες κατηγορίες καρκίνου.

Στην in vivo μελέτη χρησιμοποιώντας το μοντέλο ξενομοσχεύματος Α549, η θεραπεία ξεκίνησε στο ίδιο ημέρα της εμφύτευσης των καρκινικών κυττάρων. Ως εκ τούτου, τα μεγέθη του όγκου ήταν σχετικά μικρό, στο τέλος των in vivo πειράματα. Σε μελλοντικές μελέτες, μένει να προσδιοριστεί αν η θεραπεία με DMH1 ακόλουθα διαφορετικά προγράμματα μπορεί να οδηγήσει σε μεγαλύτερη αντικαρκινική δράση. Αν και η θεραπεία DMH1 σημαντικά εξασθενημένη ανάπτυξη καρκίνου του πνεύμονα

in vivo

, σε σύγκριση με το

in vivo

επιδράσεις των φαρμάκων χημειοθεραπείας όπως η πακλιταξέλη στο ίδιο μοντέλο ξενομοσχεύματος (μη δημοσιευμένα αποτελέσματα), η επίδραση του DMH1 δεν ήταν ως ισχυρός. Η παρατήρηση αυτή υποδηλώνει ότι DMH1 δεν είναι ένας κυτταροτοξικός παράγοντας και μπορεί να μην διεγείρει απόπτωση σε χαμηλότερες δόσεις. Έτσι, για το μέλλον της κλινικής εφαρμογής, μία από τις πιθανές ερευνητικές κατευθύνσεις είναι να επικεντρωθεί στην συνδυασμένη χρήση DMH1 με άλλη στοχευμένη θεραπεία ή χημειοθεραπεία. Απαιτείται μια συστηματική προσέγγιση για την αναζήτηση για μια συνεργιστική συνδυασμό. Περαιτέρω μελέτες είναι επίσης αναγκαία για τον εντοπισμό υποομάδες των καρκίνων του πνεύμονα που είναι πιο ευαίσθητα σε αναστολείς ΒΜΡ για το σκοπό της εξατομικευμένης θεραπείας.

Εν περιλήψει, η μελέτη μας έδειξε ότι ανταγωνισμό των υποδοχέων τύπου ΒΜΡ Ι με μικρά μόρια είναι αποτελεσματική για την καταστολή της πολλαπλασιασμός των καρκινικών κυττάρων του πνεύμονα, η μετανάστευση, εισβολή

in vitro

και ανάπτυξη του όγκου

in vivo

. Μη τοξικά και εξαιρετικά επιλεκτική μικρού μορίου αναστολείς BMP, όπως DMH1, μπορεί να αντιπροσωπεύουν μία νέα κατηγορία θεραπευτικών παραγόντων για τη μείωση της θνησιμότητας και της κινητικότητας καρκίνο του πνεύμονα του ασθενούς.