Αφηρημένο

Πρωτοβάθμια καρκίνωμα του παγκρέατος έχει δυσμενή πρόγνωση και πρότυπο στρατηγικές θεραπείας ως επί το πλείστον αποτύχει σε προχωρημένες περιπτώσεις. Ιοθεραπείας θα μπορούσε να ξεπεραστεί αυτή η αντίσταση σε τρέχουσες θεραπευτικές δυνατότητες. Ωστόσο, τα στοιχεία από κλινικές μελέτες με ογκολυτικούς ιούς, συμπεριλαμβανομένων αντιγραφόμενα αδενοϊικές (Ad) φορείς, έχουν δείξει μόνο περιορισμένη δραστικότητα εναντίον του καρκίνου του παγκρέατος και άλλα καρκινώματα. Δεδομένου του παγκρέατος καρκινώματα έχουν ένα πολύπλοκο αρχιτεκτονική του όγκου και συχνά μια ισχυρή διαμέρισμα στρωματικά που αποτελείται από μη-νεοπλασματικών κυτταρικών τύπων (κυρίως παγκρεατικά αστεροειδή κύτταρα = hPSCs) και εξωκυττάριας μήτρας, δεν είναι έκπληξη το γεγονός ότι Ad φορείς αντιγραφής σε νεοπλασματικά κύτταρα, πιθανότατα θα αποτύχει να εξαλειφθεί αυτό επιθετικό τύπο του όγκου. Επειδή ο υποδοχέας ΤΟΡβ (TGFBR) εκφράζεται και στις δύο νεοπλασματικά κύτταρα και hPSCs εμείς παρεμβάλλεται το TGFBR πεπτίδιο που στοχεύει CKS17 στην υπερμεταβλητή περιοχή 5 (HVR5) της πρωτεΐνης καψιδίου hexon με σκοπό να δημιουργήσει ένα αντιγραφικού φορέα Ad με βελτιωμένη δραστικότητα σε πολύπλοκες όγκους . Δείξαμε αυξημένη μεταγωγή των δύο παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές και των hPSCs και ενισχυμένη κυτταροτοξικότητα σε συν-καλλιέργειες των δύο τύπων κυττάρων. ανάλυση συντονισμού πλασμονίου επιφάνειας καταδείξει μειωμένη δέσμευση του παράγοντα πήξης Χ σωματίδια Ad CKS17 τροποποιημένων και

in vivo

μελέτες βιοκατανομής πραγματοποιήθηκαν σε ποντίκια έδειξε μειωμένη μεταγωγή των ηπατοκυττάρων. Ετσι, για να αυξηθεί η δραστηριότητα της αντιγραφής Ad φορείς προτείνουμε να χαλαρώσουν κυττάρου όγκου εκλεκτικότητα με γενετική hexon μεσολάβηση στόχευση στον TGFBR (ή άλλους υποδοχείς παρόντες στις δύο νεοπλασματικών και μη νεοπλασματικών κυττάρων εντός του όγκου) για να επιτρέψει την αντιγραφή επίσης στο κύτταρο στρωματικών διαμέρισμα των όγκων, ενώ η κατάργηση μεταγωγή ηπατοκυττάρων, και αυξάνοντας έτσι την ασφάλεια

Παράθεση:. Lucas Τ, Benihoud Κ, Vigant F, Schmidt αξιολόγησης της πιστοληπτικής ικανότητας, Bachem MG, Simmet T, et al. (2015) Ηεχοη Τροποποίηση για να βελτιώσει τη Δραστηριότητα ογκολυτικού Φορείς Αδενοϊού έναντι νεοπλασματικών και στρωματικά κύτταρα καρκίνου του παγκρέατος. PLoS ONE 10 (2): e0117254. doi: 10.1371 /journal.pone.0117254

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Eric J. Kremer, γαλλικό Εθνικό Κέντρο Επιστημονικής Έρευνας, Γαλλία

Ελήφθη: 14 του Νοέμβρη 2013? Αποδεκτές: 22 Δεκέμβρη 2014? Δημοσιεύθηκε: 18 του Φλεβάρη 2015

Copyright: © 2015 Lucas et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση: Το έργο υποστηρίζεται με επιχορήγηση 109.545 (σε SK και AW) από την Deutsche Krebshilfe. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνωμα του παγκρέατος ανήκει στα πιο θανατηφόρα ανθρώπινη κακοήθειες στις δυτικές χώρες με το χαμηλότερο ποσοστό επιβίωσης οποιουδήποτε καρκίνου [1,2]. Οι λόγοι είναι η ταχεία ανάπτυξη του όγκου, πρώιμη εμφάνιση μεταστάσεων, και η διάγνωση σε προχωρημένο στάδιο. Μέχρι σήμερα, η απάντηση στην τρέχουσα τυπική θεραπεία (χειρουργική επέμβαση, ακτινοθεραπεία και χημειοθεραπεία) είναι περιορισμένη. Έτσι, άλλες στρατηγικές απαιτούνται επειγόντως και γονιδιακής θεραπείας προσεγγίσεις με ιικούς φορείς μπορεί να αντιπροσωπεύουν μια νέα λεωφόρος για ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος. Οι αδενοϊικοί (Ad) φορείς έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως σε κλινικές μελέτες θεραπεία του καρκίνου. Παρά πολλά υποσχόμενων προκλινικών Ad φορείς δεδομένων που χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία των παγκρεατικών καρκίνων έχουν αποκαλύψει μόνο φτωχή κλινική αποτελεσματικότητα [3,4]. Εμπόδια εξηγεί αυτά τα απογοητευτικά αποτελέσματα περιλαμβάνουν i) η ισχυρή συκώτι τροπισμός του ανθρώπινου αδενοϊού τύπου 5 (HAdV-5? Συντομία: Ad5), ii) το σύμπλοκο μορφολογία του παγκρέατος και η χαμηλή έκφραση του πρωτογενούς υποδοχέα Ad στα κύτταρα του όγκου, και iii ) ανεπαρκή εντός του όγκου εξάπλωση των μη αντιγραφόμενος ή υπό όρους που αναπαράγει φορείς.

Λόγω της ταχείας εξέλιξης και πρώιμη έναρξη των μεταστάσεων του παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκινώματα (PDACs) ενδοφλέβια χορήγηση Ad φορείς θα πρέπει να φτάσουν διαδίδονται μεταστάσεις. Κατά τη διάρκεια της αγγειακής μεταφοράς, ωστόσο, Ad5 αλληλεπιδρά με ποικιλία κυκλοφορούντων διαλυτών παραγόντων όπως οι παράγοντες πήξης του αίματος [5-7], φυσικά αντισώματα, και συμπληρώνουν [8] με αποτέλεσμα μια ισχυρή απορρόφηση από διαφορετικούς τύπους κυττάρων του ήπατος, π.χ. ηπατοκύτταρα, τα μακροφάγα του ήπατος (κύτταρα Kupffer) [9,10], και το ήπαρ ημιτονοειδή ενδοθηλιακά κύτταρα (LSECs) [11,12]. Αν και η σειριακή σύνδεση του Ad5 στην πρωτοβάθμια CAR του υποδοχέα [13] και ανβ3 και ανβ5 ιντεγκρινών [14] είναι κρίσιμης σημασίας για την είσοδο στο κύτταρο

in vitro

, αυτές οι αλληλεπιδράσεις δεν φαίνεται να απαιτείται για την μεταγωγή ηπατοκυττάρων, τουλάχιστον σε ποντικούς [15]. Αντ ‘αυτού, αρκετές ομάδες έχουν εντοπίσει ένα διαφορετικό μηχανισμό πρόσληψης διαφήμισης που βασίζεται σε παράγοντες πήξης του αίματος [5,6,16], ιδίως παράγοντα Χ (FX), στη διαμεσολάβηση μεταγωγής των ηπατοκυττάρων [5,7]. FX δεσμεύει μέσω τομέα του Gla σε διαφορετικές υπερμεταβλητές περιοχές (HVR) των κελυφών των ιών hexon [7,16] και αλληλεπιδρά με μεμβράνη-εντοπισμένο πρωτεογλυκάνη θειικής ηπαράνης (HSPGs) [6], με τον τρόπο αυτό «γεφύρωση» του ιού στην επιφάνεια των ηπατοκυττάρων. Πρόσφατα, μια άλλη λειτουργία του FX σύνδεσης προς σωματίδια Ad έχει περιγραφεί, που δείχνουν ότι η FX προστατεύει τα σωματίδια Ad από επίθεση με το κλασικό μονοπάτι του συμπληρώματος, επιτρέποντας συκώτι μεταγωγής [17]. Εκτός από FX, ένας άλλος μηχανισμός πρόσληψης έχει ταυτοποιηθεί. Αρκετές ομάδες έχουν δείξει την πρόσληψη και την εκκαθάριση των σωματιδίων διαφημίσεων από το αίμα από τα κύτταρα Kupffer (και LSEC) από τους υποδοχείς οδοκαθαριστής, φυσικά αντισώματα και συμπληρώνουν [8,18,12].

παγκρέατος καρκινώματα-όπως και τα άλλα καρκινώματα, έχουν πολύπλοκη σύνθεση των ιστών. Εκτός νεοπλασματικά κύτταρα, τα στρωματικά συστατικά που βρίσκονται εντός του όγκου που περιλαμβάνει μη νεοπλασματικές τύπους κυττάρων συμπεριλαμβανομένων στρωματικά κύτταρα, ενδοθηλιακά κύτταρα και μακροφάγα, και εξωκυτταρική μήτρα (ECM) συστατικά (π.χ. κολλαγόνα, ινονηκτίνες). Σε πολλές περιπτώσεις, τα καρκινικά κύτταρα αντιπροσωπεύουν ένα μικρό συνεισφορά στο κυτταρικό μάζα εντός του όγκου. Συχνά, τα στρωματικά κύτταρα και η ECM εσωκλείουν εντελώς φωλιές των κυττάρων του όγκου. Αυτή η σφιχτή φυσικού φραγμού που σχηματίζεται από το στρώμα μπορεί να αποτρέψει την τρέχουσα Ad φορείς (στόχευση σε καρκινικά κύτταρα μόνο) για τη μεταγωγή παρακείμενες περιοχές των καρκινικών κυττάρων και να εξαπλωθεί σε όλο τον όγκο. Στρωματικά κύτταρα των παγκρεατικών καρκινωμάτων που έχουν χαρακτηριστεί ως ενεργοποιημένα παγκρέατος αστεροειδή κύτταρα (ΚΕΕ) – διαδραματίζουν κεντρικό ρόλο στην ανάπτυξη του όγκου και desmoplasia. Στα ποντίκια, συν-ένεση καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος και των ανθρωπίνων ΚΕΕ (hPSCs) έχει αποδειχθεί ότι οδηγεί σε επιτάχυνση της αύξησης του όγκου τονίζοντας τη σημασία της hPSCs στον καρκίνο του παγκρέατος [19,20].

Μια σύνθετη αλληλεπίδραση μεταξύ του καρκίνου κύτταρα και μη νεοπλασματικά ΚΕΕ ενορχηστρώνεται μέσω έκκριση διαφόρων αυξητικών παραγόντων συμπεριλαμβανομένων αυξητικός παράγοντας μετασχηματισμού βήτα (ΤΟΡβ). Συνεπώς, οι περισσότερες κυτταρικές γραμμές καρκίνου του παγκρέατος εκφράζουν φυσιολογικά ή ακόμη και υψηλά επίπεδα τύπου II υποδοχέα ΤΟΡβ (TGFBRII) [21-23], και η ανάλυση των PDACs αποκάλυψε αυξημένη έκφραση TGFBRII συγκριτικά με φυσιολογικό ιστό του παγκρέατος [24,25]. Λόγω της έκφρασης χαμηλή CAR (υποδοχέας Ad5) σε παγκρεατικά καρκινώματα ή άλλες κακοήθειες [26-28], TGFBRII θα μπορούσε να είναι ένας στόχος υποψήφιος υποδοχέας να ξεπεράσει περιορισμένη μεταγωγή του όγκου με Ad φορείς.

Για την πλήρη καταστροφή του όγκου αποτελεσματική διάδοση του Ad5 φορέων εντός του ιστού του όγκου είναι απαραίτητη. Κατ ‘αρχήν, διασποράς εντός του όγκου μπορεί να επιτευχθεί με τη χρήση αντιγραφόμενο (ογκολυτική) Ad φορείς. Σε σύγκριση με ελλιπούς αναδιπλασιασμού, διαγραφή Ε1 (ΔΕ1) Ad φορείς, ογκολυτικοί φορείς μπορούν να αναπαραχθούν και να καταστρέψουν τα καρκινικά κύτταρα με την απελευθέρωση ιοσωμάτια απογόνους οι οποίοι είναι ικανοί να μολύνουν γειτονικά κύτταρα μέχρι-ιδανικά-η όλη όγκος καταστρέφεται. Για λόγους ασφάλειας, η αντιγραφή του ογκολυτικού Ad φορείς, σε γενικές γραμμές, είναι συνήθως περιορίζεται σε καρκινικά κύτταρα, είτε με τη χρήση του ιστού προαγωγούς /όγκου-ειδικά για τον έλεγχο της έκφρασης Ε1Α, ή με εισαγωγή μεταλλάξεων εντός Ε1Α ή /και Ε1Β, το τελευταίο κατ ‘αρχήν, η απενεργοποίηση αντιγραφή του ιού σε μη νεοπλασματικά κυτταρικούς τύπους. Λαμβάνοντας υπόψη την πολύπλοκη σύνθεση των παγκρεατικών όγκων (όπως περιγράφεται παραπάνω), όπως σχεδιασμό του φορέα, ωστόσο, θα απίθανο αποτέλεσμα την εξάλειψη των καρκινωμάτων.

Προς Στόχος μας είναι να δημιουργήσει ένα ογκολυτικού φορέα Ad5 επαναστοχοθετημένα από τα ηπατοκύτταρα να διαδίδονται καρκινικούς ιστούς , αντικαταστήσαμε το υπερμεταβλητή περιοχή 5 (HVR5) του hexon (εμπλέκεται στη σύνδεση FX και μεταγωγή ηπατοκυττάρων) με το συνθετικό πεπτίδιο στόχευσης CKS17, το οποίο είναι ομόλογο με ένα διατηρημένο πεδίο βρεθεί σε ρετροϊικές πρωτεΐνες φακέλου [29-31]. Ενδιαφέρον για τη στόχευση τόσο κύτταρα και ΚΕΕ παγκρεατικό καρκίνωμα, το CKS17 δεκαεπταπεπτίδιο περιέχει ένα υποθετικό ΤΟΡβ ενεργού θέσεως μοτίβο [32], η οποία μεσολαβεί στη δέσμευση σε TGFBRII οποίο ρυθμίζεται αυξητικά στην πλειοψηφία των καρκινωμάτων του παγκρέατος. Πράγματι, διαπιστώσαμε ότι CKS17-τροποποιημένους φορείς Ad θα μπορούσε να χρησιμοποιήσει ένα TGFBRII εξαρτώμενη μηχανισμός εισόδου κύτταρο για την μεταγωγή CAR-αρνητικά τον καρκίνο του παγκρέατος και συστοιχίες hPSCs, με αποτέλεσμα μια αυξημένη κυτταρολυτική αποτελεσματικότητα

in vitro

. Επιπλέον, η αντικατάσταση της hexon HVR5 με CKS17 μειωμένη σύνδεση με FX και οδήγησε σε μειωμένη πρόσληψη του φορέα σε ηπατοκύτταρα

in vivo

σε ποντίκια.

Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι Ad5 φορείς με μειωμένη τροπισμό ηπατοκυττάρων και αυξημένη στόχευση σε διαφορετικούς τύπους κυττάρων εντός του όγκου, ιδιαίτερα του καρκίνου και στρωματικά κύτταρα-ίσως ξεπεραστούν ορισμένα από τα κύρια εμπόδια (σημαντική μεταγωγή ηπατοκυττάρων, αναποτελεσματική μεταγωγή των κυττάρων στόχων και της περιορισμένης ενδοογκική εξαπλώνεται λόγω της πολύπλοκης δομής του όγκου) για την αποδοτική στόχευση του όγκου και την καταστροφή των παγκρεατικών καρκίνων.

Υλικά και Μέθοδοι

οι κυτταρικές σειρές

κύτταρα N52.E6 βασίζονται σε ανθρώπινες αμνιοκύτταρα σταθερά μετασχηματισμένα με Ε1Α και Ε1Β του Ad5) [33] και καλλιεργήθηκαν σε μέσο α-ΜΕΜ (Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Γερμανία) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FCS) και 2 mM γλουταμίνη (Glutamax? Gibco). Η Α549 κυτταρική γραμμή είναι μία ανθρώπινη αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα επιθηλιακή κυτταρική γραμμή που ελήφθη από την American Type Culture Collection (ATCC Νο CCL-243). Α549 κύτταρα διατηρήθηκαν σε μέσο ΜΕΜ (Gibco) συμπληρωμένο με 10% FCS και 2 mM γλουταμίνη. Ιδρύθηκε ανθρώπινη παγκρεατική κυτταρικές γραμμές όγκου PANC1 (ATCC Νο CRL-1469), και MiaPaCa (ATCC Νο 1420), και η πρώιμη ανθρώπινη παγκρεατική κυτταρική γραμμή όγκου UlaPaCa [34] καλλιεργήθηκαν σε DMEM /F12 media Ham’s (ΡΑΑ, GE Healthcare, Coelbe, Germany) συμπληρωμένο με 10% FCS και 2 mM γλουταμίνη. Πρωτογενή ανθρώπινα παγκρεατικά αστεροειδή κύτταρα (HPSC), που απομονώνονται όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19,35], διατηρήθηκαν σε DMEM /F12 media Ham’s συμπληρωμένο με 20% FCS και 2 mM γλουταμίνη. Η ωοθήκη κινέζικου χάμστερ Κ1 (CHOK1, ATCC Νο CCL-61) κυτταρική γραμμή που έχει έλλειψη του υποδοχέα coxsackie και αδενοϊού (CAR) αναπτύχθηκε σε μέσο DMEM συμπληρωμένο με 10% FCS και 2 mM γλουταμίνη. Η μυϊκή κυτταρική σειρά μακροφάγων RAW 264.7 (ATCC Νο CRL-2278) καλλιεργήθηκε σε RMPI-1640 (Gibco) συμπληρωμένο με 10% FCS και 2 mM γλουταμίνη. Οι κυτταρικές σειρές αναπτύχθηκαν υπό πρότυπες συνθήκες στους 37 ° C, 95% υγρασία και 5% CO

2.

Ιοί και αδενοϊικοί φορείς

Όλοι οι φορείς που προέρχονται από HAdV-5 (σύντομη : Ad5). Ad1stGFP είναι ένας φορέας ΔΕ1 Ad5 περιγράφηκε προηγουμένως [36]. AdGFPhCKS17 και AdGFPhWt είναι ΔΕ1 /Ε3 Ad φορείς. Και οι τρεις φορείς εκφράζουν GFP υπό τον έλεγχο ενός άμεσου πρώιμου υποκινητή hCMV στη θέση της περιοχής Ε1. Επιπλέον, AdGFPhCKS17 έχει hexon τροποποιείται με αντικατάσταση 13 αμινοξέα της υπερμεταβλητής περιοχής 5 (HVR5) που αντιστοιχούν σε αλληλουχίες Ad5 νουκλεοτίδιο (nt.) 19.645 έως 19.684 (η αρίθμηση είναι σύμφωνα με την ακολουθία HAdV-5 από τον αριθμό πρόσβασης GenBank AC_000008) με το συνθετικό πεπτίδιο ρετροϊικό CKS17 [37] που πλαισιώνεται από επιπλέον αμινοξέα που εξυπηρετούν ως διαχωριστικό για καλύτερη απεικόνιση πεπτίδιο [38]. Η αλληλουχία που κωδικοποιεί του πεπτιδίου CKS17 χρησιμοποιείται σε αυτή την εργασία πλευρίζεται από βραχείες αλληλουχίες που κωδικοποιούν την περιοχή διαχωρισμού (μικρά γράμματα) και παρακείμενες αλληλουχίες Ad5 (υπογραμμισμένες): CAAGTGGAAATGCAATTTTTCTCGgggTTACAGAATCGTAGAGGCCTAGATCTACTATTCCTAAAAGAGGGAGGTTTGctgggcgggCCTAAGGTGGTATTGTACAGT. Για την παραγωγή διάνυσμα όλοι οι φορείς ΔΕ1 και ΔΕ1 /Ε3 διαφήμισης παρήχθησαν σε κύτταρα N52.E6.

Ο φορέας ικανός αντιγραφής AdhCKS17 (είναι άγριου τύπου για Ad5 Ε1) φέρει το ίδιο hexon-τροποποίηση ως μη αντιγραφικό ομόλογό του AdGFPhCKS17. AdhCKS17 και ο φορέας ελέγχου hexon-μη τροποποιημένο (AdhWt) δημιουργήθηκαν με την εισαγωγή της περιοχής Ad5 Ε1 και για AdhCKS17 την κωδικεύουσα αλληλουχία νουκλεοτιδίων πεπτιδίου CKS17 στο bacmid pBelo-pGS66 βασίζεται σε pGS66 [33] με ομόλογο ανασυνδυασμό (Gene Bridges, Χαϊδελβέργη, Γερμανία ), ακολουθούμενη από τον φορέα αναγέννηση από bacmid. Ανθρώπινα Ad5 ιό άγριου τύπου (Ad5Wt? Ευγενώς από τον Albert Heim, Ιατρική Σχολή του Ανόβερου, Ανόβερο, Γερμανία), AdhWt και AdhCKS17 πολλαπλασιάστηκαν σε κύτταρα Α549

Όλοι οι φορείς καθαρίστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [39] από. μία διαβάθμιση βήμα πυκνότητας CsCl ακολουθούμενη από μία συνεχή κλίση πυκνότητας ΟδΟΙ. Οι φορείς αφαλατώθηκαν με μία Ρϋ-10 στήλη αποκλεισμού μεγέθους (GE Healthcare, Dassel, Germany) και φυλάχθηκαν στους -80 ° C σε PBS συμπληρωμένο με 10% (ν /ν) γλυκερόλη. Μετά τον καθαρισμό διάνυσμα ο φορέας DNA απομονώθηκε από τα σωματίδια φορέα με το QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) όπως περιγράφεται από τον manufacturer`s πρωτόκολλο και επαληθεύεται με περιοριστική ανάλυση και μερικό προσδιορισμό της αλληλουχίας. Μολυσματικές και σωματίδιο τίτλοι φορέα προσδιορίσθηκαν με ανάλυση DNA κηλίδος σχισμής [40] χρησιμοποιώντας ένα Ad5 ίνα-ειδικό ανιχνευτή που περιλαμβάνει nt. 31042 με 32390 της αλληλουχίας Ad5. Η αντίστροφη βιοδραστικότητα υπολογίστηκε διαιρώντας τον αριθμό των φυσικών από τον αριθμό των μολυσματικών σωματιδίων.

Ad φορέα μεταγωγή

in vitro

Η

2×10

4 hPSCs ή 2×10 κύτταρα

5 όγκων σπάρθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων. Περίπου 16 ώρες αργότερα τα κύτταρα μετάγονται με ΔΕ1 GFP που εκφράζουν Ad5 φορείς (Ad1stGFP, AdGFPhCKS17 ή AdGFPhWt) στην υποδεικνυόμενη πολλαπλότητα μόλυνσης (ΜΟΙ) της φυσικής σωματιδίων (PMOI) ή μολυσματικών σωματιδίων (iMOI) ανά κύτταρο.

Για την αξιολόγηση των κυττάρων έκφρασης GFP φορέα με τη μεσολάβηση αποκολλήθηκαν από τις πλάκες καλλιέργειας 24 ώρες μετά την μεταγωγή χρησιμοποιώντας ένα προθερμασμένο διάλυμα θρυψίνης (Gibco). Μετά την προσθήκη του PBS που περιέχει 20 mM EDTA και 10% (ν /ν) FCS (προς απενεργοποίηση τρυψίνης) και φυγοκέντρηση σε 300 g για 5 λεπτά, τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό FACS που περιείχε 2% (ν /ν) FCS, 20 mM EDTA σε PBS. Τα κύτταρα αξιολογήθηκαν με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής χρησιμοποιώντας ένα Becton-Dickinson FACSCalibur χωρίς gating (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής). Σχετική μονάδες μεταγωγής αναφέρονται στο ποσοστό των GFP-θετικών κυττάρων ή την μέση τιμή φθορισμού όλων των κυττάρων. Για να προσδιοριστεί η σχετική περιεκτικότητα γονιδίωμα Ad μέσα στα κύτταρα, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με προθερμανθέν PBS για 5 λεπτά 2 ώρες μετά την μεταγωγή και στην συνέχεια αποσπάται με 200 μΙ 50 mM EDTA σε PBS. Μετά την προσθήκη 200 μΐ 0.8 Ν ΝαΟΗ για λύση των κυττάρων, λύματα κυττάρων υποβλήθηκαν σε ανάλυση DNA κηλίδος σχισμής [40]. Σχετική περιεχόμενο γονιδίωμα Ad φορέα εκφράζεται ως σχετικές μονάδες μεταγωγής υπολογίστηκαν και στο 100% για τα κύτταρα Α549 σε μεταγωγή με φορέα Ad έξον-όχι.

αντιγραφής AdWt

in vitro

Η

1×10

6 καρκινικά κύτταρα ανά 6 cm τρυβλίου σπάρθηκαν την ημέρα πριν μολύνθηκαν με Ad5Wt σε κηλίδα σχισμής ρυθμίστηκε ΜΟΙ 1. Δύο και 48 ώρες μετά τη μόλυνση τα κύτταρα πλύθηκαν με προθερμανθέν PBS και αποκολλήθηκαν με κατεργασία τρυψίνης. Μετά την αδρανοποίηση της θρυψίνης με τα κύτταρα σφαιροποιήθηκαν FCS (300 χ g, 5 min, 4 ° C) και πλύθηκε με 1 ml PBS. Μετά από μια άλλη στάδιο φυγοκέντρησης (300 χ g, 5 min, 4 ° C) κάθε κυτταρικό σφαιρίδιο επαναιωρήθηκε σε 200 μΙ PBS και το συνολικό DNA απομονώθηκε με τη QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Δύο μικρογραμμάρια DNA υποβλήθηκαν σε ανάλυση κηλίδος σχισμής χρησιμοποιώντας μια Ad5 ίνα-ειδικό ανιχνευτή. αντιγραφής Ad υπολογίστηκε από την αναλογία των περιεχομένων γονιδιώματος Ad ελήφθησαν στις 48 και 2 ώρες μετά τη μόλυνση και ρυθμιστεί στο 100% για Ad5Wt-μολυσμένα κύτταρα Α549.

Παραγωγή μολυσματικών σωματιδίων διαφημίσεων

in vitro

1×10

6 καρκινικά κύτταρα ανά 6 cm τρυβλίου σπάρθηκαν την ημέρα πριν μολύνθηκαν με Ad5Wt σε κηλίδα σχισμής ρυθμίστηκε ΜΟΙ 1. Σαράντα οκτώ ώρες μετά τη μόλυνση τα κύτταρα πλύθηκαν με προθερμανθέν PBS και αποκολλήθηκαν με κατεργασία τρυψίνης . Μετά την αδρανοποίηση της θρυψίνης με τα κύτταρα σφαιροποιήθηκαν FCS (300 χ g, 5 min, 4 ° C) και πλύθηκε με 1 ml PBS. Μετά από μια άλλη στάδιο φυγοκέντρησης (300 χ g, 5 min, 4 ° C) κάθε κυτταρικό ίζημα πάλι επαναιωρήθηκε σε 1 ml PBS. Τα κύτταρα στη συνέχεια διασπάστηκαν με επανειλημμένη κατάψυξη και απόψυξη, και προϊόντα λύσης διαυγάστηκαν με φυγοκέντρηση (1800 χ g, 5 min, 4 ° C). Για να αφαιρέσετε και νοούνται αδενοϊικών γονιδιωμάτων, κυτταρικού DNA και RNA, προϊόντα λύσης υποβλήθηκαν σε αγωγή με 5 μονάδες ενδονουκλεάσης Benzonase (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Γερμανία) και επωάστηκαν στους 37 ° C για 30 λεπτά. Δύο και 10 μικρολίτρα του λύματος χρησιμοποιήθηκαν για την επαναμόλυνση 2×10

5 κύτταρα Α549 σπάρθηκαν την ημέρα πριν. Δύο ώρες μετά την επαναμόλυνση, τα κύτταρα Α549 πλένονται δύο φορές με προθερμανθέν PBS. Στη συνέχεια, τα κύτταρα αποκολλήθηκαν με 50 mM EDTA σε PBS και λύθηκαν με 0.4 Ν ΝαΟΗ. Ο αριθμός των μολυσματικών σωματιδίων προσδιορίστηκε με ανάλυση DNA κηλίδος σχισμής [40] χρησιμοποιώντας ένα ίνα-ειδικό ανιχνευτή Ad5 και ο αριθμός των μολυσματικών σωματιδίων ανά κύτταρο όγκου υπολογίστηκε.

έκφραση CAR επί παγκρεατικών κυττάρων

5×10

4 hPSCs και 5×10

5 καρκινικά κύτταρα σπάρθηκαν την ημέρα πριν πλύθηκαν με PBS και αποκολλήθηκαν με θρυψίνη. Μετά από θρυψίνη αδρανοποίηση με FCS, τα κύτταρα ιζηματοποιήθηκαν (300 χ g, 5 min, 4 ° C) και πλένεται με 1 ml ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης (παγωμένο PBS που περιέχει 5% (ν /ν) FCS). Μετά από φυγοκέντρηση το υπερκείμενο αναρροφήθηκε, πρωτεύον αντίσωμα αντι-CAR (1 μg ανά δείγμα, rMCB κλώνος? Millipore, Schwalbach, Γερμανία) προστέθηκε και επωάστηκε για 30 λεπτά σε πάγο. Τα κύτταρα πλύθηκαν και πάλι και επωάστηκαν με το δευτερογενές αντίσωμα, Alexa 488, F (ab ‘)

2 θραύσμα (1 μg ανά δείγμα? Invitrogen, Darmstadt, Γερμανία), για 30 λεπτά σε πάγο. Ως έλεγχος χρησίμευσε κύτταρα, τα οποία χρωματίστηκαν με μόνο το δευτερογενές αντίσωμα. Μετά από άλλα κύτταρα βήμα πλύσης επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό πλύσης και υποβλήθηκαν σε ανάλυση κυτταρομετρίας ροής για τον προσδιορισμό της έκφρασης CAR υπολογίζεται από τη μέση ένταση φθορισμού όλων των κυττάρων.

επίπεδα σταθερής κατάστασης των TGFBRII στα παγκρεατικά κύτταρα

παγκρέατος hPSCs και καρκινικά κύτταρα λύθηκαν σε ΝΡ40 ρυθμιστικό λύσης (50 mM Tris /HCl, ρΗ 8,0, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.15% (w /v) Nonidet Ρ-40) με την παρουσία του πλήρους κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Roche, Penzberg, Γερμανία) και 1 mM PMSF επί 1 ώρα επί πάγου. Μετά επανειλημμένη κατάψυξη και απόψυξη των κυττάρων υπολείμματα δισκιοποιούνται (21,000 χ g, 15 λεπτά, 4 ° C). Η συγκέντρωση πρωτεΐνης του υπερκειμένου λύματος προσδιορίστηκε (δοκιμασία πρωτείνης Bio-Rad? Biorad, Μόναχο, Γερμανία). Πενήντα μα των προϊόντων λύσης αναλύθηκαν με 8% SDS-PAGE και ανοσοκηλίδωση. TGFBRII ανιχνεύθηκε με αντι-TGFBRII-ειδικό πολυκλωνικό αντίσωμα από κουνέλι (SC-1700? Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Germany). Το μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού DM1A από την Sigma-Adrich (Taufkirchen, Γερμανία) χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση του α-τουμπουλίνης χρησιμεύει ως έλεγχος φόρτωσης.

Ανταγωνιστικές ιός δοκιμασίες μεταγωγής

Για να επιδειχθεί ένα αλλαγμένο κελί μονοπάτι εισόδου ενός εξονίου-τροποποιημένο φορέα Ad CKS17, μονοστοιβάδες κυττάρων Α549 προκατεργάστηκαν με διαλυτές πόμολο ινών (ευγενώς από τον Pierre Boulanger, Université Λυών, Λυών, Γαλλία) σε 1000 φορές μοριακή περίσσεια έναντι της πρωτεΐνης ίνας ή με ένα πολυκλωνικό αντι-TGFBRII αντισώματος από κουνέλι (SC-1700? Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Germany) σε 1000 φορές μοριακή περίσσεια έναντι της πρωτεΐνης hexon για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Ως έλεγχος ισοτύπου για αντι-TGFBRII αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε ο ίδιος όγκος ορού κουνελιού. AdGFPhCKS17 και ο φορέας ελέγχου προστέθηκαν σε μια PMOI 100 χωρίς απομάκρυνση των competitiors. Μετά από επώαση για 1,5 ώρες επώασης σε θερμοκρασία δωματίου τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με μέσο καλλιέργειας για να απομακρυνθούν οι παραμένοντες ιούς και ανταγωνιστές. Στη συνέχεια, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C για επιπλέον 2 ώρες για να καθοριστούν τα επίπεδα γονιδίωμα Ad από απομονωμένο ολικό DNA από qPCR ή για 24 ώρες για την αξιολόγηση της έκφρασης GFP (εκφράζονται ως ο μέσος φθορισμός όλων) με κυτταρομετρία ροής.

Απελευθέρωση απόγονοι

1×10

6 hPSCs ή 2.5×10

6 Α549, PANC1 ή UlaPaCa κύτταρα σπάρθηκαν την ημέρα πριν από πλένονται μία φορά με PBS. Μετά την προσθήκη του μέσου και αναπαράγει Ad φορείς (AdhWt ή AdhCKS17) σε ένα μολυσματικό ΜΟΙ 20, τα κύτταρα επωάστηκαν για 6 ώρες στους 37 ° C. Στη συνέχεια, το μέσο που περιέχει Ad φορείς απομακρύνθηκε και τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές πριν από φρέσκο ​​μέσο προστέθηκε στα κύτταρα. Δείγματα του μέσου ελήφθησαν στις 48 και 72 ώρες μετά τη μόλυνση, φυγοκεντρήθηκαν για την απομάκρυνση κυττάρων, αναμιγνύεται με γλυκερόλη (για να ληφθεί μια τελική συγκέντρωση 10% γλυκερόλης) και φυλάσσεται στους -80 ° C. Στις 72 ώρες μετά τη μόλυνση, τα κύτταρα αποξέστηκαν στο υπόλοιπο μέσο και αποθηκεύεται επίσης στους -80 ° C.

Για τις επόμενες ποσοτική ανάλυση PCR του απελευθερώνονται σωματίδια Ad στο μέσο DNA απομονώθηκε από τα δείγματα που ελήφθησαν μέσον 48 και 72 ώρες μετά τη μόλυνση με τη χρήση κιτ GenElute ™ Mammalian Γονιδιωματικό DNA Miniprep (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Γερμανία). Ποσοτική PCR ανάλυση διεξήχθη με ενίσχυση του γονιδίου Ad5 Ε4 χρησιμοποιώντας το Stratagene 2 × Brilliant II SYBR Green QRT-PCR Master Mix Kit, 1-βαθμίδας σε μια μηχανή Stratagene 3005P qPCR. Για τη δημιουργία μιας πρότυπης καμπύλης, μέσον εμπλουτίστηκε με 1×10

8 σωματίδια AdhWt και σειριακά αραιωμένο. Ολιγονουκλεοτίδια: Ε4-νόημα (5′-tagacgatccctactgtacg -3 ‘), Ε4-αντινόημα (5′- ggaaatatgactacgtccgg -3’). Σαράντα κύκλοι με το ακόλουθο θερμικό πρωτόκολλο διεξήχθησαν: τήξη (95 ° C? 30 δευτερόλεπτα), αναδιάταξη (60 ° C? 30 δευτερόλεπτα), και επιμήκυνσης (72 ° C? 30 δευτερόλεπτα). Για την ανάλυση, ο αριθμός των αντιγράφων Ε4 προσδιορίστηκε με Ε4 Ct (DR) αξίες και την πρότυπη καμπύλη και αναφέρονται στους αριθμούς των κυττάρων σπάρθηκε.

Ο αριθμός των μολυσματικών σωματιδίων που απελευθερώνεται εντός του μέσου στις 48 και 72 ώρες μετά μόλυνση και μέσα στα κύτταρα και το μέσο συλλέγονται στις 72 ώρες προσδιορίστηκε με πλάκα δοκιμασίας. Κύτταρα συλλέγονται μαζί με μέσο διασπάστηκαν με επανειλημμένη κατάψυξη και απόψυξη όπως περιγράφεται παραπάνω. Για να απομακρυνθούν τα κυτταρικά υπολείμματα, τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν στα 400 χ g για 10 λεπτά και τα υπερκείμενα μεταφέρθηκαν σε φρέσκους σωλήνες. Το μέσο που λαμβάνονται σε δεικνυόμενα χρονικά σημεία χρησιμοποιήθηκε απευθείας σε αυτή τη δοκιμασία. Διαδοχικές αραιώσεις των υπερκειμένων και του μέσου χρησιμοποιήθηκαν για να μολύνουν κύτταρα Α549 που σπάρθηκαν σε μια σειρά από 7.5×10

5 κύτταρα που την προηγούμενη ημέρα. Ένα 5% (w /v) PeqGold διάλυμα αγαρόζης χαμηλού σημείου τήξεως (σε διάλυση σε PBS και σε αυτόκαυστο) ήταν 1: 4 αραιωμένο με θρεπτικό μέσο που περιείχε 2% ορό και διατηρήθηκαν στους 37 ° C. Μετά από 2 ώρες το μέσο που περιέχει ιό αναρροφήθηκε προσεκτικά και τα κύτταρα επικαλύφθηκαν με προθερμασμένο (37 ° C) 1,25% (/ν ν) διάλυμα αγαρόζης. Μετά από 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου ώστε να επιτραπεί η αγαρόζη να στερεοποιηθεί, τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C. Ο αριθμός των πλακών μετρήθηκε 10 ημέρες μετά τη μόλυνση.

Κυτταρική βιωσιμότητα δοκιμασία

Η κυτταρολυτική ενεργότητα του φορέα hexon τροποποιημένου αναλύθηκε σε δύο μονά και συν-καλλιέργειες των καρκινικών κυττάρων και hPSCs. Έτσι, 2 x10

3 κύτταρα σε καλλιέργειες μόνο κύτταρο σε πλάκες 96-φρεατίων ανά φρεάτιο και κάθε 1 x10

3 των καρκινικών κυττάρων και hPSCs σε συν-καλλιέργειες σπάρθηκαν την ημέρα πριν από μετήχθησαν με AdhCKS17 και τον έλεγχο AdhWt, αντίστοιχα, σε διαφορετικά σωματιδίου ΜΟΙ που κυμαίνονται από 1 έως 1000. Επτά ημέρες μετά τη μόλυνση, η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε σύμφωνα με την του κατασκευαστή, καθώς πρωτόκολλο με τη χρήση του συστήματος κυττάρων TiterGlo (Promega, Mannheim, Germany).

SPR ανάλυση

Για να αναλυθούν οι αλληλεπιδράσεις των εξονίου-τροποποιημένα (AdGFPhCKS17) και η εξονίου-μη τροποποιημένο ελέγχου (AdGFPhWt) φορέων με παράγοντα Χ (FX) επιφανειακών πλασμονίων πειράματα (SPR) διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας ένα όργανο Reichert SR7500DC SPR (Reichert Technologies, Μπάφαλο, Νέα Υόρκη, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερική). Ανθρώπινα πήξης FX (Αιματολογικές Technologies, Essex Junction, Βερμόντ, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής) ακινητοποιήθηκε ομοιοπολικά πάνω σε ένα κελί ροής ενός (καρβοξυ υδρογέλη βιοαισθητήρα τσιπ (CMD500m τσιπ που αγοράζονται από XanTec Βιολογική ανάλυση GmbH, Duesseldorf, Γερμανία)) με σύζευξη αμίνης σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Πρότυπη σύζευξη αμίνη σε απουσία οποιασδήποτε πρωτεΐνης (εικονική σύζευξη) διεξήχθη σε ένα δεύτερο κύτταρο ροής αποδίδοντας ένα κύτταρο ροής αναφοράς. Σήματα που λαμβάνεται για το FX-επιφάνεια αφαιρέθηκαν από τα σήματα που λαμβάνονται για την κυτταρική ροή αναφοράς σύμφωνα με την τυπική διαδικασία. Μόνο διαγραμμάτων αισθητήρα αναφοράς αφαιρείται δείξει. Απομάκρυνση της γλυκερόλης από διαλύματα αποθέματος ιού και την ανταλλαγή ρυθμιστικού σε 10 mM HEPES ρΗ 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM ΟαΟ

2, και 0,005% Tween 20 επιτεύχθηκε με διήθηση πηκτής χρησιμοποιώντας PD MiniTrap G-25 στήλες (GE Healthcare , Dassel, Germany). Φορείς αραιώθηκαν με το ίδιο ρυθμιστικό για να ληφθεί συγκεντρώσεις που κυμαίνονται από 1.25×10

8 έως 1×10

9 φυσικά σωματίδια ανά κυβικό εκατοστό πέρασαν πάνω από το τσιπ για 3 λεπτά σε ένα ρυθμό ροής 25 μΐ /λεπτό. Η φάση διάστασης αποτελείτο από ροής ρυθμιστικού διαλύματος σε 25 μΙ /λεπτό για 5 λεπτά και ακολουθείται από ένα στάδιο αναγεννήσεως με ρυθμιστικό αναγέννησης (10 mM HEPES (ρΗ 7,4), 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, και 0,005% Tween 20), η οποία εγχύθηκε για 50 s σε ένα ρυθμό ροής των 25 μl /min.

FX-εξαρτώμενη μεταγωγή

για να διερευνηθεί η επίδραση της τροποποίησης hexon σε αλληλεπίδραση με FX οι FX-εξαρτώμενη ποσοστά μεταγωγή του CKS17 εξονίου-τροποποιημένα Ad φορέα αναλύθηκαν. Ως εκ τούτου, 2×10

4 Α549 κύτταρα εντατικά πλύθηκαν δύο φορές με PBS μία ημέρα μετά τη σπορά. Στη συνέχεια, τα κύτταρα έλαβαν είτε μέσο άνευ ορού (έλεγχος) ή χωρίς ορό μέσο που περιέχει 8 μg /ml FX (φυσιολογική συγκέντρωση). Ad φορείς με ένα σωματίδιο ΜΟΙ (PMOI) του 1000 προστέθηκαν στα κύτταρα. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν για 3 ώρες στους 37 ° C και πλύθηκαν τρεις φορές με PBS. Μετά την προσθήκη του μέσου κυτταρικής καλλιέργειας που περιέχει ορό, τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C για 24 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα συλλέχθηκαν όπως περιγράφεται ανωτέρω και η έκφραση GFP αναλύθηκε με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής.

In vivo βιοκατανομή

Για να διερευνηθεί η επίδραση της μειωμένης FX πρόσδεσης του hexon -τροποποιημένης Ad φορέα AdGFPhCKS17

in vivo

, μια μελέτη βιοκατανομής σε ποντίκια έγινε. Θηλυκά ποντίκια BALB /c (ηλικίας 6 έως 8 εβδομάδων) αγοράστηκαν από την Charles River, Sulzfeld, Γερμανία. Όλα τα πειράματα σε ζώα εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Φροντίδας Ζώων της κυβέρνησης της Βάδης-Βυρτεμβέργης (Αριθμός Άδειας: 975) και ήταν αυστηρά σύμφωνα με τις οδηγίες του ιδρύματος. Clodronate ήταν ένα δώρο από τη Roche Diagnostics GmbH (Mannheim, Γερμανία). Ήταν έγκλειστα σε lipsosomes όπως περιγράφηκε προηγουμένως [41]. Για εξάντληση των κυττάρων Kupffer, 200 μΙ clodronate λιποσωμάτων εγχύθηκε στη φλέβα της ουράς. Μετά από 24 ώρες, τα σωματίδια φορέα διαφήμισης (3 x10

10) εγχύθηκαν ενδοφλεβίως εντός της φλέβας της ουράς των ποντικών σε ένα συνολικό όγκο 200 μΙ (σε αλατούχο ρυθμιστικό διάλυμα HEPES). Σαράντα-πέντε λεπτά ή 72 ώρες μετά την ένεση οι ποντικοί αναισθητοποιήθηκαν με ισοφλουράνιο (Forene? Abbott, Ludwigshafen, Γερμανία) εισπνοής, ήπατα διαποτίστηκαν με PBS, και τα όργανα συλλέχθηκαν. Στη συνέχεια, οι ποντικοί θυσιάστηκαν με διμερείς θωρακοτομή. Στη συνέχεια, τα όργανα καταψύχθηκαν ακαριαία σε υγρό άζωτο και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C για μετέπειτα απομόνωση DNA (ανάλυση qPCR) ή ομογενοποίηση (φθορομετρική ανάλυση).

ποσοτική PCR αναλύσεις

ποσοτική PCR ανάλυση πραγματοποιήθηκε με ενίσχυση του γονιδίου ίνας Ad5 χρησιμοποιώντας το Stratagene 2 × Brilliant II SYBR Green QRT-PCR Master Mix Kit, 1-βαθμίδας σε μια μηχανή Stratagene 3005P qPCR. Για την κανονικοποίηση της κυτταρικής μυοειδούς περιεχόμενο DNA ή ανθρώπου β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε. Για να δημιουργήσετε πρότυπες καμπύλες, συκώτι DNA του παρθένα ποντίκια (μελέτη βιοκατανομής) ή γονιδιωματικό DNA που απομονώθηκε από ανθρώπινα κύτταρα Α549 (πείραμα ανταγωνισμού) εμπλουτίστηκε με pGS66 που περιέχει το γονίδιο Ad5 ίνα. Ολιγονουκλεοτίδια: β ποντικού-ακτίνης-νόημα (5′-GCTGTGTTCTTGCACTCCTTG-3 ‘), ποντικού β-ακτίνη αντιπληροφοριακό (5′-CGCACGATTTCCCTCTCAGC-3′), ανθρώπινη β-ακτίνη νόημα (5’-GCTCCTCCTGAGCGCAAG-3 ‘), ανθρώπινης β-ακτίνης-αντινόημα (5’-CATCTGCTGGAAGGTGGACA-3 ‘), ίνα-νόημα (5′-GCTACAGTTTCAGTTTTGGCTG-3′), ίνα-αντινόημα (5’-GTTGTGGCCAGACCAGTCCC-3 ‘). Σαράντα κύκλοι με το ακόλουθο θερμικό πρωτόκολλο διεξήχθησαν: τήξη (95 ° C? 30 δευτερόλεπτα), αναδιάταξη (60 ° C? 30 δευτερόλεπτα), και επιμήκυνσης (72 ° C? 30 δευτερόλεπτα). Για την ανάλυση, οι Ct τιμές ινών (DR) ομαλοποιήθηκαν σε β-ακτίνη τιμές Ct (DR) του ίδιου δείγματος.

φθορισμομετρική ανάλυση των ομογενοποιημένων ήπαρ ποντικού

Πεντακόσια μικρογραμμάρια αρδευόμενου και snap-κατεψυγμένο ήπαρ ομογενοποιήθηκαν σε 1 ml ρυθμιστικό διάλυμα ομογενοποίησης (50 mM Tris /HCl, ρΗ 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% (ν /ν) ΝΡ-40, 0,25% (w /v) δεσοξυχολικό νάτριο) με ένα κωνικό μύλο ιστών (Wheaton, Millville, NJ, USA), μεταφέρθηκε σε ένα σωλήνα 1.5 ml αντίδρασης και επωάζεται για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν για 10 λεπτά, 20.000 χ g, 4 ° C. Το υπερκείμενο διαυγές κλάσμα μεταφέρθηκε σε ένα νέο σωλήνα αντίδρασης, φυγοκεντρήθηκαν για 10 λεπτά, 20,000 g, 4 ° C, και αραιώνεται 1: 500 έως 1: 20.000 σε ρυθμιστικό διάλυμα ομογενοποίησης. Ο φθορισμός GFP αναλύθηκε σε ένα LS50B φασματόμετρο φθορισμού (Perkin Elmer, Waltham, ΜΑ, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής) στα 488 nm μήκος κύματος διέγερσης και 512 nm μήκος κύματος εκπομπής. Σχετική μονάδες υπολογίστηκαν και οι αυθαίρετες μονάδες για το μη τροποποιημένο φορέα τέθηκαν σε 1.

Εξουδετέρωση των φορέων διαφήμισης από φυσικά IgM

Η επίδραση της τροποποίησης hexon σχετικά με την αναγνώριση των φυσικών αντισωμάτων IgM ερευνήθηκε σε μια δοκιμασία εξουδετέρωσης. 2×10

4 Α549 σπάρθηκαν την ημέρα πριν από πλύθηκαν μία φορά με PBS, και προστέθηκε μέσο ελεύθερο ορού. 1×10

7 σωματίδια Ad οποία είχαν επωαστεί για 20 λεπτά στους 37 ° C με 30 μΙ hirudinized (Refludan®, Celgene, Μόναχο, Γερμανία) στο πλάσμα από ποντίκια .1Η-ΠΜΣ ή με μέσο άνευ ορού (έλεγχος) σε ένα συνολικό όγκο 32 μΙ, προστέθηκαν στα κύτταρα. Μετά από 3 ώρες επώασης στους 37 ° C τα κύτταρα πλύθηκαν μία φορά με PBS, και μετά την προσθήκη του μέσου που περιέχει ορό, τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C για 24 ώρες, ακολουθούμενη από κυτταρομετρία ροής για τον προσδιορισμό GFP-έκφρασης.

πρόσληψη Ad φορείς από μακροφάγα ποντικού

1×10

5 RAW 264.7 κύτταρα εμβολιάζονται την ημέρα πριν πλύθηκαν μία φορά με PBS, και προστέθηκε μέσο ελεύθερο ορού.

2×10

σωματίδιο φορέα AD 8 που είχαν επωαστεί με 30 μλ hirudinized πλάσματος από ποντικούς .1Η-ΠΜΣ ή με μέσο άνευ ορού (έλεγχος) (σε συνολικό όγκο 35 μΐ) για 20 λεπτά στους 37 ° C προστέθηκαν στα κύτταρα. Μετά από 45 λεπτά επώασης στους 37 ° C τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS, και το συνολικό DNA απομονώθηκε σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή, καθώς. *

P

& lt? *

P

& lt? *

P

& lt? *

P

& lt?