Αφηρημένο

Η διαμεμβρανική πρωτεΐνη τύπου Ι με επιδερμικού αυξητικού παράγοντα και δύο φολιστατίνη μοτίβα 2 ( TMEFF2), εκφράζεται κυρίως στον εγκέφαλο και του προστάτη. Η έκφραση του TMEFF2 απορυθμίζεται σε καρκίνο του προστάτη, γεγονός που υποδηλώνει ένα ρόλο σε αυτή τη νόσο, αλλά ο μοριακός μηχανισμός (ες) που συμμετέχουν σε αυτή τη δράση δεν είναι σαφής. Παρά το γεγονός ότι τα ανδρογόνα προάγουν

TMEFF2

μεταγραφή, ανδρογόνο παράδοση σε ευνουχισμένα ζώα που φέρουν ξενομοσχεύματα CWR22 αυξάνει τα επίπεδα πρωτεΐνης TMEFF2 απουσία αλλαγών mRNA, γεγονός που υποδηλώνει ότι

TMEFF2

μπορεί επίσης να είναι μετα-μεταγραφικά ρυθμιστεί. Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι η μετάφραση του

ΤΜΕΡΡ2

ρυθμίζεται από ανδρογόνα. Η προσθήκη φυσιολογικών συγκεντρώσεων διυδροτεστοστερόνη (DHT) σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη αυξάνει μετάφραση του ενδογενούς

ΤΜΕΡΡ2

ή επιμολυσμένα

TMEFF2-λουσιφεράσης

συντήξεις, και το αποτέλεσμα αυτό απαιτεί την παρουσία ανάντη ανοικτά πλαίσια ανάγνωσης ( uORFs) στην 5′-αμετάφραστη περιοχή (5′-UTR) του

TMEFF2

. Χρησιμοποιώντας χημικά και siRNA αναστολή του υποδοχέα ανδρογόνων (AR), δείχνουμε ότι η επίδραση των ανδρογόνων στο

ΤΜΕΡΡ2

μετάφραση διαμεσολαβείται από την AR. Σημαντικά, DHT επίσης προάγει τη φωσφορυλίωση της α υπομονάδας του παράγοντα έναρξης μετάφρασης 2 (eIF2α) σε AR-εξαρτώμενο τρόπο, παράλληλα με την επίδραση επί

ΤΜΕΡΡ2

μετάφραση. Επιπλέον, ενδοπλασματικό δίκτυο (ER) συνθήκες στρες, οι οποίες προωθούν φωσφορυλίωση eIF2α, επίσης, την τόνωση

ΤΜΕΡΡ2

μετάφραση. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η σηματοδότηση των ανδρογόνων προωθεί φωσφορυλίωση eIF2α και μετέπειτα μετάφραση του

ΤΜΕΡΡ2

μέσω ενός μηχανισμού που απαιτεί uORFs στην 5′-UTR του

ΤΜΕΡΡ2

Η

Παράθεση:. Overcash RF, Chappell VA, Πράσινο T, Geyer CB, Asch AS, Ruiz-Echevarría MJ (2013) ανδρογόνα Σηματοδότησης προάγει τη μετάφραση του

ΤΜΕΡΡ2

σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη μέσω φωσφορυλίωση της α υπομονάδας του Μεταφραστικού Έναρξη Factor 2. PLoS ONE 8 (2): e55257. doi: 10.1371 /journal.pone.0055257

Επιμέλεια: Hari Κοαΐ, Πανεπιστήμιο του Κολοράντο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 23, Ιούλη, 2012? Αποδεκτές: 27, Δεκεμβρίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 6η Φεβρουαρίου του 2013

Copyright: © 2013 Overcash et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από μια επιχορήγηση από το Εθνικό Ίδρυμα Καρκίνου (1R15CA155873). Καμία πρόσθετη εξωτερική χρηματοδότηση ελήφθη για τη μελέτη αυτή. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικές ενδιαφέρον

Εισαγωγή

Τα ανδρογόνα σηματοδότηση μέσω του AR διαδραματίζουν ουσιαστικό ρόλο στην φυσιολογική ανάπτυξη του προστάτη και συμβάλλουν στην εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη. Η δέσμευση των ανδρογόνων στον AR προωθεί μια διαμορφωτική αλλαγή που τελικά οδηγεί σε μετατόπιση του προς τον πυρήνα και τη ρύθμιση της μεταγραφής ενός συγκεκριμένου συνόλου γονιδίων που αποκρίνονται στο ανδρογόνο. Κλινική και πειραματική απόδειξη υποδεικνύουν ότι εξέλιξης του καρκίνου του προστάτη συμβαίνει μέσω μεταβολή της κανονικής σηματοδότησης ανδρογόνων, μειώνοντας την ιδιαιτερότητα ή την ποσότητα του συνδέτη AR που απαιτούνται για τον πολλαπλασιασμό και την επιβίωση [1]. Σημαντικά, τα πρόσφατα αποτελέσματα δείχνουν ότι η λειτουργία του AR είναι ειδικά για το στάδιο της νόσου, προκαλώντας ένα διαφορετικό πρόγραμμα γονιδιακής έκφρασης σε εξαρτώμενη από ανδρογόνο σε σύγκριση με ανεξάρτητο από ανδρογόνο καρκίνο του προστάτη [2]. Ενώ ο ρόλος του AR άξονα στην μεταγραφική ρύθμιση σηματοδότησης είναι καλά τεκμηριωμένη, πολύ λίγα είναι γνωστά σχετικά με το ρόλο της στην έναρξη της μετάφρασης που προτείνονται στις αρχικές μελέτες [3], [4].

Η διαμεμβρανική πρωτεΐνη με επιδερμικό αυξητικό παράγοντα και δύο μοτίβα φολλιστατίνη 2 (TMEFF2) είναι ένα μόνο πέρασμα διαμεμβρανική πρωτεΐνη. TMEFF2 εκφράζεται στο έμβρυο [5], [6], και επιλεκτικά στον εγκέφαλο των ενηλίκων και του προστάτη [7] – [9]. Ένας ρόλος για TMEFF2 στον καρκίνο του προστάτη προτάθηκε από μελέτες που δείχνουν ότι η έκφραση TMEFF2 μεταβάλλεται σε ένα σημαντικό κλάσμα των πρωτογενών και μεταστατικών όγκων του προστάτη [5] – [10]. Επιπλέον, αποδείξαμε πρόσφατα ότι ΤΜΕΡΡ2 αλληλεπιδρά με αφυδρογονάση σαρκοσίνης (SARDH), του ενζύμου που ευθύνεται για τη μετατροπή της σαρκοσίνης σε γλυκίνη [11]. Σημαντικά, σαρκοσίνη ταυτοποιήθηκε ως ένας δείκτης για την εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη σε μια οθόνη μεγάλης κλίμακας των μεταβολιτών από δείγματα ανθρώπινου προστάτη [12]. Αυξημένα επίπεδα στο πλάσμα και τα ούρα σαρκοσίνη διακρίνεται καρκίνο του προστάτη από καλοήθη ιστό του προστάτη, και περαιτέρω αυξημένα σε μεταστατικό καρκίνο. Επιπλέον, ο μεταβολισμός σαρκοσίνη και τα ένζυμα που εμπλέκονται σε αυτό (δηλ SARDH) έχουν δειχθεί ότι δρουν ως ρυθμιστές της κυτταρικής εισβολής και της μετάστασης [12]. Ως εκ τούτου, η αλληλεπίδραση της TMEFF2 με SARDH προτείνει περαιτέρω ένα ρόλο για TMEFF2 στην πρόοδο του καρκίνου του προστάτη. Στην πραγματικότητα, έχουμε επίσης αποδειχθεί ότι λειτουργεί TMEFF2 πλήρους μήκους ως καταστολέας όγκων και ότι ο ρόλος αυτός συσχετίζει, τουλάχιστον εν μέρει, με την ικανότητά του να αλληλεπιδρά με SARDH και ρυθμίζουν τα κυτταρικά επίπεδα της σαρκοσίνης [11].

Στην παρούσα μελέτη αναφέρουμε ότι η μετάφραση του

ΤΜΕΡΡ2

ρυθμίζεται από ανδρογόνα, και το αποτέλεσμα αυτό απαιτεί ένα λειτουργικό AR. Αποτελέσματα χρησιμοποιώντας μοντέλα ξενομοσχεύματος και κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη αποδείχθηκε ότι η έκφραση TMEFF2 αλλάζει σε απόκριση σε ανδρογόνα ή /και την εξαρτώμενων από ανδρογόνα ή ανεξάρτητη από την κατάσταση των κυττάρων [8], [10]. Όπως αποδεικνύεται από Gery et al., [8] Οι αλλαγές αυτές οφείλονται εν μέρει σε μεταγραφική ενεργοποίηση του

TMEFF2

σε απόκριση σε ανδρογόνα. Ωστόσο, τα αυξημένα επίπεδα της πρωτεΐνης TMEFF2 απουσία αντίστοιχη αύξηση στα επίπεδα mRNA έχουν παρατηρηθεί μετά την προσθήκη των ανδρογόνων σε ευνουχισμένα ζώα που φέρουν ξενομοσχεύματα CWR22, γεγονός που υποδηλώνει ότι

TMEFF2

μπορεί επίσης να είναι μετα-μεταγραφικά ρυθμίζονται [10].

Το

ΤΜΕΡΡ2

mRNA έχει πολλές δυνητικές πλαίσια ανάντη ανοικτής ανάγνωσης (uORFs) στην περιοχή ηγέτη του, και ανάλυση της αλληλουχίας δείχνει ότι είναι καλά συντηρημένα μεταξύ των θηλαστικών. Παρά το γεγονός ότι υπάρχει μόνο σε 5-10% των κυτταρικών mRNAs, uORFs είναι κοινά στις περιοχές αρχηγός του mRNA που κωδικοποιούν ογκοπρωτεϊνών ή πρωτεΐνες που εμπλέκονται στον έλεγχο της κυτταρικής ανάπτυξης και διαφοροποίησης, και λειτουργούν με διαμόρφωση μετάφραση αυτών των βασικών γονιδίων [13]. Μετά την μετάφραση, uORFs μπλοκάρουν γενικά μετάφραση του κυρίως κατάντη περιοχή κωδικοποίησης από παρεμποδίζουν τη μετάφραση επανέναρξης στο κεντρικό κωδικόνιο έναρξης της μετάφρασης. Ωστόσο, uORFs μπορεί να προωθήσει την επιλεκτική μετάφραση της κατάντη περιοχής κωδικοποίησης κάτω από κυτταρικό στρες ή άλλες καταστάσεις που αυξάνουν τη φωσφορυλίωση της α υπομονάδας του ευκαρυωτικού παράγοντα έναρξης της μετάφρασης 2 (eIF2α) [13].

eIF2 στην GTP- της δεσμευμένη μορφή είναι απαραίτητη για την επιλογή του κωδικονίου έναρξης μετάφρασης. Η φωσφορυλίωση της α υπομονάδας της eIF2 σε Ser-51 (eIF2α-P) αναστέλλει την ανταλλαγή eIF2-ΑΕΠ eIF2-GTP, εμποδίζοντας την αναγνώριση της κωδικόνιο έναρξης και τη μείωση της παγκόσμιας έναρξης μετάφρασης [14]. Ωστόσο, όπως αναφέρθηκε παραπάνω, οι uORF περιέχουν mRNA μεταφράζονται ενεργά υπό αυτές τις συνθήκες. Δύο μηχανισμοί έχουν προταθεί για να εξηγήσουν αυτή την επίδραση. Στην πρώτη, παραδειγματικά με το

ATF4

mRNA που περιέχει δύο uORFs, μετάφραση επανέναρξης στην ανασταλτική κατάντη uORF παρακάμπτεται υπό συνθήκες eIF2α-P, λόγω του γεγονότος ότι τα χαμηλότερα επίπεδα eIF2-GTP αύξησης ο χρόνος που απαιτείται για τα ριβοσώματα σάρωσης για την εκ νέου απόκτηση eIF2-GTP και να ξαναρχίσει τη μετάφραση [15]. Στο δεύτερο, που παρατηρείται σε mRNAs που περιέχει ένα μόνο uORF, ριβοσώματα σάρωση παρακάμψει την ανασταλτική uORF λόγω της μειωμένης αποδοτικότητας της μετάφρασης στα κωδικόνια έναρξης με μια φτωχή συναινετική αλληλουχία Kozak [16]. Σε αμφότερες τις περιπτώσεις, τα uORF παράκαμψης οδηγεί σε μία αύξηση του αριθμού των ριβοσωμάτων ξεκινώντας μετάφρασης στο κωδικόνιο έναρξης της κύριας αλληλουχίας κωδικοποίησης, αυξάνοντας έτσι την σύνθεση της συγκεκριμένης πρωτεΐνης.

Σε αυτή τη μελέτη, δείχνουμε ότι

ΤΜΕΡΡ2

μετάφραση ρυθμίζεται από ανδρογόνα. Ανδρογόνων-ρύθμιση του

ΤΜΕΡΡ2

μετάφραση απαιτεί την παρουσία των uORFs στην περιοχή ηγέτης του

ΤΜΕΡΡ2

mRNA και εξαρτάται από eIF2α-P. Περαιτέρω, αυτό το αποτέλεσμα προκαλείται από τον AR, δεδομένου ότι δεν παρατηρείται όταν τα επίπεδα AR μειώνονται κατά RNAi ή του ανταγωνιστή βικαλουταμίδης AR, ή σε κυτταρικές γραμμές που δεν το εκφράζουν. Τα αποτελέσματα αυτά υποστηρίζουν ένα νέο ρυθμιστικό μηχανισμό της σηματοδότησης των ανδρογόνων στην οποία uORF περιέχουν mRNAs τα μεταφραστικά ενεργοποιούνται σε απόκριση προς eIF2α-Ρ.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture

LNCaP και 22RV1 κύτταρα ελήφθησαν από την American Type Culture Collection και διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 (Gibco) συμπληρωμένο με είτε 10% FBS (Gemini Bio-προϊόντα) ή 10% απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα ορό (Atlanta Biologicals). PC3 κύτταρα (ATCC) ελήφθησαν από τον Dr. D. Terrian (Carolina University Ανατολή) και επίσης διατηρήθηκαν σε RPMI 1640. Mouse εμβρυϊκών ινοβλαστών που εκφράζουν την αγρίου τύπου και μεταλλαγμένων (ser51 σε Αία) eIF2 ελήφθησαν από τον Dr. R. Kaufman ( Sanford /Burnham Medical Research Institute) και έχουν περιγραφεί στο παρελθόν [17]. Αυτά τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε DMEM. Διυδροτεστοστερόνη, βικαλουταμίδη, και ακτινομυκίνη D αγοράσθηκαν από την Sigma-Aldrich.

κατασκευάσματα και Reporter Δοκιμασίες

μεταλλαξογένεση PCR χρησιμοποιήθηκε για τη μετάλλαξη των κωδικονίων έναρξης των uORFs από Αύγουστο έως GUG στο em

ΤΜΕΡΡ2

5 ‘UTR. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για μεταλλαξογένεση παρατίθενται στον Πίνακα 1. Τα 5 ‘UTRs εισήχθησαν ανοδικά του Gaussia

λουσιφεράσης γονίδιο στο φορέα pCMV-gluc (New England Biolabs). Η-his TMEFF2-myc κατασκεύασμα σύντηξης έχει περιγραφεί προηγουμένως (11). Για τις αναλύσεις uORF, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 70-90% συρροή σε πλάκες 6-φρεατίων και επιμολύνθηκαν με 1.5 μg του κάθε κατασκεύασμα ανά φρεάτιο και η ίδια ποσότητα του pSEAP-Control Vector II (BD Biosciences). Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με Lipofectamine 2000 (Invitrogen) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή και χρησιμοποιώντας 4 μl /φρεάτιο αντιδραστηρίου Lipofectamine. Κύτταρα και υπερκείμενα συλλέχθηκαν 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, και η δραστικότητα της λουσιφεράσης προσδιορίζεται από τα υπερκείμενα χρησιμοποιώντας το κιτ Biolux (New England Biolabs). επίπεδα SEAP μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας το Great Escape ΣΔΑΕ Χημειοφωταύγειας Kit 2.0 (Clontech Laboratories). Για αμφότερους τους προσδιορισμούς, φωταύγεια ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας ένα 20/20

n φωτόμετρο (Turner Biosystems).

Η

Για προσδιορισμούς ρεπόρτερ DHT-διεγερμένα κύτταρα ήταν ορμόνη-πεινασμένο για 48 ώρες σε φαινόλη red- ελεύθερο μέσο που περιέχει 10% απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα ορό (CSS) πριν από τη διέγερση με DHT. Είκοσι τέσσερις ώρες μετά την απομάκρυνση της ορμόνης τα κύτταρα επιμολύνθηκαν χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο διαμόλυνσης Fugene HD (Promega) σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Εν συντομία, 10 μg κάθε κατασκεύασμα και 10 μg pSeap2 αραιώθηκαν σε RPMI χωρίς ορό μαζί με 30 μΙ αντιδραστήριο Fugene HD για συνολικό όγκο 500 μΙ. 100 μΐ αυτού του μείγματος διαμόλυνσης προστέθηκαν ανά φρεάτιο μιας πλάκας 6-φρεατίων. Την επόμενη ημέρα, DHT ή όχημα αιθανόλης προστέθηκαν σε φρέσκο ​​CSS-RPMI και τα κύτταρα επωάστηκαν για άλλες 48 ώρες πριν από τη συγκομιδή των κυττάρων και τα υπερκείμενα. Για τη μέτρηση των επιπέδων mRNA Gaussia λουσιφεράσης, το RNA απομονώθηκε από τα κύτταρα χρησιμοποιώντας το κιτ RNAqueous (Ambion) ακολουθώντας το παρεχόμενο πρωτόκολλο. cDNA μετά συντίθεται χρησιμοποιώντας το κιτ iScript (BioRad Laboratories), και τα επίπεδα mRNA λουσιφεράσης μετρήθηκαν με qRT-PCR χρησιμοποιώντας IQ SYBR Green Supermix και το IQ5 Real-Time Σύστημα Ανίχνευσης PCR (BioRad Laboratories). επίπεδα λουσιφεράσης mRNA ομαλοποιήθηκαν με β-

ακτίνης και της έκφρασης του γονιδίου αναλύθηκε χρησιμοποιώντας IQ5 Οπτική Λογισμικό συστήματος (BioRad Laboratories). Βλέπε Πίνακα 1 για εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για qRT-PCR.

DHT Διέγερση Time-πορεία

Τα κύτταρα ορμόνη στερημένα σε άνευ ερυθρού φαινόλης μέσου που περιέχει 10% CSS όλη τη νύκτα πριν από τη διέγερση με 10 ηΜ DHT ή τον έλεγχο DMSO. Η ακτινομυκίνη D χρησιμοποιήθηκε σε συγκέντρωση 5 ηΜ. RNA απομονώθηκε από κύτταρα χρησιμοποιώντας την RNeasy κιτ (Qiagen) και cDNA συντέθηκε χρησιμοποιώντας Superscript II Reverse Transcriptase (Invitrogen).

ΤΜΕΡΡ2

επίπεδα μήνυμα μετρήθηκαν με ενίσχυση qRT-PCR χρησιμοποιώντας TaqMan

ΤΜΕΡΡ2

εκκινητές (Hs00249367_m1, Applied Biosystems), και κανονικοποιημένο στο

επίπεδα GAPDH

μήνυμα (ενισχυμένο με Hs99999905_m1, Applied Biosystems).

ανδρογόνων υποδοχέων Νοκ ντάουν

έκφραση AR μειώθηκε σε 22RV1 κύτταρα χρησιμοποιώντας το ON-TARGET συν SMART πισίνα για ανθρώπινη AR (Thermo Scientific). Μη στόχευση siRNA συμπεριλήφθηκε ως μάρτυρας. Εν συντομία, 5 μΐ φίμωση RNA και 7,5 μΙ αντιδραστηρίου επιμόλυνσης DharmaFECT (Thermo Scientific) ήταν το καθένα χωριστά αραιωμένο σε 300 μΙ ελεύθερο ορού, άνευ ερυθρού φαινόλης RPMI. Μετά από 5 λεπτά επώαση, τα διαλύματα συνδυάστηκαν και επωάστηκαν για άλλα 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, κατόπιν προστίθεται σε ένα μονοστοιβάδα συρρεόντων κυττάρων 85% σε ένα Τ-25 φιάλη που περιέχει 2,4 ml πλήρους, άνευ ερυθρού φαινόλης RPMI.

Ανοσοκηλίδωση

τα κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν με Δοκιμασία ραδιοανοσοκατακρήμνισης (RIPA) ρυθμιστικό [25 mM Tris-HCl ρΗ 7,6, 150 mM NaCl, 1% Trition Χ-100, 1% δεοξυχολικό νάτριο, 0.1% SDS] συμπληρωμένο με 0,1 mM β-γλυκεροφωσφορικό και 0.5 mM ορθοβαναδικό νάτριο κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης και (Sigma). Είκοσι μγρ κυτταρολύματα διαχωρίστηκαν σε Mini-Protean πηκτώματα TGX (BioRad) και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF. Αυτά στη συνέχεια δεσμεύτηκαν για 30 λεπτά σε 5% NFDM αραιωμένο σε TBS-T και επωάστηκαν με το πρωτογενές αντίσωμα όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Επωάσεις με αραίωση 1:10,000 του συζευγμένου με HRP δευτερογενούς αντισώματος (Santa Cruz Biotechnology) ήταν για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Η ανίχνευση διεξήχθη με τη χρήση SuperSignal West Pico χημειοφωταύγειας Υπόστρωμα (Thermo Scientific) για 5 λεπτά. Σε ορισμένες περιπτώσεις, οι κηλίδες απογυμνώθηκαν με την Επαναφορά PLUS Western Blot απογύμνωσης Buffer (Thermo Scientific) ακολουθώντας τις συστάσεις του κατασκευαστή. Αντισώματα έναντι TMEFF2, PSA, και eIF2α-Ρ (ser51) ήταν από Abcam, eIF2α και αντισώματα CREB2 /ATF4 αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology, και (ser51) αντισωμάτων Ρ-eIF2α ήταν από τη Cell Signaling Technology.

πολυσωμάτων Ανάλυση

μονοστοιβάδες κυττάρων πλύθηκαν μία φορά με ψυχρό 1Χ PBS και αποξέστηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης [100 mmol /L ΚΟΙ, 10 mmol /L HEPES (ρΗ 7.4), 0.5% ΝΡ40, 5 mmol /L MgCl

2, 100 μg /ml κυκλοεξιμιδίου], και επωάστηκαν σε πάγο για 10 λεπτά, ακολουθούμενο από ένα 5 λεπτά περιστροφή στις 10.000 rpm στους 4 ° C για να σφαιροποιηθούν τα κυτταρικά θραύσματα. Ίσες συγκεντρώσεις πρωτεΐνης των κυτταροπλασματικών εκχυλισμάτων (1,8 mg) στη συνέχεια επιστρώνεται επάνω σε μια γραμμική κλίση σακχαρόζης [15-45% (w /v) 10 mmol /L HEPES (ρΗ 7.4), 100 mmol /L ΚΟΙ, 5 mmol /L MgCl

2] και φυγοκεντρείται στις 35.000 rpm για 2 ώρες στους 4 ° C σε ένα ρότορα SW41-Ti χωρίς φρένο. Χρησιμοποιώντας ένα ISCO UA-6, τα κλάσματα συλλέχθηκαν με συνεχή παρακολούθηση υν στα 254 nm. RNA απομονώθηκε από τα κλάσματα χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Ambion). Είκοσι πέντε μικρογραμμάρια του RNA στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκαν για τη σύνθεση cDNA χρησιμοποιώντας ένα κιτ iScript (BioRad Laboratories). Ένα δείγμα 0.1 μg από κάθε παρασκεύασμα cDNA χρησιμοποιήθηκε για να ενισχύσει

TMEFF2

,

ATF4

, και

β-ακτίνης

με PCR χρησιμοποιώντας το σύστημα Platinum Taq HiFi DNA Polymerase ( Invitrogen). Τα PCR προϊόντα στη συνέχεια οπτικοποιήθηκαν σε ένα πήκτωμα αγαρόζης 1% και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα ΝΙΗ Image J δημόσιο τομέα (που αναπτύχθηκε στο αμερικανικό Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας και διατίθενται στο Διαδίκτυο στη https://rsb.info.nih.gov/nih- image /).

ανοσοφθορισμού

τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε πυκνότητα 10.000 κύτταρα /φρεάτιο σε Lab-Tek 8 καλά θαλαμωτά πλακίδια (Nalge Nunc International) και επωάστηκαν για μία νύχτα σε υγροποιημένο 37 ° C θερμοκοιτίδα με 5% CO

2. Τα κύτταρα πλύθηκαν σε PBS και σταθεροποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη για 10 λεπτά, πλύθηκαν σε PBS και κατέστησαν διαπερατά με 0,1% Τπίοη-Χ100 σε PBS και αποκλείστηκαν με 5% φυσιολογικό ορό κατσίκας σε 0.1% PBST. Τα δείγματα επωάστηκαν για 1 ώρα με τα υποδεικνυόμενα πρώτα αντισώματα. Τα αντίστοιχα δευτερογενή αντισώματα προστέθηκαν σε μια 1:500 αραίωση σε 5% ορό κατσίκας σε PBS-T (0.1% Tween 20): κατσίκας αντι-κουνελιού IgG-AF488 (Invitrogen) και κατσίκα αντι-ποντικού IgG-AF488 (Invitrogen). Τα κύτταρα πλύθηκαν 3 φορές σε PBS-T (0.1% Tween 20). Τα πλακίδια ξηραίνονται με αέρα και τοποθετούνται σε μέσο που περιέχει DAPI.

Υποκυτταρική κλασματοποίηση

Εκχυλίσματα από κύτταρα που αναπτύσσονται παρουσία 10 ηΜ DHT, ή DMSO ως έλεγχος, κλασματώθηκαν σε κυτοσολικά, μεμβρανώδη, πυρηνικά και κυτταροσκελετική κλάσματα χρησιμοποιώντας το κιτ Υποκυτταρική Proteome Extraction (Calbiochem).

Στατιστική Ανάλυση

τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD. Οι διαφορές αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ζεύγη, δύο-tailed t-tests. Οι τιμές Ρ ≤0.05 (*) ή ≤0.01 (**) θεωρήθηκαν σημαντικές.

Αποτελέσματα

Η

ΤΜΕΡΡ2

5′-UTR περιέχει αρκετές uORFs που αποτρέπουν την μετάφραση του η πρωτεΐνη TMEFF2

η 5 ‘UTR του

ΤΜΕΡΡ2

mRNA περιέχει αρκετά δυναμικό uORFs (Εικόνα 1Α) ότι, εάν μεταφραστεί δυνητικά θα μπλοκάρουν μετάφραση του

ΤΜΕΡΡ2

κύρια κωδικοποίηση ακολουθία, και ως εκ τούτου συμβάλλει στη ρύθμιση της

ΤΜΕΡΡ2

έκφρασης. Για να διερευνηθεί ο ρόλος των uORFs στη ρύθμιση έκφρασης πρωτεΐνης TMEFF2, αναρωτηθήκαμε εάν το κλείδωμα μετάφραση των uORFs θα επηρεάσει τη μετάφραση της πρωτεΐνης TMEFF2 σε ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές προστάτη. Μια TMEFF2-Gaussia λουσιφεράσης (gluc) ρεπόρτερ δημιουργήθηκε για το σκοπό αυτό από κλωνοποίηση ο

TMEFF2

5′-UTR, συμπεριλαμβανομένων τεσσάρων uORFs, ανάντη των αλληλουχιών gluc (pTM1234-Gluc? Εικόνα 1Β). Η

ΤΜΕΡΡ2

-Gluc σύντηξης τέθηκε υπό τον έλεγχο του υποκινητή CMV. Η ρυθμιστική συμβολή των uORFs να

ΤΜΕΡΡ2

μετάφραση αξιολογήθηκε μεταλλάσσοντας τα κωδικόνια έναρξης (AUGs) των τεσσάρων δυνητικών uORFs (AUG να GUG, Εικόνα 1Β) και προσδιορισμό επίδρασή τους επί της έκφρασης gluc σε το ανδρογόνο-εξαρτώμενη προστάτη καρκινική κυτταρική γραμμή LNCaP και οστεο-μεταστατικό, ανδρογόνο-ανεξάρτητες παράγωγο C4-2B κυτταρική γραμμή. Μια αύξηση έξι έως επτά φορές σε έκφραση λουσιφεράσης παρατηρήθηκε όταν τα AUGs και από τις τέσσερις uORFs μεταλλάχθηκαν (pTMXXXX-Gluc? Σχήμα 1C). Ενιαία μεταλλάξεις στις AUGs της δεύτερης, τρίτης ή τέταρτης uORFs προώθησε μια 3-4 φορές αύξηση στην έκφραση gluc, ενώ μετάλλαξη του AUG της πρώτης uORF είχε πολύ μικρή επίδραση, υποδηλώνοντας μία ελάχιστη ρόλο, εάν υπάρχει, στην ρύθμιση της TMEFF2 έκφραση. Κατά συνέπεια, σε συνδυασμό μεταλλάξεις uORFs 2, 3, και 4 οδήγησε σε πέντε έως έξι φορές αύξηση στην έκφραση λουσιφεράσης του ανταποκριτή, παρόμοια με αυτή που παρατηρήθηκε, όταν και οι τέσσερις uORFs μεταλλάχθηκαν (Σχήμα 1 C). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν σε άλλες καρκινικές κυτταρικές σειρές που αποκρίνονται στο ανδρογόνο (22Rv1) και ανεξάρτητη από (PC3) του προστάτη. Μετάλλαξη των uORFs οδήγησε σε αυξημένη έκφραση λουσιφεράσης του δημοσιογράφου gluC, έστω και σε διαφορετικό επαγωγής φορές (Σχήμα 1D). Στα κατασκευάσματα που χρησιμοποιούνται για αυτά τα πειράματα, η έκφραση του γονιδίου σύντηξης κατευθύνθηκε από τον προαγωγό CMV, και η δράση της λουσιφεράσης κανονικοποιήθηκε με τα επίπεδα mRNA. Συνολικά, τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι οι uORFs στην 5′-UTR του

ΤΜΕΡΡ2

λειτουργία mRNA συνεργικά για να καταστείλει τη μετάφραση του κυρίως κατάντη ORF.

Α) Σχηματική αναπαράσταση των 394 nt πριν από το

ΤΜΕΡΡ2

κύρια περιοχή κωδικοποίησης και σχετική εντοπισμό των τεσσάρων πιθανών uORFs (αα = αμινοξύ) εντός της 5′-UTR. Β) Σχηματική αναπαράσταση του ρεπόρτερ TMEFF2-Gaussia λουσιφεράσης και μεταλλαγμένα κατασκευάσματα. Το Χ υποδεικνύει μετάλλαξη του AUG σε ένα GUG για την πρόληψη της μετάφρασης των μεταλλαγμένων uORFs. Ενιαία και πολλαπλές μεταλλάξεις εισήχθησαν. δραστηριότητα C) λουσιφεράσης αποδεικνύεται από την pTM1234-Gluc και τα διαφορετικά μεταλλάκτη κατασκευάσματα στα κύτταρα LNCaP και C4-2. D) δραστηριότητα λουσιφεράσης αποδεικνύεται από την pTM1234-Gluc και το μόρφωμα με όλες τις uORFs μεταλλαγμένα (pTMXXXX-Gluc) σε PC3 και τα κύτταρα 22Rv1. Στην Γ) και Δ) δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε στο υπερκείμενο και υπολογίζεται πρώτα ομαλοποίηση σε επίπεδα mRNA για κάθε κατασκεύασμα και στη συνέχεια με τη δραστηριότητα λουσιφεράσης αποδεικνύεται από το κατασκεύασμα ανταποκριτή pTM1234-Gluc, η οποία δεν έχει μεταλλάξεις στα uORFs, θεωρείται αυθαίρετα ως 1. τα δεδομένα που δείχνονται είναι μέση τιμή ± SD από τουλάχιστον δύο ανεξάρτητα πειράματα με πολλαπλούς επαναλήψεις. *,

σ

& lt? 0,05 και **,

σ

& lt?. 0.01

Η

Η μετάφραση ενός Reporter ΤΜΕΡΡ2-λουσιφεράσης ρυθμίζεται από ανδρογόνα, μέσω ενός μηχανισμό που απαιτεί την παρουσία των uORFs στην περιοχή του mRNA Leader

Μεταγραφή

του

ΤΜΕΡΡ2

γονίδιο ρυθμίζεται από ανδρογόνα [8]. Ωστόσο, έχει προταθεί ότι τα ανδρογόνα επηρεάζουν επίσης

ΤΜΕΡΡ2

έκφραση στο μετα-μεταγραφικό επίπεδο [10], προτρέποντας μας να εξετάσει εάν

ΤΜΕΡΡ2

μετάφραση επηρεάζονται από τα ανδρογόνα. 22Rv1 κύτταρα επελέγησαν για τα πειράματα αυτά, δεδομένου ότι: i) έχουν δειχθεί ότι είναι ένα πολύτιμο μοντέλο για δοκιμασίες AR-μεσολάβηση γονίδιο αναφοράς [18], ii) κατέδειξαν την υψηλότερη αύξηση πλάσια στην έκφραση του γονιδίου αναφοράς της λουσιφεράσης όταν μεταλλάχθηκαν τα uORFs ( βλέπε Εικόνα 1 D), και iii) εκφράζουν ανιχνεύσιμα επίπεδα του ενδογενούς πρωτεΐνης TMEFF2. 22Rv1 κύτταρα επιμολύνθηκαν με τον ανταποκριτή pTM1234-Gluc, αναπτύχθηκαν σε ελεύθερο ερυθρού φαινόλης μέσο συμπληρωμένο με απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα (CS) FBS – για την απομάκρυνση στεροειδούς ΦΥΤΟΟΡΜΟΝΕΣ και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις διυδροτεστοστερόνη (DHT). Η δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε από τα υπερκείμενα και ομαλοποιήθηκε ως προς τα επίπεδα mRNA. Η προσθήκη DHT αυξημένη έκφραση λουσιφεράσης με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 2Α), υποδεικνύοντας ότι τα ανδρογόνα διεγείρουν την μετάφραση του κύριου ORF. Είναι σημαντικό ότι αυτό το φαινόμενο παρατηρήθηκε σε συγκεντρώσεις DHT μέσα στα φυσιολογικά επίπεδα που βρέθηκαν σε ανθρώπινο ορό [19]. Η δραστικότητα λουσιφεράσης από τα κύτταρα που φέρουν το κατασκεύασμα ανταποκριτή pTMXXXX-Gluc, στην οποία μεταλλάχθηκαν τα AUGs από τις τέσσερις uORFs, δεν άλλαξε σε απόκριση DHT, αν και, όπως αναμενόταν, ήταν πολύ υψηλότερη (Σχήμα 2Α). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η μετάφραση του κύριου ORF καθοδικά του

ΤΜΕΡΡ2

5′- UTR ρυθμίζεται από ανδρογόνα σε uORF-εξαρτώμενο τρόπο.

Α) δραστηριότητα λουσιφεράσης αποδεικνύεται από την pTM1234-Gluc και η μεταλλαγμένη pTMXXXX-Gluc κατασκεύασμα 22Rv1 κύτταρα παρουσία διαφόρων συγκεντρώσεων DHT. Β) Η δραστικότητα λουσιφεράσης αποδεικνύεται από την pTM1234-Gluc κατασκεύασμα 22Rv1 κυττάρων παρουσία διαφορετικών συγκεντρώσεων DHT και DHT 20 μΜ βικαλουταμίδη (BIC), έναν αγωνιστή AR. C) δραστηριότητα λουσιφεράσης αποδεικνύεται από την pTM1234-Gluc κατασκεύασμα σε κύτταρα PC3 με την παρουσία διαφόρων συγκεντρώσεων DHT. Για όλα αυτά τα πειράματα τα κύτταρα ήταν στερημένα ορμόνη σε άνευ ερυθρού φαινόλης μέσο που περιείχε ξυλάνθρακα απογυμνωμένο ορό. Η δραστικότητα λουσιφεράσης ομαλοποιήθηκε ως προς τα επίπεδα του mRNA για κάθε κατασκεύασμα και στη συνέχεια στην δραστικότητα λουσιφεράσης αποδεικνύεται από κάθε ένα από τα κατασκευάσματα που εκφράζεται σε κύτταρα που αναπτύσσονται απουσία του DHT, η οποία ορίστηκε σε 1. Τα δεδομένα που δεικνύονται είναι μέσος όρος ± S.D. τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων με πολλαπλές επαναλήψεις. *,

σ

& lt? 0,05 και **,

σ

& lt?. 0.01

Η

Για να καθοριστεί εάν η επίδραση DHT σε μετάφραση διαμεσολαβείται από το AR , τα πειράματα που περιγράφονται παραπάνω επαναλήφθηκαν παρουσία της βικαλουταμίδης να εμποδίσει την ενεργοποίηση AR. Η προσθήκη αυτού του φαρμάκου μείωσε την DHT-μεσολαβούμενη επαγωγή της λουσιφεράσης έκφραση pTM1234-Gluc σε σχεδόν βασικά επίπεδα, αν και ένα μικρό δύο έως τρεις φορές επαγωγή θα μπορούσε να παρατηρηθεί στα 10 ηΜ DHT (Σχήμα 2Β). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η επίδραση της DHT για τη μετάφραση του κατασκευάσματος ανταποκριτή απαιτεί AR σηματοδότησης. Σε συμφωνία με αυτά τα αποτελέσματα, δεν παρατηρήσαμε DHT που προκαλείται από τη μετάφραση του ρεπόρτερ pTM1234-Gluc σε PC3 καρκίνου του προστάτη κύτταρα που δεν εκφράζουν το AR (Σχήμα 2C). Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η DHT που προκαλείται από μετάφραση του

ΤΜΕΡΡ2

απαιτεί ενεργοποίηση του AR και διαμεσολαβείται από τα uORFs στην περιοχή αρχηγός του mRNA.

μετάφραση της πρωτεΐνης ενδογενής TMEFF2 είναι Ρυθμίζεται από ανδρογόνα

οι αλλαγές στην έκφραση της ενδογενούς πρωτεΐνης TMEFF2 σε απόκριση σε ανδρογόνα αναλύθηκαν επίσης. Για το σκοπό αυτό, τα κύτταρα 22Rv1 αναπτύχθηκαν σε ελεύθερο ερυθρού φαινόλης μέσο συμπληρωμένο με CS-FBS σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις της DHT, και προϊόντα λύσης αναλύθηκαν για έκφραση TMEFF2 με κηλίδωση Western. Σε περίπτωση απουσίας των ανδρογόνων, η έκφραση της TMEFF2 ήταν μόλις ανιχνεύσιμη. Ωστόσο, η προσθήκη της DHT αυξημένη έκφραση TMEFF2 (Σχήμα 3Α), και είχε ως αποτέλεσμα υψηλότερα επίπεδα εντός του εύρους των φυσιολογικών συγκεντρώσεων DHT. DHT-επαγόμενη έκφραση του ενδογενούς TMEFF2 παρατηρήθηκε επίσης στα κύτταρα του προστάτη LNCaP καρκίνου του αποκρίνονται στο ανδρογόνο (Σχήμα 3Α). Η έκφραση του ειδικού προστατικού ανδρογόνου (PSA), ενός στόχου AR χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος για ανδρογόνων μεταγραφική δραστικότητα, ενισχύθηκε με την προσθήκη της DHT (Σχήμα 3Α). Κατεργασία των κυττάρων με βικαλουταμίδη κυρίως ανέστειλαν DHT που προκαλείται ΤΜΕΡΡ2 και PSA έκφραση που παρατηρήθηκε μόνο στις υψηλότερες συγκεντρώσεις της DHT (Σχήμα 3Α). Η αναστολή της DHT-επαγόμενη έκφραση TMEFF2 επιτεύχθηκε επίσης μετά να χτυπήσει κάτω την έκφραση του AR χρησιμοποιώντας siRNA (Σχήμα 3Β). Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η έκφραση της ενδογενούς πρωτεΐνης TMEFF2 ρυθμίζεται από σηματοδότηση AR.

Α) Αντιπροσωπευτική κηλίδες Western που δείχνει μια αύξηση στην έκφραση TMEFF2 σε απόκριση προσθήκης DHT σε κύτταρα 22Rv1 και LNCaP (α = αντίσωμα ). Ταυτόχρονη προσθήκη 20 μΜ βικαλουταμίδης να 22Rv1 κύτταρα (μεσαίο πλαίσιο) απέτρεψε την αύξηση στην έκφραση TMEFF2 παρατηρήθηκε σε φυσιολογική συγκέντρωση της DHT. PSA χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος επειδή η έκφρασή του επάγεται από ανδρογόνο σε AR-εξαρτώμενο τρόπο. β-τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Β) κηλίδα Western που δείχνει αποτελεσματικό χτύπημα κάτω από τις δύο μορφές του AR σε κύτταρα 22Rv1 χρήση siRNA (δεξιά). Αντιπροσωπευτικά στύπωμα Western που δείχνει ότι η προσθήκη του DHT δεν έχει καμία επίδραση στην έκφραση των TMEFF2 σε κύτταρα στα οποία τα επίπεδα AR μειώθηκαν κατά RNAi. PSA χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος και, όπως αναμένεται, η έκφρασή της δεν επηρεάστηκε από DHT στο AR-siRNA επεξεργασμένα κύτταρα. β-τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Γ) Αλλαγές στο

ΤΜΕΡΡ2

επίπεδα mRNA σε κυτταρικές σειρές LNCaP και 22Rv1 απαντώντας σε DHT όπως μετράται με qRT-PCR. Οι τιμές ομαλοποιήθηκαν σε β-τουμπουλίνης mRNA. Κάθε πείραμα επαναλήφθηκε τουλάχιστον τρεις φορές και, για τις αντιπροσωπευτικές εικόνες που παρουσιάζονται, οι μεμβράνες απογυμνώθηκαν και επανα-διερευνήθηκαν με τα διαφορετικά αντισώματα ή τα ίδια δείγματα επανα-τρέχουν σε μια διαφορετική πηκτή. β-τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης κάθε φορά τα δείγματα τρέχουν.

Η

Παρατηρήσαμε μια αύξηση σε ποσοστό

ΤΜΕΡΡ2

επίπεδα του mRNA σε απόκριση DHT όπως μετράται με qRT-PCR ( Σχήμα 3C), σύμφωνα με μια προηγούμενη έκθεση δείχνει ότι τα ανδρογόνα διεγείρουν

ΤΜΕΡΡ2

μεταγραφή [8]. Ωστόσο, η μικρή αύξηση των επιπέδων mRNA δεν πιθανό να εξηγήσει την παρατηρούμενη DHT μεσολάβηση αύξηση στην έκφραση πρωτεΐνης. Για να αποκλειστεί η πιθανότητα ότι η αύξηση στην ενδογενή πρωτεΐνη TMEFF2 παρατηρηθεί σε απόκριση σε DHT οφείλεται αποκλειστικά στην αυξημένη μεταγραφή, χρησιμοποιήσαμε ακτινομυκίνη D για να εμποδίσει τη μεταγραφή και αξιολογούνται τα επίπεδα πρωτεΐνης TMEFF2 και mRNA σε 22Rv1 κύτταρα σε διάφορα χρονικά σημεία μετά την προσθήκη της DHT, για να προκληθεί

TMEFF2

έκφραση, και /ή ακτινομυκίνη επίπεδα πρωτεΐνης D. TMEFF2 αυξηθεί δραματικά 60-120 λεπτά μετά την προσθήκη της DHT, αλλά όχι DMSO, ο έλεγχος του οχήματος (Σχήμα 4Α). Είναι σημαντικό ότι, με την παρουσία του ακτινομυκίνη D, προσθήκη DHT ακόμη προωθείται μια αύξηση στην έκφραση πρωτεΐνης TMEFF2, αν και σε χαμηλότερο επίπεδο από ό, τι παρατηρείται απουσία του αναστολέα της μεταγραφής. Όπως φαίνεται από την ανάλυση του

ΤΜΕΡΡ2

επίπεδα mRNA από qRT-PCR, η προσθήκη της ακτινομυκίνης D ανέστειλε τη βασική και DHT που προκαλείται από

ΤΜΕΡΡ2

μεταγραφής (Εικόνα 4Β). Η προσθήκη του DHT μόνη προώθησε μια ελαφρά αρχική αύξηση στην μεταγραφή (1,2-φορές μετά από 20 λεπτά) που προοδευτικά μειώθηκε στα βασικά επίπεδα μετά από 60 λεπτά επεξεργασίας (δεν φαίνεται). Συνεπώς, αυτά τα αποτελέσματα αποκαλύπτουν ότι τα ανδρογόνα ρυθμίζουν όχι μόνο μεταγραφή του

ΤΜΕΡΡ2

γονίδιο, αλλά και τη μετάφραση του ενδογενούς

TMEFF2

mRNA, που υποστηρίζουν τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται παραπάνω χρησιμοποιώντας έναν ανταποκριτή TMEFF2-λουσιφεράσης.

Α) Αντιπροσωπευτική κηλίδα western που αποδεικνύουν την πρωτεΐνη TMEFF2 στα δεικνυόμενα χρονικά σημεία μετά την προσθήκη 10 ηΜ DHT παρουσία ή απουσία 5 ηΜ ακτινομυκίνη D (Act D) για να εμποδίσει τη μεταγραφή. Είτε DMSO ή DHT και ακτινομυκίνη D προστέθηκαν ταυτόχρονα. Η ποσοτικοποίηση των κηλίδων παρουσιάζεται κάτω από την κηλίδα western. Οι εντάσεις ζώνης των δειγμάτων που έλαβαν θεραπεία με DHT κανονικοποιήθηκαν πρώτα σε β-τουμπουλίνης και στη συνέχεια προς τις τιμές που λαμβάνονται για τα δείγματα DMSO στα αντίστοιχα χρονικά σημεία. Β) Μεταβολές

ΤΜΕΡΡ2

επίπεδα mRNA σε 22Rv1 κύτταρα σε απόκριση DHT ή DMSO και ακτινομυκίνη D αγωγή όπως μετράται από qRT-PCR. Τιμές ομαλοποιήθηκαν σε

GAPDH

. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά των δύο ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Άλλες πρωτεΐνες συμπεριλαμβανομένων των β-κατενίνης και occludin μετατοπίζονται στον πυρήνα ή περιοχές της κυτταρικής επαφής μετά τη θεραπεία ανδρογόνων. Ωστόσο, τα αποτελέσματά μας έδειξε ότι η θεραπεία με ανδρογόνα δεν μετέβαλε το υποκυτταρικό εντοπισμό των ΤΜΕΡΡ2 (Σχήμα S1).

ανδρογόνων Σηματοδοσίας Προωθεί eIF2α φωσφορυλίωση

Η φωσφορυλίωση της eIF2α μειώνει την παγκόσμια μετάφραση, αλλά παρέχει επίσης ένα μηχανισμό που επιλεκτικά ενισχύει μετάφραση του uORF περιέχουν mRNAs [13], [20]. Ως εκ τούτου, υποθέσαμε ότι DHT προωθεί την ενδογενή

ΤΜΕΡΡ2

μετάφραση μέσω φωσφορυλίωσης της eIF2α. Η επίδραση της DHT επί της φωσφορυλίωσης eIF2α εξετάστηκε με ανάλυση κηλίδος western στον καρκίνο του προστάτη 22Rv1 και τα κύτταρα PC3 αναπτύχθηκαν σε ελεύθερο ερυθρού φαινόλης μέσο συμπληρωμένο με CS-FBS και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις της DHT. Αυξημένα επίπεδα eIF2α-P ήταν σαφώς ανιχνεύθηκαν, με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, σε προϊόντα λύσης από 22Rv1 κύτταρα DHT επεξεργασμένα, αλλά όχι σε κυτταρολύματα από AR-ηυΙΙ κύτταρα PC3 DHT-κατεργασία (Σχήμα 5Α), υποδεικνύοντας ότι τα ανδρογόνα προάγουν eIF2α-P και ότι αυτή η επίδραση εξαρτάται από την παρουσία ενός λειτουργικού AR. Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα αυτά, προκατεργασία των κυττάρων 22Rv1 με τον ανταγωνιστή βικαλουταμίδης AR εμπόδισε μεσολαβεί DHT αυξήσεις στη φωσφορυλίωση eIF2α (Σχήμα 5Β). Επιπλέον DHT προωθείται επίσης μια αύξηση στην έκφραση της πρωτεΐνης ATF4, έναν παράγοντα μεταγραφής που ρυθμίζεται από φωσφορυλίωση eIF2α (Σχήμα 5Α).

Α) Αντιπροσωπευτική κηλίδες Western που δείχνει αύξηση των eIF2α-P σε απόκριση προσθήκης DHT σε 22Rv1 κύτταρα. Αυτό το αποτέλεσμα καταργήθηκε σε κύτταρα PC3, τα οποία δεν εκφράζουν AR (δεξιά). επίπεδα πρωτεΐνης ATF4 μετρήθηκαν ως ένας θετικός έλεγχος επειδή προκαλείται από eIF2α-P. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Β) προσθήκη 20 μΜ βικαλουταμίδης να 22Rv1 κύτταρα εμποδίζεται η αύξηση στην eIF2α-Ρ που παρατηρείται μετά την προσθήκη του DHT.