Αφηρημένο

Η γεμσιταμπίνη, ένας αποτελεσματικός παράγοντας στη θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος, έχει υποστεί βλάβες σε πολλές περιπτώσεις μετά από πολλαπλούς κύκλους θεραπείας οφείλεται σε εμφάνιση ανθεκτικότητας στα φάρμακα. Συνδυασμός των διαιτητικών ενώσεων με κλινικά επικυρωθεί φάρμακα έχει αναδειχθεί ως ένα αποτελεσματικό θεραπευτική προσέγγιση για τη θεραπεία όγκων του παγκρέατος, ανθεκτικοί στην θεραπεία γεμσιταβίνης. Για να βελτιστοποιήσουν μια πιθανή συνεργιστική συνδυασμός της Γεμσιταβίνη (ΕΚΒ) με διαιτητικές μόρια, Betuilnic οξύ (BA) και Thymoquinone (ΔΠ), stand-alone IC

50 δόση της GCB, η BA και η ΔΠ υπολογίστηκε για τον καρκίνο του παγκρέατος κυτταρικές σειρές . Σταθερή αναλογία IC

50 δόση των διατροφικών μορίων σε συνδυασμό με μειωμένη IC

50 δόση του GCB δοκιμάστηκε σε GCB ανθεκτικά PANC-1 και ευαίσθητα κύτταρα ΜΙΑ PaCa-2 για συνεργία, προσθετικό απόκριση και ανταγωνισμού, χρησιμοποιώντας CalcuSyn. δείκτη συνδυασμού (CI) αποκάλυψε ότι η προ-θεραπεία της ΒΑ και ΔΠ μαζί με GCB ανέστειλε συνεργιστικά τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων σε

in-vitro

πειράματα. πυροσταφυλική κινάση (ΡΚ) M2 ισομορφή, ένα πολλά υποσχόμενο στόχο που εμπλέκονται στο μεταβολισμό των καρκινικών κυττάρων, έδειξε ρύθμιση προς τα κάτω στην παρουσία της ΔΠ ή BA σε συνδυασμό με GCB. GCB με BA ενήργησε κατά προτίμηση σε μιτοχόνδρια των όγκων και προκάλεσε μιτοχονδριακό μετάβαση διαπερατότητα. Προ-έκθεση των κυτταρικών γραμμών, ΜΙΑ PaCa-2 και PANC-1, για να TQ σε συνδυασμό με επαγόμενη GCB απόπτωση. Έτσι, η αποτελεσματικότητα της ΒΑ ή ΔΠ σε συνδυασμό με GCB να αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, διεγείρουν απόπτωση και ρυθμίζουν προς τα κάτω την έκφραση της PKM2, αντανακλά υπόσχεση σε παγκρεατικά θεραπεία του καρκίνου

Παράθεση:. Pandita Α, Kumar Β, Manvati S, Vaishnavi S, Singh SK, Bamezai RNK (2014) συνεργιστικό συνδυασμό των γεμσιταβίνη και Διαιτητικές Molecule επάγει την απόπτωση σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα και Κάτω ρυθμίζει την έκφραση PKM2. PLoS ONE 9 (9): e107154. doi: 10.1371 /journal.pone.0107154

Επιμέλεια: Ajay Pratap Singh, Πανεπιστήμιο της Νότιας Αλαμπάμα Mitchell Ινστιτούτο Καρκίνου, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 24, 2014? Αποδεκτές: 13 Αυγ 2014? Δημοσιεύθηκε: 8 του Σεπτέμβρη του 2014

Copyright: © 2014 Pandita et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:.. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

προσπάθειες έχουν madeto βελτιώσει την αποτελεσματικότητα των κλινικά επικυρωθεί φαρμάκων σε θεραπευτική αγωγή σε συνδυασμό με την ενίσχυση της απόκρισης τους προς πυρίμαχων όγκων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του παγκρέατος [1]. Εκτός από 5-φλουορουρακίλη, Γεμσιταβίνη (GCB), ένα ευρέως χρησιμοποιούμενο χημειοθεραπευτικό φάρμακο για τον καρκίνο του παγκρέατος, έχει δείξει αποτυχίες μετά από πολλαπλούς κύκλους θεραπείας λόγω της εμφάνισης της ανθεκτικότητας στα φάρμακα [2], [3]. Θεραπεία του παγκρέατος όγκους που είναι ανθεκτικοί στη θεραπεία γεμσιταμπίνη είναι μια πρόκληση για τους ογκολόγους. Οι προσπάθειες, όπως και σε άλλους καρκίνους, να στοχεύουν τις βασικές διαδικασίες, όπως καρκινογόνο μεταβολισμό, την κυτταρική διαίρεση, διαφοροποίηση, την απόπτωση, την ανάπτυξη καρκίνου του παγκρέατος, έχει δημιουργήσει ενδιαφέρον για διαιτητικές φυτοχημικά για πιθανές χημειοπρόληψη του καρκίνου. Μια μηχανιστική σύνδεση μεταξύ της διατροφής και του καρκίνου του παγκρέατος προέρχεται από καιρό αναγνωρισμένο αλληλεξάρτηση της [4]. Ένα τέτοιο διαιτητικό παράγοντα, τα οποία θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν σε συνδυασμό με GCB για τη θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος, είναι betulinic οξύ (ΒΑ), μια φυσικώς απαντώμενη πεντα-κυκλικό-τριτερπενίου με μια ποικιλία βιολογικών δραστηριοτήτων, συμπεριλαμβανομένης ισχυρές αντικαρκινικές ιδιότητες [5]. BA περιέχεται στο εξωτερικό φλοιό των διαφόρων φυτών σε όλο το φυτικό βασίλειο, συμπεριλαμβανομένου του λευκού-barked σημύδα δέντρα [6], με αντι-φλεγμονώδη, αντι-ιικές και αντι-νεοπλασματικές ιδιότητες [7]. Αντικαρκινική δράση του ΒΑ έχει συνδεθεί με την ικανότητά του να ενεργοποιεί κατευθείαν μιτοχονδριακής διαπερατότητας της μεμβράνης, ένα κεντρικό γεγονός στην αποπτωτική διαδικασία, αυξάνοντας την ελπίδα να παρακάμψει την αντίσταση σε συμβατικά χημειοθεραπευτικά [6]. Thymoquinone (ΔΠ), μια άλλη πιθανή αντικαρκινική-nutraceutical παράγοντας, είναι μια βιοενεργά ένωση που προέρχεται από το μαύρο σπόρο (

Nigella sativa

) πετρελαίου. Σε λαογραφία ιατρική, η κατανάλωση του σπόρου ΔΠ έχει συσχετιστεί με διαφορετικές θεραπευτικά οφέλη στο βρογχικό άσθμα, δυσεντερία, κεφαλαλγία, γαστρεντερικά προβλήματα, έκζεμα, υπέρταση και παχυσαρκία [8]. Στο πλαίσιο του καρκίνου, TQ αναφέρεται ότι επιδεικνύει αντι-πολλαπλασιαστικά αποτελέσματα σε κυτταρικές σειρές, που προέρχονται από το στήθος, του παχέος εντέρου, των ωοθηκών, του λάρυγγα, του πνεύμονα, μυελοβλαστική λευχαιμία και οστεοσαρκώματος [9] – [15]? και δράση αντι-μετάσταση στον καρκίνο humanpancreatic. Έχει αποδειχθεί για να καταστείλει την μετανάστευση και την διείσδυση των κυττάρων PANC-1 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο [16] και ρυθμίζουν προς τα κάτω NF-kappa Β και έκφραση ΜΜΡ-9. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει επίσης την βιολογική δραστικότητα του thymoquinone (ΔΠ) σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα

in vitro

. Αυτό αποκάλυψε χημειο-ευαισθητοποίηση των επίδρασή του μετά την προ-έκθεση των κυττάρων σε ΔΠ (25 μmol /L) για 48 ώρες, που ακολουθείται από gemcitabine ή οξαλιπλατίνη, με αποτέλεσμα το 60% έως 80% αναστολή της ανάπτυξης σε σύγκριση με 15% έως 25% . της αναστολής με γεμσιταβίνη ή oxaliplatinalone [17]

Τα καρκινικά κύτταρα, που εξαρτώνται κυρίως από την επαναπρογραμματισμό των μεταβολικών αναγκών τους, καταναλώνουν περισσότερη γλυκόζη και παράγει μια μεγάλη ποσότητα γαλακτικού οξέος, ακόμη και σε καλά οξυγονωμένο περιβάλλον? η διαδικασία ονομάζεται ως αερόβια γλυκόλυση ή «φαινόμενο Warburg» [18], [19]. Ενώ η κανονική διαφοροποιημένα κύτταρα μεγιστοποιηθεί η παραγωγή ΑΤΡ από μιτοχονδριακή οξειδωτική φωσφορυλίωση της γλυκόζης κάτω από συνθήκες ορθοξικές, τα καρκινικά κύτταρα παράγουν πολύ λιγότερο ΑΤΡ από γλυκόζη με αερόβια γλυκόλυση. Παρά το γεγονός ότι λιγότερο αποτελεσματικοί σε παραγωγή ΑΤΡ, γλυκόλυση είναι ένα πολύ πιο γρήγορη διαδικασία σε καρκινικά κύτταρα [20], [21]. Εδώ πυροσταφυλική κινάση (ΡΚ) καταλύει την τελευταία αντίδραση με μεταφορά μιας φωσφορικής ομάδας υψηλής ενέργειας από φωσφο-enolpyruvate (PEP) προς ADP, παράγοντας ΑΤΡ και πυροσταφυλικό η οποία ανάγεται σε γαλακτικό με γαλακτική αφυδρογονάση (LDH) στο κυτταρόπλασμα. πυροσταφυλική κινάση (ΡΚ) αποτελείται από τέσσερις ισομορφές, εκ των οποίων PKM2 εκφράζει κυρίως σε καρκινικά κύτταρα [22]. Αυτές είναι: κόλον [23], νεφρικών κυττάρων [24], του πνεύμονα [25] και άλλοι. PKM2 έχει δειχθεί ότι δρα ως ένας δείκτης για: νεφροκυτταρικό καρκίνωμα (RCC) [26], [27], ο καρκίνος των όρχεων [28], του καρκίνου του μαστού [29], ουρολογικές όγκους [30], καρκίνωμα του πνεύμονα, ο καρκίνος του τραχήλου της μήτρας, και όγκων του γαστρεντερικού [31]? και με μια πιθανή ανίχνευση στα κόπρανα των ασθενών με γαστρικό και του παχέος εντέρου [32]. Στο πρόσφατο παρελθόν, φασματομετρία μάζας έδειξε περαιτέρω μια κυρίαρχη παρουσία PKM2 σε:. RCC, καρκίνωμα της ουροδόχου κύστεως, ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα, ορθοκολικό καρκίνο, καρκίνωμα του πνεύμονα, και θυρεοειδή θυλακιώδη αδενώματος [33]

Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε η επίδραση της ΒΑ ή ΔΠ με GCB, ανεξάρτητα και σε συνδυασμό, σε ανθρώπινα κύτταρα αδενοκαρκινώματος, ΜΙΑ PaCa-2 και PANC-1, για να επάγουν κυτταρικό θάνατο. εκτιμήθηκε υποκείμενο μηχανισμό δράσης τους, ιδίως όσον αφορά την έκφραση PKM2 και δραστηριότητας και των μιτοχονδρίων μετάβασης διαπερατότητα.

Υλικά και Μέθοδοι

Γραμμές κυττάρων, τη συντήρηση και αντιδραστήρια

Ανθρώπινο παγκρέατος κυτταρικές σειρές καρκίνου, PANC-1 και ΜΙΑ PaCa-2 αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε DMEM συμπληρωμένο με 10% βόειο εμβρυϊκό ορό στους 37 ° C σε υγροποιημένη 5% CO

2 ατμόσφαιρα. Γλουταμίνη, HEPES ή πυροσταφυλικό νάτριο συμπληρώματα, προστέθηκαν για να διατηρηθεί σωστή ανάπτυξη των κυττάρων. Betulinic οξύ (ΒΑ), Thymoquinone (TQ), γεμσιταβίνη (GCB), διμεθυλοθειαζολο-2-υλο-2, 5-διφαινυλ-τετραζολίου-βρωμίδιο (ΜΤΤ), Rodhamine-123 (Rh-123), ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ) και άλλα χημικά (Sigma Chemical Co, USA)? μαζί με κιτ ανίχνευσης απόπτωσης Annexin-V-FITC (Cayman Chemical Company), αντισώματα έναντι: προ-κασπάση-3, βήτα-ακτίνη, PKM2, πολυ-ΑϋΡ-ριβόζη πολυμεράση (PARP) (Cell Signaling), είχαν αγοραστεί και να χρησιμοποιηθεί στη μελέτη.

προφίλ Θεραπεία και βιωσιμότητα των κυττάρων δοκιμασία

κύτταρα ΜΙΑ PaCa-2 PANC-1 και αναπτύχθηκαν σε φιάλες Τ-75. Μετά από 80% συρροή, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και φυγοκεντρήθηκαν στα 100 χ g για 5 λεπτά. Το σφαιρίδιο του κυττάρου εναιωρήθηκε σε ϋΜΕΜ μέσο? και 2 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο διανέμονται σε Nunclon-96-φρεατίων επίπεδου πυθμένα πλάκες να προσκολληθούν για 24 ώρες. Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε διαφορετικές συγκεντρώσεις της ΒΑ, ΔΠ και GCB, μεμονωμένα και σε συνδυασμούς. Σε πειράματα συνδυασμού, τα κύτταρα πρώτα σε επεξεργασία και ευαισθητοποιημένα με ΒΑ ή TQ για 24 ώρες, που ακολουθείται από έκθεση σε GCB για επόμενες 24 ώρες και επωάζονται σε CO

2 επωαστήρα στους 37 ° C. Για τη δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας, διάλυμα ΜΤΤ (20 μΙ 2.5 mg /ml σε DMEM) προστέθηκε σε κάθε κοιλότητα και τα τρυβλία καλλιέργειας αναδεύτηκε ήπια, και ακολούθησε επώαση σε CO

2 επωαστήρα στους 37 ° C για 3 ώρες. Το υπερκείμενο αναρροφήθηκε και οι κρύσταλλοι ΜΤΤ-φορμαζόνης διαλύθηκαν σε 150 μΙ DMSO. Οι πλάκες και πάλι επωάζονται στους 37 ° C και αναδεύεται για 10 λεπτά σε έναν αναδευτήρα πλακός. Η απορρόφηση του DMSO κρύσταλλοι διαλύονται ΜΤΤ-φορμαζόνης μετρήθηκε στα 570 nm. τιμές Chemo-ευαισθησίας εκφράστηκαν ως% κυτταρική βιωσιμότητα της συγκέντρωσης του φαρμάκου που ανέστειλε την κυτταρική ανάπτυξη κατά 50%? και το IC

50 τιμές που υπολογίζονται από τις σχέσεις συγκέντρωσης-επίδρασης, χρησιμοποιώντας Graph Pad πρίσμα Έκδοση 5.00.

Ανάλυση των συνδυασμένων επιπτώσεων των ναρκωτικών

συνέργεια των ναρκωτικών προσδιορίστηκε από ισοβολογραφήματος και συνδυασμός- μέθοδοι δείκτη, που προέρχεται από την αρχή μέσου αποτελέσματος των Chou και Talalay [34], με τη χρήση του λογισμικού CalcuSyn (Biosoft, Version 2.1). Τα δεδομένα που λαμβάνονται από τα πειράματα αναστολής αύξησης χρησιμοποιήθηκε για την εκτέλεση αυτών των αναλύσεων. Η μέθοδος ισοβολόγραμμα είναι μια γραφική αναπαράσταση της φαρμακολογικής αλληλεπίδρασης? και σχηματίζεται με την επιλογή ενός επιθυμητού επηρεάζονται κλασματική θανάτωση κυττάρων (Fa). Μια ευθεία γραμμή συντάχθηκε για να συνδέσετε τον Φα πόντοι που καταγράφεται σε πειραματικά χρησιμοποιούνται συνδυασμοί σταθερή αναλογία του φαρμάκου (GCB) και τη διαιτητική μόριο (BA ή ΔΠ) σε Χ και Υ-άξονες για τη δημιουργία ισοβολογραμμάτων. σημεία δεδομένων συνδυασμός που έπεσε στη γραμμή αντιπροσώπευε μια αλληλεπίδραση φαρμάκου-φαρμάκου πρόσθετο? λαμβάνοντας υπόψη ότι τα σημεία δεδομένων που ήταν κάτω ή πάνω από τη γραμμή αντιπροσωπεύεται συνέργεια ή ανταγωνισμού, αντιστοίχως. Ο συνδυασμός-δείκτης (CI), μια αριθμητική τιμή, υπολογίστηκε από τον τύπο [35]: Όπου, C

Α, Χ και C

Β, Χ, ήταν οι συγκεντρώσεις του φαρμάκου Α anddrug Β, που χρησιμοποιούνται σε συνδυασμό για να επιτευχθεί x επίδραση% φάρμακο. IC

Χ, Α και IC

Χ, Β ήσαν οι συγκεντρώσεις των μεμονωμένων παραγόντων για να επιτευχθεί το ίδιο αποτέλεσμα.

Ο συνδυασμός-δείκτης (CI) μέθοδος είναι μια μαθηματική και ποσοτική αναπαράσταση ενός δύο -drug φαρμακολογική αλληλεπίδραση. Χρησιμοποιώντας τα δεδομένα από την ανασταλτική πειράματα ανάπτυξης και μηχανογραφημένη λογισμικό, τιμές CI παρήχθησαν σε ένα φάσμα των επιπέδων Φα από 0,05 με 0,90 (5% -90% αναστολή της ανάπτυξης). Μια CI 1 έδειξε αθροιστική δράση μεταξύ των δύο παραγόντων, ενώ ένα CI & lt? 1 ή CI & gt? 1 υποδεικνύεται, συνεργισμό ή ανταγωνισμού, αντιστοίχως.

Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής για την ανίχνευση της απόπτωσης

1 × 10

5 κύτταρα /ml /φρεάτιο ΜΙΑ PaCa-2 και PANC-1 ήταν κατεργάζεται με ΒΑ, ΔΠ, και GCB μόνο και σε συνδυασμό επί 48 ώρες. Τα κύτταρα πλύθηκαν και χρωματίστηκαν με Annexin-V-FITC αντισώματος και ΡΙ, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. δοκιμασία οικόπεδο dot κυτταρομετρίας ροής διεξήχθη και τα κύτταρα σαρώνονται για την ένταση φθορισμού στο FL-1 (FITC) και FL-2 (PI) κανάλια. Το κλάσμα του κυτταρικού πληθυσμού σε διαφορετικά τεταρτημόρια αναλύθηκε, χρησιμοποιώντας τεταρτημόριο στατιστικές. Τα κύτταρα στην κάτω δεξιά τεταρτημόριο, εκπροσωπούμενη απόπτωση? και στην πάνω δεξιά τεταρτημόριο, νέκρωση ή μετά αποπτωτικών νέκρωση [36].

Μέτρηση της μιτοχονδριακής μεμβράνης δυναμικό

1 × 10

5 κύτταρα /ml /και της MIA PaCa-2 και PANC-1 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ΒΑ, ΔΠ, και μόνο και σε συνδυασμό GCB σε πλάκα 12 φρεατίων για 48 ώρες. Στην τελευταία από 1 ώρα επώασης, πριν από τη λήξη της έκθεσης, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με ροδαμίνη-123 (5 μg /ml). Τα κύτταρα πλύθηκαν σε PBS και φυγοκεντρήθηκαν στα 100 χ g για 5 λεπτά και αιωρούνται σε PBS. Για την ανίχνευση των αλλαγών στην μιτοχονδριακή μεμβράνη trans-δυναμικό (ψ), σαν αποτέλεσμα της μιτοχονδριακής διαταραχής, μία μείωση στην ένταση φθορισμού αναλύθηκε ροής cytometrically επί FL-1channel [37].

Παρασκευή λύματος ολόκληρων κυττάρων και ανοσοαποτύπωση

Cells, (2 × 10

6/6 mL μέσου /60 χιλιοστά πλάκα καλλιέργειας ιστού) που εκτίθενται σε BA, ΔΠ, και GCB μεμονωμένα και σε συνδυασμό μετά από 48 ώρες θεραπείας, συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση και πλύθηκε με PBS.The σφαιρίδιο που ελήφθη λύθηκαν με παγωμένο ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (50 mMTris ρΗ 8,0, 150 mMNaCl, 5 mM EDTA, 1% ν /ν Nonidet Ρ-40, 1 mM PMSF και 1% (ν /ν) αναστολέα πρωτεάσης κοκτέιλ) και διατηρήθηκε για 30 λεπτά σε πάγο με ενδιάμεσο κτύπημα μετά από κάθε 5 λεπτά. Τα προϊόντα λύσης φυγοκεντρήθηκαν στα 12.000 g για 10 λεπτά στους 4 ° C και το υπερκείμενο συλλέχθηκε για ανοσοκηλίδωση [38]. Το υπερκείμενο που συλλέγονται προσδιορίστηκε ποσοτικά χρησιμοποιώντας δοκιμασία δικιγχονικού οξύ (δοκιμασία BCA) σετ από Thermo Scientific. Για ανάλυση στυπώματος Western, 50 μg συνολικής πρωτεΐνης αναλύθηκε σε SDS-PAGE σε 60 V και στη συνέχεια μεταφέρονται ηλεκτρο σε μεμβράνη PVDF όλη τη νύκτα στους 4 ° C με ρεύμα 30 V. Η μη ειδική δέσμευση στις πρωτεΐνες μπλοκαρίστηκε με 5% μη λιπαρό γάλα σε Tris-ρυθμισμένο αλατούχο διάλυμα, που περιέχει 0,1% Tween-20 (TBST), για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Τα στυπώματα ανιχνεύθηκαν με τα αντίστοιχα πρωτογενή ποντίκι /κουνέλι /κατσίκας αντι ανθρώπινα αντισώματα για 2 ώρες και πλύθηκαν τρεις φορές με TBST. Οι κηλίδες ακολούθως επωάζονται με υπεροξειδάση κρένου συζευγμένη δευτερογενή αντισώματα για 1 ώρα, πλύθηκαν και πάλι τρεις φορές με TBST και ανιχνεύθηκαν σήματα χρησιμοποιώντας ECL συν κιτ χημειοφωταύγειας σε ένα φιλμ ακτίνων Χ [38].

δραστηριότητα PKM2 δοκιμασία

δραστικότητα PKM2 μετρήθηκε φασματο-φωτομετρικά (UV-1800, Shimadzu, Ιαπωνία), χρησιμοποιώντας NADH /γαλακτικής αφυδρογονάσης (LDH) συζευγμένο ανάλυσης όπως περιγράφηκε προηγουμένως [39].

Στατιστική ανάλυση

δεδομένα των πειραμάτων που διεξάγονται εις τριπλούν εκφράστηκε ως μέση τιμή +/- SD, εκτός εάν υποδεικνύεται διαφορετικά. Οι συγκρίσεις έγιναν μεταξύ ομάδων ελέγχου και θεραπείας, χρησιμοποιώντας μονόδρομη ANOVA (Dunnett ή Tukey) και Ρ τιμές & lt?. 0.01 θεωρήθηκαν σημαντικές

Αποτελέσματα

In vitro

συνδυασμός μελέτες γκεμσιταμπίνης με betulinic οξύ και thymoquinone

η χημειο-ευαισθησία σε καρκίνο του παγκρέατος κυτταρικές σειρές, ΜΙΑ PaCa-2 και PANC-1, προς την κατεύθυνση της GCB ναρκωτικών και τη διαιτητική μόρια, BA ή ΔΠ, αντικατοπτρίζεται στην αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης, η οποία υπολογίζεται από την IC

50 (50% αναστολή ανάπτυξης) σε 48 ώρες? και συγκρίνονται αρχικά με τις τιμές που λαμβάνονται σε ένα κύτταρο ελέγχου γραμμής, FR2. Το IC

50 τιμές που λαμβάνονται από ανεξάρτητες θεραπεία στις τρεις κυτταρικές γραμμές, ΜΙΑ PaCa-2, PANC-1 και FR2, παρέχονται λεπτομερώς στον Πίνακα 1 (ΒΑ: 25 ± 0,9 μΜ, 23,5 ± 3,5 μΜ, 50 ± 1 μΜ? ΔΠ 36 ± 0,28 μΜ, 23 ± 2 μΜ και 77 ± 2 μΜ? GCB 1 ± 0,66 μΜ, 5.5 ± 2.5 μΜ και & lt? 0.025 μΜ). Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν με μονόδρομη Annova-Dunnett παρουσιάζοντας σημαντική (τιμή ρ & lt? 0.01) αποτέλεσμα μεταξύ αγωγή, σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 1). Με βάση αυτά τα αποτελέσματα, επιλέχθηκε σταθερή αναλογία φαρμάκου (GCB: ΒΑ ή GCB: TQ) σε μία περιοχή συγκεντρώσεων φαρμάκου και χρησιμοποιούνται σε περαιτέρω πειραματισμούς (Σχήμα 2). Συνδυασμός-δείκτη (CI) χρησιμοποιήθηκε για να αναλύσει και να επιβεβαιώσει συνέργεια παρατηρείται μετά την προ-επεξεργασία των κυττάρων με διαιτητικές μόριο, ακολουθούμενη από την έκθεση σε GCB για 48 ώρες (GCB: BA και GCB: TQ). Οι τιμές CI, παρέχοντας ένα ποσοτικό μέτρο του βαθμού αλληλεπίδρασης φαρμάκου, υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό CalcuSyn, σε τιμές Fa 0,50, 0,75, και 0,90 (Πίνακας 2). Ισοβολογράμματα κατασκευαστεί για αυτές τις τιμές, που αντιπροσωπεύουν το 50%, 75% και 90% αναστολή ανάπτυξης αντίστοιχα, τόσο για ΜΙΑ PaCa-2 και PANC-1 κύτταρα (Σχήμα 3) και πλοκή Fa-CI, παρέχεται ως Σχήμα S1. Ο Πίνακας 3 απεικονίζει τις τιμές CI σε Φα των 0,50 – 0,90 για τις διατροφικές μόρια (BA ή ΔΠ) και τα ναρκωτικά (ΕΚΒ). Μια σύγκριση της μονοθεραπείας (BA, GCB, TQ) με συνδυασμό (CI

(GCB: BA) και CI

(GCB: TQ)) έδειξε σημαντική διαφορά στην τιμή p & lt? 0,01. Οι τιμές ED της isolobologram για ΜΙΑ PaCa-2 και PANC-1 αναφέρονται στον Πίνακα S1. Στα κύτταρα ΜΙΑ PaCa-2, που ευαισθητοποιούνται με BA και ακολούθησε με την έκθεση GCB, το CI

(GCB: BA) τιμές που λαμβάνονται σε δόσεις (6.25:0.082 και 25:0.33) ήταν 0.519, 0.889. Με ΔΠ, η CI

(GCB: TQ) σε δόσεις (4.5:0.082? 9:0.15 και 36:0.66) έδειξε τις τιμές των 0.721, 1.050, 0.681. Ωστόσο, σε PANC-1 το CI

(GCB: BA) στο (5:1.3 και 20:5.2) δόσεις έδειξε 0,766, 0,429 και με ΔΠ CI

(GCB: TQ) σε δόσεις (6.25:1.3 και 25:5.3), οι τιμές ήταν 0.736, 0.371. Οι τιμές CI του & lt? 1? & Lt? 0.5 και & gt? 1, εκπροσωπούμενης συνέργεια, ισχυρή συνέργεια και ανταγωνιστικό αποτέλεσμα, αντίστοιχα. Η συνέργεια παρατηρήθηκε σε ένα ευρύ φάσμα συγκεντρώσεων και στα δύο κυτταρικές σειρές που μελετήθηκαν παγκρεατικού όγκου. Συνεργιστική συνδυασμός φαρμάκων, δηλαδή CI (ο δείκτης συνδυασμός) των CI

(GCB: BA) (25 + 0.33) και CI

(GCB: TQ) (36 + 0,66) σε ΜΙΑ PaCa-2cell γραμμή και CI

(GCB: ΒΑ) (20 + 5,25) και CI

(GCB: TQ) (25 + 5,25) σε PANC-1, που αντιπροσωπεύει την τιμή Φα 0,75 (δείχνοντας 75% αναστολή), χρησιμοποιήθηκαν σε ανάπαυση από τις δοκιμασίες . Ωστόσο, η κανονική κυτταρική γραμμή που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη (FR2), για σύγκριση σαν ένας έλεγχος, έδειξαν αναστολή στην αξία Φα από 0,75 έως 0,90. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η επίδραση των διαιτητικών μορίων (ΒΑ ή TQ) σε φυσιολογικά κύτταρα παρατηρήθηκε σε μία υψηλή συγκέντρωση? ενώ μόνο ένα ελάχιστο δόση GCB απαιτήθηκε για την αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Σε περίπτωση μελέτες συνδυασμού, η συνολική έκθεση της γεμσιταβίνης στα καρκινικά κύτταρα ήταν μόνο για 24 ώρες.

IC

50

αξία υπολογίστηκε για την πώληση

Ανθρώπινο πάγκρεας αδενοκαρκίνωμα

em

κυτταρικές σειρές (Α) ΜΙΑ PaCa-2 (Β) PANC-1 και (Γ) Η κανονική κυτταρική σειρά FR2: για ατομική θεραπεία γεμσιταμπίνη, Thymoquinone και betulinic οξέος για 48 ώρες (** , σημαντική ως compaired να ελέγχεται σε τιμή p & lt?. 0.01, n = 3) σε-μεταξύ των τριών κυτταρικών σειρών

η

(Α) ΜΙΑ PaCa-2 και (Β) κύτταρα PANC-1 είχαν εκτεθεί σε διαβαθμισμένες συγκεντρώσεις της betulinic οξύ, Thymoquinone ή γεμσιταβίνη είτε μόνα τους είτε σε συνδυασμό με σταθερό λόγο δόσεων betulinic οξέος έναντι της γεμσιταβίνης και Thymoquinone εναντίον γεμσιταβίνη για 48 ώρες. (Η γεμσιταβίνη

έχοντας έκθεσης για 24 ώρες μόνο στην περίπτωση συνδυασμού), γεμσιταβίνη (τετράγωνα),

betulinic οξύ και Thymoquinone

(κύκλος) γεμσιταβίνη + betulinic οξύ και γεμσιταβίνη + Thymoquinone (τρίγωνο). (θεραπεία Mono ( BA, GCB, TQ) Versus συνδυασμοί (CI

(GCB: BA), CI

(GCB: TQ).) (**, σημαντική διαφορά στην τιμή p & lt? 0.01, n = 3)

η

(Α και Β) Εμφάνιση isolobolograms ανάλυση του συνδυασμού της γεμσιταβίνης, betulinic οξύ ή Thymoquinone στο (Α) κύτταρα μΙΑ PaCa-2 με αναλογία σταθερού φαρμάκου 1:0.01 του ΕΚΒ : BA και GCB: ΔΠ

(Β) PANC-1 κύτταρα με μια σταθερή αναλογία 1:0.2 φάρμακο GCB: BA και GCB: ΔΠ. Οι επιμέρους δόσεις gemcitabine, betulinic οξύ και Thymoquinone, για να επιτευχθεί το 90% (ευθεία γραμμή) αναστολής ανάπτυξης (Fa = 0,90), 75% (ενωτικό γραμμή) αναστολής ανάπτυξης (Fa = 0,75) και 50% (σταυροί) αναστολή της ανάπτυξης ( fa = 0.50) απεικονίσθηκαν για την x και y άξονες. δείκτης συνδυασμού (CI) τιμές που υπολογίζονται χρησιμοποιώντας το λογισμικό CalcuSyn αντιπροσωπεύεται από τα σημεία παραπάνω (indicating- ανταγωνισμός μεταξύ των φαρμάκων) ή κάτω από τις γραμμές (indicating- συνέργεια). (Σύμβολο Χ) ED50, (συν) ED75 και (ανοιχτή διακεκομμένη κύκλο) ED90 (μονοθεραπεία (BA, GCB, TQ) έναντι συνδυασμών (CI

(GCB: BA), CI

(GCB: TQ)) (*** σημαντική διαφορά στην τιμή p & lt? 0.001, n = 3).

Η

Η

Η

Η απώλεια της μιτοχονδριακής μεμβράνης δυναμικό

BA ή TQ προεπεξεργασία μΙΑ PaCa-2 και κύτταρα μαζί με GCB, σε συνδυασμό και ανεξάρτητα 1 PANC-, όταν αναλύθηκε για Rh-123 πρόσληψη από cytometery ροής, εμφανίζεται απώλεια 11% και 17% δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης (ΜΜΡ) , σε MIA κύτταρα PaCa-2 υποβάλλεται σε επεξεργασία με 0,33 μΜ και 0,66 μΜ GCB, αντίστοιχα, ενώ σε συνδυασμό, CI

(BA: GCB)., ήταν thedecrease 77% σε σύγκριση με τον μάρτυρα (ρ τιμή & lt? 0.001) (Σχήμα . 4Α) Ωστόσο, τα κύτταρα PANC-1, η οποία είναι σχετικά ανθεκτικά στην GCB σε σύγκριση με μΙΑ PaCa-2, έδειξε μια μείωση της τάξης του 74% μόνο με BA και σε συνδυασμό, CI

(GCB: BA), η μείωση ήταν επάνω to46%, σε σύγκριση με τον μάρτυρα (ρ τιμή & lt? 0.001). η αγωγή με την ατομική δόση GCB δηλαδή 5,25 μΜ, έδειξε μια μείωση έως και 13% (Σχήμα 4Β). TQ μόνη ή σε συνδυασμό με GCB δεν έδειξε καμία αλλαγή στο ΜΜΡ και στις δύο κυτταρικές σειρές. Προφανώς, η BA ισο-ισχυρώς στοχευμένη μιτοχονδριακών λειτουργιών από ΔΠ και GCB, στους δύο τύπους κυττάρων. Στα μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου, σχεδόν όλα τα κύτταρα ήταν βιο-ενεργά ενεργός, όπως αποδεικνύεται από τα υψηλά Rh-123 φθορισμού

(Α) ΜΙΑ PaCa-2:. Betulinic οξύ

μόνος και σε συνδυασμό CI

(GCB: BA) με γεμσιταβίνη προκαλούμενη απώλεια του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης (ψ) η οποία δεν παρατηρείται σε Thymoquinone και γεμσιταβίνη ούτε μόνος ούτε σε συνδυασμό CI

(GCB: TQ). Τα κύτταρα βάφτηκαν με ροδαμίνη-123 (5 mg /mL) για 1 ώρα και αναλύθηκαν σε FL-1 κανάλι του κυτταρόμετρου ροής. Δεδομένων σε όλα τα στοιχεία που είναι αντιπροσωπευτικά του ενός από τα τρία παρόμοια πειράματα. (Β) Παρόμοιες μελέτες διεξήχθησαν σε PANC-1 κυτταρική γραμμή, betulinic οξύ μόνο προκαλεί μεγαλύτερη απώλεια της μιτοχονδριακής μεμβράνης από σε συνδυασμό με γεμσιταβίνη CI

(GCB: BA) επίσης δεν παρατηρήθηκε καμία απώλεια στην μιτοχονδριακή μεμβράνη, όταν υποβάλλεται σε επεξεργασία με Thymoquinone και gemcitabine μόνη της ή σε συνδυασμό CI

(GCB: TQ) για 48 ώρες (έλεγχος στίχους Μονοθεραπεία (BA, ΔΠ, GCB) και Ελέγχου στίχοι συνδυασμοί (CI

(GCB:. BA), CI

( GCB: TQ)), (*** σημαντική διαφορά στην τιμή p & lt? 0.001, n = 3)

Η

κυτταρομετρίας ροής Ανάλυση του βαθμολόγησης των αποπτωτικών κυττάρων, που έλαβαν θεραπεία με BA, ΔΠ. και GCB, μεμονωμένα και σε

Η ενισχυμένη κυτταροτοξικότητα από ΒΑ ή TQ προεπεξεργασίας επαγόμενη απόπτωση ήταν ένα ερώτημα που πρέπει να απαντηθεί. συνδυασμός

BA ή προ-επεξεργασμένα κύτταρα ΔΠ μαζί με GCB, σε συνδυασμό και ατομικά, παράγονται δόση εξαρτώμενη αύξηση σε αποπτωτικά και μετά αποπτωτικών κυτταρικό πληθυσμό σε αμφότερες τις παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές, ΜΙΑ PaCa-2 και PANC-1. στην ΜΙΑ PaCa-2, ανεξάρτητα θεραπεία με BA (25 μΜ), TQ (36 μΜ) και GCB (0,33 μΜ και 0,66 μΜ) οδήγησε σε 7%, 5%, 1% και 2% ποσοστό της απόπτωσης, αντίστοιχα. Σε συνδυασμό, CI

(GCB: BA), που παράγεται το 11% και CI

(GCB: TQ) παρήγαγε 6% (τιμή ρ & lt? 0.001) απόπτωσης, whencompared για τον έλεγχο (Σχήμα 5Α). Ομοίως, στην κυτταρική γραμμή PANC1, BA (20 μΜ), TQ (25 μΜ) και GCB (5,25 μΜ), μεμονωμένα παράγεται 9%, 8%, ποσοστό 7% της απόπτωσης, αντίστοιχα. Ενώ σε συνδυασμό, CI

(GCB: BA), και CI

(GCB: TQ), το ποσοστό αυξήθηκε σε 11% και 12% (τιμή p & lt? 0.001), αντίστοιχα, σε σύγκριση με τον έλεγχο (Εικόνα 5Β) . Στη θεραπεία συνδυασμού παρατηρήθηκε αύξηση στο ρυθμό απόπτωσης σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές. BA παρήγαγε περισσότερο αποπτωτικό αποτέλεσμα μεμονωμένα και σε συνδυασμό με GCB από GCB και ΔΠ μόνα ή ΔΠ σε συνδυασμό με GCB σε ΜΙΑ PaCa-2? ενώ, αντίστροφη παρατηρήθηκε σε κύτταρα PANC-1.

(Α) ΜΙΑ PaCa-2 κύτταρα (1 χ 10

5) επωάστηκαν με δεικνυόμενες συγκεντρώσεις του betulinic οξύ, Thymoquinone και γεμσιταβίνη

μόνο και σε συνδυασμό CI

(GCB: BA), και CI

(GCB: TQ) για

48 ώρες και αναλύθηκαν για χρώση /ΡΙ Αηηβχίην-FITC για τον προσδιορισμό αποπτωτικών κυτταρικών πληθυσμών όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι τμήμα. (Β) Παρόμοιες μελέτες διεξήχθησαν με σε PANC-1 κύτταρα μετά τη θεραπεία με υποδεικνυόμενες δόσεις του betulinic οξύ, Thymoquinone και gemcitabine μόνο και σε συνδυασμό CI

(GCB: BA), και CI

(GCB: TQ) για 48 ώρες (έλεγχος έναντι της μονοθεραπείας (BA, ΔΠ, GCB) και τον έλεγχο σε σχέση με τους συνδυασμούς (CI

(GCB:. BA), και CI

(GCB: TQ)), (*** σημαντική διαφορά στο τιμή p & lt? 0.001, n = 3)

Η

έκφραση PKM2 και Δραστηριότητα

BA ή TQ προ-θεραπεία με μια συνεργική δόση του Φα 0.75 μαζί με GCB σε συνδυασμό. (CI

GCB: BA και CI

GCB: TQ). για 48 ώρες σε δύο παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές σειρές, μΙΑ PaCa-2 και PANC-1, παρουσίασε μείωση επίπεδο πρωτεΐνης inPKM2 (Σχήμα 6Α και Β) Ενώ , στο Fa 0,5 δηλαδή κύτταρα προεπεξεργασμένα με BA (5 μΜ) και ΔΠ (6,25 μΜ) σε συνδυασμό με GCB (1,3 μΜ) για 48 ώρες, μια μείωση παρατηρήθηκε στις Pro Caspase-3-έκφραση και PARP? χωρίς καμία επίδραση επί της έκφρασης PKM2, εκτός από μια μέτρια μείωση στην έκφραση σε PKM2 με TQ (Σχήμα 6C). η δραστηριότητα του PKM2, ωστόσο, έδειξε μια αύξηση inuntreated μΙΑ PaCa-2 κύτταρα και μία μείωση των κατεργασμένων κυττάρων με BA (25 μΜ) , TQ (36 μΜ) και GCB (0,33 μΜ και 0,66 μΜ)? η οποία ενισχύεται στο συνδυασμό (CI

GCB: BA και CI

GCB: TQ) (Εικόνα 7Α). Ενώ, στην περίπτωση PANC-1 κύτταρα, τα αποτελέσματα που ελήφθησαν με αντίστροφης σε μη επεξεργασμένα κύτταρα που έδειξαν μειωμένη δραστικότητα PKM2 και μια αύξηση στη δραστηριότητα σε μόνες ή σε συνδυασμό (Σχήμα 7Β) των κυττάρων αντιμετωπίζεται.

(Α) ΜΙΑ PaCa-2 και (Β) PANC-1 συνεργική δόσεις σε Φα 0.75 της betulinic οξέος και Thymoquinone χρησιμοποιήθηκαν μόνα τους και σε συνδυασμό CI

(GCB: BA) και CI

(GCB: TQ) με γεμσιταβίνη

από τις κηλίδες παρατηρήθηκε ότι υπήρξε μείωση στην έκφραση της PKM2 όταν έλαβαν θεραπεία σε δόσεις συνδυασμό.. (Γ) PANC1 κυτταρική γραμμή δόσεις Fa 0.5 του betulinic οξύ, Thymoquinone και γεμσιταβίνη χρησιμοποιήθηκαν μόνα τους και σε συνδυασμό, και από τις κηλίδες παρατηρήσαμε ότι υπήρχε μια μείωση της προ-κασπάσης-3 που ακολουθείται από μείωση στην PARP και ελαφρά μείωση παρατηρείται σε Thymoquinone αντιμετωπίζονται PKM2.

η

(Α) ΜΙΑ PaCa-2 κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με betulinic οξύ, Thymoquinone και Τζεμσιταμπίνη μεμονωμένα και σε συνδυασμό, CI

(GCB : BA) και

CI

(GCB: TQ) σε 48 ώρες. Μια μείωση της δραστηριότητας σε επεξεργασμένα κύτταρα ακολούθησε με

περισσότερα

μειώσει

σε συνδυασμό (s), CI

(GCB: BA)

και CI

(GCB: TQ),

σε σύγκριση με παρατηρήθηκε ο έλεγχος?

(Β)

Σε PANC-1 κυτταρική γραμμή αντίστροφα ήταν παρατηρηθεί. Ελέγχου έναντι της μονοθεραπείας (BA, ΔΠ, GCB) και τον έλεγχο σε σχέση με τους συνδυασμούς (CI

(GCB: BA) & amp? CI

(GCB: TQ)), (*** σημαντική διαφορά στην τιμή p & lt? 0.001, n = 3)

Η

Συζήτηση

παγκρέατος όγκους που είναι ανθεκτικοί στη θεραπεία γεμσιταμπίνη αποτελούν πρόκληση για τους ογκολόγους. Θεραπείες που είναι σήμερα σε χρήση για τη θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος έδειξαν απογοητευτικά αποτελεσματικότητα? και η απόκτηση ανθεκτικότητας στα φάρμακα κατά τη διάρκεια της χημειοθεραπείας αποτελεί μια μεγάλη πρόκληση. Έτσι, νέες στρατηγικές πρέπει να τεθούν σε εφαρμογή προκειμένου να αναπτυχθούν νέα χημειο-προληπτική και /ή χημειο-θεραπευτικούς παράγοντες που θα μπορούσαν να βελτιώσουν την κλινική έκβαση της ασθένειας αυτής. Αυξανόμενες ενδείξεις ενθαρρύνει τη χρήση διαιτητικών συμπληρωμάτων μορίων και κατά την δίαιτα για να αυξήσει την απόκριση του προτύπου χημειοθεραπευτικών παραγόντων καρκίνου. Προηγουμένως, έχουν φλαβονοειδή έχουν αναφερθεί για την αδρανοποίηση συχνά απορυθμισμένη οδούς, όπως Akt και NF-κΒ, τον καρκίνο του παγκρέατος, συμβάλλοντας στην ανάπτυξη των κυττάρων, τη μετάσταση και την αντίσταση χημειο. Genistein, μια διαιτητική ένωση, έχει δειχθεί ότι ενισχύουν την αντικαρκινική δραστικότητα της erlotinib και γεμσιταβίνη σε πειραματικά συστήματα καρκίνου του παγκρέατος [40]. Νωρίτερα, έχει επίσης αποδειχθεί ότι Γκαρσινόλη, μια διαιτητική μόριο, συνεργεί με γεμσιταβίνη να αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και επάγει την απόπτωση σε κύτταρα ΜΙΑ PaCa-2 με σημαντική διαμόρφωση των βασικών ρυθμιστών καρκίνου, συμπεριλαμβανομένων των

PARP

,

VEGF

,

MMPs

,

ILs

, κασπασών, και

NF-κΒ

[

41

]. Η κουρκουμίνη, ένα διατροφικό συστατικό, ευαισθητοποιεί τον καρκίνο του παγκρέατος σε γεμσιταβίνη

in vitro

και

in vivo. In vitro

, κουρκουμίνη αποδείχθηκε ότι αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των διαφόρων παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές, ενισχυτικά απόπτωση που επάγεται με γεμσιταβίνη, και αναστέλλοντας συστατική ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ στα κύτταρα.

In vivo

, όγκοι από γυμνούς ποντικούς που ενέθηκαν με καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ένα συνδυασμό κουρκουμίνης και gemcitabine έδειξαν σημαντική μείωση σε όγκο (

P

= 0,008 έναντι μάρτυρα?

P

= 0,036 vs μόνος γεμσιταβίνη) [42]. Στα πειράματά μας, μία συνδυασμένη αλληλεπίδραση του betulinic οξέος (ΒΑ) ή thymoquinone (TQ), τα δύο neutraceuticals με γεμσιταβίνη (GCB), με GCB ευαίσθητη-ΜΙΑ PaCa-2 και GCB ανθεκτικά-PANC-1 – παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές , έδειξε συνέργεια. Η δοκιμασία βιωσιμότητας αποκάλυψε μια συνεργική κυτταροτοξική αλληλεπίδραση μεταξύ GCB και ΒΑ ή GCB και ΔΠ σε αμφότερες GCB ευαίσθητη και ανθεκτικών κυτταρικών γραμμών, όπως προσδιορίζεται από την DRI (Μείωσης Δόσης Index) του & gt? 1 που λαμβάνεται από CalcuSyn [43]. Μηχανιστικά, GCB διαμεσολαβεί κυτταροτοξικά αποτελέσματα του αναστέλλοντας την σύνθεση βήμα επισκευή μέσω της δράσης της ως αναστολέας της ριβονουκλεοτιδικής αναγωγάσης, εξαντλώντας τις ενδοκυτταρικές δεξαμενές δεοξυ-νουκλεοτιδίων, και την ενίσχυση του δυναμικού της δικής ενσωμάτωσή της στο πρόσφατα συντεθειμένο DNA. Μόλις ενσωματωθεί στο DNA, το ανάλογο προκαλεί τερματισμό της σύνθεσης του DNA και είναι ανθεκτικό σε απομάκρυνση με εξω-νουκλεάσες, με αποτέλεσμα διάσπαση της έλικας του DNA [44]. Betulinic οξύ (ΒΑ), ένα φαρμακευτικό προϊόν διατροφής, έχει δειχθεί ότι επάγει απόπτωση μέσω μιτοχονδριακής οδών, όπου κατά τη διάρκεια αυτής της διαδικασίας οι διαπερατά τόσο οι μιτοχονδριακές εξωτερικές και εσωτερικές μεμβράνες, με αποτέλεσμα την απελευθέρωση των διαλυτών πρωτεϊνών, όπως το κυτόχρωμα c, Smac ή ΟΕΕ, από η μιτοχονδριακή διάκενο στο κυτοσόλιο [45]. BA επάγει επίσης deathin αρκετές διαφορετικές κυτταρικές σειρές καρκίνου μέσω πολλαπλών οδών, οι οποίες περιλαμβάνουν ρ53-ανεξάρτητη επαγωγή του ρ21 /WAF1, πάνω ρύθμιση των υποδοχέων θανάτου, η αναστολή των παραγόντων πρωτεΐνης ειδικότητας (Sp) μεταγραφή [46]. Ομοίως, Thymoquinone (TQ) διεγείρει απόπτωση σε κύτταρα όγκου με διάφορους μηχανισμούς, συμπεριλαμβανομένης της καταστολής ΝΡ-κΒ, η ενεργοποίηση Akt και εξωκυτταρικό μονοπάτια κινάσης σηματοδότησης σήματος ρυθμίζεται, και επίσης με την αναστολή της αγγειογένεσης όγκου [47]. Βάσει των ΕΔ

50, ED

75 και ED

90 συνδυασμούς φαρμάκων, ισοβολογράμματα παράχθηκαν και η συνέργεια αξιολογούνται, σύμφωνα με CalcuSyn. Betulinic οξύ (ΒΑ) ή Thymoquinone (TQ) σε συνδυασμό με γεμσιταβίνη (GCB), σε πολλαπλές συγκεντρώσεις φαρμάκου, έδειξε ότι σε GCB ευαίσθητη-ΜΙΑ PaCa-2 και GCB ανθεκτικά-PANC-1 κύτταρα, ο δείκτης συνδυασμού (CI) ήταν κάτω από 0,88 σε Φα 0,75 (μείωση κατά 75% της κυτταρικής ανάπτυξης) σε κύτταρα ΜΙΑ PaCa-2. Ότι, σε περίπτωση PANC-1, ο δείκτης συνδυασμού (CI) ήταν κάτω από 0,76 σε Φα 0.5. Η βιολογική βάση γι ‘αυτή τη συνέργεια ήταν σαφής στη διαφορική αλλαγές στην απόπτωση τόσο με τις διαιτητικές μόρια. Ακόμα κι αν μηχανιστικά συνδυασμούς μας είναι «αμοιβαία μη αποκλειστικές» στη φύση, αλλά και οι δύο διαιτητικές μόρια έδειξαν σημαντική διαφορά στην κβαντική επαγωγής κυτταροτοξικότητας σε σύγκριση με σταθεί μόνη της GCB. Ωστόσο, το ποσοστό της επαγωγής απόπτωσης από ΒΑ σε συνδυασμό με GCB ήταν πιο αποτελεσματική σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές, από TQ σε συνδυασμό με GCB. Επίσης, μείωση στην trans-μεμβράνης μιτοχονδριακού δυναμικού (Ψ) παρατηρήθηκε όταν η ΒΑ μόνη ή σε συνδυασμό με GCB παρασχέθηκε τόσο τις κυτταρικές σειρές. Καμία αλλαγή, ωστόσο, παρατηρήθηκε σε trans-μεμβράνης μιτοχονδριακού δυναμικού (Ψ), όταν κυτταρικές γραμμές καρκίνου υποβλήθηκαν σε θεραπεία με GCB μόνο.