Αφηρημένο

Ιστορικό

Electroporation, μια μέθοδος για την αύξηση της διαπερατότητας των μεμβρανών σε ιόντα και μικρά μόρια, χρησιμοποιείται στην κλινική με χημειοθεραπευτικά φάρμακα για τη θεραπεία του καρκίνου (ηλεκτροχημειοθεραπεία). Η ηλεκτροπόρωση με ασβέστιο προκαλεί ΑΤΡ (τριφωσφορική αδενοσίνη) εξάντληση και θάνατο των καρκινικών κυττάρων και θα μπορούσε να είναι μια νέα θεραπεία του καρκίνου. Η μελέτη αυτή στοχεύει στην κατανόηση της σχέσης μεταξύ της εφαρμοσμένης ηλεκτρικό πεδίο, η συγκέντρωση ασβεστίου, ΑΤΡ εξάντληση και την αποτελεσματικότητα

Μέθοδοι

Σε τρεις ανθρώπινες κυτταρικές σειρές -. Η69 (καρκίνος του πνεύμονα μικρού κυττάρου), SW780 ( καρκίνο της ουροδόχου κύστης), και U937 (λευχαιμία), η βιωσιμότητα προσδιορίστηκε μετά από αγωγή με 1, 3, ή 5 mM ασβέστιο και οκτώ 99 μs παλμούς με 0,8, 1,0, 1,2, 1,4 ή 1,6 kV /cm. Διαρρύθμιση ανάλυση εφαρμόστηκε για την ποσοτικοποίηση της κυτταρικής θανάτωσης αποτελεσματικότητα στην παρουσία του ασβεστίου. Μετα-αγωγή ενδοκυτταρικό ΑΤΡ μετρήθηκε σε Η69 και τα κύτταρα SW780. Μετά τη θεραπεία ενδοκυτταρικό ΑΤΡ παρατηρήθηκε με ομοεστιακό μικροσκόπιο φθορισμού των κυττάρων U937 quinacrine-επισημασμένο.

Αποτελέσματα

Τόσο Η69 και τα κύτταρα SW780 έδειξε εξαρτώμενη από τη δόση (συγκέντρωση ασβεστίου και ηλεκτρικό πεδίο) μείωση στην ενδοκυτταρική ΑΤΡ (p & lt? 0,05) και μειωμένη βιωσιμότητα. Το 50% θανάτωση αποτελεσματική κυττάρων βρέθηκε στο 3,71 kV /cm (Η69) και 3,28 kV /cm (SW780), μειώνεται σε 1,40 και 1,15 kV /(αντίστοιχα) cm με 1 mM ασβεστίου (χαμηλότερη EC50 για υψηλότερες συγκεντρώσεις ασβεστίου). Quinacrine ένταση φθορισμού των κυττάρων U937 ασβεστίου-ηλεκτροδιατρήθηκαν ήταν κατά ένα τρίτο χαμηλότερη από ό, τι στην ομάδα ελέγχου (p & lt? 0.0001).

Συμπεράσματα

δοσοεξαρτώμενο τρόπο ηλεκτροδιάτρησης ασβέστιο μειωμένη επιβίωση των κυττάρων και ενδοκυτταρικό ΑΤΡ. Αύξηση εξωκυτταρικό ασβέστιο επιτρέπει τη χρήση μιας χαμηλότερης ηλεκτρικού πεδίου.

γενικότερη σημασία

Αυτή η μελέτη υποστηρίζει τη χρήση ηλεκτροδιάτρησης ασβεστίου για τη θεραπεία του καρκίνου και πιθανώς μειώνοντας το εφαρμοζόμενο ηλεκτρικό πεδίο σε μελλοντικές δοκιμές.

Παράθεση: Hansen EL, Sozer EB, Romeo S, Frandsen SK, Vernier PT, Gehl J (2015) δοσο-εξαρτώμενη ΑΤΡ εξάντληση και θάνατο των καρκινικών κυττάρων Electroporation παρακάτω ασβέστιο, Σχετική Επίδραση της συγκέντρωσης ασβεστίου και Ηλεκτρικό πεδίο δύναμη. PLoS ONE 10 (4): e0122973. doi: 10.1371 /journal.pone.0122973

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Boris Rubinsky, Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνιας στο Berkeley, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 29 Δεκέμβρη 2014? Αποδεκτές: 11 Φεβρουαρίου, 2015? Δημοσιεύθηκε: 8 Απρίλη 2015

Copyright: © 2015 Hansen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. ELH υποστηρίχθηκε από μια υποτροφία από τη δανική Εταιρεία Καρκίνου (R81-A5208-13-S7) και με επιχορήγηση από το COST Action «Ευρωπαϊκό Δίκτυο για την Ανάπτυξη της Electroporation- με βάση τεχνολογίες και θεραπείες «(TD1104-010414-042351). SR υποστηρίχθηκε από μια επιχορήγηση από το COST Action (TD1104-040514-041263). JG ήταν μια Βασιλική Σουηδική Ακαδημία Επιστημών Research Fellow υποστηρίζεται από μια επιχορήγηση από το Ίδρυμα Acta Oncologica (2009-2014). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς δηλώνουν το δίπλωμα ευρεσιτεχνίας «Θεραπευτικές εφαρμογές της ηλεκτροδιάτρησης ασβεστίου για να προκαλέσει αποτελεσματικά νέκρωσης όγκων» (PCT /DK2012 /050.496, συν-εφευρέτες SKF και JG) έχει υποβληθεί. Άλλοι συγγραφείς δηλώνουν δεν υπάρχει σύγκρουση συμφερόντων. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Η ηλεκτροπόρωση είναι μια μέθοδος που χρησιμοποιείται για να δημιουργήσει αυξημένη όσμωση κυτταρικών μεμβρανών εφαρμόζοντας περατά ηλεκτρικούς παλμούς [1]. Η μέθοδος μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την επαγωγή διέλευση αλλιώς μη διαπερνά φάρμακα [2-5] ή ιόντα όπως ασβεστίου [6,7] σε κύτταρα μέσω της κυτταρικής μεμβράνης [8].

Αναστρέψιμη ηλεκτροδιάτρηση, όπου κύτταρο μεμβράνες επανασφράγιση μετά από παροδική διαπερατότητα, χρησιμοποιείται στην κλινική σε συνδυασμό με χημειοθεραπευτικά φάρμακα για την τοπική θεραπεία των κακοήθων όγκων (ηλεκτροχημειοθεραπεία) [9-11]. Αντικαθιστώντας το ασβέστιο για χημειοθεραπευτικούς παράγοντες σε αυτή τη διαδικασία (ηλεκτροδιάτρησης ασβεστίου) θα μπορούσε να είναι μια νέα, αποτελεσματική και φθηνή θεραπεία του καρκίνου [6].

Είναι μεγάλο κλινικό ενδιαφέρον να διερευνήσει τη δυνατότητα της ελαχιστοποίησης του ηλεκτρικού πεδίου μεγέθους κατά τη διάρκεια της θεραπείας , τόσο στην αποφυγή μυϊκές συσπάσεις και στην ανάπτυξη των ηλεκτροδίων που μπορεί να θεραπεύσει βαθιές όγκους. Έκθεση των κυττάρων σε μοιρασμένης δόσης ηλεκτροδιάτρηση έχει αποδειχθεί ότι αυξάνουν την ευαισθησία των κυττάρων να ηλεκτροχημειοθεραπεία, ένα φαινόμενο που ονομάζεται electrosensitation [12]. Η μελέτη μας έχει ως στόχο να διερευνήσει μια πιθανή αύξηση της ευαισθησίας, επίσης, να μη αναστρέψιμη θεραπεία ηλεκτροπόρωσης όταν αυξάνεται το εξωκυτταρικό ασβέστιο. Μη αναστρέψιμη ηλεκτροδιάτρησης (IRE) [13] είναι μια άλλη θεραπεία με βάση την ηλεκτροδιάτρηση, όπου οι ισχυρότερες ηλεκτρικά πεδία χρησιμοποιούνται για να σκοτώσουν τα καρκινικά κύτταρα μέσω μη αναστρέψιμη διαπερατότητα της μεμβράνης. Αύξηση ηλεκτρόδιο θεραπευτικό εύρος με τη μείωση του ηλεκτρικού πεδίου είναι μια ιδιαίτερη ανησυχία σε IRE, καθώς και άλλες θεραπείες που βασίζονται ηλεκτροδιάτρηση [14]. Για IRE, προσθέτοντας ασβεστίου μπορεί να αυξήσει την ακτίνα της θεραπείας και την αποτελεσματικότητα.

Το ασβέστιο είναι ένα πανταχού παρόν δεύτερος αγγελιοφόρος που εμπλέκονται σε πολλές κυτταρικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της ελεγχόμενης νέκρωση (necroptosis) [15-18]. Η βαθμίδα συγκέντρωσης για ασβέστιο μέσω της κυτταρικής μεμβράνης ρυθμίζεται αυστηρά προκειμένου να διατηρηθεί κυτταρικής ομοιόστασης. Σε φυσιολογικά κύτταρα η ενδοκυτταρική συγκέντρωση του ιονισμένου ασβεστίου διατηρείται περίπου 100 ηΜ, σημαντικά χαμηλότερο από την εξωκυτταρική συγκέντρωση, η οποία τυπικά υπερβαίνει το 1 mm [16,19]. Η κλίση διατηρείται μέσω πολυάριθμων αντλίες μεμβράνης, όπως Ca

2 + ΑΤΡάσεων, που καταναλώνουν ΑΤΡ (τριφωσφορική αδενοσίνη) για την ενέργεια είτε αποβάλλει την περίσσεια ασβεστίου από το κύτταρο ή το μεταφέρουμε σε κυτταρικά διαμερίσματα όπως το ενδοπλασματικό δίκτυο ή μιτοχόνδρια [20-22].

Έχουμε δείξει στο παρελθόν ότι τα κυτταρικά επίπεδα ΑΤΡ πέσει μετά από ηλεκτροδιάτρηση ασβεστίου [6]. Όταν συμβαίνει μια δραματική αύξηση στο ενδοκυτταρικό ασβέστιο, πιθανώς με ηλεκτροδιάτρηση ασβέστιο, αυξημένη δραστικότητα Ca

2 + ΑΤΡάσεων καταναλώνει βιαστικά κυτταρική ΑΤΡ [19]. Μια αύξηση σε ασβέστιο επηρεάζει επίσης τις μιτοχόνδρια που οδηγεί σε απώλεια της παραγωγής ΑΤΡ [20]. Επιπλέον, η δημιουργία της παροδικής πόρων στη μεμβράνη πλάσματος μπορεί να προκαλέσει διαρροή του ΑΤΡ έξω από το κύτταρο. [23] Συνολικά, κυτταρική ΑΤΡ μειώνεται όταν ένα τοξικό επίπεδο του ασβεστίου επάγεται μέσα στο κύτταρο, πιθανώς μέσω αυτών των μηχανισμών. Η εξάντληση των αποθεμάτων ΑΤΡ μπορεί να συμβάλει στην έναρξη του κυτταρικού θανάτου [6,24].

ηλεκτροδιάτρησης ασβέστιο είναι συγκρίσιμη σε αποτελεσματικότητα με ηλεκτροχημειοθεραπεία

in vitro

[7] και βρίσκεται στο στάδιο της πρώτης κλινικής δοκιμής σε μια τυχαιοποιημένη μελέτη μη κατωτερότητας διπλά τυφλή φάση ΙΙ (ClinicalTrials.gov-ID NCT01941901). Περισσότερες γνώσεις σχετικά με το μηχανισμό της ηλεκτροδιάτρησης ασβεστίου είναι απαραίτητη για την περαιτέρω κατανόηση και να εκμεταλλευτούν αυτή την αντικαρκινική τροπικότητα.

Για να διερευνήσουν τη σχέση μεταξύ της συγκέντρωσης του ασβεστίου και παλμικά ηλεκτρικά πεδία στην απόκτηση καταστροφής του ATP και επαρκής θανάτωση κυττάρων

in vitro

, χρησιμοποιήσαμε κυτταρικές σειρές που είναι γνωστό ότι έχουν διαφορετική ανταπόκριση σε θεραπεία ηλεκτροπόρωσης ασβέστιο

in vivo

: Η69 ανθρώπινου καρκίνου μικρών κυττάρων του πνεύμονα με υψηλή ευαισθησία (77-100% νέκρωση σε όγκους 6 ημέρες μετά την ηλεκτροδιάτρηση ασβέστιο? [ ,,,0],9]) και SW780 ανθρώπινης κύστης καρκινική κυτταρική σειρά με χαμηλή ευαισθησία (1-60% νέκρωση σε όγκους 6 ημέρες μετά την ηλεκτροδιάτρηση ασβέστιο? αδημοσίευτα δεδομένα). Διερευνήσαμε επίσης τις βραχυπρόθεσμα αποτελέσματα της ηλεκτροδιάτρησης ασβεστίου επί της ΑΤΡ περιεχόμενο ενός ανθρώπινου κυττάρου λευχαιμίας γραμμή (U937) με τη χρήση απεικόνισης συνεστιακού με τη φθορίζουσα κινακρίνη σημειωτή.

Αυτή η μελέτη ερευνά τη σχέση μεταξύ εφαρμοζόμενου ηλεκτρικού πεδίου, η συγκέντρωση ασβεστίου , ευαισθησία κυτταρική γραμμή και η επίδραση στην περιεκτικότητα σε ATP και την επιβίωση.

Υλικά και Μέθοδοι

Τρεις ανθρώπινες κυτταρικές σειρές χρησιμοποιήθηκαν για πειράματα. Πειράματα ανάλυσης της περιεκτικότητας σε ΑΤΡ και βιωσιμότητα διεξάγεται στο Πανεπιστήμιο της Κοπεγχάγης Νοσοκομείο Herlev χρησιμοποιείται Η69 ανθρώπινο καρκίνο του πνεύμονα μικρών κυττάρων και κυτταρικές σειρές ανθρώπινου καρκίνου της ουροδόχου κύστης SW780. Η ανθρώπινη κυτταρική γραμμή λευχαιμίας U937 χρησιμοποιήθηκε για πειράματα στο Ερευνητικό Κέντρο Frank Reidy για Bioelectrics.

Κυττάρων καλλιέργεια

Το ανθρώπινο πνεύμονα κυτταρική σειρά καρκίνου μικρού κυττάρου Η69 σταθερά επιμολυσμένα με ενισχυμένη πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (EGFP) ρυθμίζεται από τον υποκινητή του κυτταρομεγαλοϊού [25] ήταν ευγενική παραχώρηση από το Τμήμα Ακτινοθεραπευτικής Βιολογίας, Copenhagen University Hospital. Το ανθρώπινο κύστης καρκίνωμα μεταβατικού κυττάρου SW780 παρασχέθηκε ευγενώς από τον Dr. Lars Dyrskjøt Andersen, Τμήμα Μοριακής Ιατρικής, Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Aarhus [26]. Το ανθρώπινο ιστιοκυτταρικό λέμφωμα μονοκυττάρων κυτταρική σειρά U937 (ATCC CRL-1593.2) παρασχέθηκε ευγενώς από τον Όλγα Pakhomova, Frank Reidy Κέντρο Ερευνών για Bioelectrics Πανεπιστημίου Old Dominion.

Όλες οι κυτταρικές σειρές διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 που περιέχει 10 % ορό εμβρύου μόσχου (Gibco, Invitrogen), 100 U /ml πενικιλλίνη και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη σε 37 ° C και

2.

Electroporation πρωτόκολλο

Cells σε 5% CO ρυθμιστικό HEPES (10 mM HEPES (Lonza), 250 mM σακχαρόζη, 1 mM MgCl

2 σε αποστειρωμένο νερό) με τελική συγκέντρωση 6.1 × 10

6 κύτταρα /ml, ψύχθηκαν σε πάγο για 5 λεπτά. Για ηλεκτροδιάτρηση ασβέστιο (CAEP), 20 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος HEPES που περιέχει CaCl

2 προστέθηκε σε κυψελίδες ηλεκτροδιάτρησης με διαχωρισμό ηλεκτρόδιο 4 mm (Molecular BioProducts Inc., San Diego, CA, USA) για να δώσει μία τελική συγκέντρωση 0 mM, 1 mM, 3 mM, ή 5 mM ΟαΟ

2 μετά την προσθήκη 180 μΐ κυτταρικού αιωρήματος. Οι κυψελίδες παρέμειναν σε πάγο για 5 λεπτά πριν την ηλεκτροδιάτρηση (ΕΡ). ΕΡ αποτελείτο από 8 παλμούς 99 μs με 0,8 kV /cm, 1,0 kV /cm, 1,2 kV /cm, 1,4 kV /cm ή 1,6 kV /cm αντίστοιχα, που παραδίδεται σε συχνότητα 1 Hz χρησιμοποιώντας ΒΤΧ Τ820 τετραγωνικό κύμα ηλεκτροπόρωσης ( BTX Χάρβαρντ Συσκευή). Μετά από 20 λεπτά επώασης στους 37 ° C και 5% CO

2, τα κύτταρα αραιώθηκαν σε 5 ml μέσου καλλιέργειας (τελική συγκέντρωση 2.4 × 10

5 κύτταρα /ml).

δοκιμασίας ΑΤΡ

επίπεδο κυτταρικής ATP μετρήθηκε σε Η69 και τα κύτταρα SW780 επεξεργασία με ασβέστιο, με ή χωρίς ηλεκτροδιάτρησης χρησιμοποιώντας δοκιμασία φωταύγειας ΑΤΡ (Enliten δοκιμασία ΑΤΡ? Promega) μετά την κυτταρική λύση. Για την ανίχνευση ΑΤΡ 11,5 × 10

4 κύτταρα /ml Η69 κύτταρα ή 4,6 × 10

4 κύτταρα /ml SW780 κύτταρα σε 100 μΐ μέσου καλλιέργειας ήταν σε πλάκες 96-φρεατίων σύμφωνα με την αρχική βελτιστοποίηση.

τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή σύμφωνα με το πρωτόκολλο ηλεκτροδιάτρησης. Τα κύτταρα ηλεκτροδιατρήθηκαν με ρυθμιστικό HEPES, μη ηλεκτροδιάτρηση κυττάρων με ασβέστιο, και μη επεξεργασμένα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες. Κύτταρα τρεις φορές αποψυχθεί και κατεψυγμένα, στη συνέχεια υφίσταται κατεργασία με υπερήχους (λουτρό υπερήχων Branson 1200), χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος (νεκρά κύτταρα). Μετά από φυγοκέντρηση του υπερκείμενου τρυβλία 96 φρεατίων απομακρύνθηκε. Cellular περιεχόμενο ΑΤΡ 1, 2, 4, και 8 ώρες μετά την αγωγή προσδιορίστηκε με τη λύση των κυττάρων (30 min) και στη συνέχεια προσθήκη 100 μΙ RL /l αντιδραστήριο και με μέτρηση εκπομπής φωτός χρησιμοποιώντας ένα φωτόμετρο (Lumistar, Ramcon).

MTS Βιωσιμότητα δοκιμασία

η βιωσιμότητα των Η69 και SW780 κύτταρα επεξεργασμένα με ασβέστιο, με ή χωρίς ηλεκτροδιάτρηση εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας MTS (3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -5- (carboxymethophenyl) -2- (4-σουλφονυλο) -2Η-τετραζόλιο) (Cell Titer δοκιμασία Πολλαπλασιασμού 96 Υδατικά μη ραδιενεργά κυττάρων? Promega). δοκιμασία MTS είναι μια χρωματομετρική μέθοδος που υπολογίζει τον ρυθμό μεταβολισμού σε βιώσιμα κύτταρα. Μετά την κατεργασία 100 μλ εναιωρήματος κυττάρου (2.4 × 10

5 κύτταρα /ml) εμβολιάστηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων. Μετά αντιδραστήριο 24 ώρες επώασης 20 μΙ MTS /PMS προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο (τελική συγκέντρωση 333 μg /ml MTS και 25 μΜ PMS). Μετά από 1 ώρα επώασης στους 37 ° C και 5% CO

2 βιωσιμότητα των κυττάρων αξιολογήθηκε με μέτρηση της οπτικής πυκνότητας (OD) χρησιμοποιώντας Multiscan-Ascent αναγνώστη ELISA (ThermoLabsystems, Φινλανδίας) στα 490 nm με μετρήσεις υποβάθρου στα 690 nm.

Προσαρμογή των σχέσεων μεταξύ των πειραματικών παραμέτρων και δεδομένων επιβίωση των κυττάρων

Η ανάλυση των δεδομένων έγινε με τη χρήση του MATLAB (Natick, ΜΑ, USA) λογισμικού. Η επιβίωση των κυττάρων (που εκφράζεται ως ποσοστό του ελέγχου) των κυτταρικών γραμμών Η69 και SW780 στις 24 ώρες μετά την αγωγή σχεδιάστηκε έναντι του πλάτους του ηλεκτρικού πεδίου σε κάθε συγκέντρωση ασβεστίου θεωρούνται. Η καλύτερη προσαρμογή καμπύλης ακολούθως προέρχεται. Από τις καμπύλες τοποθέτηση, η ένταση του ηλεκτρικού πεδίου (Ε

50) που απαιτούνται για να σκοτώσει τουλάχιστον 50% των κυττάρων σε κάθε συγκέντρωση ασβεστίου εκχυλίζεται, για να ποσοτικοποιηθεί αποτελεσματικότητα της θανάτωσης κυττάρων ηλεκτροδιάτρησης σε απουσία ή σε παρουσία ασβεστίου.

απεικόνισης ΑΤΡ

χρησιμοποιώντας ομοεστιακό απεικόνισης σάρωσης με SP8 μικροσκόπιο Leica TCS, ΑΤΡ περιεχόμενο μετά την ηλεκτροδιάτρηση αξιολογήθηκε σε κύτταρα U937 χρησιμοποιώντας τον φθορίζουσα χρωστική κινακρίνη (Sigma-Aldrich, USA), ένα μη ειδικό δείκτη με υψηλή συγγένεια για τα νουκλεοτίδια αδενίνης [15]. διερευνήθηκαν τέσσερις προϋποθέσεις: Κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με 3 mM εξωτερικό ασβέστιο? κύτταρα που εκτίθενται σε ηλεκτροδιάτρηση παλμούς (1 kV /cm, 8 × 99 μs, 1 Hz)? κύτταρα που εκτίθενται σε τόσο 3 mM εξωτερικού ασβεστίου και ηλεκτροδιάτρηση όσπρια? και μη επεξεργασμένα δείγματα ελέγχου. Τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C για 30 λεπτά σε μέσο ανάπτυξης που περιέχει 10 μΜ κινακρίνη, ακολουθούμενο από το πρωτόκολλο ηλεκτροδιάτρησης που περιγράφεται στην ενότητα 2.2. (Συγκέντρωση ίδιο κελί που χρησιμοποιείται αλλά εξαιρούνται ψύξη και τα κύτταρα ηλεκτροδιατρήθηκαν σε κυψελίδες 1 mm σε παρουσία ιωδιούχου προπιδίου 10 μΜ). Αμέσως μετά την ηλεκτροφόρηση τα κύτταρα μεταφέρθηκαν αντίστοιχα για να καλυφθούν υάλινους θαλάμους για την απεικόνιση που περιέχει RPMI 1640, 1,6 μΜ κινακρίνη και 1,25 μΜ ιωδιούχο προπίδιο (Molecular Probes, USA? Ένας δείκτης της διαπερατότητα μεμβράνης) με αραίωση 1: 6 και των δύο κυττάρων και βαφές (κυτταρική συγκέντρωση 1 × 10

6 κύτταρα /ml) και σε πλάκες 96-φρεατίων για την δοκιμασία βιωσιμότητας. Εμείς απεικονίζεται ο φθορισμός κινακρίνη 15 λεπτά μετά την αγωγή. Η ένταση φθορισμού μετρήθηκε σε 9 εικόνες ανά συνθήκη. Σε κάθε εικόνα, ο φθορισμός των είκοσι τυχαία επιλεγμένα κύτταρα εντάχθηκε και κατά μέσο όρο τη χρήση του λογισμικού MATLAB (180 κύτταρα συνολικά).

Η ρεσαζουρίνη δοκιμασία βιωσιμότητας

Η βιωσιμότητα των κυττάρων U937 αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία ρεσαζουρίνη (Life Technologies , USA) διεξήχθη 24 ώρες μετά την έκθεση. Δέκα μικρολίτρα αντιδραστηρίου (Prestoblue, Molecular Probes) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο που περιέχει 90 μΙ κυτταρικού εναιωρήματος (συγκέντρωση κυττάρων 2.4 χ 10

5 κύτταρα /ml). Μετά από 1 ώρα επώασης στους 37 ° C και 5% CO

2, η βιωσιμότητα των κυττάρων αξιολογήθηκε με μέτρηση φθορισμού χρησιμοποιώντας Synergy 2 αναγνώστη μικροπλάκας (BioTek Instruments, USA).

Στατιστικές αναλύσεις

οι διαφορές στην ATP ένταση φωτοβολίας μεταξύ των ομάδων δοκιμάζονται με την δοκιμασία φωταύγειας ΑΤΡ επικυρώθηκαν και αναλύθηκαν με εκθετικό μοντέλο μείωση με διόρθωση Bonferroni με τη χρήση του λογισμικού SAS (έκδοση 9.2). τιμές φωταύγεια είχαν καταγραφής μετατραπεί πριν από την ανάλυση. Αμφίδρομη ANOVA (ανάλυση διακύμανσης) με διόρθωση Bonferroni χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογηθούν οι διαφορές στη βιωσιμότητα μεταξύ των ομάδων δοκιμάζονται με προσδιορισμό πολλαπλασιασμού MTS χρησιμοποιώντας επίσης SAS 9,2 λογισμικού. T-test χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση των διαφορών μεταξύ των ομάδων δοκιμάζονται με την δοκιμασία resazurin βιωσιμότητα και για εκτυπωμένων ομάδων αναλύθηκαν με το λογισμικό MATLAB.

Αποτελέσματα

Κυτταρικής ATP και τη βιωσιμότητα μετά την ηλεκτροδιάτρηση ασβεστίου

μόνο ασβέστιο (χωρίς ηλεκτροδιάτρηση).

έκθεση των κυττάρων σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις εξωκυτταρικού ασβεστίου σε απουσία ηλεκτροδιάτρησης δεν είχε εμφανή επίδραση στο επίπεδο κυτταρικής ΑΤΡ ή βιωσιμότητα σε σύγκριση με τους ελέγχους σε οποιαδήποτε από τις δύο κυτταρικές σειρές (Σχ 1Α και 1Β, 2Α και 2Β)

επίπεδα Cellular ΑΤΡ προσδιορίστηκε 1, 2, 4, και 8 ώρες μετά την θεραπεία ηλεκτροδιάτρηση ασβέστιο δύο ανθρώπινων κυτταρικών σειρών (Η69, μια μικρή κυτταρική σειρά καρκίνου του πνεύμονα (α).? και SW780, ένας καρκίνος της ουροδόχου κύστης κυτταρική γραμμή (Β)). Εξωκυτταρικές συγκεντρώσεις ασβεστίου από 0 mM, 1 mM, 3 mM, 5 mM ή και εφαρμοζόμενου ηλεκτρικού πεδίου του 0,8 kV /cm, 1,0 kV /cm, ή 1,2 kV /cm. Τα αποτελέσματα απεικονίζονται ως ποσοστό του μάρτυρα (χωρίς ηλεκτροδιάτρηση, χωρίς προσθήκη ασβεστίου). . Κανονικοποιημένη για τον έλεγχο σε κάθε χρονικό σημείο (%), μέση-Τ.Α, η = 6.

Η

Βιωσιμότητα, αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία MTS, από Η69, ένα ανθρώπινο μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κυτταρική γραμμή (Α)? και SW780, μια κυτταρική σειρά ανθρώπινου καρκίνου της ουροδόχου κύστης (Β) 24 ώρες μετά την αγωγή με ηλεκτροδιάτρηση ασβέστιο. Τελική εξωκυτταρικό συγκεντρώσεις ασβεστίου από 0 mM, 1 mM, 3 mM, 5 mM ή και εφαρμοζόμενου ηλεκτρικού πεδίου είτε 0,8 kV /cm, 1,0 kV /cm, ή 1,2 kV /cm. Κύτταρα τρεις φορές αποψυχθεί και κατεψυγμένα, στη συνέχεια υφίσταται κατεργασία με υπερήχους χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος (νεκρά κύτταρα). Τα αποτελέσματα απεικονίζονται ως ποσοστό του ελέγχου (χωρίς ηλεκτροπόρωση, χωρίς προσθήκη ασβεστίου), ηλεκτροπόρωση (ΕΡ), σημαίνει + SD, n = 6.

Η

Electroporation μόνο (χωρίς ασβέστιο).

αύξηση το ηλεκτρικό πεδίο δεν είχε σημαντική επίδραση επί του περιεχομένου ΑΤΡ των κυττάρων Η69, όταν τους εκθέτουν σε ηλεκτροδιάτρηση μόνο (Σχήμα 1Α). επίπεδα ΑΤΡ σε ηλεκτροδιάτρηση μόνο Η69 δειγμάτων αυξήθηκε με την πάροδο του χρόνου κατά τη διάρκεια της επώασης όπως παρατηρήθηκε προηγουμένως [6]. Δεν υπήρχε σημαντική μείωση της βιωσιμότητας των κυττάρων Η69 που έλαβαν μόνο παλμικού ηλεκτρικού πεδίου (Σχήμα 2Α).

Αύξηση του ηλεκτρικού πεδίου από 0,8 έως 1,2 kV /cm δεν έχουν σημαντική επίδραση στην περιεκτικότητα ΑΤΡ του SW780 κύτταρα, όταν τους εκθέτουν σε ηλεκτροδιάτρηση μόνο (Σχήμα 1Β). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Β, υπήρξε μια πτώση 28% σε βιωσιμότητα των κυττάρων SW780 σε επεξεργασία με 0,8 kV /cm ηλεκτρικό πεδίο που υποδεικνύει ότι ηλεκτροδιάτρηση μόνη προκάλεσε κυτταρικό θάνατο, αν και όχι στατιστικά σημαντική.

Ασβέστιο ηλεκτροδιάτρηση-Η69 κυτταρική ΑΤΡ .

ATP επίπεδα μειώθηκαν σε Η69 κύτταρα με αυξανόμενες συγκεντρώσεις ασβεστίου και η αύξηση του ηλεκτρικού πεδίου (Σχήμα 1Α). ηλεκτροδιάτρηση ασβεστίου χρησιμοποιώντας 0,8 kV /cm μείωσε σημαντικά την ενδοκυτταρική επίπεδο ΑΤΡ όταν συνδυάζεται με 5 mM ασβέστιο σε σύγκριση με μη κατεργασμένους μάρτυρες (ρ & lt? 0,05). Κατά τη χρήση 1,0 kV /cm και 1,2 kV /cm, όλες οι συγκεντρώσεις δοκιμάστηκαν ασβεστίου (1, 3, και 5 mM) μείωσε σημαντικά την ενδοκυτταρική επίπεδο ΑΤΡ σε σύγκριση με χωρίς θεραπεία ελέγχους και ασβέστιο μόνο (ρ & lt? 0.001). Η αύξηση του ηλεκτρικού πεδίου από 0,8 να 1,0 kV /cm σε ηλεκτροδιάτρηση ασβεστίου με 1 mM ασβέστιο μείωσε σημαντικά το επίπεδο ΑΤΡ (ρ & lt? 0,05). Περαιτέρω αύξηση του πεδίου 1,0 έως 1,2 kV /cm δεν είχε καμία επιπλέον επίδραση στο επίπεδο ΑΤΡ.

ηλεκτροδιάτρηση-Η69 Ασβέστιο βιωσιμότητα των κυττάρων.

Όπως φαίνεται στο σχήμα 2Α, ηλεκτροδιάτρηση ασβέστιο προκάλεσε σημαντική μείωση στην κυτταρικής βιωσιμότητας Η69 για όλες τις δόσεις που δοκιμάστηκαν υπερβαίνει το 1 mm ασβεστίου με 0,8 kV /cm (ρ & lt? 0,05). Περαιτέρω αυξήσεις σε ηλεκτρικό πεδίο ή η συγκέντρωση του ασβεστίου δεν έχουν σημαντική πρόσθετη επίδραση στην H69 βιωσιμότητας (Σχήμα 2Α).

ηλεκτροδιάτρησης-SW780 ασβέστιο ΑΤΡ κυττάρων.

Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Β, 1, 3 ή 5 mM ηλεκτροδιάτρηση ασβέστιο μείωσε σημαντικά τα επίπεδα του ΑΤΡ σε όλες τις συνθήκες παλμού σε σύγκριση με μη κατεργασμένους μάρτυρες, καθώς και ασβέστιο μόνο (ρ & lt? 0,05). Η αύξηση του ηλεκτρικού πεδίου από 0,8 να 1,0 kV /cm, και 1,0 έως 1,2 kV /cm σε κατεργασία με 1 mM ηλεκτροδιάτρηση ασβέστιο μείωσε σημαντικά το επίπεδο ΑΤΡ (ρ & lt? 0,0001). Η προσθήκη ασβεστίου στη διαδικασία ηλεκτροπόρωσης μειώθηκε σημαντικά ΑΤΡ σε όλες τις συνθήκες παλμού (ρ & lt? 0,0001)..

ηλεκτροδιάτρηση-SW780 Ασβέστιο βιωσιμότητα των κυττάρων

Όπως φαίνεται σχηματικά στο σχήμα 2Β, ηλεκτροδιάτρηση ασβέστιο προκάλεσε σημαντική μείωση στη βιωσιμότητα κυττάρου SW780 για όλες τις δόσεις που δοκιμάστηκαν υπερβαίνει το 1 mm ασβεστίου με 0,8 kV /cm (ρ & lt? 0.0001) (Σχήμα 2Β). Η αύξηση του ηλεκτρικού πεδίου από 0,8 έως 1,2 kV /cm επηρεάζεται σημαντικά SW780 βιωσιμότητα με την παρουσία του ασβεστίου (ρ & lt? 0.001). απαιτείται μέγιστη θανάτωση κυττάρων SW780 1,2 kV /cm και 5 mM ασβεστίου οδήγησε σε χαμηλότερες τιμές στην δοκιμασία MTA από την κατάψυξη και απόψυξη των κυττάρων τρεις φορές με επακόλουθη κατεργασία με υπερήχους (p & lt? 0.001).

Προσαρμογή ανάλυση των δεδομένων επιβίωσης των κυττάρων

μετά την ανάλυση με καμπύλη MATLAB εργαλείο εφαρμογής, βρήκαμε ότι η καλύτερη τοποθέτηση λειτουργία για τη σχέση μεταξύ κυτταρικής επιβίωσης μετά από 24 ώρες και το πλάτος του ηλεκτρικού πεδίου σε σταθερές συγκεντρώσεις ασβεστίου, ήταν μια εκθετική συνάρτηση δύο παραμέτρων,

y (x) = a · exp (-β · x)

όπου

x

είναι το πλάτος του ηλεκτρικού πεδίου και

y (x)

είναι το ποσοστό επιβίωσης των κυττάρων. Τα αποτελέσματα για τα κύτταρα SW780 αναφερθεί στο σχήμα 3. Το E

50 παράμετρο σε κάθε συγκέντρωση ασβεστίου θεωρείται εξήχθη χρησιμοποιώντας τη βρήκε λειτουργία. Τα αποτελέσματα, που αναφέρονται σχηματικά στον Πίνακα 1 τόσο για το Η69 και η κυτταρική σειρά SW780, μας επέτρεψε να ποσοτικοποιηθεί η αυξημένη κυτταρική θανάτωση αποτελεσματικότητα της ηλεκτροδιάτρησης με την παρουσία του ασβεστίου. Σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές, και για όλες τις συγκεντρώσεις ασβεστίου που δοκιμάστηκαν, το ηλεκτρικό πεδίο που απαιτείται για να μειωθεί κατά το ήμισυ της κυτταρικής επιβίωσης στις 24 ώρες μετά τη θεραπεία σε παρουσία εξωκυτταρικού ασβεστίου ήταν δύο έως τρεις φορές χαμηλότερο από ότι στην περίπτωση της ηλεκτροπόρωσης μόνο. Διαφορετικές αποκρίσεις ελήφθησαν ανάμεσα στις δύο κυτταρικές σειρές. Η κυτταρική γραμμή Η69 απαιτείται υψηλότερο πλάτος του ηλεκτρικού πεδίου (περίπου 20%) από ό, τι SW780 κύτταρα για να ληφθεί ένα 50% μείωση της βιωσιμότητας των κυττάρων, με μια εξωκυτταρική συγκέντρωση του χλωριούχου ασβεστίου από 1 έως 5 mM. Η κυτταρική γραμμή SW780 μπορεί να είναι πιο ευαίσθητα σε θεραπεία με χαμηλές δόσεις ασβεστίου από Η69 κύτταρα

in vitro

.

Η επιβίωση των κυττάρων (%) έναντι του ηλεκτρικού πεδίου (Ε) σε ηλεκτροδιάτρηση ασβεστίου χρησιμοποιώντας 0, 1, 3, ή 5 mM ασβέστιο στα SW780 καρκινικά κύτταρα ανθρώπινης κύστης αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία MTS 24 ώρες μετά τη θεραπεία. Ηλεκτρικό πεδίο πλάτος 0,8 kV /cm, 1,0 kV /cm, 1,2 kV /cm, 1,4 kV /cm, ή 1,6 kV /cm εφαρμόστηκε. Τοποθέτηση καμπύλες προέκυψαν με τη χρήση του λογισμικού MATLAB. Τα αποτελέσματα απεικονίζονται ως ποσοστό του μάρτυρα (χωρίς ηλεκτροδιάτρηση, χωρίς προσθήκη ασβεστίου), μέσος όρος ± SD, η = 6.

Η

συνεστιακή απεικόνιση φθορισμού του ΑΤΡ και της διαπερατότητας

μεταχειρισμένα συνεστιακή απεικόνιση φθορισμού του κινακρίνη-επισημασμένων κυττάρων να ερευνήσει τις αλλαγές στα επίπεδα ενδοκυτταρικού και διανομή του ΑΤΡ [27-30]. Το Σχήμα 4 δείχνει επιλεγμένα αντιπροσωπευτικά εικόνων που λαμβάνονται 15 λεπτά μετά την αγωγή. Η μέση κινακρίνη φθορισμός του ηλεκτροδιάτρηση δειγμάτων ασβεστίου ήταν περίπου 30% χαμηλότερη σε σχέση με τα ασβέστιο μόνο δείγματα (ρ & lt? 0,0001), που φαίνεται σχηματικά στο Σχήμα 5Α. Το ηλεκτρικό πεδίο που απαιτείται για να σκοτώσει τα μισά από τα κύτταρα (Ε

50) υπό τις συνθήκες διερευνηθεί σε παρουσία 3 mM ασβέστιο, εκτιμήθηκε σε 0,70 kV /cm.

U937, μία ανθρώπινη κυτταρική σειρά λευχαιμίας. Τελική εξωκυτταρικές συγκεντρώσεις χλωριούχου ασβεστίου από 0 mM ή 3 mM και εφαρμοζόμενου ηλεκτρικού πεδίου του 1,0 kV /cm. Quinacrine φθορισμού (επάνω σειρά), 10 μΜ? προπίδιο ιωδίδιο φθορισμού (μεσαία γραμμή), 7.5 μΜ? εικόνες φάση κυττάρων αντίθεσης (κάτω σειρά).

Η

U937, ένα ανθρώπινο κύτταρο λευχαιμίας γραμμή. (Α) Κυτταρική κινακρίνη ένταση φθορισμού των U937 15 λεπτά μετά την ηλεκτροδιάτρηση ασβεστίου. Η εξωκυτταρική συγκέντρωση κινακρίνη ήταν 10 μΜ κατά τη φόρτωση και ηλεκτροδιάτρηση. Τελική εξωκυτταρικό συγκεντρώσεις ασβεστίου από 0 mM ή 3 mM και εφαρμοζόμενου ηλεκτρικού πεδίου από 1,0 kV χρησιμοποιήθηκαν /cm. Στήλες απεικονίζουν το μέσο όρο των 180 κυττάρων (9 πειράματα × 20 κύτταρα). Αυθαίρετες μονάδες (AU), μέσος όρος + Τ.Α., η βιωσιμότητα n = 9. (Β) των κυττάρων U937 μετρήθηκαν 24 ώρες μετά την ηλεκτρομεταμόλυνση ασβεστίου. Βιωσιμότητας που υπολογίζεται για 937 χρησιμοποιώντας ρεζαζουρίνης δοκιμασία πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Εξωκυτταρικές συγκεντρώσεις ασβεστίου από 0 ή 3 mm. Εφαρμοζόμενο ηλεκτρικό πεδίο του 1,0 kV /cm. Τα αποτελέσματα απεικονίζονται ως ποσοστό του μάρτυρα (χωρίς ηλεκτροδιάτρηση, χωρίς προσθήκη ασβεστίου), μέσος όρος + SD, η = 6.

Η

διαπερατότητα των κυττάρων U937 χαρακτηρίζεται από εισροή ιωδιούχου προπιδίου καθυστέρησε και περισσότερο ακανόνιστη μετά ασβεστίου ηλεκτροδιάτρηση σε σύγκριση με ηλεκτροδιάτρηση χωρίς ασβέστιο (Εικόνα 4).

επίσης παρατηρήσαμε μορφολογικές αλλαγές σε ασβέστιο ηλεκτροδιάτρηση κύτταρα με αστάθεια που εμφανίζουν ακεραιότητα σε κίνδυνο μεμβράνη, διόγκωση, συρρίκνωση, ή ακανόνιστο σχήμα των κυττάρων (Εικόνα 4).

η ρεσαζουρίνη δοκιμασία βιωσιμότητας

Τα αποτελέσματα της δοκιμασίας βιωσιμότητας (Σχήμα 5Β) των κυττάρων U937 δείχνουν ότι υπήρχαν περισσότερες βιώσιμων κυττάρων στο δείγμα σε επεξεργασία με ασβέστιο και μόνο σε σχέση με το δείγμα ασβέστιο ηλεκτροδιάτρηση (ρ & lt? 0,0001).

Συζήτηση

Αυτή η μελέτη διερευνά την απάντηση σε κυτταρικό επίπεδο ATP και τη βιωσιμότητα σε διαφορετικές παραμέτρους ηλεκτροδιάτρησης και των συγκεντρώσεων του ασβεστίου για τη θεραπεία ηλεκτροπόρωσης ασβεστίου. Τόσο οι κυτταρικές σειρές Η69 και SW780 εμφανίζεται μια δοσοεξαρτώμενη μείωση στην κυτταρική ΑΤΡ και τη βιωσιμότητα με την αύξηση του ηλεκτρικού πεδίου μαζί με την αύξηση της συγκέντρωσης του ασβεστίου (Σχήμα 1Α και 1Β). Τα αποτελέσματα δεν αποκαλύψει πλήρως εάν η θεραπεία μπορεί να βελτιστοποιηθεί σύμφωνα με την ευαισθησία του κάθε ατόμου κυτταρική σειρά. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η κυτταρική γραμμή Η69 απαιτείται ένα υψηλό ηλεκτρικό πεδίο να επάγει μέγιστη εξάντληση ΑΤΡ (Εικ 1Α) και κυττάρων εξοντώσεως (Σχήμα 2Α).

Η διαφορά μεταξύ των αποκρίσεων των δύο κυτταρικών σειρών προς το διερευνηθούν παράμετροι για συγκέντρωση ασβεστίου και ηλεκτρικό πεδίο μπορεί εν μέρει να εξηγηθεί από τη διαφορά στο μέγεθος των κυττάρων. Η κυτταρική απόκριση σε ηλεκτροπόρωση ασβεστίου είναι λιγότερο εξαρτάται από το μέγεθος των κυττάρων

in vivo

λόγω της γενικής έλλειψης εξωκυττάριο χώρο, που επηρεάζουν τα κύτταρα ικανότητα να «κρύψει» από την έκθεση παλμό [31], ένα λόγο που

in vitro

αποτελέσματα για κατώτατα όρια δεν μπορεί να προβλέψει απαραίτητα in vivo αποτελεσματικότητα.

ηλεκτροδιάτρησης ασβεστίου προκάλεσε σημαντική βραχυπρόθεσμη μείωση του φθορισμού quinacrine στα κύτταρα U937, που μπορεί να δείχνουν μείωση του ΑΤΡ, και η θεραπεία μειώθηκε σημαντικά κυττάρων βιωσιμότητα μετά από 24 ώρες. Πιο συστηματική έρευνες για να ακολουθήσει θα μπορούσε να χρησιμοποιήσει μια ATP-ειδική δοκιμασία, όπως φωταύγεια από λουσιφερίνης-λουσιφεράσης.

Μη αναστρέψιμη ηλεκτροδιάτρησης (IRE) είναι μια διαδικασία κατά την οποία τα κύτταρα εκτίθενται σε εφαρμογή τις παραμέτρους ηλεκτρικού πεδίου αρκετά ισχυρή για να προκαλέσει μόνιμη βλάβη της κυτταρικής μεμβράνης, οδηγώντας τελικά σε διαταράσσεται ομοιόσταση ιόντων και του κυτταρικού θανάτου [14]. IRE προκαλεί αφαίρεσης ιστού με χαμηλότερη αποδοτικότητα θεραπεία στο περιθώριο του στοχευόμενου ιστού όπου η ένταση ηλεκτρικού πεδίου είναι χαμηλότερο. Η ικανότητα να επιτύχει υψηλότερες θανάτωση των κυττάρων και να προκαλέσουν αποκόλληση των ιστών όταν αυξάνεται το ηλεκτρικό πεδίο είναι το υπόβαθρο για τη χρήση IRE για τη θεραπεία του καρκίνου [13], και χρησιμοποιείται σήμερα για τη θεραπεία της νεφρικής [32], η ηπατική [33] και του παγκρέατος [34 ], και ενδεχομένως για προστάτη [35] και ενδοκρανιακών όγκων [36]. Έχουμε βρει ότι αυξάνοντας την εξωκυτταρική συγκέντρωση ασβεστίου κατά την διάρκεια ηλεκτροδιάτρησης επάγει μεγαλύτερη θανάτωση κυττάρου, πράγμα που σημαίνει ότι η προσθήκη ασβεστίου, ακόμη και σε χαμηλές δόσεις, θα μπορούσε δυνητικά να βελτιώσει τη θεραπευτική δράση του IRE σε χαμηλότερες περιοχές ένταση του στοχευόμενου ιστού, καθώς τα αποτελέσματα στον Πίνακα 1 δείχνουν . Ως εκ τούτου, η προσθήκη ασβεστίου στην διαδικασία IRE θα μπορούσε δυνητικά να αυξήσει την ακτίνα θεραπεία και την αποτελεσματικότητα.

IRE και ηλεκτροδιάτρηση χρησιμοποιείται σε συνδυασμό με χημειοθεραπευτικά φάρμακα κερδίζει γενική αναγνώριση ως μορφή θεραπείας για συμπαγείς όγκους, και χρησιμοποιείται ως παρηγορητική θεραπεία για τους ασθενείς που είναι ακατάλληλα για τη χειρουργική επέμβαση (NICE κλινική κατευθυντήρια γραμμή 446, Μάρτης 2013 [2,9-11]). ηλεκτροδιάτρησης ασβέστιο έχει αποδειχθεί συγκρίσιμη αποτελεσματικότητα με ηλεκτροχημειοθεραπεία

in vitro

[7] και βρίσκεται στο στάδιο της πρώτης μη-κατωτερότητας κλινική δοκιμή για τη θεραπεία δερματικών μεταστάσεων (ClinicalTrials.gov-ID NCT01941901). Η αποτελεσματικότητα της calium ηλεκτροδιάτρηση ως νέου τροπικότητα θεραπεία του καρκίνου είναι επίσης αντικείμενο έρευνας για τη θεραπεία των όγκων σε εσωτερικά όργανα [37,38].

Προηγούμενες μελέτες που διερευνούν ηλεκτροδιάτρηση ασβέστιο έχουν δείξει ότι η θεραπεία επηρεάζει την κυτταρική ΑΤΡ και βιωσιμότητα [ ,,,0],6]. Αυτή η μελέτη επιβεβαιώνει ότι η θεωρία του με την επίδειξη της εξάρτηση από τη δόση, και την περαιτέρω υποστηρίζει τη χρήση του ασβεστίου ως αποτελεσματική και ανέξοδη εναλλακτική λύση σε χημειοθεραπευτικά στις διαδικασίες ηλεκτροδιάτρησης.

Για τις γνώσεις μας, η σχέση μεταξύ της συγκέντρωσης του ασβεστίου και του ηλεκτρικού πεδίου στην θεραπεία ηλεκτροπόρωσης ασβεστίου των καρκινικών κυττάρων δεν έχει προηγουμένως μελετηθεί. Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η ηλεκτροδιάτρηση ασβέστιο είναι αποτελεσματική με μειωμένη ηλεκτρικά πεδία, εάν η συγκέντρωση ασβεστίου αυξάνεται. Απαιτείται περισσότερη έρευνα για να κατανοήσουμε πλήρως το πώς αυτή η νέα μέθοδος θεραπείας του καρκίνου προκαλεί κυτταρικό θάνατο και το ρόλο που εξάντλησης ΑΤΡ και διαταραχή της ομοιόστασης ασβεστίου παίζει στη θεραπευτική δράση της ηλεκτροδιάτρησης ασβεστίου.

Συμπεράσματα

Η επίδραση της ηλεκτροπόρωσης ασβεστίου επηρεάζεται από ατομικές απαντήσεις κυτταρική γραμμή και εξαρτάται τόσο από τη συγκέντρωση του ασβεστίου και πλάτος ηλεκτρικού πεδίου. Η μελέτη καταδεικνύει ότι η ηλεκτροδιάτρηση ασβέστιο μειώνει σημαντικά την κυτταρική ΑΤΡ και την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων. Τα αποτελέσματα υποστηρίζουν περαιτέρω τη χρήση των ηλεκτροδιάτρησης ασβεστίου ως θεραπευτική τροπικότητα στη θεραπεία του καρκίνου, καθώς και τη δυνατότητα της μείωσης του εφαρμοζόμενου ηλεκτρικού πεδίου σε μελλοντικές μελέτες με ηλεκτροφόρηση.

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς ευχαριστήσω Όλγα Pakhomova για την παροχή διευκολύνσεων για ρεσαζουρίνη δοκιμασία τη βιωσιμότητα, και να ευχαριστήσω τη Marianne Fregil για την παροχή άριστη τεχνική βοήθεια.