Αφηρημένο

Η υποξία έχει πολύ καιρό αναγνωριστεί ως σημαντικές μικροπεριβάλλον του καρκίνου-προώθηση. Σε μια τέτοια ενέργεια-περιοριστική κατάσταση, μετα-μεταγραφική μηχανισμοί αποκτούν σημασία πάνω από τα μηχανήματα μεταγραφής γονιδίων ενέργειας ακριβά. Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι η έναρξη των χαρακτηριστικών του καρκίνου των βλαστικών κυττάρων που προκαλείται από υποξία απαιτεί τη βήτα-κατενίνης εξαρτώμενη μετα-μεταγραφική ρύθμιση προς τα πάνω του CA9 και γονιδιακής έκφρασης SNAI2. Σε απάντηση στην υποξία, βήτα-κατενίνης κινείται από την μεμβράνη του πλάσματος στο κυτταρόπλασμα όπου προσδένεται και σταθεροποιεί SNAI2 και CA9 mRNAs, σε συνεργασία με την σταθεροποιητική πρωτεΐνη mRNA HuR. Πρέπει επίσης να παρέχουν στοιχεία που αποδεικνύουν ότι η μετα-μεταγραφική δραστηριότητα της κυτταροπλασματικής β-κατενίνης λειτουργεί υπό φυσιολογική οξυγόνωση στο /triple-αρνητικό καρκίνο του μαστού βασικά κύτταρα-όπως, όταν ο νοκ ντάουν βήτα-κατενίνης καταστέλλει το φαινότυπο βλαστοκυττάρων

in vitro

και την ανάπτυξη του όγκου

in vivo

. Σε τέτοια κύτταρα, εμείς διαλευκάνουν τη γενικευμένη συμμετοχή της βήτα-κατενίνης με γνώμονα μηχανήματα για τη σταθεροποίηση του EGF-επαγόμενης mRNAs, συμπεριλαμβανομένου του ρυθμιστή καρκινικό κύτταρο βλαστικών IL6. Η μελέτη μας υπογραμμίζει τον καίριο ρόλο της μετα-μεταγραφικής μηχανισμοί για τη διατήρηση /εξαγορά των χαρακτηριστικών του καρκίνου των βλαστικών κυττάρων και δείχνει ότι η παρεμπόδιση της κυτταροπλασματικής λειτουργίας των β-κατενίνης μπορεί να αντιπροσωπεύει μια πρωτοφανή στρατηγική για τη στόχευση του καρκίνου του μαστού βλαστικά κύτταρα /βασικοκυτταρικό-όπως.

Παράθεση: D’Uva G, Bertoni S, M Lauriola, De Carolis S, Pacilli A, D ‘Anello L, et al. (2013) β-κατενίνης /HuR μετα-μεταγραφικό Μηχανήματα διέπει καρκινικά βλαστικά Χαρακτηριστικά κυττάρων σε απάντηση στην υποξία. PLoS ONE 8 (11): e80742. doi: 10.1371 /journal.pone.0080742

Επιμέλεια: Ρατζίβ Samant, Πανεπιστήμιο της Αλαμπάμα στο Μπέρμιγχαμ, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 16 Ιουλίου του 2013? Δεκτές: 7, Οκτ 2013? Δημοσιεύθηκε: 15 Νοέμβρη, 2013

Copyright: © 2013 D’Uva et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο έχει υποστηριχθεί από: ιταλικού Υπουργείου Παιδείας, Πανεπιστημίων και Επιστημονικής Έρευνας επιχορήγηση ΠΡΙΝ 2008KTRN38 «Κλινική, διαγνωστικές και θεραπευτικές συνέπειες των μελετών σχετικά με τον καρκίνο του μαστού βλαστικά κύτταρα» στο ΜΤ και MB? Cassa di Risparmio στο Ίδρυμα Μπολόνια «Ruolo della Regolazione della Sintesi proteica nelle κύτταρο staminali del cancro» (Ν. 135/2010 με 0102) σε LM και MB. ΠΟΑ κεφάλαια ex 60%, Cornelia και Roberto Ίδρυμα Pallotti (ν. 2011-110512) σε MB. Οι συγγραφείς ευχαριστήσω Fondazione Cassa di Risparmio στην Μπολόνια και Fondazione Banca del Monte e Ραβέννα για την υποστήριξη του Κέντρου Εφαρμοσμένης Βιοϊατρικής Έρευνας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

τα βλαστικά κύτταρα έτρεφε σε εξειδικευμένα τμήματα της αγοράς όπου ένταση χαμηλού οξυγόνου (υποξία) συμβάλλει στη ρύθμιση της αυτο-ανανέωσης και της διαφοροποίησης [1-3]. Στην πραγματικότητα, υποξία διατηρεί την αδιαφοροποίητη κατάσταση των εμβρυϊκών, αιμοποιητικά, μεσεγχυματικά και νευρικών βλαστικών /προγονικών [2] κύτταρα. Η υποξία σε όγκους συσχετίζεται με κακή πρόγνωση [4]. Κύτταρα σε υποξικές περιοχές του όγκου σταθεροποίηση υποξία-παράγοντες (HIFs) και να ενεργοποιήσετε προσαρμοστική έκφραση του γονιδίου που οδηγεί στην επιθετικότητα του καρκίνου μέσω της επιβίωσης των κυττάρων και αποδιαφοροποίηση [1,5]. Επιπλέον, η δραστηριότητα HIF σε μια σπάνια υποσύνολο των υποξικών καρκινικών κυττάρων παρέχει βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν με ιδιότητες [1-3].

Η βήτα-κατενίνης είναι ένας κρίσιμος ρυθμιστής του φυσιολογικού και βλαστικών κυττάρων καρκίνου αυτο-ανανέωση [6,7 ]. Σε απάντηση σε διάφορα ερεθίσματα, βήτα-κατενίνης επάγει την έκφραση των γονιδίων στόχων με μετακινούνται μέσα στον πυρήνα, όπου αλληλεπιδρά με παράγοντες TCF /LEF οικογένεια μεταγραφή [6].

Φυσική αλληλεπίδραση μεταξύ των HIF-1, το σημαντικό παράγοντα στην αντιμετώπιση της υποξίας, και βήτα-κατενίνης έχει περιγραφεί [8]. Επιπλέον, βήτα-κατενίνης και HIF-1 συνεργικά να διευκολύνει την επιβίωση υποξία στον καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα και αυτο-ανανέωσης σε νευρικά βλαστικά κύτταρα [8,9].

Η υποξία είναι μια ενέργεια περιοριστική συνθήκη, η οποία μειώνει σημαντικά συνολικό

de novo

μεταγραφή και προωθεί την εξοικονόμηση ενέργειας μετα-μεταγραφική ρύθμιση της προϋπάρχουσας mRNAs [10-12]. Πρόσφατες μελέτες αναφέρουν ότι η βήτα-κατενίνης ρυθμίζει την ημιζωή των κυτταροπλασματικών mRNAs [13-17]. Αυτά τα δεδομένα οδηγούν σε εμάς υποθέσουμε ότι η μετα-μεταγραφική δραστικότητα των β-κατενίνης διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην προσαρμογή των καρκινικών κυττάρων στην υποξία. Εδώ αναλύσαμε το ρόλο της βήτα-κατενίνης στην παραγωγή και σταθεροποίηση των δύο σημαντικών ρυθμιστικών γονιδίων του καρκίνου του μαστού των βλαστικών κυττάρων, δηλαδή καρβονικής ανυδράσης 9 (CA9) και SNAI2 mRNAs. Η έκφραση του CA9 και SNAI2 γονιδίων επάγεται από υποξία, μέσω HIF1-άλφα-μεσολάβηση μεταγραφική πάνω ρύθμιση [18-20]. έκφραση CA9 ρυθμίζει ρΗ στο μικροπεριβάλλον υποξική να προωθήσει την επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών βλαστικών κυττάρων [21,22]. Ως εκ τούτου, CA9 έχει προταθεί ως στόχος αντικαρκινική θεραπεία [23,24]. SNAI2, επίσης γνωστή ως γυμνοσάλιαγκα, είναι μια σημαντική λειτουργική καταστολέας των προγονικών μαστού δέσμευση ανθρώπινου κυττάρου γράμμωσης και διαφοροποίηση, την προώθηση φυσιολογικών και καρκινικών μαστικό αδένα στελέχους /προγονικών κυττάρων κατάσταση [25,26].

εδώ αναφέρουν ότι η κυτταροπλασματική συσσώρευση των β-κατενίνης σε απόκριση προς υποξία ενεργοποιεί έναν μετα-μεταγραφικό de-διαφοροποίηση και την επιβίωση του προγράμματος, το οποίο ενισχύει τα χαρακτηριστικά βλαστικών κυττάρων σε κύτταρα καρκίνου του μαστού. Το φαινόμενο εξαρτάται από την ικανότητα των κυτταροπλασματικών βήτα-κατενίνης να δεσμεύσει και να σταθεροποιήσει SNAI2 και CA9 mRNAs. Πρέπει επίσης να παρέχουν στοιχεία που αποδεικνύουν ότι η μετα-μεταγραφική δραστηριότητα της κυτταροπλασματικής β-κατενίνης λειτουργεί υπό φυσιολογική οξυγόνωση στο /triple-αρνητικό καρκίνο του μαστού βασικά κύτταρα-όπως. Η /τριπλά αρνητικό καρκίνο του μαστού βασικοκυτταρικό-όπως είναι μια κακώς διαφοροποιημένο και επιθετικό υπότυπο του καρκίνου του μαστού, η οποία χαρακτηρίζεται από την έκφραση ενός κυττάρου που ομοιάζει προφίλ γονίδιο στέλεχος [27,28], με την κυτταροπλασματική εντόπιση της βήτα-κατενίνης [29-31 ] και από CA9 και γονιδιακή υπερέκφραση SNAI2 [32,33]. Σε τέτοια κύτταρα, βήτα-κατενίνης knockdown μείωσε δραματικά τη σταθερότητα και την έκφραση του CA9 και SNAI2 mRNAs και αμβλύνει τον φαινότυπο των βλαστικών κυττάρων

in vitro

και την ικανότητα ξενομοσχεύματος περί

in vivo

. Επιπλέον, βήτα-κατενίνης βήτα-κατενίνης ήταν σε θέση να ρυθμίζουν την σταθερότητα του mRNA διαφόρων mRNAs EGF προκαλούμενη, μεταξύ των οποίων η προ-φλεγμονώδης κυτοκίνη ιντερλευκίνη 6 (IL6), ένα αναγνωρισμένο ανάπτυξη του καρκίνου βλαστικών παράγοντας [21,34]. Τα δεδομένα που αναφέρονται εδώ τονίζουν το ρόλο των μετα-μεταγραφικούς μηχανισμούς για τη ρύθμιση των χαρακτηριστικών του καρκίνου των βλαστικών κυττάρων, και τον προσδιορισμό β-κατενίνης ως μια βασική μετα-μεταγραφική παίκτης στο φαινότυπο των βλαστικών κυττάρων του καρκίνου του μαστού. Προτείνουμε ότι η παρεμπόδιση της βήτα-κατενίνης μετα-μεταγραφική δραστηριότητα που περιγράφεται εδώ αντιπροσωπεύει μια που δεν έχουν ακόμη διερευνηθεί στρατηγική που θα στοχεύει μαστού καρκινικά βλαστικά κύτταρα /βασικοκυτταρικό-όπως.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές, χημικά και έκθεση υποξία

Χρησιμοποιήσαμε κύτταρα MCF7 ως μοντέλο καρκινώματος καλά διαφοροποιημένο αυλού του μαστού και MDA-MB-468 και τα κύτταρα MDA-MB-231 ως πρότυπο πτωχά διαφοροποιημένο καρκίνωμα του μαστού βασικοκυτταρικό-όπως [35 ]. Όλες οι κυτταρικές γραμμές αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). MCF7, MDA-MB-468 και MDA-MB-231 αναπτύχθηκαν σε RPMI-1640, DMEM /F12 και DMEM αντίστοιχα. Όλα τα μέσα συμπληρώθηκαν με 10% FBS, 1% πενικιλλίνη και στρεπτομυκίνη και 1% γλουταμίνη EuroClone (Μιλάνο-Ιταλία). Όλες οι καλλιέργειες κυττάρων ορθοξικές διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε ένα 5% CO

2-υγροποιημένη ατμόσφαιρα. Υποξία (1% pO

2, 5% pCO

2, 94% pN

2) λήφθηκε σε ένα

InVivo

υπουργικού συμβουλίου 300 υποξία (Ruskinn Τεχνολογίας, Bridgend, Ηνωμένο Βασίλειο) για 48 h. Ο κυτταρικός θάνατος εκτιμήθηκε με χρώση μπλε Τρυπάνης.

Δημιουργία MS από πρωτογενή μαστού καρκινικούς ιστούς και κυτταρικές σειρές

MS από μαστικού αδένα ιστούς του ανθρώπου ελήφθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [21]. Εν συντομία, τα δείγματα ιστού τοποθετήθηκαν σε αποστειρωμένο μέσο Epicult (StemCell Technologies, Vancouver, Canada), τεμαχίζονται με αποστειρωμένο νυστέρια, και επωάστηκαν για 6-12 ώρες παρουσία 1000 U μίγματος ενζύμων κολλαγενάση /Υαλουρονιδάσης (StemCell Technologies) και διηθείται μέσω 40 πλέγμα μm νάιλον (Becton Dickinson), αιωρούνται εκ νέου σε πλήρη MEGM και απλώνονται σε 1 εκατοστό

2 χαμηλά πλάκες στήριξης. Δευτερογενής παραγωγή MS ελήφθη με επώαση πρωτογενή ή διαδοχικές MS σε 1 χ διάλυμα θρυψίνης-ΕϋΤΑ (Cambrex) για 3 λεπτά, διήθηση σε όλη μια νάιλον 40 μm mesh και μόνο κύτταρο επαναιώρηση σε πλήρη MEGM. MS βαθμολογήθηκαν την ημέρα 7. Εκκαθάριση ελήφθη από την επιτροπή δεοντολογίας S.Orsola-Malpighi Νοσοκομείο, Πανεπιστήμιο της Μπολόνια (Prot. Ν. 75/2011 για την LM και MB και MT). Γραπτή ενημερωμένη συγκατάθεση λήφθηκε από ασθενείς των οποίων οι ιστοί χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη. MCF7-MS δημιουργήθηκαν με σπορά 5000 κύτταρα MCF7 σε χαμηλή προσκόλληση 24 φρεατίων και βαθμολογήθηκαν την ημέρα 5.

Σταθερό βήτα-κατενίνης και SNAI2 knockdown σε MCF7, MDA-MB-468 και MDA-MB-231 κύτταρα

Σταθερό knockdown βήτα-κατενίνης σε MCF7, MDA-MB-468 και MDA-MB-231 επιτεύχθηκε με μεταγωγή του φορέα ρετροϊού pCtoGMB-GFP που φέρει ανθρώπινο βήτα-κατενίνης ειδική 19nt αλληλουχία κωδικοποίησης (GAGCCTCTATACCACCCAC) με μια PCR με έδρα στρατηγική κλωνοποίησης, όπως περιγράφηκε προηγουμένως για το διάνυσμα shSNAI2 [20]. shBeta και shSNAI2-μολυσμένα κύτταρα επιλέχθηκαν με GFP κυτταροφθορισμομετρική διαλογή, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [20].

Ανοσοφθορισμός και συνεστιακή μικροσκοπία ανάλυση

Τα καλλιεργημένα κύτταρα σπάρθηκαν πάνω σε γυάλινες καλυπτρίδες σε 60% συρροή, ενώ το MS καλλιεργήθηκαν σε BD μειωμένη Matrigel

TM (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) . Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 2% παραφορμαλδεΰδη και κατέστησαν διαπερατά με 0,2% Triton Χ-100. Τα κύτταρα επωάστηκαν με αντι-β-κατενίνης πρωτογενές αντίσωμα (κλώνος E5, Santa Cruz βιοτεχνολογίες, Santa Cruz, CA) και δευτερογενή συζευγμένο αντίσωμα αντι-ποντικού FITC (Dako Cytomation, Glostrup, DK). Οι πυρήνες βάφτηκαν αντίθετα με ιωδιούχο προπίδιο και τοποθετείται στο αντι-fade Pro-μακρά στερέωσης αντιδραστήριο μέσου (Molecular Probes Inc, Eugene, Oregon, USA). Εικόνες συλλήφθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Zeiss LSM 710 σε ένα Zeiss Παρατηρητής Ζ1 ή μια Leica DMI 6000B ανεστραμμένο μικροσκόπιο (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Γερμανία).

Η παροδική επιμόλυνση των siRNA και φορείς έκφρασης

CA9-, HuR- και SNAI2 ειδικά siRNAs και μη ειδικό έλεγχο siRNA (siSCR) ολιγονουκλεοτίδια (Stealth

τεχνολογία TM) με συμφωνημένα περιεχόμενο GC αγοράστηκαν από την Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Πλασμίδια που κωδικοποιούν άγριου τύπου β-κατενίνης (Beta-WT? PCI-neo), κυρίαρχη αρνητική pcDNA4-TCF4DN (TCF4DN), και τον φορέα pter + shBeta-κατενίνης (shBeta) κωδικοποιεί ελήφθησαν από τον Dr. Marc Van De Wetering (Hubrecht Institute, Ουτρέχτη, Ολλανδία) και Bert Vogelstein (Πανεπιστήμιο Johns Hopkins, MD, USA). Πλασμίδιο που κωδικοποιεί HIF1-άλφα λήφθηκε από τον Eric Huang (Τμήμα Νευροχειρουργικής, Πανεπιστήμιο της Γιούτα, Salt Lake City, Utah). Άγριου τύπου διάνυσμα EGFR κωδικοποίησης λήφθηκε από Pier Paolo di Fiore (Ευρωπαϊκό Ινστιτούτο Ογκολογίας, Μιλάνο, Ιταλία)? siRNAs ή πλασμίδια επιμολύνθηκαν σε κύτταρα MCF7 (10

5 κυττάρων σε ένα 3 cm

2 φρεάτιο) σε συγκέντρωση 1 μg /φρεάτιο για 72 ώρες ή 24 ώρες αντιστοίχως χρησιμοποιώντας λιποφεκταμίνη 2000 (Life Technologies, νησί Gran, ΝΥ ), ή Jet-Πέι (Polyplus, Illkirch, France) στην περίπτωση της σκλήρυνσης κατά πλάκας. κύτταρα MCF7 σταθερά μεταγωγή με ένα ρετροϊικό φορέα που κωδικοποιεί ένα ρ53 κυρίαρχο απενεργοποίησης μινι-πρωτεΐνη (p53D) έχουν περιγραφεί προηγουμένως [36].

Gene υποκινητή και ανιχνεύσεις αναφοράς της λουσιφεράσης mRNA 3’UTR

Η καρβονική ανυδράση -9 πλασμίδιο λουσιφεράσης (CA9-Luc, που καλύπτουν το -170 έως 34 περιοχή του υποκινητή CA9), παρασχέθηκε ευγενώς από τον Dott. Jaromir Pastorek? HIF1alpha ανταποκρίνεται πλασμίδιο λουσιφεράσης, HRE-Luc, παρασχέθηκε ευγενώς από τον Dr. Giovanni Melillo (εργαστήριο όγκων υποξία, Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, Frederick, MD, USA). SNAI2-Luc πλασμίδιο παρασχέθηκε ευγενώς από τον Dr. Τόγκο Ikuta (Σαϊτάμα Κέντρο Καρκίνου, Saitama, Japan)? TopFlash, ήταν ένα δώρο του Dr. Rolf Kemler (Ινστιτούτο Max Planck, Χαϊδελβέργη, Γερμανία)? Οιστρογόνων Response Element (ERE-Luc) δημοσιογράφος που παρέχονται από Rakesh Kumar (Τμήμα Μοριακής και Κυτταρικής Ογκολογίας, MD Anderson Cancer Κέντρο, Χιούστον, Τέξας)? Θυμιδίνης κινάσης Renilla πλασμίδιο αναφοράς λουσιφεράσης (Promega, Madison, WI) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος σε δοκιμασία λουσιφεράσης μετά από 24 ώρες με τη χρήση της διπλής Luciferase® σύστημα προσδιορισμού ανταποκριτή (Promega), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα δεδομένα εκφράζονται ως φορές αλλαγές πυγολαμπίδας πάνω δραστηριότητας της λουσιφεράσης της Renilla. κατασκευάσματα δοκιμασίας λουσιφεράσης CA9 και SNAI2 3’UTR ελήφθησαν από Genecopoeia (Rockwell, Maryland, USA). Κάθε κυτταρική γραμμή επιμολύνθηκε με τον φορέα 3’UTR-CA9 /SNAI2 ή με έλεγχο pEZX-MT01 κενό φορέα. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως λόγος του 3’UTR-CA9 /SNAI2 πάνω φορέα ελέγχου, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

εκχύλιση RNA και ενίσχυση cDNA

Ολικό RNA εξήχθη από κύτταρα χρησιμοποιώντας Αντιδραστήριο TRIzol® σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Invitrogen, Carlsbad, CA). Οι εκκινητές και οι συνθήκες PCR αναφέρονται στον Πίνακα S1.

ανάλυση Real-Time PCR

Real-Time PCR ανάλυση πραγματοποιήθηκε με προσέγγιση TaqMan στο aiCycler iQ ™ Real-Time PCR DetectionSystem (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). Κάθε δείγμα αναλύθηκε εις τριπλούν. Σετ των εκκινητών και φθορισμογόνου ανιχνευτές ειδικούς για CA9, SNAI2, ESR1, IL6 και CD44 mRNAs αγοράστηκαν από την Applied Biosystems. Οι αντιδράσεις επωάστηκαν στους 50 ° για 2 λεπτά? 95 ° C για 15 λεπτά που ακολουθείται από 45 κύκλους των 95 ° C για 15 s και 60 ° C για 1 λεπτό. Η σχετική ποσότητα του mRNA στόχου υπολογίστηκε ίση με 2

– (Δ

C

t στόχος mRNA- Δ

C

t ελέγχου), χρησιμοποιώντας mRNA ανθρώπινης βήτα-γλυκουρονιδάση ως έλεγχος, εκτός από την ανάλυση mRNA ανοσοκατακρήμνισης, δοκιμασία τη σταθερότητα του mRNA, και δοκιμασία κυτταροπλασματική κλασματοποίηση.

High Throughput Gene Expression Μέτρηση με Real Time PCR σε Microfluidic Δυναμική Array (Fluidigm® Real-Time PCR)

RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το PerfectPure RNA Καλλιεργημένα Kit κυττάρων με DNAse-1 πέψης (5 Prime, Αμβούργο, Γερμανία). cDNA συντέθηκε χρησιμοποιώντας το SuperScriptII πρώτου κλώνου κιτ σύνθεσης (Invitrogen, Carlsbad, CA). Για qPCR του pre-mRNA και mRNA, αντιστοίχως, προς τα εμπρός εναρκτήρες τοποθετημένη στο δεύτερο εσώνιο και εξώνιο, και κοινή αντίστροφο εκκινητή (εδώ ονομάζεται καθολική) τοποθετήθηκε στο τρίτο εξόνιο συστατική. Για γονίδια στα οποία γενικών εκκινητών ακολουθίες δεν ήταν διαθέσιμα, 2 ζευγάρια εκκινητών σχεδιάστηκαν για να ενισχυθούν αντίστοιχα ιντρονικές και εξονικές αλληλουχίες. Κάθε δείγμα cDNA αναμίχθηκε με την ομάδα εναυσμάτων για αντίδραση πριν την ενίσχυση των 14 κύκλων με αντιδραστήριο (Fluidigm PN 85000735) και TaqMan προενισχυτή Master Mix, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το cDNA Προενισχυμένες αραιώθηκε 1: 100. Το τροποποιημένο 2x TaqMan καθολικής Master Mix προστέθηκε στο αραιωμένο cDNA προκειμένου να ληφθεί μια τελική συγκέντρωση του Master Mix 1χ στα δείγματα. Το τσιπ σημάνθηκε στον ελεγκτή NanoFlexTM 4-IFC πριν από τη φόρτωση των δειγμάτων και των αντιδραστηρίων δοκιμασίας στις εισόδους. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με τη χρήση τιμών Ct και τις αξίες ΔΔCt. Κάθε δείγμα ήταν εις τριπλούν και κανονικοποιήθηκαν είτε σε GAPDH, Β2Μ και ΤΒΡ. Οι αλληλουχίες εκκινητών παρατίθενται στον Πίνακα S2.

Western Blot και συν-ανοσοκαταβύθιση δοκιμασία

Σύνολο πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν με RIPA ρυθμιστικό (25mM Tris-HCl, ρΗ 7.6, 145 mM NaCl, 1% ΝΡ -40, SDS 0,1%, δεοξικολικού νατρίου 0.5%) προστέθηκε με κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Roche, Βασιλεία, Ελβετία). Η ανάλυση στυπώματος Western έγινε χρησιμοποιώντας τα ακόλουθα αντισώματα: λαμινίνη, Beta-τουμπουλίνης, αντι-β-κατενίνης (Ε5), αντι-ακτίνης (C4) αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology, (Santa Cruz, CA)? αντι-HuR (Molecular Probes, Invitrogen) αγοράστηκαν από την Molecular Probes? αντι-CA9 (AF2188) αγοράστηκε από την R .; σ τιμές αναφέρονται σε

t

δοκιμής αναφέρονται, εκτός αν ορίζεται διαφορετικά (n = 3).

Αποτελέσματα

Η υποξία προκαλεί αποδιαφοροποίηση κυττάρων καρκίνου του μαστού και την επιβίωση /πολλαπλασιασμός πυροδοτώντας CA9 και SNAI2 έκφραση

In vitro

, ο καρκίνος του μαστού βλαστικά /προγονικά χαρακτηριστικά υπερεκπροσωπούνται σε mammospheres (MS) [39]. Η έρευνά μας είχε ζητηθεί από την παρατήρηση ότι η έκθεση ή προ-έκθεση σε υποξία (1% pO

2) αύξησε την ικανότητα σχηματισμού MS κυττάρων MCF7 (Εικόνα 1Α), και πορογενές καρκίνωμα του μαστού οι ιστοί που προέρχονται από τα κύτταρα (Τ-MS , Εικόνα 1Β). Στη συνέχεια παρατηρήθηκε ότι σε κύτταρα MCF7, καθώς επίσης και σε Τ-MS, υποξία αύξησε την έκφραση mRNA των δύο κρίσιμα ρυθμιστικά γονίδια του καρκίνου του μαστού των βλαστικών κυττάρων, δηλαδή καρβονικής ανυδράσης 9 (CA9) και SNAI2 (Σχήμα 1 C), μέσω

de novo

παραγωγή mRNA (Σχήμα S1 Α). Σημαντικά, SNAI2 shRNA knockdown μειωμένη ικανότητα σχηματισμού ορθοξικές MS, καθώς και αμβλύνθηκε υποξία MS διαστολής (Σχήμα 1 D). Σταθερά, siRNA μεσολάβηση SNAI2 νοκ ντάουν παραποιηθεί υποξική T-MS σχηματισμό (Σχήμα S1B). Επιπλέον, shRNA μεσολάβηση SNAI2 knockdown σταματήσει η υποξία προκαλούμενη κάτω ρύθμιση των επιθηλιακών δεικτών διαφοροποίησης οιστρογόνου άλφα υποδοχέα (ESR1), κεράτινη 18 (KRT18) και Ε-καδερίνης (Cdh1) (Σχήμα 1 Ε και το Σχήμα S1c) και το υποξία επαγόμενη από τα πάνω ρύθμιση της έκφρασης CD44 (Σχήμα 1 F), ένας δείκτης του καρκίνου του μαστού βλαστικών /προγονικών κυττάρων [21,40]. Τέλος, σύμφωνα με το προ-επιβίωσης /πολλαπλασιασμού ρόλος του CA9 [21,22], siRNA μεσολάβηση CA9 αποσιώπηση αυξημένο κυτταρικό θάνατο και εμποδίζεται ο σχηματισμός MS σε υποξικά κύτταρα MCF7 (Εικόνα 1G). Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι η υποξία επάγει μία εξαρτώμενη από SNAI2 πρόγραμμα de-διαφοροποίηση και CA9 εξαρτώμενη πρόγραμμα επιβίωση /πολλαπλασιασμός, που οδηγεί σε αύξηση του στελέχους /προγονικών κυττάρων υπο-πληθυσμού (Σχήμα 1).

Α, Mammosphere (MS) δοκιμασία σχηματισμού σε κύτταρα MCF7 σε απόκριση σε έκθεση υποξία (1% pO

2), ή μετά από προ-έκθεση των προσκολλημένων κυττάρων σε 1% pO

2 (pre-1% pO

2) ? MS ικανότητα σχηματισμού των κυττάρων MCF7 σε φυσιολογική οξυγόνωση (NOR) έχει αναφερθεί ως βασική αξία? Β, Tumor δοκιμασία σχηματισμού MS (T-MS) σε Ούτε /1% pO

2 πορογενές καρκίνωμα μαστού ιστούς που προέρχονται από τα κύτταρα, η = 5? περιλαμβάνονται αντιπροσωπευτικά εικόνες? C, CA9 και SNAI2 mRNA σε Ούτε /1% pO

2 κύτταρα MCF7 και Τ-MS? D, δοκιμασία σχηματισμού ΚΜ Ctrl /SNAI2 ειδικό shRNA ρετροϊού (shSNAI2) -επιμολυσμένα κύτταρα MCF7 εκτίθενται σε Ούτε /1% pO

2? Ε, Real-Time PCR ανάλυση των επιπέδων ESR1 και KRT18 mRNA σε κύτταρα Ctrl /shSNAI2 MCF7 εκτίθενται σε Ούτε /1% pO

2? F, Real-Time PCR ανάλυση των επιπέδων CD44 mRNA σε κύτταρα Ctrl /shSNAI2 MCF7 εκτίθενται σε Ούτε /1% pO

2? G, ο θάνατος των κυττάρων και MS δοκιμασία στο σκαρφάλωμα (Ctrl) και CA9 siRNA (siCA9) επιμολυσμένα κύτταρα MCF7 εκτίθενται σε Ούτε /1% pO

2? Η, Σχηματική αναπαράσταση του ρόλου των CA9 και SNAI2 στη ρύθμιση των χαρακτηριστικών του καρκίνου των βλαστικών κυττάρων για την αντιμετώπιση της υποξικής μικροπεριβάλλον. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή +/- τυπική απόκλιση; .; τιμές ρ αναφέρεται σε t τεστ. n = 3, εκτός αν ορίζεται διαφορετικά.

Η

Η βήτα-κατενίνης αυξάνει τον φαινότυπο των βλαστικών κυττάρων του καρκίνου του μαστού σε απόκριση σε υποξία, ανεξάρτητα από την πυρηνική μεταγραφικής δραστικότητας του

Στη συνέχεια διερευνήθηκε το ρόλο του βήτα κατενίνης στη ρύθμιση της CA9 και του καρκίνου του μαστού φαινότυπο SNAI2 εξαρτώμενη βλαστοκυττάρων. κύτταρα MCF7 που φέρουν βήτα-κατενίνης ειδικών ρετροϊικό φορέα shRNA (shBeta) παρουσίασαν δραματική μείωση της έκφρασης πρωτεΐνης SNAI2 και CA9 (Σχήμα 2Α), σε συνδυασμό με μειωμένη νορμοξικές σχηματισμό MS και εξασθενημένη υποξική MS διαστολής (Σχήμα 2Β). Ο καρκίνος του μαστού βλαστικά /προγονικά κύτταρα είναι επίσης υπερ-εκπροσωπούνται στην CD44

υψηλή /CD24

χαμηλή υπο-πληθυσμού [40]. Συνεπής με τα δεδομένα επί των κυττάρων MS, MCF7-shBeta αποκαλύπτονται περικοπούν ποσοστό των CD44

υψηλή /CD24

χαμηλή κυττάρων σε φυσιολογική οξυγόνωση, και αμβλύνθηκε CD44

υψηλή /CD24

χαμηλή αύξηση του πληθυσμού κάτω από υποξία (Σχήμα 2C ). Σε μακροπρόθεσμη υποξία-εκτεθειμένες κύτταρα MCF7-shBeta, μπορούμε επίσης να παρατηρηθεί μειωμένη ικανότητα να σχηματίζουν εστίες (Σχήμα S2A). Επιπλέον shRNA μεσολάβηση β-κατενίνης νοκ ντάουν μειωθεί εντυπωσιακά μαλακό άγαρ ικανότητα σχηματισμού αποικιών (Εικόνα S3A), αυτό το τελευταίο είναι ένα αυστηρά

in vitro

δοκιμασία για την ανίχνευση των κυττάρων κακοήθη εξαλλαγή. Τα στοιχεία αυτά μας οδήγησαν στο λόγο ότι νοκ ντάουν βήτα-κατενίνης εμποδίζει βλαστικών /προγονικών κυττάρων αυτο-ανανέωση. Είναι ενδιαφέρον ότι, βήτα-κατενίνης knockdown παρεμπόδισε επίσης την υποξία-επαγόμενη μειορύθμιση ESR1 (Εικόνα 2D), αποκαλύπτοντας την ικανότητα των β-κατενίνης για να παίξει έναν κεντρικό ρόλο στο πρόγραμμα de-διαφοροποίηση που προκαλείται από υποξία που είναι παράλληλη με την απολαβή των βλαστικών κυττάρων χαρακτηριστικά σε κύτταρα καρκίνου του μαστού. Στη συνέχεια παρατηρήθηκε ότι η υποξία προκάλεσε σημαντική μετεγκατάσταση της βήτα-κατενίνης από την κυτταρική μεμβράνη στο κυτταρόπλασμα, το γεγονός αυτό να συμβαδίζει με μια μείωση στην κυττάρου-προς-κύτταρο επαφές (Σχήμα 2Ε). Είναι ενδιαφέρον, υποξία προκάλεσε ούτε βήτα-κατενίνης πυρηνικό εντοπισμό ούτε βήτα-κατενίνης /TCF μεταγραφική δραστικότητα σε κύτταρα MCF7 και σε Τ-MS (Σχήμα 2F, G). Τα στοιχεία αυτά μας οδήγησαν να συλλάβουν ότι η βήτα-κατενίνης διευκολύνει CA9 και SNAI2 έκφρασης και την επακόλουθη φαινότυπο βλαστικών κυττάρων στην υποξία-εκτεθειμένες καρκινικά κύτταρα του μαστού, ανεξάρτητα από την πυρηνική μεταγραφικής δραστηριότητας του.

Α, ανάλυση Western (WB) του βήτα-κατενίνης, τα επίπεδα της πρωτεΐνης SNAI2 και CA9 στα κύτταρα Ctrl /shBeta MCF7 κατά Ούτε /1% pO

2 συνθήκες? Β, MS δοκιμασία σε σταθερή β-κατενίνης σιγήσει που σχηματίζουν τα κύτταρα (shBeta) MCF7 κατά Ούτε /1% pO

2 συνθήκες? C, κυτταροφθορισμομετρικής ανάλυση των CD44

υψηλή /CD24

χαμηλή βλαστικών /προγονικών πληθυσμού ctrl κύτταρα /shBeta MCF7 κατά Ούτε /1% pO

2 συνθήκες? D, Real-Time PCR ανάλυση του επιπέδου ESR1 mRNA σε κύτταρα Ctrl /shBeta MCF7 κατά Ούτε /1% pO

2 συνθήκες? Ε, ανοσοφθορισμού (IF) ανάλυση της β-κατενίνης στην Ούτε /1% pO

2 κύτταρα MCF7? F, WB ανάλυση των β-κατενίνης σε Ούτε /1% pO

2 κύτταρα MCF7 κυτταροπλασματική και πυρηνική κλάσματα (λαμίνης Β και βήτα-τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχοι κλασμάτωση)? G, βήτα-κατενίνης /TCF μεταγραφική δημοσιογράφος (TOPFLASH) δοκιμασία σε κύτταρα MCF7 και T-MS κάτω Ούτε /1% pO

2. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή +/- τυπική απόκλιση; .; τιμές ρ αναφέρεται σε t τεστ. n = 3, εκτός αν ορίζεται διαφορετικά.

Η

Η υποξία επάγει CA9 και της έκφρασης SNAI2 μέσω εξαρτώνται HIF1-άλφα μεταγραφή του mRNA και βήτα-κατενίνης εξαρτάται mRNA σταθεροποίηση

CA9 και SNAI2 είναι υποξία -παράγοντα-1-άλφα (HIF-1) μεταγραφικό στόχους [8,20]. Πρόσφατα, έχει προταθεί ότι οι β-κατενίνης προάγει έκφραση CA9, δρώντας ως HIF-1 μεταγραφικού συν-παράγοντας σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου [8]. Με αφορμή την εν λόγω δεδομένων, επιδιώξαμε να διερευνηθεί η επίδραση της βήτα-κατενίνης επί HIF-1 εξαρτώμενη μεταγραφή, καθώς και για CA9 και τη δραστηριότητα υποκινητή SNAI2. Παραδόξως, η λουσιφεράση οδηγείται δοκιμασία αποκρίνεται ρεπόρτερ απέδειξαν ότι βήτα-κατενίνης υπερέκφραση παρεμποδίζει HIF1-άλφα μεταγραφική δραστικότητα κατά την έκθεση υποξία ή μετά HIF1-άλφα παροδική υπερέκφραση (Σχήμα 3Α). Σταθερά, βήτα-κατενίνης knockdown ενεργοποιείται HIF1-άλφα μεταγραφική δραστικότητα (Σχήμα 3Β). Παρομοίως, β-κατενίνης κατέστειλε την προκαλούμενη από υποξία CA9 και SNAI2 γονίδια υποκινητή δραστηριότητα (Σχήμα 3C). Τα ευρήματα αυτά δείχνουν την έναρξη της ανταγωνιστική δράση μεταξύ βήτα-κατενίνης και HIF1-άλφα μεσολαβεί μεταγραφή σε υποξία-εκτεθειμένα κύτταρα καρκίνου του μαστού. Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα αυτά, η επιμόλυνση της κυρίαρχων αρνητικών ισομορφή του TCF4 (TCF4-DN), η οποία σταματά βήτα-κατενίνης μεταγραφική δραστηριότητα [6], δεν ήταν σε θέση να μειώσει CA9 και έκφραση SNAI2 mRNA σε υποξία-εκτεθειμένα κύτταρα MCF7 (Εικόνα S3b). Αποδεικτικά στοιχεία ότι το β-κατενίνης μειώνει παραδόξως δραστηριότητα CA9 και SNAI2 υποστηρικτής, αλλά αυξάνει τα επίπεδα έκφρασης των συγγενών mRNA, μας ώθησε να διερευνήσει τη σταθερότητα του mRNA ως ένα νέο στρώμα της λειτουργίας των β-κατενίνης-εξαρτώμενη. Για να αποδειχθεί αυτή η υπόθεση, χρησιμοποιήσαμε ακτινομυκίνη D, έναν αναστολέα της πολυμεράσης 2 (Pol2) ότι βλάπτει

de novo

mRNA μεταγραφή. Σύμφωνα με την υπόθεσή μας, σταθερή βήτα-κατενίνης σίγηση μειωθεί CA9 και SNAI2 mRNA χρόνος ημιζωής στο υποξία εκτεθειμένα κύτταρα MCF7 (Σχήμα 3D). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι το πρόγραμμα των κυττάρων σε καρκινικά κύτταρα του μαστού, επικαλείται την HIF1alpha εξαρτώμενη παραγωγή του CA9 και SNAI2 mRNA, ακολουθούμενη από την βήτα-κατενίνης εξαρτώμενη σταθεροποίηση αυτών των mRNAs (Σχήμα 3Ε), η υποξία-επαγόμενη de-διαφοροποίηση /στελέχους.

Α, HIF-1 μεταγραφικής ρεπόρτερ (HRE-Luc) δοκιμασία σε κύτταρα MCF7 επιμολυσμένα με άγριου τύπου βήτα-κατενίνης (Beta-κβ) κάτω Ούτε /1% pO

2 συνθήκες ή σε συνδυασμό με HIF1 άλφα (HIF1a) φορέα που κωδικοποιεί? Β, HRE-Luc δοκιμασία στο 1% pO

2-εκτεθειμένες ctrl /κυττάρων shBeta MCF7? C, CA9-Luc και SNAI2-Luc δοκιμασία στην ctrl /β-κβ επιμολυσμένα και ctrl κύτταρα /shBeta MCF7 κάτω Ούτε /1% pO

2 συνθήκες? D, CA9 και δοκιμασία σταθερότητας SNAI2 mRNA μετά την αναστολή της πολυμεράσης 2 μεταγραφικής δραστικότητας από ακτινομυκίνη D (100 ng /ml) σε κύτταρα Ctrl /shBeta MCF7 εκτέθηκαν σε 1% pO

2? Ε, Σχηματική αναπαράσταση της αλληλεπίδρασης HIF1-άλφα /βήτα-κατενίνης σε κύτταρα καρκίνου του μαστού σε απόκριση σε υποξία: HIF1-άλφα προάγει μεταγραφή και κυτταροπλασματική βήτα-κατενίνης αυξάνει σταθεροποίηση του SNAI2 και CA9 mRNAs? η αρνητική επίδραση των β-κατενίνης σε HIF-1-επαγόμενη μεταγραφή απεικονίζεται επίσης. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή +/- τυπική απόκλιση; .; τιμές ρ αναφέρεται σε t τεστ. n = 3, εκτός αν ορίζεται διαφορετικά.

Η

Συστατικώς ενεργή β-κατενίνης μετα-μεταγραφική δραστηριότητα στα βασικά μοιάζει /τριπλά αρνητικό καρκίνο του μαστού κύτταρα

Όταν συγκρίναμε MCF7 προέρχονται τα κράτη μέλη να συγγενές κύτταρα προσκολλημένα για CA9 και έκφραση SNAI2 βρήκαμε υψηλότερη CA9 και δραστικότητα προαγωγού SNAI2 και έκφραση mRNA που σταμάτησε το shBeta νορμοξικά MS (Σχήμα 4Α-Β). Αν και το φαινόμενο παράλληλα με την αύξηση της βήτα-κατενίνης κυτταροπλασματική εντόπιση (Σχήμα 4C), παρόμοια επίπεδα ολικής πρωτεΐνης βήτα-κατενίνης και μεταγραφική δραστικότητα ήταν παρόντες σε προσκολλητικά και MCF7 προέρχονται MS (Εικόνα 4D). Αυτά τα δεδομένα επισημαίνουν ότι η μετα-μεταγραφική δραστικότητα των β-κατενίνης μπορεί να εμπλέκεται στη διατήρηση της κατάστασης στελέχους /προγονικών κυττάρων, ακόμη και σε νορμοξία.