Abstract

Ένα σημαντικό μηχανισμός των μονοκλωνικών αντισωμάτων που στοχεύουν εκλεκτικά τον υποδοχέα 1 που μοιάζει με ινσουλίνη τύπου αυξητικού παράγοντα (IGF-1 R) να αναστέλλει την ανάπτυξη του όγκου είναι με την προς τα κάτω ρύθμιση του υποδοχέα, ανεξάρτητα από το αν είναι σε θέση (ανταγωνιστική ) ή ανίκανος (αγωνιστική) αποκλεισμού της πρόσδεσης των συγγενών συμπλοκοποιητών. Έχουμε αναπτύξει και που χαρακτηρίζεται από ένα νέο αγωνιστικό ανθρωποποιημένο αντίσωμα αντι-IGF-1 R, HR1, και χρησιμοποίησαν τη μέθοδο Dock-και-Lock (DNL) για να κατασκευαστεί Hex-HR1, το πρώτο πολυσθενές αντίσωμα που περιλαμβάνει 6 λειτουργικά Fabs της HR1, με σκοπό την ενίσχυση της δραστικότητας των HR1. Με βάση πειράματα χιαστί αποκλεισμού, HR1 αναγνωρίζει μια περιοχή πλούσια σε κυστεΐνη περιοχή στην α-υπομονάδα, διαφορετική από τα επίτοπα χαρτογραφηθεί για τις υπάρχουσες αντι-IGF-1 R αντισώματα, ακόμη HR1 είναι παρόμοιο με άλλα αντισώματα αντι-IGF-1 R σε προς τα κάτω ρύθμιση IGF-1 R και αναστολής του πολλαπλασιασμού, σχηματισμό αποικιών, ή εισβολή των επιλεγμένων καρκινικών κυτταρικών σειρών in vitro, καθώς επίσης και καταστολή της ανάπτυξης του RH-30 ραβδομυοσαρκώματος ξενομοσχεύματος σε γυμνά ποντίκια όταν συνδυάζεται με τον αναστολέα mTOR, ραπαμυκίνη. Hex-HR1 και HR1 είναι γενικά συγκρίσιμη σε βιοδραστικότητες τους στο πλαίσιο της εν intro και in-vivo συνθήκες διερευνώνται. Παρ ‘όλα αυτά, σε επιλεκτική πειράματα που περιλαμβάνουν την άμεση σύγκριση της δραστικότητας, Hex-HR1 επέδειξε μια ισχυρότερη επίδραση επί αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού που διεγείρεται από IGF-1 και μπορεί να ρυθμίζουν προς τα κάτω αποτελεσματικά IGF-1 R σε μια συγκέντρωση τόσο χαμηλή όσο 20 ρΜ.

Παράθεση: Chang CH, Wang Υ, Trisal P, Λι R, Rossi DL, Nair A, et al. (2012) αξιολόγηση ενός νέου Εξασθενές εξανθρωπισμένο αντι-IGF-1R αντισωμάτων και δισθενή Γονικός IgG του σε διάφορες σειρές καρκινικών κυττάρων. PLoS ONE 7 (8): e44235. doi: 10.1371 /journal.pone.0044235

Επιμέλεια: Zhaozhong Χαν, του Πανεπιστημίου Vanderbilt, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 24, 2012? Αποδεκτές: 30 Ιουλίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 31 Αυγούστου, 2012

Copyright: © Chang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο εν μέρει χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου χορηγήσει 1Κ 43CA150742-01 από τις Ηνωμένες Πολιτείες Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας. Καμία πρόσθετη εξωτερική χρηματοδότηση ελήφθη για τη μελέτη αυτή. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει τα ακόλουθα συμφέροντα. Παρά το γεγονός ότι μία ή περισσότερες από τις συγγραφείς απασχολούνται από εμπορικές εταιρείες Immunomedics, Inc, IBC Pharmaceuticals, Inc, και το Κέντρο Μοριακής Ιατρικής και Ανοσολογίας, αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

σήματα μεταδίδονται μέσω υποδοχέων της κυτταρικής επιφάνειας ανάπτυξης παράγοντα κατά την πρόσδεση στο συγγενές συνδέτες είναι απαραίτητη για τη ρύθμιση φυσιολογική κυτταρική ανάπτυξη και διαφοροποίηση, αλλά επίσης να συμβάλουν στην ανάπτυξη, τον πολλαπλασιασμό, την επιβίωση, την κινητικότητα, και μετάσταση διαφορετικών τύπων κακοηθών κυττάρων, όπως επεξηγείται από τα καλά μελετηθεί μοιάζει με ινσουλίνη αυξητικούς παράγοντες (IGFs), και κύρια υποδοχέα σηματοδότηση τους, IGF-1 R [1] – [4]. Ο άξονας σηματοδότησης IGF αποτελείται επίσης από ινσουλίνη ως συνδέτης? τρία άλλα ομο-υποδοχείς, IGF-2R, ισομορφή του υποδοχέα της ινσουλίνης Α (IRA), και ισομορφή του υποδοχέα της ινσουλίνης Β (IRB)? τρία υβριδικά-υποδοχείς, καθένα σχηματίζεται από IGF-1R και IRA, IGF-1R και IRB, και IRA και IRB? έξι δέσμευσης IGF πρωτεϊνών (IGFBRs)? και μια ομάδα πρωτεασών που αποδομούν IGFBPs να απελευθερώσει IGFs. IGF-1 R είναι μία κινάση τυροσίνης υποδοχέα, που περιλαμβάνει δύο συνδεδεμένα με δισουλφιδικούς δεσμούς εξωκυτταρικό α-υπομονάδες, κάθε επίσης δισουλφίδιο συνδέεται με μια διαμεμβρανική β-υπομονάδα. Η κυτταροπλασματική περιοχή της β-υπομονάδας φιλοξενεί ένα πεδίο κινάσης τυροσίνης, καθώς και μια θέση πρόσδεσης για τα μέλη της οικογένειας του υποστρώματος υποδοχέα ινσουλίνης (IRS), και το SH2 που περιέχει πρωτεΐνη προσαρμογέα, Shc [5]. IGF-1 δεσμεύεται με τις α-υπομονάδες της IGF-1 R με υψηλότερη συγγένεια από τον IGF-2 [6]. Η εμπλοκή του IGF-1 R με IGFs επάγει αυτοφωσφορυλίωση των τριών υπολειμμάτων τυροσίνης στον τομέα κινάσης του β-υπομονάδας [7], η οποία φωσφορυλιώνει περαιτέρω άλλα κατάλοιπα τυροσίνης στην κυτταροπλασματική περιοχή, οδηγώντας έτσι σε πρόσληψη IRS και Shc, με επακόλουθη ενεργοποίηση τόσο φωσφοϊνοσιτιδίου 3-κινάσης (ΡΙ3Κ) -Akt και τα μονοπάτια που ενεργοποιείται από μιτογόνο κινάσης πρωτεΐνης (ΜΑΡΚ) [8]. Τα ελάχιστα δομικά στοιχεία του 1 IGF-θέση επί του IGF-1 R δεσμευτικούς [9] για να απαιτήσει την Ν-τελική περιοχή L1 (αα 1-150), το Ο-τελικό άκρο της πλούσια σε κυστεΐνη περιοχή (αα 190- 300), και το C-άκρο της α-υπομονάδας (αα 692-702). Σε σύγκριση, οι λειτουργικές επιτόπια του IGF-2 επί IGF-1 R χαρτογραφήθηκαν [10] για τη συμμετοχή του Ν-τελική περιοχή L1 και το Ο-άκρο της α-υπομονάδας, αλλά όχι το πλούσια σε κυστεΐνη περιοχή. Εκτός από IGFBPs, η βιοδιαθεσιμότητα του IGF-2 ρυθμίζεται επίσης από τον IGF-2R, που έχει έλλειψη ενδοκυτταρική δραστικότητα κινάσης και έτσι λειτουργεί ως υποδοχέας σαρωτής για IGF-2. Αν και IRB αναγνωρίζει μόνο ινσουλίνη, την παραλλαγή του ματίσματος, IRA, η οποία είναι πιο συχνά εκφράζεται από όγκους, συνδέεται επίσης με IGF-2 [11] με υψηλή συγγένεια, καταλήγοντας σε μιτογονικά αποτελέσματα και αυξημένη επιβίωση, την κινητικότητα και διεισδυτικότητα των καρκινικών κυττάρων [12 ]. Η πολυπλοκότητα του συστήματος IGF-σηματοδότηση επιτείνεται περαιτέρω από την ικανότητα των IGF-2 για την τόνωση της IRA και IRA /IRB, η ικανότητα των δύο IGF-1 και IGF-2 για την τόνωση της IGF-1 R, IGF-1 R /IRA, και IGF-1 R /IRB, και η στιχομυθία μεταξύ IGF-1 R και EGFR [13] – [15], τα οποία φαίνεται να συνιστούν διόδους για ορισμένα καρκινικά κύτταρα να ξεφύγουν IGF-1 R-στοχευμένες θεραπείες, και παρέχουν την λογική για cotargeting IGF -1R με IR [16], [17] ή EGFR /HER2 [18], [19] για την ενίσχυση της αποτελεσματικότητας της θεραπείας.

το δυναμικό για τη στόχευση IGF-1 R για τη θεραπεία καρκίνων καταδείχθηκε αρχικά από την ικανότητα του Αir-3, ένα μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού (mAb) που δεσμεύει σύνδεση IGF-1 R [20], να αναστέλλουν την ανάπτυξη in-vivo του οιστρογόνου-ανεξάρτητο MDA-MB-231 ανθρώπινου μαστού ξενομοσχεύματος καρκίνου σε γυμνούς ποντικούς [21]. Δύο κύριες στρατηγικές για τον IGF-1 R-στοχευμένη θεραπεία (δηλαδή, μπλοκάροντας αντι-IGF-1 R αντισώματα και αναστολείς μικρού μορίου των υποδοχέων κινάσης τυροσίνης) έχουν επιδιωχθεί ενεργά κατά την τελευταία δεκαετία, με αποτέλεσμα διάφορα προκλινικές και κλινικές μελέτες σε ποικίλες μορφές καρκίνου, η οποία επανεξετάστηκαν περιοδικά [22] – [36]. Επιπλέον, η δυνατότητα για διπλή αναστολή του IGF-1 και IGF-2 με εξουδετερωτικά αντισώματα αποδείχθηκε πιο πρόσφατα [37].

Πιο mAbs αναπτύχθηκαν έναντι IGF-1 R μέχρι σήμερα έχουν σχεδιαστεί για τα ανταλλακτικά IR και επιλεκτικά αναστέλλουν IGF-IR με τη μεσολάβηση σηματοδότηση από το κλείδωμα IGFs από τη σύνδεση. Μπορούν επίσης να μοιράζονται μια κοινή ιδιότητα να προκαλεί ρύθμιση προς τα κάτω IGF-1R μέσω εσωτερίκευση και την υποβάθμιση [38], η οποία θα μπορούσε να επηρεάσει ακούσια σηματοδότηση της ινσουλίνης λόγω της ταυτόχρονης προς τα κάτω ρύθμιση των υβριδικών υποδοχέων IGF-1 R /IR [39]. Όπως συνοψίζεται στον Πίνακα S1 στις συμπληρωματικές πληροφορίες

σε απευθείας σύνδεση

, αυτά τα mAbs, εκτός του ότι είναι ποντικού, εξανθρωπισμένα ή πλήρως ανθρώπινα, διαφέρουν σε δομικές και λειτουργικές ιδιότητες που περιλαμβάνουν ισότυπο, επιτόπιο, δραστικότητα για την αναστολή είτε ή και τα δύο IGFs, και συγγένεια για IGF-1 R. Οκτώ όπως μονοκλωνικά αντισώματα (AVE1642, BIIB022, cixutumumab, dalotuzumab, figitumumab, ganitumumab, R1507, και robatumumab) έχουν ήδη ή βρίσκονται επί του παρόντος σε κλινικές δοκιμές σε διάφορους συνδυασμούς. Ότι τα αντικειμενικά αποκρίσεις έχουν αναφερθεί από κάποια δοκιμές φάσης II, για παράδειγμα, σε δύο μελέτες [40], [41] που δείχνει κλινικό όφελος σε καρκίνο μη-μικρών κυττάρων πνεύμονος (NSLCL) ασθενείς που έλαβαν θεραπεία με figitumumab, πακλιταξέλη και καρβοπλατίνη (FPC) , έχουν δύο δοκιμές επόμενη φάση ΙΙΙ αξιολόγηση FPC και ένα συνδυασμό figitumumab με erlotinib σε μη επιλεγμένους ασθενείς με προχωρημένο NSCLC ανασταλεί τον Οκτώβριο του 2009, λόγω της έλλειψης αποτελεσματικότητας και μεγαλύτερη τοξικότητα από το αναμενόμενο από τα δεδομένα πρώιμης φάσης [42]. Έτσι, παρά την πληθώρα των ισχυρών προκλινικά δεδομένα που υποστηρίζουν το σκεπτικό για τον IGF-1 R-στοχευμένη θεραπεία του καρκίνου, τα γενικά απογοητευτικά κλινικά αποτελέσματα, όπως αποκαλύφθηκε από figitumumab, R1507 (κλινική ανάπτυξη ανέστειλε το Δεκέμβριο του 2009), και άλλοι [43], έχουν επισημάνει σε μια μελλοντική κατεύθυνση που θα επικεντρωθεί στην αναγνώριση και την επικύρωση της πρόβλεψης βιοδεικτών, καθώς και η διερεύνηση των πιο ορθολογικό συνδυασμό με άλλα αντικαρκινικά φάρμακα για την καταπολέμηση κοινούς μηχανισμούς αντίστασης που αναπτύχθηκε από τον αποκλεισμό από μόνη της IGF-1R.

Πολυσθενή αντισώματα συχνά αυξάνουν την ισχύ του δισθενούς γονείς τους, εν μέρει ως αποτέλεσμα των υψηλότερων απληστίας σύνδεσης προς συγγενικά αντιγόνα στα κύτταρα στόχους. Χρησιμοποιώντας το Dock-και-Lock (DNL) πλατφόρμας [44], [45] για να δημιουργήσει ένα εξασθενές αντισώματος, που ορίζεται Hex-HR1, από δισθενή μητρική της, HR1, ένα μυθιστόρημα εξανθρωπισμένο αντίσωμα (IgG 1,

κάπα

) που στοχεύει IGF-1 R, αλλά όχι IR, διερευνήσαμε τη δυνατότητα συγκρίσεως των διαφόρων βιολογικών δραστηριοτήτων που παρουσιάζεται από Hex-HR1 και HR1 σε διάφορες καρκινικές κυτταρικές σειρές, όπως επίσης και in vivo αποτελεσματικότητα τους σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος ανθρώπινου ραβδομυοσαρκώματος (RH -30) σε γυμνά ποντίκια, με ή χωρίς την προσθήκη της ραπαμυκίνης. Αναφέρουμε εδώ ότι HR1 προσδένεται στην περιοχή του IGF-1R που βρίσκεται στα μέσα του πρώτου μισού του πλούσια σε κυστεΐνη περιοχή (αα 185 -222), η οποία είναι διαφορετική από τα επίτοπα που αναφέρονται για έναν αριθμό αντι-IGF-1 R mAbs [46, 47, και Πίνακας S1]. Η ανομοιότητα των HR1 σε αυτές τις αντι-IGF-1 R mAbs στην κλινική ανάπτυξη περιλαμβάνει επίσης την αδυναμία της να εμποδίσει την πρόσδεση του είτε IGF-1 ή IGF-2 για να IGF-1 R, και μια ενδιαφέρουσα συμπεριφορά για να επάγει φωσφορυλίωση του IGF-1 R και κατάντη σηματοδότησης χωρίς κυρίως διεγείροντας την κυτταρική ανάπτυξη. Από την άλλη πλευρά, HR1 είναι παρόμοιο με άλλα αντισώματα αντι-IGF-1 R στην ικανότητά του να ρυθμίζουν προς τα κάτω IGF-1 R και αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό, σχηματισμό αποικιών, ή εισβολή των επιλεγμένων κυτταρικών σειρών in vitro, καθώς επίσης και για να επιβραδύνει την ανάπτυξη του RH -30 ξενομοσχεύματος σε γυμνά ποντίκια όταν συνδυάζεται με τον αναστολέα mTOR, ραπαμυκίνη. Hex-HR1 και HR1 γενικά είναι συγκρίσιμα σε βιοδραστικότητες τους υπό τις συνθήκες που ερευνήθηκαν, αν και Hex-HR1 έδειξε υψηλότερη δραστικότητα από ό, τι HR1 σε προς τα κάτω ρύθμιση του IGF-1 R και στην παρεμπόδιση του πολλαπλασιασμού ορισμένων αποκρίνονται καρκινικών κυτταρικών γραμμών.

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταρικές γραμμές, αντισώματα και αντιδραστήρια

Όλες οι κυτταρικές σειρές αγοράστηκαν από την ATCC, εκτός RH-30, το οποίο ελήφθη από DSMZ. Εξανθρωπισμένα αντισώματα, συμπεριλαμβανομένων HR1, hPAM4 (αντι-βλεννίνης), HA20 (αντι-CD20), hRS7 (αντι-Trop-2), hLL2 (αντι-CD22), και HMN-15 (αντι-CEACAM6), παρασχέθηκαν από Immunomedics . Η ανασυνδυασμένη ανθρώπινη IGF-1R (rhIGF-1 R), ανασυνδυασμένη ανθρώπινη IGF-1, το ανασυνδυασμένο ανθρώπινο IGF-2, και ποντικού αντι-ανθρώπινου IGF-1 R mAb (MAB391) ελήφθησαν από την Κ & amp? D Systems. Πρόσθετες αντι-ανθρώπινου IGF-1 R αντισώματα ελήφθησαν από την Calbiochem για Ab-1 (κλώνος αIR3), Ab-3 (Κλώνος 33,255.111) και Ab-4 (κλώνος 24-31)? από Santa Cruz Biotechnology για 2C8, 1H7, 3Β7, και C-20? από Millipore για 24-57 και 24-31? και από την Invitrogen για 17-69, 24-60, και 1-2. Φωσφο-ειδικά αντισώματα και άλλα πρωτεύοντα αντισώματα αποκτήθηκαν από τη Cell Signaling ή Santa Cruz Biotechnology. Η υπεροξειδάση χράνου (HRP) δευτερογενές αντίσωμα και ανίχνευση κυτταρικού πολλαπλασιασμού One Solution (MTS) ελήφθησαν από την Promega. FITC- ή TRITC-συζευγμένα δευτερογενή αντισώματα ήταν από Jackson ImmunoResearch Laboratories. Αντιδραστήριο PhosphoSafe Εξόρυξη και RIPA ρυθμιστικό που χρησιμοποιείται για την λύση των κυττάρων ελήφθησαν από EMD Biosciences και Κυτταρικής Σηματοδότησης, αντίστοιχα. Κυττάρων μέσα καλλιέργειας, τα συμπληρώματα, και τρανσφερίνης βοοειδών (ολο μορφή) αγοράστηκαν από την Invitrogen. Η ραπαμυκίνη (Sigma-Aldrich) διαλύθηκε σε DMSO, κλασματοποιήθηκε και αποθηκεύθηκε στους -20 ° C μέχρι τη χρήση. Protein Dye Reagent Δοκιμασία συμπύκνωμα από την Bio-Rad. Όλα τα άλλα χημικά αγοράστηκαν από την Sigma.

Cell Culture

κακοήθεις κυτταρικές σειρές διατηρήθηκαν με συνήθη τρόπο σε 37

o C σε 5% CO

2 σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10 % θερμο-απενεργοποιημένο ορό εμβρύου μόσχου (FBS), 1% Glutamax Ι, 1% HEPES, 1% μη απαραίτητα αμινοξέα, και 1% πυροσταφυλικό νάτριο (που αναφέρεται ως 10% RPMI). Για Capan-1, 20% FBS χρησιμοποιήθηκε (20% RPMI). Το μέσο καλλιέργειας αλλάχθηκε τουλάχιστον μία φορά την εβδομάδα και μόνο τα κύτταρα με λιγότερους από 50 περάσματα χρησιμοποιήθηκαν για πειράματα.

Δημιουργία R1

Τρεις ποντικοί BALB /c ανοσοποιήθηκαν το καθένα ε.π. με 15 μα rhIGF-1 R (Met1Asn932), το οποίο περιλαμβάνει ένα μίγμα και των δύο επεξεργασμένων και μη επεξεργασμένων εξωκυτταρική περιοχή του ανθρώπινου IGF-1 R, σε πλήρες ανοσοενισχυτικό Freund. Πρόσθετες ανοσοποιήσεις σε ατελές ανοσοενισχυτικό του Freund έγιναν 14, 21, και 28 ημέρες μετά την αρχική ανοσοποίηση. Τα υβριδώματα που δημιουργούνται από τη σύντηξη των κυττάρων σπλήνας από τα ανοσοποιημένα ποντίκια με κύτταρα μυελώματος Ρ3 × 63Ag8.653. Ένας κλώνος υβριδώματος (C-11), των οποίων το υπερκείμενο εμφάνισε δραστικότητα δέσμευσης για τον IGF-1 R, αλλά όχι IR, απομονώθηκε και επεκτάθηκε σε καλλιέργειες για να ληφθεί το αντίσωμα ποντικού που ορίζεται R1 ή MR1.

Δημιουργία CR1

χιμαιρισμού του R1 για να ληφθεί CR1 διεξήχθη ως εξής. Το V

H και V

γονίδια K των R1 κλωνοποιήθηκαν από 5′-RACE. Οι αλληλουχίες DNA των κλωνοποιημένων V

H και V

γονίδια K προσδιορίσθηκαν με την αυθεντικότητα επιβεβαιώνεται με Ν-τερματική αλληλούχιση πρωτεΐνης η οποία εμφάνισε μια ακριβή αντιστοιχία των πρώτων 15 Ν-τερματικών αμινοξέων με τα αντίστοιχα αμινοξέα συναγόμενη από αλληλουχίες DNA (Πίνακας S2). Το κλωνοποιημένο V

H και V

γονίδια K εισήχθησαν μέσα στο

pdHL2

φορέα για να δημιουργήσει

cR1pdHL2

, το οποίο χρησιμοποιήθηκε για τη διαμόλυνση SPE-26 κύτταρα, μια παραλλαγή ofSp2 /0-Ag14 αναπτυχθεί in-house. Οι επιμολύνσεις επιλέχθηκαν με 0.075 μΜ μεθοτρεξάτη (ΜΤΧ), και υποβλήθηκαν σε διαλογή με ELISA για ανθρώπινες δραστηριότητες σύνδεσης Fc. Υψηλότερες κλώνοι που παράγουν επεκτάθηκαν περαιτέρω για την απόκτηση των δύο καλύτερα κλώνους (709.2D2 και 710.2G2), από την οποία CR1 παρήχθη σε καλλιέργειες παρτίδας και καθαρίζεται με χρωματογραφία πρωτεΐνης Α.

Δημιουργία HR1

ο εξανθρωπισμός [48] του CR1 να HR1 επιτεύχθηκε με εμβολιασμό των CDRs πάνω στις περιοχές ανθρώπινου πλαισίου του HMN-14. Για ορισμένες θέσεις πλαισίου, ποντικού κατάλοιπα R1 διατηρήθηκαν, με αποτέλεσμα οι αλληλουχίες αμινοξέων των HR1 V

H (Εικόνα S1A) και HR1 V

Κ (Σχήμα S1B). Συνθετικά γονίδια που κωδικοποιούν HR1 V

Η και Vk HR1 γενετική μηχανική μέσα σε

pdHL2

να ληφθεί

hR1pdHL2

, ο φορέας έκφρασης για HR1. Μεταγενέστερες προσπάθειες για την εξασφάλιση του κλώνου παραγωγής (711.3C11) για HR1 ήταν παρόμοιες με εκείνες που περιγράφονται παραπάνω για CR1, εκτός από το ότι επελέγησαν οι θετικοί κλώνοι για σύνδεση δραστηριότητες τόσο για την ανθρώπινη Fab και rhIGF-1 R.

Δημιουργία Hex -hR1 με DNL

C

H1-DDD2-Fab-HR1 και C

H3-AD2-IgG-HR1 παράχθηκαν ως πρωτεΐνες σύντηξης στα κύτταρα SpESF [49] επιμολύνονται με τους αντίστοιχους φορείς ως περιγράφεται για C

H1-DDD2-Fab-HA20 και C

H3-AD2-IgG-HA20 [50]. Hex-HR1 ελήφθη ως εξής. C

H1-DDD2-Fab-HR1 αναμίχθηκε με C

H3-AD2-IgG-HR1 σε ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο (PBS), ρΗ 7.4, με 1 mM EDTA, σε μία μοριακή αναλογία 4.2 για να πραγματοποιηθεί η σύζευξη των περισσότερων, αν όχι όλες, C

H3-AD2-IgG-HR1 έως C

H1-DDD2-Fab-HR1, μειώνοντας έτσι την πιθανότητα συν-καθαρισμός του C

H3-AD2-IgG- HR1 με το τελικό προϊόν σε χρωματογραφία στήλης πρωτεΐνης Α. Η αντίδραση DNL άρχισε με προσθήκη ανηγμένη γλουταθειόνη (GSH) έως 1 mM, ακολουθούμενη από την προσθήκη οξειδωμένης γλουταθειόνης (GSSH) σε 2 mM την επόμενη ημέρα, και μετά από μια περαιτέρω επώαση όλη τη νύκτα, Hex-HR1 καθαρίστηκε από το προκύπτον διάλυμα με πρωτεΐνη ένα χρωματογραφία.

Αγνότητα, του μεγέθους και αναλύσεις Μαζικής

αποκλεισμού μεγέθους υψηλής απόδοσης υγρή χρωματογραφία (SE-HPLC) πραγματοποιήθηκε σε Beckman System Gold Μοντέλο 116 με BioSep-SEC-S3000 στήλη (300 χ 7,80 mm) του Phenomenex χρησιμοποιώντας 0.04 Μ PBS (ρΗ 6.8) συν 1 mM EDTA ως κινητή φάση για να προσδιοριστεί η ακεραιότητα και η καθαρότητα του προϊόντος μοριακού mAbs και HexAbs. Οι μέσες υδροδυναμική διάμετρο HR1 και Hex-HR1 προσδιορίστηκαν με δυναμική σκέδαση φωτός (DLS) με μια σύμβαση για Microtrac. Ηλεκτροψεκασμού χρόνος ιονισμού της πτήσης (ESI-TOF) υγρού /φασματομετρία μάζας χρωματογραφία (LC-MS) πραγματοποιήθηκε σε HPLC 1200-series σε συνδυασμό με 6210 TOF MS (Agilent Technologies). Εν συντομία, HR1 ή Hex-HR1 μειώθηκε με 50 mM τρις ​​(2-καρβοξυαιθυλ) φωσφίνη για 30 λεπτά και επιλύονται με αντίστροφης φάσης HPLC (RP-HPLC), χρησιμοποιώντας ένα 20-λεπτών βαθμίδα 30-80% ακετονιτρίλιο σε 0.1% υδατικό μυρμηκικό οξύ με μια στήλη C4 5μ Δία (Phenomenex). Για το ΤΟΡ MS, τα τριχοειδή και θραυσματοποιητή τάσεις τέθηκαν σε 5500 και 250 V, αντίστοιχα.

Ανταγωνισμός Μελέτες δέσμευσης

Ομογενής χάντρες μικρόσφαιρας πολυστερίνης επικαλυμμένα με rhIGF-1 R χρησιμεύουν ως υποκατάστατα των κυττάρων που εκφράζουν IGF-1 R χρησιμοποιήθηκαν σε όλες τις μελέτες σύνδεσης ανταγωνισμού. Για να συγκριθεί η συγγένεια δέσμευσης, διάφορες συγκεντρώσεις μη επισημασμένου MR1, CR1, και HR1 αναμείχθηκαν με μια σταθερή ποσότητα του Alexa Fluor 532-σημασμένο CR1 (532-CR1). Τα επικαλυμμένα σφαιρίδια προστέθηκαν σε μία τελική πυκνότητα 2 × 10

5 σωματίδια /mL και τα μίγματα επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου (RT) για 1 ώρα με ήπια ανατάραξη. Το δεσμευμένο 532-CR1 προσδιορίστηκε με μέτρηση διάμεση ένταση φθορισμού (MFI) του 2000 χάντρες σε γκουάβα Σύστημα PCA (Millipore).

Για να καθοριστεί εάν CR1 μπορεί να εμποδίσει τη δέσμευση του IGF-1 ή IGF-2 για να IGF-1 R, διάφορες συγκεντρώσεις (0 έως 670 ηΜ) του CR1, IGF-1, ή IGF-2 αναμείχθηκαν με μία σταθερή ποσότητα

125Ι-IGF-1 ή

125Ι-IGF-2. Τα επικαλυμμένα σφαιρίδια στη συνέχεια προστέθηκαν, επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα με ήπια ανακίνηση, πλύθηκαν και μετρήθηκαν για ραδιενέργεια.

Για την ανίχνευση της πρόσδεσης περιοχή του HR1 επί IGF-1 R, ένα πάνελ εμπορικώς διαθέσιμων αντι-IGF -1R mAbs, με επίτοπους τους στην IGF-1 R χαρτογραφηθεί (εκτός MAB391), αξιολογήθηκαν ως ανταγωνιστές για αποκλεισμό HR1 από σύνδεση προς τους rhIGF-1 R-επικαλυμμένα σφαιρίδια. Σε αυτά τα πειράματα, τα R1, CR1, HR1, MAB391, 24-60, και Αir-3 το καθένα σημασμένο με R-φυκοερυθρίνη (ΡΕ) και επωάζεται με ένα μη επισημασμένο αντίσωμα ενδιαφέροντος σε διάφορες συγκεντρώσεις.

Η πρόσδεση σε Cell Surface IGF-1 R

Κάθε δείγμα παρασκευάστηκε εις διπλούν για να περιέχουν 2 × 10

5 κυττάρων και 10 μg /mL από ένα τεστ αντισωμάτων σε έναν τελικό όγκο 200 μL. Μετά από επώαση στους 4 ° C για 45 λεπτά, τα δείγματα πλύθηκαν δύο φορές με PBS-1% BSA, ακολουθούμενο από την προσθήκη ΡΙΤΟ-GAH IgG, (Η + L), και περαιτέρω επώαση στους 4 ° C για 45 λεπτά σε ο σκοτάδι. Δείγματα στη συνέχεια πλύθηκαν δύο φορές με PBS-1% BSA, επαναιωρήθηκαν σε 500 μL PBS-ρυθμισμένη φορμαλίνη και αναλύθηκαν σε FACScan.

Κυτταρικού Πολλαπλασιασμού Προσδιορισμός

Όλες οι επωάσεις κυττάρων πραγματοποιήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη 5% CO

2 θερμοκοιτίδα. Τα κύτταρα αποκολλήθηκαν με θρυψίνη, πλύθηκαν τρεις φορές με PBS για να απομακρυνθεί οποιοδήποτε ίχνος ορού, και εναιωρούνται εκ νέου σε ένα μέσο χωρίς ορό που περιέχει 10 μg /mL τρανσφερίνης βοοειδών (SFM-Trf). Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 1.0 × 10

3 κύτταρα /50 μΐ /φρεάτιο και επωάστηκαν όλη τη νύκτα. Την επόμενη ημέρα κάθε αντικείμενο δοκιμής σε SFM-Trf ήταν 5 φορές σειριακά αραιωμένου από 400 nm έως 0.001 ηΜ και 50 μL από κάθε συγκέντρωση προστέθηκαν εις τριπλούν στα φρεάτια έτσι ώστε οι τελικές συγκεντρώσεις του αντικειμένου δοκιμής κυμαίνονταν από 200 ηΜ έως 0.0005 ηΜ. Τα μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου έλαβαν μόνο το 50 μL του SFM-Trf. Μετά από επώαση για 1 ώρα, καθορισμένα φρεάτια έλαβαν 100 μL από κάθε είδους δοκιμής στην ίδια συγκέντρωση σε SFM-Trf που περιέχει 50 ng /mL του IGF-1. Οι πλάκες στη συνέχεια επωάστηκαν για μία χρονική περίοδο όπως υποδεικνύεται και ο αριθμός των βιώσιμων κυττάρων σε κάθε φρεάτιο προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία MTS ανά πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

Σχηματισμού Αποικίας Δοκιμασία κύτταρα που αναπτύσσονται σε καλλιέργεια μονοστιβάδας

DU 145 κύτταρα αποκολλήθηκαν με θρυψίνη και απλώθηκαν σε τρυβλία 60-mm (1 × 10

3 κύτταρα) σε 10% RPMI συμπληρωμένο με 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (P /S). άρθρα δοκιμής προστέθηκαν και μέσο που περιέχει τα αντικείμενα δοκιμής αντικαθίσταται κάθε τέσσερις ημέρες, Μετά από 14 ημέρες, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν σε 4% παρα-φορμαλδεΰδη και χρωματίστηκαν με 5% διάλυμα Giemsa. Αποικιών μεγαλυτέρων από 50 κύτταρα απαριθμήθηκαν κάτω από μικροσκόπιο. Σε ένα ξεχωριστό πείραμα, τα είδη ελέγχου δεν προστέθηκαν στο μετέπειτα μέσο.

Αποικίας Δοκιμασία Σχηματισμού κυττάρων που αναπτύσσονται σε μαλακό άγαρ

άγαρ Basal (0,5%) παρασκευάστηκε με ανάμιξη 1% άγαρ ( στους 40 ° C) με ένα ίσο όγκο 2 χ 10% RPMI και προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο (0.5 mL) σε ένα 24-φρεατίων. Κύτταρα σε 2 × 10% RPMI αναμίχθηκαν με ίσο όγκο 0.7% αγαρόζη και προστέθηκε (0.5 mL) στο επάνω μέρος του άγαρ βάση για την τελική καταμέτρηση των κυττάρων του 1250 ανά φρεάτιο σε 0.35% αγαρόζης. Τα κύτταρα τροφοδοτήθηκαν με 0,5 mL 10% RPMI προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο σε εβδομαδιαία βάση. Επεξεργασμένα φρεάτια περιείχαν τα άρθρα δοκιμής στο στρώμα αγαρόζης /κύτταρο στην αρχή και στις επόμενες τροφοδοτήσεις. Μόλις αποικίες ήταν σαφώς ορατές με μικροσκοπία σε φρεάτια ελέγχου χωρίς θεραπεία, το μέσο απομακρύνθηκε και οι αποικίες βάφτηκαν με κρυσταλλικό ιώδες. Αποικίες μετρήθηκαν κάτω από το μικροσκόπιο και ο μέσος αριθμός προσδιορίστηκε από πέντε διαφορετικών πεδίων ορατότητας εντός του φρεατίου.

Ανάλυση ανοσοκηλιδώσεως

Εκτός αν άλλως αναφέρεται, τα κύτταρα στερήθηκαν τροφής σε μέσο ελεύθερο ορού για 24 h, υποβλήθηκε σε επεξεργασία, και λύθηκαν σε θερμοκρασία παγωμένου σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα, όπως ορίζεται. Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης προσδιορίσθηκαν με την Protein Bio-Rad Δοκιμασία και τα δείγματα (15 έως 30 μg φορτώθηκε σε κάθε λωρίδα) διαχωρίστηκαν σε 4-20% γέλες Τρισ-γλυκίνης, μεταφέρθηκε σε PDVF ή nitrocellullose μεμβράνες, αποκλείστηκαν με ρυθμιστικό TBST (50 mM Tris ρΗ 8,0, 150 mM NaCl, 0,1% Tween 20) που περιέχει 5% άπαχο γάλα, πλύθηκε με ρυθμιστικό διάλυμα TBST και επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C με πρωτεύοντα αντισώματα. Οι μεμβράνες στη συνέχεια πλύθηκαν σε TBST τέσσερις φορές (μια φορά για 15 λεπτά και τρεις ακόμα για 5 λεπτά η κάθε μία), επωάστηκαν με συζευγμένο με HRP δεύτερα αντισώματα για 1 h σε RT, πλύθηκαν σε ρυθμιστικό TBST τέσσερις φορές όπως περιγράφηκε παραπάνω, στη συνέχεια ανιχνεύονται με Super σήμα West Dura Extended Διάρκεια υποστρώματος (Thermo Scientific) σύμφωνα με τις οδηγίες που παρέχονται από τον κατασκευαστή. Τα σήματα κατέστησαν ορατά ανοσοστύπωμα με ένα σύστημα χημειοφωταύγειας (Thermo Scientific). Ψηφιακές εικόνες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Carestream (Carestream Molecular Imaging).

Η μειωτική ρύθμιση του IGF-IR

Cells σε 10% RPMI σπάρθηκαν σε 1 × 10

6 ανά 100 mm δίσκου και καλλιεργήθηκαν επί μία νύκτα για την προσκόλληση. Την επόμενη ημέρα, το μέσο αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​10% RPMI που περιέχει ένα είδος αναλύσεως του ενδιαφέροντος σε υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις και τα κύτταρα επωάστηκαν περαιτέρω για 24 ώρες ή ένα προκαθορισμένο χρονικό διάστημα. Για την ανάλυση με στύπωμα Western, επεξεργασμένα κύτταρα πλύθηκαν με ψυχρό PBS, αποξέστηκαν από τα τρυβλία, συλλέχθηκε και φυγοκεντρήθηκε στους 4 ° C σε 2000 rpm για 5 λεπτά. Τα κύτταρα σφαιρίδια λύθηκαν για 10 λεπτά σε πάγο σε ρυθμιστικό RIPA ή ένα ρυθμιστικό διάλυμα που αποτελείται από 25 mM Tris (ρΗ 8), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton και 1 χ Complete, άνευ ΕϋΤΑ αναστολέα πρωτεάσης Cocktail (Roche Diagnostics ). Τα προϊόντα λύσης διαυγάστηκαν με φυγοκέντρηση, αναλύθηκαν για συγκέντρωση πρωτεΐνης και αναλύθηκε με ανοσοστύπωση. Για την ανάλυση με κυτταρομετρία ροής, επεξεργασμένα κύτταρα πλύθηκαν σε PBS δυο φορές, επωάστηκαν με ΡΕ-επισημασμένο 1H7 για 1 ώρα, πλύθηκαν δύο φορές με PBS, επαναιωρήθηκαν σε 500 μL PBS, και αναλύθηκαν σε FACScan.

Η φωσφορυλίωση του IGF -IR και Akt

κύτταρα (5 × 10

5 ανά φρεάτιο) αναπτύχθηκαν σε 10% RPMI σε πλάκες των 6-φρεατίων όλη τη νύκτα για προσκόλληση. Μετά από δύο πλύσεις με μέσο χωρίς ορό, τα κύτταρα επωάστηκαν για 4 ώρες σε μέσο χωρίς ορό και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με τα είδη ελέγχου στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις για συγκεκριμένο χρονικό διάστημα. Τα κύτταρα στη συνέχεια διεγέρθηκαν με ΙΟΡ-Ι για 10 λεπτά, πλύθηκαν με PBS, λύθηκαν με 200 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος RIPA για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, και υποβάλλονται σε επεξεργασία για ανάλυση ανοσοστυπώματος.

Matrigel Δοκιμασία Invasion

το πρωτόκολλο του κατασκευαστή για BD BIOCOAT ™ Matrigel ™ εισβολή Επιμελητηρίου (BD Biosciences) ακολουθήθηκε, χρησιμοποιώντας τη μορφή 24-καλά, το οποίο παρέχει 12 ένθετα, το καθένα περιέχει μία μεμβράνη μεγέθους πόρων 8-μm με ένα λεπτό στρώμα της MATRIGEL Υπόγειο μεμβράνης Matrix. Πριν από τη χρήση, το συγκρότημα 24 φρεατίων απομακρύνθηκε από αποθήκευση στους -20 ° C και αφέθηκε να θερμανθεί σε RT. Το εσωτερικό των προσθηκών και του πυθμένα των φρεατίων επανυδατώθηκαν με θερμό (37 ° C) όξινου ανθρακικού με βάση μέσο καλλιέργειας επί 2 ώρες, και αφαιρείται προσεκτικά. Τα κύτταρα (0,5 ml σε 5 × 10

4 /mL) σε μέσο χωρίς ορό τοποθετήθηκαν στο ένθετο (άνω τμήμα) και το φρεάτιο (κάτω τμήμα) πληρώθηκε με 0,5 mL 10% RPMI. Μετά από 2 ώρες, άρθρα δοκιμής προστέθηκαν στα κύτταρα στον άνω θάλαμο και η επώαση συνεχίστηκε για 20 ώρες, στον οποίο χρόνο τα κύτταρα που παρέμειναν στην Matrigel ή συνδέεται με την άνω πλευρά της μεμβράνης απομακρύνθηκαν με συμβουλές βαμβάκι. Τα κύτταρα στην κάτω πλευρά της μεμβράνης μονιμοποιήθηκαν σε μεθανόλη, βάφτηκαν είτε με Wright-Giemsa χρώση ή Hoechst 33258, και εξετάστηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού.

μικροσκοπία ανοσοφθορισμού

κύτταρα αναπτύσσονται σε καλυπτρίδες πλύθηκαν, σταθεροποιήθηκαν με 4% φορμαλίνη, πλύθηκαν, επωάστηκαν με πρωτογενή αντισώματα για 1 h σε RT, πλύθηκαν με PBS, και αντιδρά με FITC- ή TRITC-συζευγμένα δευτερογενή αντισώματα σε RT για 40 min. Μετά την πλύση, τα δείγματα βάφτηκαν με Hoechst 33258, συναρμολογημένα, και εξετάστηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού.

In vivo αποτελεσματικότητα

Θηλυκά 8 εβδομάδων ποντίκια SCID (Taconic Farms) χρησιμοποιήθηκαν. Κάθε ποντικός εγχύθηκε s.c. με 5 × 10

6 RH-30 κύτταρα. Μόλις οι όγκοι έφθασαν περίπου 0,2 cm

3 σε μέγεθος, τα ζώα χωρίστηκαν σε έξι ομάδες των 10 ποντικών κάθε μία και εγχύθηκαν ε.π. δύο φορές την εβδομάδα για τέσσερις εβδομάδες με HR1 (1 mg), Hex-HR1 (0,82 mg), ραπαμυκίνη (5 mg /kg), HR1 (1 mg) συν ραπαμυκίνη (5 mg /kg), Hex-HR1 (0,82 mg) συν ραπαμυκίνη (5 mg /kg), και αλατούχο διάλυμα (που περιέχει 2% DMSO), αντίστοιχα. Ένα αποθεματικό διάλυμα rapamycin παρασκευάστηκε σε αλατούχο διάλυμα (που περιέχει 2% DMSO) σε 1 mg /mL και 100 μL χορηγήθηκαν σε κάθε ποντικό ανά ένεση. Οι όγκοι μετρήθηκαν και ζυγίστηκαν τα ποντίκια δύο φορές την εβδομάδα. Τα ζώα θυσιάστηκαν όταν οι όγκοι έφθασαν δύο εκατοστά

3. Μια δεύτερη μελέτη για να συγκριθεί η αποτελεσματικότητα της HR1 και Hex-HR1 δίνεται σε μοριακές ισοδύναμες δόσεις (0,33 mg έναντι 0,82 mg) επίσης διεξήχθη. Πρωτόκολλα για μελέτες σε ζώα εγκρίθηκαν από τη Φροντίδα των Ζώων και Χρήση Επιτροπή CMMI Θεσμική.

Στατιστική Ανάλυση

Για in vitro μελέτες, η στατιστική διαφορά μεταξύ των δύο πληθυσμών προσδιορίστηκε από Φοιτητών

t

-τεστ. Η στατιστική ανάλυση των δεδομένων για την ανάπτυξη του όγκου βασίστηκε στην περιοχή κάτω από την καμπύλη (AUC) και ο μέσος χρόνος επιβίωσης χρησιμοποιώντας μια δίπλευρη

t-test

να εκτιμήσει σημασία μεταξύ όλων των διαφόρων ομάδων θεραπείας και ελέγχου, εκτός από το αλατούχο διάλυμα ελέγχου, για τα οποία μονόπλευρο

t-test

χρησιμοποιήθηκε. Οι καμπύλες επιβίωσης αναλύθηκαν με Kaplan-Meier οικόπεδα (ανάλυση log-rank), χρησιμοποιώντας το πακέτο λογισμικού Prism GraphPad (v4.03? Σύνθετη Graphics Software, Inc.). Η τιμή του

P

& lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

Αξιοσημείωτες Ιδιότητες των R1, CR1 και HR1

Η γονική R1 φάνηκε. να αναστέλλει μερικώς τη δέσμευση του

125Ι-επισημασμένου IGF-1 (

125Ι-ΙΟΡ-1) στην κυτταρική σειρά ανθρώπινου καρκίνου του μαστού MCF-7L (α υπογραμμή του MCF7) συγκρίσιμη με MAB391 (Πίνακας S3). Χιμαιρισμού του R1 φάνηκε να βελτιωθεί η συγγένεια του R1 για rhIGF-1 R ακινητοποιημένη πάνω σε σφαιρίδια πολυστυρενίου, όπως φαίνεται από μία δοκιμασία ανταγωνισμού στην οποία η πρόσδεση του R1 με ετικέτα με έναν φθορίζοντα ανιχνευτή (Alexa 532) μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής σε παρουσία διαφόρων Οι συγκεντρώσεις του CR1 ή R1 (Εικόνα S2). Τα αντισώματα που παράγονται από τα δύο κλώνους του CR1 έδειξε την ίδια συγγένεια 0.1 ηΜ (Εικόνα S3) και ήταν ειδικά για ακινητοποιημένο rhIGF-1 R αλλά όχι ακινητοποιημένη rhIR (Σχήμα S4). Ωστόσο, CR1 απέτυχε να εμποδίσει τη δέσμευση του IGF-1 ή IGF-2 σε ακινητοποιημένο rhIGF-1R εις τον ποσοτικό προσδιορισμό σφαιριδίων (Σχήμα S5), σε αντίθεση με την προηγούμενη παρατήρηση ότι μυϊκό ομόλογο του θα μπορούσε να αναστείλει μερικώς την δέσμευση του

125I- IGF-1 σε κύτταρα MCF-7L. Επιτυχής εξανθρωπισμός καταδείχθηκε με το ισοδύναμο δραστικότητα της HR1 και CR1 να ανταγωνιστεί με 532-CR1 για δέσμευση με rhIGF-1 R-ακινητοποιημένο σφαιρίδια (Σχήμα S6). Από την άλλη πλευρά, η ανάλυση σφαιριδίων έδειξε επίσης HR1 ήταν αναποτελεσματικό στην αναστολή της πρόσδεσης του

125Ι-IGF-1 στο ακινητοποιημένο rhIGF-1 R (Σχήμα S7). Με βάση τα αποτελέσματα από τις πειράματα χιαστί αποκλεισμού (Πίνακες 1 και 2), το επιτόπιο του HR1 συνάχθηκε να διαμένουν μεταξύ ο υπολείμματα αμινοξέων 185 και 222 στα μέσα του πρώτου μισού του πλούσια σε κυστεΐνη περιοχή. Περιέργως, αν και MAB391 δεν είχε επίδραση επί της συνδέσεως του ΡΕ-επισημασμένου R1 σε ακινητοποιημένο rhIGF-1 R (Σχήμα S8A), το R1 ουσιαστικά μειωμένη την πρόσδεση του PE-επισημασμένου MAB391 (Σχήμα S8B), υποδηλώνοντας ότι το R1 μπορεί να αναστέλλει την πρόσδεση του MAB391 να ακινητοποιημένο rhIGF-1R αλλοστερικά.

Η

Μοριακός Χαρακτηρισμός HR1 και Hex-HR1

Οι SE-HPLC και DLS προφίλ των HR1 και Hex-HR1, που φαίνεται στο Σχ. 1Α και 1Β, αντίστοιχα, δείχνουν τον υψηλό βαθμό ομοιογένειας. Για HR1, παρατηρήθηκε μία μοναδική κορυφή σε 8,51 min. Hex-HR1, η οποία περιλαμβάνει ένα ζεύγος σταθεροποιημένου διμερή HR1 Fab προσαρτημένη σε μία πλήρη HR1 IgG στα τέρματα καρβοξυλίου των δύο βαριές αλυσίδες, εμφανίζεται επίσης μόνο μία κύρια κορυφή στα 7,43 λεπτά. Τα μεγέθη των σωματιδίων του HR1 και Hex-HR1 ήταν σε μεγάλο βαθμό μονοδιασκορπισμένη, με τον μέσο όρο των υδροδυναμικών διαμέτρους 10,34 nm και 15,83 nm, αντίστοιχα.

Η

Όπως φαίνεται στον Πίνακα 3, η μάζα εκάστου των πολυπεπτιδίων που περιλαμβάνουν HR1 και Hex-HR1 προσδιορίστηκε με LC /MS ήταν σύμφωνο με τη μάζα που υπολογίζεται από συμπερασματική αλληλουχία αμινοξέων τους και η προβλεπόμενη μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις, συμπεριλαμβανομένων Ν-συνδεδεμένη γλυκοζυλίωση και αμινο-τερματικού πυρογλουταμικού για την βαριά αλυσίδα του HR1 και Hex-HR1, και η αλυσίδα Fd-DDD2 του Hex-HR1. Τόσο για HR1 και Hex-HR1, το

κάππα

αλυσίδα, η οποία δεν μεταβάλλεται, έδωσε μια σχεδόν ταυτόσημη μάζα που παρατηρήθηκε εντός 20 ppm της προβλεπόμενης μάζας. Για HR1, η βαριά αλυσίδα ανιχνεύθηκε ως αρκετές ισομορφές, συμπεριλαμβανομένων και εκείνων των παραλλαγών λυσίνης καρβοξυλ-τερματικό και διάφορες γλυκομορφές. Για Hex-HR1, η AD2-συγχωνευμένων βαριά αλυσίδα ήταν άθικτο, με κυρίως G0F και G1F glycoforms. Η το συστατικό HR1-Fd-DDD2 του Hex-HR1 ταιριάζουν επίσης ότι από την προβλεπόμενη μάζα εντός 0,1 ppm, χωρίς επιπλέον μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις εκτός από το αμινο-τερματικό πυρογλουταμικό.

Η

Η έκφραση του IGF- 1R σε ποικίλες κυτταρικές σειρές καρκίνου

η θετική σύνδεση με HR1 και Hex-HR1 αποδείχθηκε σε MCF7 (καρκίνος του μαστού), DU 145 (καρκίνος του προστάτη), μΕ-180 (καρκίνος του τραχήλου της μήτρας) και RH-30 (ραβδομυοσάρκωμα) με κυτταρομετρία ροής (Πίνακας 4). Με βάση την παρατηρούμενη διάμεση ένταση φθορισμού (MFI), τα επίπεδα έκφρασης του IGF-1 R ποικίλει μεταξύ των τεσσάρων αυτών κυτταρικές σειρές, με τη σχετική αφθονία του υποδοχέα σε RH-30 αυξήθηκε σχεδόν κατά 2 φορές σε DU 145 ή ΜΕ-180, και περίπου 3-φορές σε MCF7. Υπό το φως του αριθμού των επιφανειακών ΙΟΡ-1R ανά κύτταρο όπως αναφέρθηκε για RH-30 [51] και MCF7 [52] να είναι 20.600 και 43.000, αντίστοιχα, θα υπάρξει 2,3 φορές αύξηση στη MCF7 σε σύγκριση με RH-30 , η οποία συμφωνεί και με την 3-πλάσια αύξηση εκτιμάται από τα δεδομένα των ΝΧΙ. Σύκο. Όπως φαίνεται στο Σχ. Όπως φαίνεται στο Σχ. Όπως φαίνεται στο Σχ.