Αφηρημένο

microRNA-135a (miR-135a) κάτω ρυθμίζει τις παραμέτρους της εξέλιξης του καρκίνου και η έκφρασή της μειώνεται σε μεταστατικούς καρκίνους του μαστού (σε σύγκριση με μη-μεταστατικούς όγκους), καθώς και σε όγκους του προστάτη σε σχέση με το φυσιολογικό ιστό. Αυτά τα πρότυπα έκφρασης και η δραστικότητα είναι αντίθετα με εκείνα του σχετιζόμενων με οιστρογόνα υποδοχέα α (ERRα), ένα ορφανό μέλος της οικογένειας των πυρηνικών υποδοχέων. Πράγματι υψηλή έκφραση ERRα συσχετίζεται με κακή πρόγνωση σε καρκίνους του μαστού και του προστάτη, και ο υποδοχέας προωθεί διάφορα χαρακτηριστικά της επιθετικότητας του καρκίνου, συμπεριλαμβανομένων των κυττάρων εισβολής. Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι miR-135α ρυθμίζει προς τα κάτω την έκφραση του ERRα μέσω ειδικών αλληλουχιών του 3’UTR της. Ως συνέπεια miR-135α μειώνει επίσης την έκφραση των κατάντη στόχοι της ERRα. miR-135α μειώνει επίσης επεμβατικές δυναμικό κυττάρου σε ένα ERRα-εξαρτώμενο τρόπο. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η μειωμένη έκφραση του miR-135a σε μεταστατικούς όγκους οδηγεί σε αυξημένη έκφραση ERRα, με αποτέλεσμα την αύξηση των ικανοτήτων των κυττάρων εισβολής

Παράθεση:. Tribollet V, Barenton Β, Kroiss Α, Vincent S, Zhang L, Forcet C, et al. (2016) miR-135a Αναστέλλει την εισβολή των καρκινικών κυττάρων μέσω καταστολή των ERRα. PLoS ONE 11 (5): e0156445. doi: 10.1371 /journal.pone.0156445

Επιμέλεια: Franky L. Chan, το Κινεζικό Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: 28η Ιανουαρίου 2016? Αποδεκτές: 13, Μαΐου του 2016? Δημοσιεύθηκε: May 26, 2016

Copyright: © 2016 Tribollet et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι μέσα στο χαρτί και Υποστήριξη αρχείο πληροφοριών της

Χρηματοδότηση:. το έργο αυτό χρηματοδοτήθηκε από Ligue contre le Καρκίνο (κόμητες Puy-de-Dome https://www.ligue-cancer.net/cd63/journal και Drôme https://www.ligue-cancer.net/cd26/journal) να JS και JMV. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Jean-Marc Vanacker είναι μια Συντακτική μέλος του διοικητικού συμβουλίου PLoS ONE. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων να PLoS ONE Editorial πολιτικές και κριτήρια.

Εισαγωγή

Τα microRNAs (Mirs) είναι μικρά μη-κωδικοποίησης RNA που, μέσα από το λεγόμενο «κουτί σπόροι» δεσμεύονται σε συγκεκριμένες συμπληρωματικές αλληλουχίες στην 3’UTR των mRNA στόχου και επάγουν την αποδόμησή τους ή να εμποδίσουν τη μετάφραση της κωδικοποιούμενης πρωτεΐνης [1]. Δεδομένου του μικρού μεγέθους της περιοχής δέσμευσης mRNA σε Mirs και δεδομένου ότι η σύνδεση ατελής miR είναι σε ορισμένες περιπτώσεις επαρκή για την επαγωγή ρύθμισης mRNA, ένα άτομο μπορεί να δράσει miR σε αρκετές mRNAs. Αυτό αυξάνει την πιθανότητα ότι ένα ολόκληρο μονοπάτι /διαδικασία μπορεί να ελέγχεται σε διάφορα επίπεδα μέσω ενός ενιαίου miR. Mirs μπορεί να προωθήσει ή να καταστείλει την έναρξη ή την εξέλιξη του καρκίνου, και η απορρύθμιση της έκφρασής τους είναι ένα κοινό χαρακτηριστικό σε αυτές τις διαδικασίες [2-5]. Ανθρώπινη miR-135a κωδικοποιείται από δύο γονίδια εντοπίζονται σε διαφορετικά χρωμοσώματα (3 και 12 για miR-135a1 και miR-135a2, αντίστοιχα), που παράγει μια πανομοιότυπη, ενεργό αλληλουχία. έχουν αντιφατικά αποτελέσματα έχουν δημοσιευθεί σχετικά με τις επιπτώσεις του miR-135a στην εξέλιξη του καρκίνου. Οι εκθέσεις δείχνουν πράγματι ότι αυτό το microRNA μπορεί να προωθήσει ή να καταστείλει διάφορα χαρακτηριστικά που σχετίζονται με την επιθετικότητα του όγκου, όπως ο πολλαπλασιασμός, η μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή σε κόλον, μελάνωμα, καρκίνο του μαστού ή του προστάτη κυτταρικές γραμμές [6-12]. Ωστόσο, αποδείχθηκε ότι η έκφραση miR-135a μειώνεται έντονα σε μεταστατικούς όγκους μαστού (σε σύγκριση με μη-μεταστατικούς καρκίνους, [10]), καθώς και στον προστάτη όγκους σε σχέση με το φυσιολογικό ιστό [11], γεγονός που υποδηλώνει ότι, τουλάχιστον σε αυτά τα καρκινικά τύπους, miR-135a εξουδετερώνει την εξέλιξη του καρκίνου. Από την άποψη αυτή, η εκ νέου έκφραση του miR-135a σε μη εκφράζοντα κύτταρα μειώνει την πιθανή εισβολή τους. Τουλάχιστον τρία μοριακών μηχανισμών έχουν προταθεί για να εξηγήσουν αυτή τη μείωση. Ανάλογα με τη μελέτη και την κυτταρική μοντέλο, miR-135a έχει πράγματι αποδειχθεί ότι μειώνουν την έκφραση της FAK, Runx2 και ROCK1 /2, όλους τους κανονισμούς που οδηγούν σε μείωση της κυτταρικής εισβολής [9-11].

το οιστρογόνο που σχετίζονται με υποδοχέα α (

ESRRA

, εφεξής ERRα) είναι ένα μέλος της υπερ-οικογένειας των πυρηνικών υποδοχέων. Ως εκ τούτου εμφανίζει μια συντηρημένη κεντρική τοποθεσία περιοχή δέσμευσης DNA, καθώς και ένα C-τερματικά που βρίσκονται τομέα υποτιθέμενο δέσμευσης συνδέτη που έρχεται σε επαφή συν-ενεργοποιητές και είναι απαραίτητο για μεταγραφική ενεργοποίηση [13]. Ωστόσο, δεν φυσικός συνδετήρας του ERRα έχει ταυτοποιηθεί μέχρι σήμερα. ERRα έτσι αναφέρεται ως υποδοχέας «ορφανό» και ενεργοποιεί την μεταγραφή των γονιδίων στόχων του σε μια προφανή συνδέτη ανεξάρτητο τρόπο. ERRα ρυθμίζει αρκετές φυσιοπαθολογικών διαδικασίες

in vivo

όπως η διαφοροποίηση των οστεοβλαστών και το σχηματισμό των οστών (που επισκοπείται στο [14]), έμφυτη ανοσία [15-16] και το μεταβολισμό της ενέργειας (αναθεωρούνται στο [17-18]). Επιπλέον, οι υψηλές ERRα έκφραση σε καρκίνους σχετίζεται με κακή πρόγνωση σε διάφορους τύπους καρκίνου ([19-25], που επισκοπείται στο [26-28]). Σταθερά, ERRα έχει αποδειχθεί ότι προάγει πολλά χαρακτηριστικά της εξέλιξης του καρκίνου, που κυμαίνονται από τον πολλαπλασιασμό [29-30], epithelio-μεσεγχυματικών μετάβαση [31], η αντίσταση στην υποξία [32], η αγγειογένεση [33], μεταβολική αλλαγή σε αερόβια γλυκόλυση [34 -35], κυτταρική μετανάστευση και εισβολή [36-37]. ERRα αυξάνει κύτταρο εισβολή μέσω τουλάχιστον δύο μοριακών μηχανισμών. Από τη μία πλευρά, ο υποδοχέας ενεργοποιεί πράγματι Wnt11 εξαρτώμενη από καταρράκτη, από την άλλη, ERRα έμμεσα μικρορυθμίσεις RhoA σταθερότητα σε ένα επίπεδο που είναι κατάλληλο για την προσανατολισμένη μετανάστευση των κυττάρων και την εισβολή.

Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι η επανεισαγωγή του miR-135a σε μη εκφράζοντα κύτταρα έχει ως αποτέλεσμα την προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης ERRα στα επίπεδα mRNA και πρωτεΐνης. Αυτό συμβαίνει μέσω 3’ΙΙΤΡ αλληλουχίες που είναι συμπληρωματικές σε κουτί σπόρων miR-135a. Σταθερά, η έκφραση των γονιδίων ERRα στοχεύει διαμορφώνεται από miR-135a σε μια ERRα-εξαρτώμενο τρόπο. Επιπλέον, miR-135a υπερ-έκφραση μειώνει τις ικανότητες εισβολή των κυττάρων MDA-ΜΒ231 και PC3 κύτταρα (ανθρώπινο μαστικό καρκίνωμα και προστατικό κύτταρα, αντίστοιχα). Αυτές οι ικανότητες μπορούν να διασωθούν με εκ νέου έκφραση ενός κατασκευάσματος ERRα που δεν αποτελούν στόχο miR-135a. Συνολικά, αυτό δείχνει να ERRα ως στόχο εναλλακτική miR-135a που εμπλέκονται στη ρύθμιση της κυτταρικής εισβολής.

Υλικά και Μέθοδοι

Κύτταρα και Αντιδραστήρια

MDA-MB231 (ανθρώπινο μαστικά επιθηλιακά κύτταρα) και PC3 (ανθρώπινα κύτταρα προστάτη) αναπτύχθηκαν σε μέσο Dulbecco τροποποιημένο Eagle (Invitrogen) συμπληρωμένου με 10% ορό εμβρύου μόσχου, 10 U /ml πενικιλλίνη, 10 μg /ml στρεπτομυκίνη. LNCaP (ανθρώπινο κύτταρο προστάτη) αναπτύχθηκαν σε RPMI (Invitrogen) συμπληρωμένου με τον ίδιο τρόπο. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO2 στους 37 ° C. siRNAs και miRNAs εισήχθησαν σε κύτταρα χρησιμοποιώντας Interferine (Ozyme) ή Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher), αντίστοιχα, σύμφωνα με τις οδηγίες των κατασκευαστών. ERRα siRNAs (ακολουθίες σε S1 πίνακα) ήταν από την Invitrogen (siERRα # 1) και Dharmacon (siERRα 2 #). Προ-miRNAs (PM11126 για miR-135a? MiR αρνητικός έλεγχος n ° 2) ήταν από την Ambion

Ανάλυση έκφρασης

Σύνολο RNAs εξήχθησαν από θειοκυανικό γουανιδίνιο /φαινόλη /χλωροφόρμιο και μετατρέπονται σε πρώτη. κλώνου cDNA χρησιμοποιώντας κιτ σύνθεσης cDNA IScript (Biorad). Real-time PCR εκτελέστηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων χρησιμοποιώντας το IQ SYBR Green Supermix (Biorad). Τα δεδομένα ποσοτικοποιήθηκαν με τη μέθοδο ΔΔ-Ct και ομαλοποιήθηκε ως προς RPLP0 (36Β4) mRNA. Οι αλληλουχίες των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη παρουσιάζονται στον πίνακα S1.

Για ανάλυση κηλίδος western, τα κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό RIPA. Πρωτεΐνες (50 μα) διαχωρίστηκαν σε 10% SDS-PAGE, κηλιδώθηκαν επί PVDF (Millipore), ανιχνεύθηκαν με ειδικά αντισώματα μετά από κορεσμό και αποκάλυψε χρησιμοποιώντας ένα ενισχυμένο σύστημα ανίχνευσης χημειοφωταύγειας (ECL kit, Amersham Biosciences) με κατάλληλες ειδικές υπεροξειδάση συζευγμένου Abs. Τα αντισώματα ήταν από Gentex (ERRα, GTX108166), Enzo (hsp90, ADI-SPA-830) και Sigma (Σημαία, F-3165).

πλασμίδια και λουσιφεράσης

pSG5Flag-ΔΑ /B-ERRα έχει περιγραφεί αλλού [38]. Ακολουθίες για ESRRA (κωδικοποιεί ERRα) 3’ΙΙΤΡ που είναι συμπληρωματικές στο κιβώτιο σπόρων miR-135a είχαν προβλεφθεί χρησιμοποιώντας TargetScan (https://www.targetscan.org), PicTar (https://pictar.mdc-berlin.de) και Miranda MiRBase (https://microrna.sanger.ac.uk) on-line διαθέσιμα προγράμματα. Ένα θραύσμα 400 bp από την ανθρώπινη ESRRA 3’UTR περιλαμβάνει τόσο προβλεφθεί συμπληρωματικές αλληλουχίες κλωνοποιήθηκε με PCR χρησιμοποιώντας MDA-ΜΒ231 καταγόμενες αναδρομικά μεταγραφομένων mRNA και εκκινητές πλευρίζεται από θέσεις περιορισμού Xhol και δαίΐ. Συμπληρωματικές ακολουθίες μεταλλάχθηκαν με ανασυνδυασμένη PCR. Μετά την επαλήθευση από αλληλούχιση, άγριου τύπου και μεταλλαγμένου θραύσματα κλωνοποιήθηκαν σε pmiRGLO διπλή φορέα έκφρασης (Promega) ως XhoI-SalI εισάγει καθοδικά της πυγολαμπίδας αλληλουχία αναφοράς της λουσιφεράσης. Οι αλληλουχίες των ολιγονουκλεοτιδίων που χρησιμοποιούνται για μεταλλαξογένεση είναι διαθέσιμα στον Πίνακα S1.

Για παροδικές επιμολύνσεις, 10

5 κύτταρα MDA-ΜΒ231 σπάρθηκαν σε πλάκες 24-φρεατίων και επιμολύνθηκαν χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000, 50 ng pmiRGLO πλασμίδιο και ο αναγράφεται το ποσό της προ-miR. Τα κύτταρα λύθηκαν 48 ώρες μετά την επιμόλυνση και ρεπόρτερ δραστηριότητες (Renilla και πυγολαμπίδας λουσιφεράσες) προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας πρότυπες μεθόδους.

Εισβολή Δοκιμασίες

Για προσδιορισμούς εισβολής, κύτταρα (5. 10

4) εναιωρήθηκαν σε 200 μΙ ϋΜΕΜ /% FCS 2 και σπάρθηκαν πάνω σε θαλάμους matrigel εισβολής (Corning). Τα κύτταρα αφέθηκαν να μεταναστεύσουν προς το κάτω θάλαμο που περιέχει DMEM /10% FCS για 48 ώρες. Matrigel απομακρύνθηκε χρησιμοποιώντας μπατονέτες και τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν 1 ώρα με 4% φορμαλδεΰδη, χρωματισμένο με 0,1% κρυσταλλικό ιώδες και microphotographed. Εισβάλλοντας κύτταρα μετρήθηκαν σε ολόκληρη καλά χρησιμοποιώντας Image J.

Στατιστική Ανάλυση

Η στατιστική σημαντικότητα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας Student t-τεστ μεταξύ των ομάδων.

Αποτελέσματα

miR-135a Μειώνει ERRα έκφραση

κατά τη διάρκεια μιας προηγούμενης μελέτης, οι συνέπειες της προ-miR-135a υπερ-έκφρασης σε LNCaP καρκινικών κυττάρων ανθρώπινου προστάτη αναλύθηκε από την άποψη της έκφρασης κυτταρικού γονιδίου χρησιμοποιώντας ένα μικρο-array προσέγγιση [11]. Παρατηρήθηκε ότι η έκφραση του πυρηνικού υποδοχέα ορφανό ERRα μειώθηκε σε μια τέτοια θεραπεία. Για την επικύρωση αυτών των αποτελεσμάτων, έχουμε παροδικά επιμολυσμένα προ-miR-135a στα κύτταρα LNCaP και ανέλυσε την έκφραση της ERRα πρωτεΐνης (Σχήμα 1α). Βρήκαμε ότι το επίπεδο αυτού του υποδοχέα μειώθηκε μόλις 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, ένα αποτέλεσμα που παρέμεινε (αν και σε μικρότερο βαθμό) για 48 ώρες. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν επίσης σε κύτταρα καρκινώματος ανθρώπινου μαστού MDA-ΜΒ231. Η ERRα-αντίστοιχο mRNA ήταν επίσης μειωμένη 24h και 48h μετά την επιμόλυνση σε αμφότερες LNCaP και MDA-ΜΒ231 κύτταρα, όπως κρίνεται με πραγματικού χρόνου PCR πειράματα (Σχήμα 1β), υποδεικνύοντας μια άμεση επίδραση στην mRNA.

Η υποδεικνύεται κύτταρα επιμολύνθηκαν με προ-miR-135a ή προφυτρωτικά miR (-) για τον υποδεικνυόμενο χρόνο. ένα. Έκφραση των αναφερόμενων πρωτεϊνών καθορίζεται από κηλίδα western. Hsp90 χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Η ποσοτικοποίηση της έκφρασης πρωτεΐνης ERRα (εμφανίζεται κάτω από τις κηλίδες) εκφράζεται σε σχέση εκείνη της hsp90, χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. σι. Η έκφραση του ERRα αντίστοιχου mRNA αναλύθηκε με πραγματικού χρόνου PCR. Τα δεδομένα παρουσιάζονται σε σχέση με το προ-miR δείγματα ελέγχου και εκφράζεται σε σχέση με την έκφραση του RPLP0. Ορατή είναι ο μέσος όρος των πειραμάτων που έγιναν τρεις φορές. Λάθη μπάρες δείχνουν SEM. ***:

σ

& lt? 0.005

Η

Αναλύσαμε το ανθρώπινο mRNA ERRα για κίνητρα αναγνώριση microRNA χρήση τριών ανεξάρτητων προγραμμάτων πρόβλεψης (TargetScan, PicTar και Miranda), η οποία απέδωσε ταυτόσημες. αποτελέσματα. Δύο δυνητικές συμπληρωματικές αλληλουχίες για miR-135a εντοπίστηκαν στην 3’UTR με την υψηλότερη (8-μερές) πιθανότητα δέσμευσης (Σχήμα 2α). Αξιοσημείωτα η αλληλουχία καθώς και η θέση αυτών των δύο τόπων είναι εξαιρετικά διατηρημένες σε θηλαστικά, όχι όμως σε πτηνά ή αμφίβια, όπου θα μπορούσε να εντοπιστεί κανένα τέτοιο αντίστοιχη αλληλουχία. Για να προσδιοριστεί εάν αυτές οι συμπληρωματικές αλληλουχίες είναι λειτουργικές για την αναγνώριση miR-135a, ένα θραύσμα 400 bp του 3’UTR (που περιλαμβάνει και τους δύο πιθανούς ακολουθίες) κλωνοποιήθηκε καθοδικά του γονιδίου αναφοράς της λουσιφεράσης σε pmiRGLO πλασμίδιο. Κάθε συμπληρωματική αλληλουχία στη συνέχεια μεταλλάχθηκε μόνα τους ή σε συνδυασμό. Τα προκύπτοντα κατασκευάσματα επιμολύνθηκαν σε κύτταρα MDA-ΜΒ231 μαζί με προ-miR-135a (Σχήμα 2β). Η άγριου τύπου ERRα-λαμβανόμενο θραύσμα που ανατίθενται ευαισθησία miR-135α, με αποτέλεσμα τη μείωση κατά 50% στην δραστικότητα ανταποκριτή. Αυτό το αποτέλεσμα καταργήθηκε με τη μετάλλαξη της συμπληρωματικής αλληλουχίας 2, αλλά όχι συμπληρωματική αλληλουχία 1. Αυτό υποδηλώνει έντονα μια άμεση επίδραση της miR-135α στην 3’UTR της ERRα, ιδίως σχετικά με συμπληρωματική αλληλουχία 2, με αποτέλεσμα μειωμένα επίπεδα του αντίστοιχου mRNA και πρωτεΐνες.

α. Οι συμπληρωματικές αλληλουχίες 1 και 2 (κεφαλαία γράμματα) στο ERRα 3’ΙΙΤΡ εμφανίζονται για τις συγκεκριμένες είδη (

Homo sapiens

,

Mus musculus

,

Bos taurus

και

Felis silvestris

) και ευθυγραμμίζονται με την αλληλουχία miR-135a. Θέση του πρώτου νουκλεοτιδίου του κάθε συμπληρωματικής αλληλουχίας (cs 1 και 2) ενδείκνυται σε σχέση το πρώτο νουκλεοτίδιο 3’UTR και σε σχέση με την έναρξη του ανθρώπου mRNA (υπό παρένθεση). Τα νουκλεοτίδια με έντονα γράμματα διαγράφηκαν στις αντίστοιχες μεταλλάξεις. σι. Σχέδιο των παραγόμενων μεταλλάξεων στο pmiR-GLO απεικονίζεται στην κορυφή. κύτταρα MDA-ΜΒ231 επιμολύνθηκαν παροδικά με τα αντίστοιχα παράγωγα pmiR-GLO μαζί με την υποδεικνυόμενη συγκέντρωση του προ-miR-135a. Οι δραστικότητες της λουσιφεράσης προσδιορίζονται 48 ώρες μετά την επιμόλυνση και η δραστικότητα της λουσιφεράσης της πυγολαμπίδας ομαλοποιήθηκε με εκείνη της λουσιφεράσης της Renilla. Τα αποτελέσματα εκφράζονται για κάθε πλασμίδιο ως επί τοις εκατό σε σχέση με την επιμόλυνση με προ-miR έλεγχο και αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Λάθη μπαρ αναφέρεται SEM. **:

σ

& lt? 0,01, ***:.

σ

& lt? 0.005

Η

miR-135a Ρυθμίζει ERRα Μοριακής και Κυτταρικής Δραστηριότητες

Για να αναλύσει τις συνέπειες αυτού του κανονισμού, εξετάστηκε κατά πόσον οι λειτουργίες των ERRα μπορεί να επηρεαστεί από miR-135a. ERRα δρα ως παράγοντας μεταγραφής και τους στόχους της γονιδίων σε MDA-ΜΒ231 κύτταρα έχουν προηγουμένως ταυτοποιηθεί μέσω μιας προσέγγισης transcriptomic RNA-αλληλούχιση [37]. Εμείς αιτιολογημένη ότι miR-135α υπερέκφραση, οδηγώντας σε μειωμένα επίπεδα ERRα, θα πρέπει επίσης να οδηγήσει σε απορρύθμιση της έκφρασης αυτών των γονιδίων-στόχων. Αυτή η υπόθεση εξετάστηκε σε εννέα επιλεγμένων γονιδίων, τα οποία είναι, σύμφωνα με transcriptomic προσέγγισή μας, είτε θετικά (DHX33, GDAP1, RAB39A, RAPGEF5, TMEM198 και TNFAIP1) ή αρνητικά (PDGFRB, RRAS, λειτουργίας του CEACAM1) ρυθμίζονται από ERRα. Σημαντικά, αυτά τα γονίδια επελέγησαν δεδομένου ότι δεν είχαν προβλεφθεί ως άμεσοι στόχοι miR-135α, σύμφωνα με TargetScan on-line πρόγραμμα. Χρησιμοποιώντας δύο διαφορετικά siRNA εναντίον του υποδοχέα, πρώτα επαλήθευσε ότι η έκφραση αυτών των γονιδίων απορυθμίζεται απουσία ERRα (Εικ 3α). Στη συνέχεια ανέλυσε το επίπεδο του mRNA των στόχων αυτών ERRα κατά miR-135a υπερέκφραση. Όπως φαίνεται στο σχήμα 3b, η έκφραση αυτών των γονιδίων ήταν χρονικά εξαρτώμενο ρυθμίζονται με επιμόλυνση του προ-miR-135a. Αξίζει να σημειωθεί ότι όλοι οι miR-135a που προκαλείται απορρυθμίσεις ήταν στην ίδια κατεύθυνση όπως εκείνες που προκαλούνται από άμεση στόχευση ERRα. Αυτό ενισχύει περαιτέρω την υπόθεση ότι η επίδραση του miR-135a σε αυτά τα γονίδια είναι ERRα μεσολάβηση. Αναλύσαμε επίσης η έκφραση των τεσσάρων γονιδίων (ROCK1, Rock2, ΡΤΚ2 και SMAD5) αναφέρονται ως άμεσοι στόχοι miR-135a στη βιβλιογραφία [10-11, 39]. Όπως αναμενόταν, η έκφραση αυτών των γονιδίων είναι χρονικά εξαρτώμενο μειώνεται κατά προ-miR-135a υπερέκφραση (Σχήμα 3c). Ωστόσο, κανένα από αυτά τα τέσσερα γονίδια φαίνεται απορυθμισμένη απουσία ERRα, όπως αναμένεται από τα δεδομένα RNA-αλληλούχιση μας (Εικόνα 3c και [37]). Στη συνέχεια χρησιμοποιείται μια προσέγγιση διάσωσης για να αμφισβητήσει την πιθανότητα μιας ERRα-εξαρτώμενη επίδραση του miR-135a. Για το σκοπό αυτό, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με ένα μιμητικό miR-135a συμπληρώθηκε ή όχι με ένα κατασκεύασμα ERRα που δεν περιλαμβάνει το φυσικό 3’UTR της (

i

.

e

. Χωρίς miR-135a συμπληρωματικές αλληλουχίες). Συνέπεια, η απορρύθμιση των στόχων ERRα διασώθηκε από την εκ νέου εισαγωγή του υποδοχέα (Σχήμα 3δ). Αντίθετα, η έκφραση των άμεσων στόχων miR-135α (ROCK1, Rock2, ΡΤΚ2 και SMAD5), μειωμένη κατά υπερέκφραση του προ-Mir, δεν αποκαταστάθηκε από ERRα διαμόλυνση. Μαζί αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι το miR-135a επιπτώσεις στη γονιδιακή έκφραση σε ERRα-εξαρτώμενη και ανεξάρτητη τρόπους.

α. κύτταρα MDA-ΜΒ231 διαμολύνθηκαν με την υποδεικνυόμενη siRNA (C: ελέγχουν siRNA) και RNA εκχυλίστηκαν μετά από 48 ώρες. σι. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με προ-miR-135a ή προφυτρωτικά miR (-). RNAs εκχυλίσθηκαν στον υποδεικνυόμενο χρόνο μετά τη διαμόλυνση. Έκφραση των στόχων ERRα εξετάστηκε (a, b). ντο. Ίδιο πείραμα ανάλυση της έκφρασης των γονιδίων στόχων άμεση miR-135a. ρε. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με προ-miR-135a και pSG5Flag κενό φορέα (MIR-135α) ή ERRα κωδικοποιεί πλασμίδιο (miR-135a + ERRα). Ως έλεγχοι, κύτταρα επιμολύνθηκαν με τον έλεγχο προ-miR συμπληρωμένο με πλασμιδιακό φορέα pSG5Flag. RNAs εκχυλίσθηκαν μετά από 48 ώρες. Η έκφραση των υποδεικνυόμενων γονιδίων προσδιορίστηκε με PCR πραγματικού χρόνου. Τα δεδομένα παρουσιάζονται σε σχέση με τον έλεγχο και εκφράζεται σε σχέση με την έκφραση του RPLP0. Ορατή είναι η μέση τιμή τριών ανεξάρτητων πειραμάτων εις τριπλούν με γραμμές σφάλματος που υποδεικνύει SEM. *:

σ

& lt? 0,05, **:

σ

& lt? 0,01, ***:

σ

& lt? 0.005, ns:. Μη σημαντική

επόμενο ερώτημα κατά πόσον λειτουργικά αποτελέσματα του miR-135a θα μπορούσε να εξαρτηθεί από ERRα. Αυτός ο υποδοχέας έχει δειχθεί ότι απαιτείται για πολλά χαρακτηριστικά που σχετίζονται με την εξέλιξη του καρκίνου συμπεριλαμβανομένης της μετανάστευσης κυττάρων και εισβολής [36-37]. Σε ένα άλλο χέρι miR-135a έχει αποδειχθεί ότι μειώνει την κυτταρική διείσδυση [9, 11]. Χρησιμοποιώντας Boyden δοκιμασίες εισβολής θάλαμο, μπορούμε συνεπώς, να εξετασθεί εάν μέρος αυτών των τελευταίων δραστηριοτήτων μπορεί να διαμεσολαβείται από την αναστολή ERRα. Υπερεκφράζουν miR-135a μιμούνται σε κύτταρα MDA-ΜΒ231 οδήγησε σε μείωση της έκφρασης ERRα καθώς και στην αναστολή της κυτταρικής εισβολής, σε σύγκριση με τους ελέγχους (Σχήμα 4α). Σε αντίθεση, η εκ νέου εκφράζουν ένα μη-στόχευσης ERRα κατασκεύασμα αποκατασταθεί πλήρως το δυναμικό των κυττάρων εισβολή. Όμοια πειράματα διεξήχθησαν στην κυτταρική σειρά ανθρώπινου προστάτη PC3 απέδωσε παρόμοια αποτελέσματα (Εικόνα 4Β). Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι miR-135a μπορεί να αναστείλει κυτταρικό εισβολή, τουλάχιστον εν μέρει, μέσω της αναστολής της έκφρασης ERRα.

ΜΟΑ-ΜΒ231 (α) ή PC3 (β) κύτταρα επιμολύνθηκαν με έλεγχο miR (miR-c ) ή miR-135a μιμούνται (τόσο συμπληρώνονται με κενό πλασμίδιο pSGFlag) ή miR-135a μιμούνται συμπληρώνεται με pSGFlag-ΔΑ /B-ERRα (διαγράφονται από 3’ΙΙΤΡ του). Η έκφραση των υποδεικνυόμενων πρωτεϊνών δεικνύεται στα ανώτερα φύλλα. Τα κύτταρα αφέθηκαν να εισβάλλουν Matrigel επί δοκιμασίες θαλάμου Boyden. Εισβάλλοντας κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και βάφτηκαν. Τυπικά μικροφωτογραφίες εμφανίζονται στα αριστερά. Η ποσοτικοποίηση πραγματοποιήθηκε σε ολόκληρη καλά χρησιμοποιώντας Image J. αποτελέσματα εκφράζονται σε σχέση με τον έλεγχο των συνθηκών miR με μπάρες σφάλματος δείχνουν SEM. **:

σ

& lt? 0,01, *:

σ

& lt? 0,05, ns:. Μη σημαντική

Η

Συζήτηση

αντιφατικά αποτελέσματα έχουν δημοσιευθεί σχετικά με τον ρόλο του miR-135a στην εξέλιξη του καρκίνου. Πράγματι, αυτή η microRNA έχει αναφερθεί ότι προάγουν ή αναστέλλουν γνωρίσματα επιθετικότητα του καρκίνου [6-12]. Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι miR-135α μειώνει την έκφραση των ERRα στα επίπεδα mRNA και πρωτεΐνης, με αποτέλεσμα την διαμόρφωση της έκφρασης των γονιδίων στόχων του υποδοχέα. Είναι ενδιαφέρον ERRα εμφανίζει ένα πρότυπο έκφρασης σε καρκίνους που είναι αντίθετη με εκείνη του miR-135a. Πράγματι τα επίπεδα του υποδοχέα (mRNA και πρωτεΐνη) είναι πιο αυξημένα σε όγκους (σε σχέση με φυσιολογικούς ιστούς) και την υψηλή έκφραση του συσχετίζεται με μία φτωχή πρόγνωση σε διαφόρους τύπους καρκίνων, όπως αυτές από το στήθος ή τον προστάτη (που επισκοπείται στο [26-28 ]). Αυτή η υψηλή έκφραση μπορεί να προκληθεί από διάφορους μηχανισμούς, όπως η γονιδιωματική ενίσχυση [40], ένας μεταγραφικός αυτορύθμισης βρόχο [41], και την προς τα κάτω ρύθμιση microRNAs που στοχεύουν ERRα [25, 42]. Εδώ προτείνουμε ότι μια μείωση στην έκφραση του miR-135a μπορεί αποκαταστέλλουν ότι του υποδοχέα. Συνεπής με τον ορισμό του ως παράγοντας κακής πρόγνωσης, ERRα προωθεί πολλά χαρακτηριστικά της εξέλιξης του καρκίνου, όπως EMT, αγγειογένεση, μεταβείτε σε αερόβια γλυκόλυση (Warburg αποτέλεσμα) και αντίσταση στην υποξία [31-35]. Δεν είναι γνωστό εάν miR-135a είναι πραγματικά εμπλέκονται σε εξουδετέρωση της εμφάνισης αυτών των διεργασιών. Παρ ‘όλα αυτά, miR-135a καταστέλλει την κυτταρική διείσδυση [11], μια παράμετρος που είναι, σε αντίθεση, που προωθείται από ERRα [36-37]. παρόντα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι η αδρανοποίηση των ERRα από miR-135a είναι αποφασιστικής σημασίας για την πρόληψη της κυτταρικής εισβολής αφού το φαινόμενο αυτό μπορεί να αποκατασταθεί με την εκ νέου εισαγωγή μιας μη δυνατότητα στόχευσης υποδοχέα. Τουλάχιστον δύο μη αλληλοαποκλειόμενες μηχανισμοί έχουν προκλητών να λογοδοτήσουν για τις προ-επεμβατική δραστηριότητα του υποδοχέα. Από τη μία πλευρά, ERRα επάγει Wnt11 σηματοδότηση η οποία ρυθμίζει άμεσα την κυτταρική διείσδυση μέσω αυτορύθμισης βρόχο που περιλαμβάνει β-κατενίνης [36]. Από την άλλη πλευρά, ο υποδοχέας ρυθμίζει θετικά την έκφραση του TNFAIP1, η οποία μειώνει τη σταθερότητα της πρωτεΐνης RhoA, καθώς και τη δραστηριότητα των κατάντη ROCK1 τελεστή του [37]. Σε περίπτωση απουσίας του ERRα η αύξηση της δραστηριότητας ROCK1 οδηγεί σε μια αναστολή του κυτταρικού εισβολής. Είναι ενδιαφέρον δείχθηκε πρόσφατα ότι miR-135α προκαλεί άμεσα την υποβάθμιση ROCK1 mRNA, επίσης με αποτέλεσμα την αναστολή της κυτταρικής εισβολής [11]. Από την άποψη αυτή, η μείωση της έκφρασης miR-135a σε καρκίνους μπορεί να οδηγήσει σε ανεξέλεγκτη έκφραση ROCK1 που μπορεί να γίνει υπερβολική και έτσι αναστέλλουν την κυτταρική διείσδυση. Ωστόσο, η μείωση του miR-135a επίσης πιθανό οδηγεί, παράλληλα, σε αυξημένη έκφραση ERRα. Με τη σειρά του ο υποδοχέας μειώνει δραστικότητα ROCK1 κάτω σε ένα επίπεδο που είναι κατάλληλη για την κυτταρική εισβολή. Εν ολίγοις miR-135a και ERRα μπορούν να σχηματίσουν μια πολυ-επίπεδη κανονιστικού δικτύου ότι η δραστηριότητα μικρορυθμίσεις ROCK1.

Perusing της βιβλιογραφίας, φαίνεται πιθανό ότι αυτό το miR-135a- ERRα κανονιστικού δικτύου μπορεί να είναι αποτελεσματική σε ένα εντελώς διαφορετικό πλαίσιο. Πράγματι έχει αποδειχθεί ότι miR-135a άμεσα ρυθμίζει προς τα κάτω την έκφραση του κύριου γονιδίου της διαφοροποίησης των οστεοβλαστών, Runx2, εμποδίζοντας έτσι την οστεογένεση [39].

Per se

, η παρατηρούμενη ΒΜΡ2 επαγόμενη μείωση στην έκφραση miR-135a μπορεί έτσι να οδηγήσει σε ανεξέλεγκτη Runx2 υπερέκφραση και επομένως πρόωρη διαφοροποίηση των οστεοβλαστών. Σε μια άλλη πλευρά, ανεξάρτητα δεδομένα έχουν δείξει ότι τόσο η έκφραση Runx2 και δραστηριότητα καταπιέζονται από ERRα ([43-45], αναθεωρούνται στο [14]). Η μείωση στην έκφραση miR-135a μπορεί έτσι αποκαταστέλλουν άμεσα την έκφραση και των δύο Runx2 και ERRα, ο τελευταίος με τη σειρά του μετριασμού της δραστηριότητας του πρώτου. Ένα τέτοιο δίκτυο θα μπορούσε να οδηγήσει τελικά στη δραστηριότητα Runx2 εξομάλυνσης, όπως περιγράφεται παραπάνω για ROCK1. Περισσότερες προσπάθειες απαιτούνται για να αποδειχθεί η ακρίβεια αυτής της υπόθεσης.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Πίνακα S1. Ολιγονουκλεοτίδια που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη

doi:. 10.1371 /journal.pone.0156445.s001

(PDF)