Αφηρημένο

Ιστορικό

Το βουτυρικό νάτριο, ένας αναστολέας των αποακετυλασών των ιστονών, έχει αναδειχθεί ως μια πολλά υποσχόμενη αντικαρκινικό φάρμακο για πολλές μορφές καρκίνου. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι το βουτυρικό νάτριο θα μπορούσε να αναστείλει την εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη? Ωστόσο, ο ακριβής μηχανισμός παραμένει ασαφής. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να διερευνηθεί ο μηχανισμός δράσης βουτυρικού νατρίου σε κύτταρα προστάτη καρκίνο DU145.

Μέθοδοι

Τα ανασταλτικά αποτελέσματα του ΝαΒ επί της κυτταρικής ανάπτυξης ανιχνεύθηκαν από το 3- (4, 5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2, 5-diphenyltetrrazolium δοκιμασία βρωμίδιο. Κυτταρικής απόπτωσης προσδιορίστηκε με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής των κυττάρων DU145 χρωματίστηκαν με ανεξίνη V και ΡΙ. Hoechst 33258 και του φθορισμού μικροσκόπια χρησιμοποιήθηκαν για να τηρήσει την πυρηνική μορφολογία των κυττάρων DU145 μετά τη θεραπεία με NaB. ANXA1 νοκ ντάουν κύτταρα δημιουργηθεί μέσω επιμόλυνσης με ANXA1 siRNA. επίπεδα ANXA1 mRNA μετρήθηκαν με qRT-PCR. Bcl-2, Βαχ, ANXA1, ERK1 /2 και pERK1 /2 ανιχνεύθηκαν με western blot.

Αποτελέσματα

NaB ανέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη και την επαγωγή απόπτωσης των DU145 και κυττάρων PC3 σε μία δόση εξαρτώμενο τρόπο. Η έκφραση του γονιδίου αντι-απόπτωσης Bcl-XL και Bcl-2 σε κύτταρα DU145 μειώνονται και η έκφραση του γονιδίου απόπτωση Βαχ και Bak αυξήθηκαν μετά τη θεραπεία NaB. Περαιτέρω μελέτες έχουν αποδείξει ότι NaB επάνω ρυθμισμένη την έκφραση ANXA1 και ότι η δράση αναστολή όγκου του ΝαΒ μειώθηκε σημαντικά μέσω knockdown του γονιδίου ANXA1 σε κύτταρα DU145. Επιπλέον, τα κύτταρα siANXA1 έδειξαν ότι ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων αυξήθηκε και η κυτταρική απόπτωση που επάγεται από την αδρανοποίηση των εξωκυτταρικών ρυθμιζόμενης κινάσης (ERK).

Συμπέρασμα

Τα αποτελέσματά μας υποστηρίζουν μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ των λειτουργιών ΝΑΒ και ANXA1 έκφραση στον καρκίνο του προστάτη, και να ανοίξει το δρόμο για περαιτέρω μελέτη του μοριακού μηχανισμού των δράσεων ΝαΒ σε καρκίνους

Παράθεση:. Mu D, Gao Ζ, Guo η, Zhou G, η Sun Β (2013) ανάπτυξη νάτριο βουτυρικό Προκαλεί Αναστολή και απόπτωση σε καρκινικά Ανθρώπινου προστάτη DU145 κύτταρα με Up-ρύθμιση της έκφρασης αννεξίνης Α1. PLoS ONE 8 (9): e74922. doi: 10.1371 /journal.pone.0074922

Επιμέλεια: Ντχιάνι Chandra, Roswell Park Cancer Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 9 του Απρίλη 2013? Αποδεκτές: 6 Αυγ 2013? Δημοσιεύθηκε: 23 Σεπτέμβρη 2013

Copyright: © 2013 Mu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη είναι μια σχετικά συχνή κακοήθης καρκίνος και η δεύτερη πιο συχνά διαγιγνώσκεται καρκίνος σε άνδρες [1]. Πρόσφατα, αρκετές αποτελεσματικές θεραπείες μπορεί να προσφερθεί για την κλινική θεραπεία του καρκίνου του προστάτη? όπως η χειρουργική επέμβαση (ριζική προστατεκτομή) και ακτινοθεραπεία (ακτινοθεραπεία εξωτερικής δέσμης, βραχυθεραπεία, ή και τα δύο) για ασθενείς με πρώιμο στάδιο της νόσου και ανοσοενισχυτικό συστηματικές θεραπείες (χημειοθεραπεία), οι οποίες είναι αποτελεσματικές για προχωρημένου σταδίου της νόσου [2]? Ωστόσο, οι θεραπείες έχουν όλα διαφορετικά προφίλ παρενεργειών. Το βουτυρικό νάτριο, ένα από τα πιο ευρέως μελετηθεί αναστολείς αποακετυλάσης ιστόνης, έχει αναδειχθεί ως μια πολλά υποσχόμενη αντικαρκινικό φάρμακο με μεταβολή της γονιδιακής έκφρασης μέσω τροποποίησης της χρωματίνης [3].

Το βουτυρικό νάτριο, το άλας νατρίου του βουτυρικού οξέος, έχει αναφερθεί να έχουν μια ευρεία ποικιλία αποτελεσμάτων επί καλλιεργημένα κύτταρα θηλαστικών, όπως η επαγωγή της διαφοροποίησης και αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, σε σχετικά χαμηλές συγκεντρώσεις [4], [5]. Επιπλέον, υπάρχει ένα σύνολο στοιχείων που δείχνει ότι το βουτυρικό νάτριο θα μπορούσε να διεγείρει απόπτωση σε πολλά καρκινικά κύτταρα [6], [7]. Λόγω της αναστολής της ανάπτυξης της και δραστικότητα επαγωγής απόπτωσης, βουτυρικό νάτριο, μόνο του ή σε συνδυασμό με άλλα αντικαρκινικά φάρμακα, θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για τη θεραπεία ορισμένων κακοηθών όγκων [8], [9]. Πρόσφατα, Degui Wang και οι συνεργάτες του απέδειξαν ότι το βουτυρικό νάτριο μπορεί να αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό κυτταρικών σειρών καρκίνου ανθρώπινου προστάτη και έχει μια συνεργική δράση με αντικαρκινικά φάρμακα στη θεραπεία του καρκίνου του προστάτη και τα δύο

in vitro

και

in vivo

[10]. Η κλινική χρησιμότητα των βουτυρικού νατρίου περιορίζεται από το μηχανισμό δράσης του, το οποίο είναι ακόμα ασαφής. Μια σημαντική πρόσφατη πρόοδος ήταν ότι το βουτυρικό νάτριο έχει βρεθεί ότι πλειορύθμιση της έκφρασης αννεξίνης Α1 (ANXA1) σε ανθρώπινα κύτταρα αδενοκαρκινώματος κόλου [11].

αννεξίνες είναι μία οικογένεια πρωτεϊνών που δεσμεύονται φωσφολιπίδιο και ασβέστιο το οποίο αποτελούνται από 12 μέλη στα θηλαστικά. Αννεξίνες είναι πανταχού παρόντες και εκφράζεται σε μία ποικιλία οργανισμών [12]. Υπάρχουν κάποιες ενδείξεις ότι τα μέλη της οικογένειας αννεξίνης έχουν σημαντικούς ρόλους στην ογκική ανάπτυξη και την εξέλιξη, επειδή αυτές οι πρωτεΐνες μπορούν να επηρεάσουν την διεισδυτικότητα και τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και να δείξει απορρύθμισης σε πολυάριθμες καρκίνους [13]. ANXA1, το πρώτο μέλος της οικογένειας του αννεξίνες, είναι μια ενδοκυτταρική πρωτεΐνη η οποία παίζει σημαντικό ρόλο στην απόπτωση, τον πολλαπλασιασμό και τον καρκίνο [14], [15]. Ένα μεγάλο μέρος της διαμάχης εξακολουθεί να υπάρχει σχετικά με την έκφραση της ANXA1 σε διαφορετικούς τύπους καρκίνων. Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι η έκφραση του ANXA1 ρυθμίζεται προς τα κάτω σε τραχήλου της μήτρας, του μαστού, της κεφαλής και του αυχένα, ή καρκίνος του θυρεοειδούς [16], [17], [18], [19], [20]. Από την άλλη πλευρά, υπάρχουν επίσης κάποιες ενδείξεις ότι έχει σημειωθεί αύξηση της έκφρασης ANXA1 σε άλλους τύπους καρκίνου, όπως του παγκρέατος, του οισοφάγου, και γαστρικά καρκινώματα [21], [22], [23]. Υπάρχει έλλειψη επαρκούς λειτουργικής πειραματικές αποδείξεις με σαφήνεια ο ρόλος του αννεξίνες στον καρκίνο του προστάτη. Αρκετές πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι αννεξίνη II μειώθηκε σε καρκίνους του προστάτη και αννεξίνες Α1 και Α2 έχουν ήδη συσχετιστεί με καταστολή όγκου στον καρκίνο του προστάτη [24]. Lecona και συνεργάτες απέδειξαν ότι το βουτυρικό μπορεί να ρυθμίζουν την έκφραση της ANXA1 σε ανθρώπινα κύτταρα αδενοκαρκινώματος κόλου [11]. Οι μελέτες αυτές υπογραμμίζουν τον πιθανό ρόλο του βουτυρικού νατρίου ως ρυθμιστής ANXA1 να αναστέλλει την εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη. Η μελέτη παρέχει την πρώτη άμεση μαρτυρία σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη που βουτυρικό νάτριο μπορεί να ρυθμίζουν την έκφραση της ANXA1 που οδηγούν σε απόπτωση κυττάρων. Δείχνουμε ότι το βουτυρικό νάτριο αναστέλλει την ανάπτυξη των κυττάρων και επάγει κυτταρική απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη από up-ρύθμιση της έκφρασης ANXA1 μέσω της οδού σηματοδότησης ERK.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντισώματα

ποντικού αντι–2 Bcl μονοκλωνικό αντίσωμα, αντι-Βαχ μονοκλωνικό αντίσωμα, μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού αντι-ΒοΙ-χι, αντι-Bak μονοκλωνικό αντίσωμα, αντι-ANXA1 μονοκλωνικό αντίσωμα και μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού αντι-β-ακτίνης ποντικού ποντίκι ποντίκι ήταν λαμβάνεται από Abcam (Cambridge, ΜΑ). Αντι-φωσφο-ΕΚΚ (pERK) μονοκλωνικό αντίσωμα, αντι-ΕΚΚ πολυκλωνικό αντίσωμα και ΗΚΡ-συζευγμένου αντισώματος κατσίκας αντι-ποντικού IgG ελήφθησαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA).

Κυτταροκαλλιέργεια

Οι ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη κυτταρικών γραμμή κυττάρων DU145 (ΗΤΒ-4? ATCC, Rockville, MD) και τα κύτταρα PC3 (ATCC, Rockville, MD) καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C υπό υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2 και 95% αέρα και αναπτύχθηκαν σε RPMI 1640 (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), 1% πενικιλίνη-στρεπτομυκίνη και 1% γλουταμίνη.

βιωσιμότητας κυττάρων δοκιμασία

Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με τη δοκιμασία εξαίρεσης κυανούν τρυπανίου, όπως περιγράφηκε προηγουμένως με ελάσσονες τροποποιήσεις [25]. Εν συντομία, DU145 και PC3 κύτταρα επιστρώθηκαν ξεχωριστά σε πλάκες 24 φρεατίων στα 2 χ 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο, που αναπτύχθηκαν σε μέσο RPMI 1640 για 24 ώρες και στη συνέχεια προστέθηκε σε διαφορετικές συγκεντρώσεις NaB σε μια τελική συγκέντρωση 0, 1 , 5, και 10 mmol. Μόνο διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) προστέθηκε για την ομάδα ελέγχου. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε ένα επωαστήρα για διαφορετικές περιόδους. εναιωρήματα κυττάρων (10 μL) σε PBS αναμίχθηκαν με 40 μL Trypan Blue (Sigma, St. Louis, ΜΟ). Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν τρεις φορές με DMSO πριν από την μέτρηση κάτω από μικροσκόπιο φωτός. Κύτταρα αποδεικνύοντας πρόσληψη χρωστικής είχαν χαρακτηριστεί ως μη βιώσιμο.

ΜΤΤ Δοκιμασία Πολλαπλασιασμού

DU145 και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων PC3 μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας το προηγουμένως περιγραφέν 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2 , βρωμιούχο 5-diphenyltetrrazolium (ΜΤΤ) [26]. Εν συντομία, DU145 και τα κύτταρα PC3 (περίπου 2 × 10

5) τοποθετήθηκαν χωριστά σε πλάκες 24 φρεατίων για 48 ώρες. Το ΜΤΤ (20 μΙ, 5 mg /mL) στη συνέχεια προστέθηκαν στο DU145 και καρκινικών κυττάρων PC3 για 4 ώρες στους 37 ° C. DMSO (200 μL) προστέθηκε σε διαλυτοποίηση των κρυστάλλων για 25 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Η τιμή οπτικής πυκνότητας (OD) μετρήθηκε σε μήκος κύματος 490 nm με ένα φασματοφωτόμετρο (Multiskan MK3, Θέρμο, Waltham, ΜΑ). Όλα τα πειράματα εκτελέστηκαν τουλάχιστον τρεις φορές και υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τα μέσα αποτελέσματα.

Ανίχνευση αποπτωτικών κυττάρων με κυτταρομετρία ροής

Η αναλογία των κυττάρων αποπτωτική μετρήθηκε με αννεξίνη V-FITC και χρώση ΡΙ που ακολουθείται από ανάλυση με κυτταρομετρία ροής (Beckman-Coulter, Brea, CA). Εν συντομία, 2 χ 10

5 κύτταρα ανά πηγάδι τοποθετήθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων και στη συνέχεια προστέθηκαν διάφορες συγκεντρώσεις NaB. Τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση και στη συνέχεια επωάστηκαν με Αννεξίνη V και ΡΙ για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Η απόπτωση εξετάστηκε με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας το κιτ αννεξίνης V-FITC /ΡΙ (BD PharMingen, San Diego, CA). Μετά από 30 λεπτά στους 37 ° C τα κύτταρα ήταν έτοιμα για την ανάλυση της κυτταρομετρίας ροής και η αναλογία των κυττάρων αποπτωτικό προσδιορίστηκε.

Πυρηνική μορφολογική παρατήρηση του ΝαΒ κατεργασμένων κυττάρων του καρκίνου DU145

απλώθηκαν

Cells σε πλάκες 24 φρεατίων σε 2 × 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο και κατεργάζεται με NaB σε διάφορες συγκεντρώσεις. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν χρησιμοποιώντας 10% ρυθμισμένη φορμαλίνη /4% φορμαλδεΰδη, και στη συνέχεια πλύθηκαν δύο φορές με PBS και χρωματίστηκαν με Hoechst 33258 διάλυμα χρώσης. Η πυρηνική μορφολογία των κυττάρων DU145 παρατηρήθηκε με αντικατοπτρίζεται φθορισμού μικροσκόπιο (Nikon MF30 LED, Japan). Ποσοτικοποίηση των αποπτωτικών κυττάρων πραγματοποιήθηκε με μέτρηση 500 DU145 κύτταρα, και στη συνέχεια προσδιορισμού του ποσοστού των αποπτωτικών κυττάρων σε τουλάχιστον πέντε διατομές ανά slide. Το πείραμα επαναλήφθηκε τουλάχιστον τρεις φορές.

ποσοτική πραγματικού χρόνου -PCR (qRT-PCR) Δοκιμασία

ANXA1

επίπεδα του mRNA μετρήθηκαν σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη DU145 χρησιμοποιώντας τη μέθοδο qRT-PCR. Ολικό κυτταρικό RNA απομονώθηκε από τα κύτταρα DU145 χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. 2 μg ολικού RNA υποβλήθηκε σε αντίστροφη μεταγραφή χρησιμοποιώντας ένα υψηλής χωρητικότητας RNA-to-cDNA Kit (Applied Biosystems) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. QRT-PCR πραγματοποιήθηκε σε ένα πραγματικό χρόνο σύστημα ανίχνευσης BioRad MyIQ μονόχρωμο PCR χρησιμοποιώντας SYBR Green Supermix (BioRad, Carlsbad, CA). Οι αλληλουχίες εναρκτήρα που χρησιμοποιούνται για qRT-PCR ήταν ως εξής:

ANXA1

εμπρός, GAGCCCCTATCCTACCT TCA?

ANXA1

αντιστραφεί, GGTTGCTTCATCCACACCT?

ΑΚΤΙΝΗΣ

προς τα εμπρός, TCCCTGGAGAAGAGCTACGA?

ΑΚΤΙΝΗΣ

αντιστραφεί, AGGAAGGAAGGCTGGAAGAG. Αυτά τα εναύσματα όλα συντίθενται από Sangon Biotech Co., Ltd (Σαγκάη, Κίνα). Οι συνθήκες κύκλων είχαν ως εξής: προ-επώαση: 95 ° C, 10 λεπτά? PCR: 94 ° C, 10 s και 60 ° C, 30 s, 45 κύκλους? τελική επιμήκυνση: 72 ° C, 10 min. Τα επίπεδα έκφρασης των σχετικών γονιδίων υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας το 2

-ΔΔCT μέθοδο [27] και με το mRNA β-ακτίνης ως ένας εσωτερικός έλεγχος.

Δοκιμασία Western Blot

Η ολική πρωτεΐνη του DU145 κύτταρα εκχυλίστηκαν με χρήση RIPA ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (Beyotime, Nantong, Κίνα) σύμφωνα με τα πρωτόκολλα λειτουργίας. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης στα προϊόντα λύσης προσδιορίστηκε με BCA κιτ δοκιμασίας πρωτεΐνης (Beyotime, Nantong, Κίνα). Οι πρωτεΐνες (40 μg /λωρίδα) υποβλήθηκαν σε 10% SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν ηλεκτροφορητικά σε Immobilon Ρ Millipore (Bedford, ΜΑ, USA). ποντικού μονοκλωνικό και πολυκλωνικά αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν σαν το πρωτογενές αντίσωμα και συζευγμένο με HRP γίδινη αντι-ποντικού IgG χρησιμοποιήθηκε σαν το δευτερογενές αντίσωμα. Τα δεσμευμένα αντισώματα κατέστησαν ορατά χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο LumiGLo (Pierce, Rockford, IL) και τα επίπεδα των πρωτεϊνών σε σχέση με την β-ακτίνη προσδιορίστηκαν. Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές.

μικρό παρεμβαλλόμενο RNA Επιμόλυνση

Τα κύτταρα DU145 καρκίνου του προστάτη με την πρωτεΐνη ANXA1 επιμολύνονται με ANXA1 siRNA (siANXA10) ή τον έλεγχο siRNA (siMock) ( Takara, Dalian, Κίνα) χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) σύμφωνα με τη μέθοδο του Maxime [28], με μικρές τροποποιήσεις. Εν συντομία, μία ημέρα πριν από την επιμόλυνση, 2 × 10

5 καρκίνου του προστάτη κύτταρα σπάρθηκαν σε ένα πλάκες 60 mm σε RPMI 1640 που περιέχει 5% FCS. Συνολικά, 1,5 μg DNA πλασμιδίου επιμολύνθηκε σε κύτταρα DU145 για RNA και πρωτεϊνική εκχύλιση. Σταθερά επιμολυσμένα κύτταρα DU145 επιλέχθηκαν με το μέσο που περιείχε πουρομυκίνη καλλιέργειας (Invitrogen, Carlsbad, CA). Οι βιώσιμες αποικίες συνελήφθησαν και μεταφέρθηκαν σε νέα πιάτα μετά από 2 έως 3 εβδομάδες μετά την επιμόλυνση. Οι αλληλουχίες στόχοι siANXA1 ήταν: 5′-ATGCCTCACAG- CTATCGTGAA-3 ‘(νοηματικό), και 5′-TTCACGATAGCTGTGAGGCAT-3’ (αντι-νόημα). SiANXA1-επιμολυσμένα και siMock-επιμολυσμένα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για περαιτέρω πειράματα.

Στατιστική Ανάλυση

Όλα τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± πρότυπο σφάλμα του μέσου (SEM). Οι διαφορές μεταξύ του ελέγχου και NaB αγωγή ομάδες συγκρίθηκαν με δοκιμή του Dunnett μετά την ANOVA. Μια τιμή της P & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές.

Αποτελέσματα

ΝαΒ αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό και την επιβίωση των κυττάρων σε DU145 κύτταρα

Η κυτταροτοξική δράση των ΝαΒ στην ανθρώπινη καρκίνο του προστάτη DU145 και PC3 κύτταρα εξετάστηκαν με ποικίλες συγκεντρώσεις ΝΑΒ και φορές με δοκιμασία εξαίρεσης κυανούν τρυπανίου (Εικ. 1 Α και C). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η βιωσιμότητα των DU145 και PC3 κύτταρα όλοι μειώθηκαν κατά NaB σε μια δόση και το χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο. ΝΑΒ προκάλεσε μια εμφανή μείωση του αριθμού των βιώσιμων κυττάρων ξενιστών δοσοεξαρτώμενο με IC

50 7,07 mmol /L στις 48 ώρες στα κύτταρα DU145 και IC

50 8,71 mmol /L στις 48 ώρες στα κύτταρα PC3 . Ένα εύρος δόσεων 0-10 mmol NaB αγωγή κυττάρων του προστάτη του καρκίνου DU145 και PC3 για 48 h είναι αναμενόμενη συγκέντρωση και το χρόνο μας.

(Α) NaB αναστέλλει την κυτταρική βιωσιμότητα σε ένα χρόνο- και δοσο-εξαρτώμενο τρόπο σε DU145 κύτταρα. Τα καρκινικά κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία μόνο με μέσο ή διάφορες συγκεντρώσεις NaB (1, 5, 10 mmol) για διάφορα χρονικά (12, 24, 48, 72, 96 και 120 ώρες). (Β) Επίδραση των ΝαΒ στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων DU145. Τα καρκινικά κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία μόνο με μέσο ή διάφορες συγκεντρώσεις NaB (1, 5, 10 mmol) για 48 ώρες. (Γ) NaB αναστέλλει τη βιωσιμότητα των κυττάρων σε κύτταρα PC3. Τα καρκινικά κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία μόνο με μέσο ή διάφορες συγκεντρώσεις NaB (1, 5, 10 mmol) για διάφορα χρονικά (12, 24, 48, 72, 96 και 120 ώρες). (D) Επίδραση της ΝαΒ στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων PC3. Τα καρκινικά κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία μόνο με μέσο ή διάφορες συγκεντρώσεις NaB (1, 5, 10 mmol) για 48 ώρες. (Ε) Επίδραση NaB σε συνδυασμό με DOC στην κυτταρική βιωσιμότητα των κυττάρων DU145 και PC3. Τα καρκινικά κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία μόνο με μέσο ή ΝαΒ (5 mmol) σε συνδυασμό με DOC (1 μπιοί) επί 48 ώρες. (F) Επίδραση ΝΑΒ σε συνδυασμό με το DOC για DU145 και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων PC3. Τα καρκινικά κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία μόνο με μέσο ή ΝαΒ (5 mmol) σε συνδυασμό με DOC (1 μπιοί) επί 48 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με δοκιμασία εξαίρεσης κυανούν τρυπανίου. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων ανιχνεύθηκε με δοκιμασία ΜΤΤ. NaB ανέστειλε σημαντικά την αύξηση των DU145 και κυττάρων PC3. Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές. Τα δεδομένα είναι μέσα ± SEM. (N = 3) (τεστ Dunnett, * P & lt?. 0.05

vs

ελέγχου)

Η

Μετρήσαμε επίσης την επίδραση του ΝαΒ για DU145 και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων PC3 με τη δοκιμασία ΜΤΤ.. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Β και D, υπήρχε μια δραστική μείωση στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων με αυξανόμενες δόσεις NaB (0-10 mmol). ΝΑΒ πολλαπλασιασμός ανέστειλε κύτταρο δοσοεξαρτώμενο τόσο DU145 και PC3 κύτταρα (Σχ. 1 Β και D). Αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν ότι NaB μπορούν να αναστείλουν τον πολλαπλασιασμό και την επιβίωση των DU145 και PC3 κύτταρα, ωστόσο, DU145 είναι πιο ευαίσθητο για θεραπεία NaB.

έχει Υπάρχουν κάποιες ενδείξεις ότι NaB σε συνδυασμό με άλλους αντικαρκινικούς παράγοντες μπορεί να είναι πολύ χρήσιμη στην κύστη καρκίνους [10]. Έτσι, εξετάσαμε την επίδραση του ΝαΒ σε συνδυασμό με ντοσεταξέλη (DOC) σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι υπάρχει μία συνεργιστική αναστολή της ανάπτυξης καρκινικών κυττάρων ανθρώπινου προστάτη από ΝΑΒ και DOC (Εικ. 1 Ε). Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω η συνεργική δράση αναστολής της ανάπτυξης του ΝαΒ, ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων ανιχνεύεται με δοκιμασία ΜΤΤ. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1F, ΝαΒ σε συνδυασμό με DOC μπορούν σημαντικές αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων.

ΝαΒ επάγει την απόπτωση σε DU145 κυττάρων Γραμμές

Η επαγωγή της απόπτωσης από ΝαΒ εξετάστηκε για πρώτη φορά από την ανάλυση κυτταρομετρίας ροής των κυττάρων DU145 βάφονται με αννεξίνη V και ΡΙ (Εικ. 2Α). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι NaB προκάλεσε μια δοσοεξαρτώμενη αύξηση στην απόπτωση των κυττάρων, και ο ρυθμός της απόπτωσης αυξήθηκε σε 30% όταν η συγκέντρωση της NaB ήταν πάνω από 5 mmol /L.

(Α) Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής του NaB κατεργασία κύτταρα DU145 χρωματίζονται με αννεξίνη V και ΡΙ. (Β) Πυρηνική μορφολογική παρατήρηση του ΝαΒ αντιμετωπίζονται DU145 καρκινικά κύτταρα. Hoechst 33258 και ένα μικροσκόπιο φθορισμού χρησιμοποιήθηκαν για να τηρήσει την πυρηνική μορφολογία των κυττάρων DU145 μετά τη θεραπεία με NaB (400 Χ). (Γ) Ποσοτικές αναλύσεις του ποσοστού της κυτταρικής απόπτωσης. (D) NaB διαμορφώνει την έκφραση του Bcl-XL και Bak σε κύτταρα DU145. (Ε) NaB διαμορφώνει την έκφραση του Bcl-2 και Bax στα κύτταρα DU145. Η έκφραση του Bcl-XL, Bcl-2, Βαχ και Bak προσδιορίστηκαν με ανάλυση κηλίδας Western. Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές. Τα δεδομένα είναι μέσα ± SEM. (N = 3) (τεστ Dunnett, * P & lt? 0,05

vs

ελέγχου.)

Η

επόμενο ποσοτικά τις μεταβολές στην πυρηνική μορφολογία των κυττάρων με χρώση Hoechst κάτω από μικροσκόπιο φθορισμού.. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Β, τα καρκινικά κύτταρα παρουσίασαν λαμπρό φθορισμό πυρήνες διόγκωση και DNA κατακερματισμό, σε σύγκριση με τα κύτταρα DU145 ελέγχου μετά από θεραπεία με NaB για 48 ώρες. Επιπλέον, ο αριθμός των αποπτωτικών κυττάρων αυξήθηκε σε NaB δοσοεξαρτώμενο τρόπο (Εικ. 2C). Ταυτόχρονα, η κυτταρική πυκνότητα μειώθηκε σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Αυτές οι αλλαγές είναι σύμφωνα με τα χαρακτηριστικά της απόπτωσης

κυτταρικής απόπτωσης φαίνεται να ελέγχεται από πολυάριθμα γονίδια.?

Bcl-XL, Bcl-2

,

Βαχ και Bak

είναι οι πιο σημαντικές σχετική με απόπτωση γονίδια μεταξύ τους. Bcl-XL και Bcl-2 πρωτείνης είναι δύο αναστολείς του κυτταρικού θανάτου, ενώ Βαχ και Bak έχει κρίσιμο ρόλο στη διευκόλυνση της απόπτωσης. Έτσι, μετρήσαμε την έκφραση του Bcl-XL, Bcl-2, πρωτεΐνες Bax και Bak σε κύτταρα DU145 με κηλίδα western μετά από θεραπεία με NaB (Σχ. 2D και Ε). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η έκφραση του Bcl-XL και Bcl-2 μειώθηκαν και η έκφραση του Βαχ και Bak ήταν ταυτόχρονα πάνω ρυθμισμένα. Ο ρυθμός της απόπτωσης ήταν σημαντικά αυξημένη λόγω της προς τα πάνω ρύθμιση των γονιδίων προ-απόπτωσης.

NaB Up-ρυθμίζει την έκφραση ANXA1 στον καρκίνο του προστάτη DU145 Κυτταρική Γραμμή

Τα ανωτέρω αποτελέσματα έδειξαν ότι NaB θα μπορούσε να αναστείλει τον πολλαπλασιασμό και την απόπτωση που επάγεται σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη? Ωστόσο, ο μηχανισμός δράσης NaB είναι ακόμα ασαφής. Lecona και συνεργάτες πρότειναν ότι το βουτυρικό μπορεί να ρυθμίζουν την έκφραση αννεξίνης A1 σε ανθρώπινα κύτταρα αδενοκαρκινώματος του παχέος εντέρου. Έτσι, το ερώτημα κατά πόσον υπήρξε κάποια σχέση μεταξύ της ΝΑΒ και ANXA1. Η έκφραση του ANXA1 και το πάνω ρύθμιση ANXA1 με NaB σε κύτταρα DU145 προσδιορίστηκαν με RT-PCR και στύπωμα Western, αντιστοίχως (Εικ. 3). Όπως φαίνεται στο Σχ. 3, τα αυξημένα επίπεδα ANXA1 mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης ανιχνεύθηκαν στα κύτταρα DU145 σε επεξεργασία με NaB. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι NaB μπορούσε πλειορύθμιση της έκφρασης του ANXA1 σε κύτταρα DU145.

(Α) έκφραση ANXA1 mRNA ανιχνεύεται από qRT-PCR. ομάδες θεραπείας ΝαΒ σημαντικά υψηλότερη από την ομάδα ελέγχου (θεραπεία με μέσο μόνο). (Β) Ανάλυση Western blot της έκφρασης ANXA1 σε κύτταρα DU145 μετά τη θεραπεία NaB. Τα δεδομένα είναι κανονικοποιημένα με τιμές β-ακτίνης και εκφράζονται ως φορές μεταβολές του β-ακτίνης σε NaB ομάδα αγωγής σε σχέση με τον έλεγχο. Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές. Τα δεδομένα είναι μέσα ± SEM. (N = 3) (τεστ Dunnett, * P & lt?. 0.05

vs

ελέγχου).

Η

Ίδρυση και οι λειτουργικές αναλύσεις ANXA1 Νοκ ντάουν κύτταρα

Από ANXA1 έκφραση ήταν ρυθμισμένα προς τα πάνω στα κύτταρα DU145 σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις ΝαΒ, υποθέσαμε ότι ANXA1 θα μπορούσαν να διαδραματίσουν ένα σημαντικό ρόλο στη δραστηριότητα των NaB. Για τη μέτρηση της ANXA1 λειτουργίες

in vitro,

ένα πείραμα siRNA πραγματοποιήθηκε σε κύτταρα DU145. Το επίπεδο mRNA και πρωτεΐνης ANXA1 στην siANXA1 επιμολυσμένα ομάδα ήταν σημαντικά χαμηλότερη από την επιμολυσμένα ομάδα siMock (Σχ. 4Α). Στη συνέχεια εξετάσαμε την επίδραση της ANXA1 knockdown σχετικά με τη δραστηριότητα του ΝαΒ, συμπεριλαμβανομένης της αναστολής της ανάπτυξης των κυττάρων (ΜΤΤ δοκιμασία) και την επαγωγή της κυτταρικής απόπτωσης (δοκιμασία κηλίδος Western). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι υπήρξε μια αύξηση στην κυτταρική ανάπτυξη του siANXA1-επιμολυσμένα ομάδα σε σύγκριση με την siMock-επιμολυσμένα ομάδα (Εικ. 4Β). Επιπλέον, το ποσοστό απόπτωσης μειώθηκε στα siANXA1-επιμολυσμένα κύτταρα (Σχ. 4C). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η δραστικότητα NaB της αναστολής της ανάπτυξης και την απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα DU145 συνδέθηκε με την υπερ-έκφραση του ANXA1.

(Α) ανάλυση Western blot της έκφρασης σε κύτταρα ANXA1 siANXA1 και siMock μετά NaB θεραπεία. Τα δεδομένα κανονικοποιήθηκαν με τιμές β-ακτίνης και εκφράζονται ως φορές μεταβολές του β-ακτίνης σε NaB ομάδα αγωγής σε σχέση με τον έλεγχο. (Β) Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων siANXA1 και siMock μετά τη θεραπεία NaB. (Γ) ανάλυση κηλίδας Western της έκφρασης του Βαχ και Bcl-2 σε κύτταρα siANXA1 και siMock. επίπεδα έκφρασης Bcl-2 και Bax ομαλοποιήθηκαν σε β-ακτίνη και παρουσιάζονται ως ο λόγος Bax /Bcl-2. Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές. Τα δεδομένα είναι μέσα ± SEM. (N = 3) (τεστ Dunnett, * P & lt? 0,05

vs

ελέγχου.)

Η

Η υπερέκφραση του ANXA1 σχετίζεται άμεσα με την ενεργοποίηση της ERK

το μονοπάτι ERK είναι συχνά ρυθμίζεται προς τα πάνω σε μια ποικιλία καρκίνων [29], [30], και υπάρχουν κάποιες ενδείξεις έδειξαν ότι ANXA1 διαμορφώνει το μονοπάτι ERK σε ένα εγγύς περιοχή [31]. Για να διερευνηθεί περαιτέρω ένα δυναμικό μηχανισμό που θα μπορούσε να εμπλέκεται στην αναστολή της ανάπτυξης και την απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα, η έκφραση της ERK και φωσφορυλιωμένων ERK (pERK) ανιχνεύθηκε. pERK ήταν σημαντικά μειωμένη σε siANXA1-επιμολυσμένα κύτταρα σύγκριση με την ομάδα siMock. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η οδός ERK ήταν εξασθενημένος σε siANXA1-επιμολυσμένα κύτταρα (Εικ. 5).

Η έκφραση του ρ-ERK και ERK ανιχνεύονται με ανάλυση κηλίδος Western. Η έκφραση της p-ERK μειώνεται αισθητά το ANXA1 νοκ ντάουν κύτταρα σε σύγκριση με τα κύτταρα siMock, ενώ το επίπεδο ERK είναι σχεδόν αμετάβλητη. Τα δεδομένα είναι κανονικοποιημένα με τιμές β-ακτίνης και εκφράζονται ως φορές μεταβολές του β-ακτίνης. Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές. Τα δεδομένα είναι μέσα ± SEM. (N = 3) (τεστ Dunnett, * P & lt? 0,05

vs

ελέγχου.)

Η

Συζήτηση

Ο καρκίνος του προστάτη είναι η δεύτερη πιο συχνά διαγιγνώσκεται καρκίνος και. η δεύτερη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο στους άνδρες. Επί του παρόντος, αρκετές αποτελεσματικές ακτινοβολία και χειρουργικές θεραπείες μπορούν να προσφέρονται για την κλινική θεραπεία του καρκίνου του προστάτη? ωστόσο, οι θεραπείες για τον καρκίνο του προστάτη είναι καθόλου ικανοποιητική και προχωρημένο καρκίνο του προστάτη παραμένει ανίατη [9]. Υπάρχει επείγουσα ανάγκη να βρεθεί ουσίες ή φάρμακα που είναι κατάλληλα για την πρόληψη και τον καλύτερο έλεγχο του καρκίνου του προστάτη. NaB, ένα μέλος της ομάδας των αναστολέων αποακετυλάσης ιστόνης (HDACs), είναι ένα φυσικό λιπαρό οξύ βραχείας αλύσου το οποίο είναι ικανό να εκκινήσει τη διαφοροποίηση πολλών τύπων κυττάρων, όπως ΗΤ29 ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα κόλου και γαστρικά καρκινικά κύτταρα [32], [33]. NaB θα μπορούσε να αυξηθεί κατά του όγκου δραστικότητα με μικρότερη τοξικότητα, και υπάρχουν αρκετές σειρές αποδείξεων που έχουν αποδείξει ότι NaB μπορεί να προκαλέσει αναστολή της ανάπτυξης και την απόπτωση σε πολλές μορφές καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του προστάτη [5], [6], [9]. Ωστόσο, ο ακριβής μηχανισμός ΝΑΒ στην ογκογένεση είναι ελάχιστα κατανοητή.

Είναι πλέον καλά τεκμηριωμένο ότι ΝαΒ μπορούν να ρυθμίζουν την έκφραση των ANXA1. Επιπλέον, αννεξίνες συχνά απορυθμίζεται σε διάφορους τύπους καρκίνου και την έκφραση τους υπέδειξε ένα ογκοκατασταλτικό ή δυνατόν ομοιοστατική ρόλο [34], [35]. Έτσι, θεωρείται ότι NaB ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την απόπτωση που επάγεται μέσω του επάνω ρυθμισμένη έκφραση του ANXA1.

Στην παρούσα μελέτη, αξιολογήσαμε την αναστολή του πολλαπλασιασμού και της προώθησης της απόπτωσης επιδράσεις των NaB σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του προστάτη DU145 , μαζί με το μηχανισμό δράσης του. Οι μελέτες μας έδειξαν ότι NaB κατά 1-10 mmol μπορούσαν και οι δύο αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των DU145 κυττάρων και διεγείρει την κυτταρική απόπτωση. Η απόπτωση, η οποία είναι επίσης γνωστή ως προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος, είναι μία φυσιολογική διαδικασία η οποία ρυθμίζεται από ένα αριθμό καλά χαρακτηρισμένων γονιδίων και είναι σημαντικό για την ανάπτυξη και την ομοιόσταση των πολλών οργανισμών. Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε ότι NaB μπορεί ρυθμίζουν προς τα κάτω την έκφραση bcl-2 και up-ρυθμίζουν την έκφραση Bax. Είναι πιθανό ότι NaB επάγει καρκίνο του προστάτη DU145 απόπτωση των κυττάρων μέσω αναστολής της έκφρασης bcl-2 και την ενεργοποίηση Bax.

Ταυτόχρονα, παρατηρήσαμε ότι NaB επάνω ρυθμισμένη η έκφραση του ANXA1 σε κύτταρα DU145. Για να προσδιορίσετε αν η λειτουργία ANXA1 είναι σχετικό με δράση ΝαΒ, πραγματοποιήσαμε λειτουργικές μελέτες με τη χρήση siRNA. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η αναστολή της έκφρασης του ANXA1 ελάττωσε σημαντικά την δράση NaB αναστολής της ανάπτυξης των κυττάρων και την απόπτωση. Επιπλέον, τα αποτελέσματα μας πρότεινε ότι ο μηχανισμός της NaB έναντι απόπτωσης μέσω του πάνω ρύθμιση ANXA1 είχε σχέση με την οδό σήματος ERK. Την αναστολή της έκφρασης ANXA1 μπορούσε να αναστείλει την φωσφορυλίωση της ERK1 /2, το οποίο δείχνει ότι η έκφραση του ANXA1 θα μπορούσε να ενεργοποιήσει την οδό σήματος ERK. Μέχρι σήμερα, η έκφραση του ANXA1 είναι πάνω ρυθμισμένα με NaB στον καρκίνο του προστάτη δεν έχει επιβεβαιωθεί. Στη μελέτη μας, έδωσαν κάποιες ενδείξεις ότι ο NaB up-ρυθμίζει την έκφραση ANXA1 και συσχετίζεται με την εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη. Αυτά τα γεγονότα υποδηλώνουν έντονα ότι ANXA1 έχει ένα σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη.

Εν κατακλείδι, NaB εμφανίζει αντι-πολλαπλασιαστικές και προ-αποπτωτική δραστηριότητα σε μια δοσο-εξαρτώμενο τρόπο σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Επιπλέον, NaB μπορεί να αυξήσει την έκφραση του ANXA1, και ANXA1 μπορεί να αυξήσει τη δραστικότητα του μονοπατιού σηματοδότησης ERK. Περαιτέρω μελέτες απαιτούνται για να αποκαλύψει τις οριστικές αλληλεπιδράσεις των ANXA1 και το μονοπάτι σηματοδότησης ERK. Τα παρόντα ευρήματα υποδεικνύουν ότι NaB είναι ιδιαίτερα αποτελεσματική στην αναστολή της εξέλιξης του καρκίνου του προστάτη μέσω της προς τα πάνω ρύθμιση της έκφρασης του ANXA1.