Abstract

Εισαγωγή

Η πρωτεΐνη που ρυθμίζεται από γλυκόζη 78-kDa (GRP78) επάγεται στο μικροπεριβάλλον του καρκίνου και μπορεί να θεωρηθεί ως νέο προάγγελος της ανταπόκρισης στη χημειοθεραπεία σε πολλούς καρκίνους. Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε ότι η ενδοκυτταρική αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) και πυρηνικού παράγοντα ερυθροειδή 2-συγγενή παράγοντα 2 (Nrf2) πυρηνική μετατόπιση ήταν υψηλότερα σε GRP78 knockdown DLD-1 καρκίνος παχέος εντέρου κύτταρα σε σύγκριση με τα ανακατωμένα κύτταρα ελέγχου.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

η θεραπεία με epirubicin στο GRP78 νοκ ντάουν κυττάρων DLD-1 ενισχυμένη απόπτωση και συνδέθηκε με μειωμένη παραγωγή των ενδοκυττάριων ROS. Επιπλέον, η απόπτωση αυξήθηκε από το γαλλικό αντιοξειδωτικά προπυλο (PG) και διθειοθρεϊτόλη (DTT) σε κωδικοποιημένα κύτταρα ελέγχου επιρουβικίνη επεξεργασία. Epirubicin επεξεργασμένα GRP78 knockdown κυττάρων οδήγησε σε περισσότερες αδρανοποιημένο Akt μέλη μονοπατιού, όπως φωσφορυλιωμένο Akt και GSK-3β, καθώς και οι μεταγενέστεροι στόχοι της έκφρασης β-κατενίνης. Knockdown του Nrf2 με μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) αυξημένη απόπτωση σε κύτταρα GRP78 knockdown epirubicin-αγωγή, η οποία πρότεινε ότι Nrf2 μπορεί να είναι ένας πρωταρχικός μηχανισμός άμυνας σε GRP78 knockdown κυττάρων. Δείξαμε επίσης ότι η επιρουβικίνη επεξεργασμένα GRP78 knockdown κυττάρων θα μπορούσε να μειώσει μονοπάτι σηματοδότησης επιβίωσης μέσω της ενεργοποίησης του redox πρωτεϊνικής φωσφατάσης 2Α (ΡΡ2Α), η οποία είναι μια σερίνη /θρεονίνη φωσφατάση που ρυθμίζει αρνητικά την Akt μονοπάτι.

Συμπεράσματα

Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η epirubicin μείωσε την ενδοκυτταρική ROS σε GRP78 knockdown κυττάρων, η οποία μείωσε την επιβίωση σηματοδότηση μέσω τόσο του μονοπατιού Akt και την ενεργοποίηση της ΡΡ2Α. Μαζί, οι μηχανισμοί αυτοί συνέβαλαν στην αύξηση του επιπέδου της epirubicin απόπτωση που παρατηρήθηκε στα GRP78 νοκ ντάουν κύτταρα

Παράθεση:. Chang YJ, Huang YP, Li ZL, Chen CH (2012) GRP78 Νοκ ντάουν Βελτιώνει την απόπτωση μέσω η ρύθμιση προς τα κάτω του οξειδωτικού στρες και AKT οδό μετά Epirubicin Θεραπεία στο Colon Cancer DLD-1 κύτταρα. PLoS ONE 7 (4): e35123. doi: 10.1371 /journal.pone.0035123

Επιμέλεια: Salvatore V. Pizzo, του Πανεπιστημίου Duke Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 3 Φλεβάρη του 2012? Αποδεκτές: 13 Μάρ 2012? Δημοσιεύθηκε: 18 Απρίλη του 2012

Copyright: © 2012 Chang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Επιστημονικό Συμβούλιο, την Ταϊβάν (NSC 99 με 2.320-B-415-002-my3? ιστοσελίδα Εθνικού Συμβουλίου Επιστήμης: https://web1.nsc.gov.tw/). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

GRP78 αποτελεί βασικό ρυθμιστή της ενδοπλασματικού δικτύου λειτουργία (ER). Οι ρόλοι των GRP78 περιλαμβάνουν (1) αναδίπλωση της πρωτεΐνης και συναρμολόγησης (2), στόχευση misfolded πρωτεΐνη για αποδόμηση, και (3) ER Ca

2 + -σύνδεση και τον έλεγχο της ενεργοποίησης των αισθητήρων στρες διαμεμβρανικών ER. Επιπλέον, λόγω των αντι-αποπτωτικών ιδιοκτησίας, GRP78 επάγεται σε μία ευρεία ποικιλία καρκινικών κυττάρων και ανθεκτικά σε φάρμακο καρκινικά κύτταρα [1]. Είναι ενδιαφέρον ότι, η έκφραση GRP78 είναι σημαντικά ισχυρότερη σε καρκίνο του παχέος εντέρου σε σχέση με το αδένωμα του κόλου και φυσιολογικό ιστό [2]. Επιπλέον, μια πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι GRP78 knockdown όχι μόνο κατέστειλε αποτελεσματικά τον πολλαπλασιασμό των RKO κύτταρα καρκίνου κόλου, αλλά επίσης προκάλεσε την πρώιμη απόπτωση των κυττάρων [3]. Επιπλέον, GRP78 μειορρύθμιση έχει αποδειχθεί ότι οδηγεί σε κόλον ευαισθητοποίηση του καρκίνου με την πακλιταξέλη επαγόμενη απόπτωση [4]. Στο σύνολό τους, οι εκθέσεις αυτές υπογραμμίζουν τη σημασία του ρόλου του GRP78 σε θεραπευτική αγωγή.

Πολλά αντικαρκινικά μέσα οδηγήσει σε οξειδωτικό στρες με την παραγωγή αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) και την επαγωγή κυτταροτοξικότητας και της απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα [5]. Το οξειδωτικό στρες που λαμβάνει χώρα κατά τη διάρκεια της χημειοθεραπείας, ωστόσο, μπορεί να επηρεάσει τα κυτταροτοξικά αποτελέσματα των αντικαρκινικών παραγόντων, τα οποία εξαρτώνται από την ταχεία διάδοση των καρκινικών κυττάρων για βέλτιστη δραστηριότητα [5]. Άλλες μελέτες έχουν επίσης φαίνεται ότι η μέτρια οξειδωτικό στρες μπορεί να διεγείρει τον πολλαπλασιασμό και την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων μέσω μηχανισμών κλιματισμού, ενώ η ενίσχυση των ROS υπερπαραγωγή από προοξειδωτικών υπό σοβαρή οξειδωτικό στρες μπορεί να οδηγήσει σε απόπτωση και κυτταρικό θάνατο [6]. Στην σηματοδότηση οξειδοαναγωγής, Nrf2 παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στη μεταγραφή μιας σειράς γονιδίων που συμβάλλουν στην Φάσης ΙΙ /ΙΙΙ ένζυμα και την άμυνα έναντι του οξειδωτικού στρες [7]. Υπάρχουν αυξανόμενα στοιχεία για συχνές μεταλλάξεις του Nrf2 σε ανθρώπινους καρκίνους, η οποία έχει ως αποτέλεσμα μία μεγάλη ποσότητα Nrf2 πυρηνική μετατόπιση και να οδηγήσει στην συστατική έκφραση του κυτταροπροστατευτικών και αποτοξίνωση γονίδια. Τα πλεονεκτήματα της ανάπτυξης και της αντίστασης στην απόπτωση που παρέχονται από αυτά τα γονίδια παρέχουν χημειοαντίσταση τη διάρκεια της θεραπείας [8]. Άλλες αναφορές έχουν επίσης απεικονισθεί ότι η θεραπεία με χημειοθεραπευτικά φάρμακα ενεργοποιεί το μονοπάτι Nrf2, η οποία επάγει κυτταροπροστατευτική γονιδίων και ρυθμίζει χημειοευαισθησία σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου [9]. Ως εκ τούτου, η αναστολή της Nrf2 πυρηνική μετατόπιση μπορεί να θεωρηθεί για την καταστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και να ενισχύσει απόπτωση σε καρκίνους. Λαμβανόμενες μαζί, αυτές οι μελέτες δείχνουν ότι το οξειδωτικό στρες και ρύθμιση παίζουν σημαντικούς ρόλους οξειδοαναγωγής στη χημειοθεραπεία.

Akt είναι ένα αποπτωτικό ρυθμιστής που ενεργοποιείται σε πολλούς καρκίνους και μπορεί να προωθήσει την αντίσταση στο φάρμακο

in vitro

[10 ]. σήματα επιβίωσης που προκαλείται από διάφορους υποδοχείς διαμεσολαβούνται κυρίως από Akt? Έτσι, η οδός Akt μπορεί να προωθήσει ανθεκτικών φαινοτύπων [11]. Η περιοδική απελευθέρωση της Akt επιβίωσης μονοπάτι σε καρκίνους σηματοδότησης έχει οδηγήσει σε σημαντικό ενδιαφέρον μεταξύ των ερευνητών που προσπαθούν να μπλοκάρουν αυτό το μονοπάτι για θεραπευτικούς σκοπούς [12]. Ως εκ τούτου, η αναστολή της οδού της Akt εξετάζεται ως νέα στρατηγική για την ευαισθητοποίηση καρκινικών κυττάρων σε αντικαρκινικά φάρμακα [13].

Η επιρουβικίνη είναι ένα παράγωγο της δοξορουβικίνης ανάλογο ανθρακυκλίνης που έχει ένα καλύτερο θεραπευτικό δείκτη από δοξορουβικίνη [14]. Με την ίδια δόση, επιρουβικίνη αποσπά χαμηλότερη αιματολογική και καρδιακή τοξικότητα από δοξορουβικίνη [15]. Ο μηχανισμός της epirubicin στην κυτταροτοξικότητα φαίνεται ότι περιλαμβάνει την παραγωγή των ROS [16]. Μέχρι σήμερα, η λεπτομερής αντικαρκινική μηχανισμός της epirubicin σε GRP78 knockdown καρκινικά κύτταρα κόλου δεν έχει διευκρινιστεί. Στην παρούσα μελέτη, ενδιαφερθήκαμε για την κατανόηση της αντικαρκινική δράση της epirubicin επί της αποπτωτικής δυναμικό της GRP78 knockdown στο ανθρώπινο κόλον DLD-1 καρκινικά κύτταρα. Ήμασταν επίσης ενδιαφέρονται για την κατανόηση της αποπτωτικό μηχανισμό του GRP78 νοκ ντάουν στο οξειδωτικό στρες, ρύθμισης οξειδοαναγωγής και το Akt μονοπατιού επιβίωσης κατά τη διάρκεια της epirubicin θεραπείας έτσι ώστε να μπορεί να αναπτυχθεί ένας οδηγός για πρόσθετα αντινεοπλασματική θεραπευτική για ανθρώπινους καρκίνους του παχέος εντέρου.

Υλικά και μέθοδοι

γραμμή κυττάρων, τα αντιδραστήρια και τα χημικά

Ο καρκίνος του παχέος εντέρου κυτταρική σειρά ανθρώπινου DLD-1 ελήφθη από τη Συλλογή Bioresource και Ερευνητικό Κέντρο (Hsinchu, Ταϊβάν). RPMI-1640 και εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS) ελήφθησαν από την Hyclone (South Logan, UT) και Gibco Inc. (Freehold, NJ), αντίστοιχα. Σύλληψη-In παράγοντα επιμόλυνσης λήφθηκε από Open Biosystems Inc. (Huntsville, AL). Η Nrf2 siRNA, χτυπητά siRNA, πρωτογενή αντισώματα εναντίον ρ-Akt (Thr308), Akt, NRF-2, της GSK-3β, β-κατενίνης, SP-1 και GAPDH ελήφθησαν από την Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA ). Το κιτ δοκιμασίας της κινάσης Akt αποκτήθηκε από την Cell Signaling Technology (Boston, ΜΑ). Το αντιδραστήριο προσδιορισμού πρωτεΐνης Bio-Rad αγοράστηκε από την Bio-Rad Laboratories (Richmond, CA). Το κιτ δοκιμασίας φωσφατάσης Ser /Thr αγοράστηκε από την Millipore Corporation (Billerica, ΜΑ). Γαλλικός προπυλεστέρας (PG), διθειοθρεϊτόλη (DTT), ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ), 2 ‘, 7’-dichlorodihydrofluorescein διοξεικό (DCFH-DA), άνευ ϋΝάσης RNase Α, διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO), μπλε τρυπάνης, αντι-ακτίνης πρωτογενούς αντίσωμα και άλλες χημικές ουσίες αγοράστηκαν από την Sigma Chemical Co. (St. Louis, ΜΟ).

Κυτταρική καλλιέργεια και θεραπεία

DLD-1 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 που περιέχει 10% FBS . Το διάλυμα αποθέματος της epirubicin διαλύθηκε σε DMSO, και το επεξεργασμένο συγκέντρωση (500 ng /ml) παρασκευάστηκε σε RPMI-1640.

Δημιουργία GRP78 knockdown κυττάρων DLD-1

Η έκφραση της GRP78 χτυπήθηκε κάτω στο DLD-1 κύτταρα με siRNA. Εν συντομία, η αλληλουχία στόχος για το mRNA ανθρώπινης GRP78 ήταν 5′-AAGGTTACCCATGCAGTTGTT-3 ‘. Η ομελέτα αλληλουχία siRNA ήταν 5’-AAGGTGGTTGTTTTGTTCACT-3 ‘. εισήχθησαν Το GRP78 siRNA και κωδικοποιημένα siRNA στο φορέα pSUPERIOR και διαμολύνθηκε σε κύτταρα DLD-1. Τα κύτταρα που είχαν επιτυχώς επιμολυσμένα και επιλέχθηκαν με αντίσταση σε αντιβιοτικό, όπως περιγράφεται προηγουμένως [17] – [19]. Στην παρούσα μελέτη, τα κύτταρα DLD-1 επιμολυσμένα με GRP78 siRNA ονομάστηκαν GRP78 knockdown κυττάρων, και τα κύτταρα DLD-1 επιμολυσμένα με περιπλεγμένο siRNA ονομάστηκαν κωδικοποιημένα κύτταρα ελέγχου. Η έκφραση των GRP78 στα κωδικοποιημένα κύτταρα ελέγχου και τα GRP78 νοκ ντάουν κυττάρων εκτιμήθηκε με κηλίδωση western.

Η βιωσιμότητα των κυττάρων δοκιμασία

Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε από την δοκιμασία εξαίρεσης κυανούν τρυπανίου. Κύτταρα (1 χ 10

6) καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία καλλιέργειας ιστού 60-mm για 24 ώρες. Το μέσο καλλιέργειας αντικαταστάθηκε με νέο μέσο και τα κύτταρα εκτέθηκαν σε epirubicin για 48 ώρες. Μετά τη θεραπεία, ένα μίγμα έγινε με 1 μέρος 0,4% trypan blue και 1 μέρος κυτταρικό εναιώρημα. Το μίγμα στη συνέχεια επωάστηκε για περίπου 3 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, μία σταγόνα του μίγματος trypan blue /κύτταρο εφαρμόστηκε σε αιματοκυτταρόμετρο και τα μη σημασμένα (βιώσιμα) και βάφτηκαν (μη βιώσιμα) κύτταρα χωριστά υπολογίζονται στο αιματοκυτταρόμετρο.

βλάβη του DNA και του κυτταρικού κύκλου ανάλυση

βλάβη του DNA και του κυτταρικού κύκλου αξιολογήθηκαν με χρώση ΡΙ και κυτταρομετρία ροής. Κύτταρα (1 χ 10

6) καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία καλλιέργειας ιστού 60-mm για όλη τη νύχτα. Το μέσο καλλιέργειας αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο, ​​και τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με epirubicin για 48 ώρες. Μετά την αγωγή, τα κύτταρα συλλέχθηκαν, πλύθηκαν με αλατούχο φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα (PBS), σταθεροποιήθηκαν σε ΡΒδ-μεθανόλης διάλυμα (1:02, όγκος /όγκο), και διατηρήθηκε στους 4 ° C για τουλάχιστον 18 ώρες. Μετά από μία PBS πλύση, τα σφαιρίδια του κυττάρου βάφτηκαν με ένα διάλυμα ΡΙ (PBS, 40 μg /ml ΡΙ, και 40 μg /ml άνευ ϋΝάσης RNase Α) για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι και αναλύθηκαν με ένα Becton-Dickinson FACScan κυτταρόμετρο ροής (Franklin Lakes, NJ). Τουλάχιστον 10.000 κύτταρα μετρήθηκαν ανά δείγμα, και τα ιστογράμματα ϋΝΑ περαιτέρω αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό ΜΟϋΡΙΤ σε ένα σταθμό εργασίας υπολογιστή για τον υπολογισμό του ποσοστού των κυττάρων στις διάφορες φάσεις του κυτταρικού κύκλου και να ποσοτικοποιηθούν τα κύτταρα με βλάβες στο DNA (subG

1 φάση).

Η ενδοκυτταρική ROS μέτρηση

Η παραγωγή ενδοκυτταρικής ROS ανιχνεύθηκε με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας DCFH-DA. Μετά την επεξεργασία, τα κύτταρα πλύθηκαν μία φορά με PBS, κατεργάστηκαν με 20 μΜ DCFH-DA για 30 λεπτά στο σκοτάδι, πλύθηκαν και πάλι με PBS, συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση και αιωρήθηκαν σε PBS. ενδοκυτταρικά επίπεδα ROS, τα οποία υποδεικνύεται από τον φθορισμό του διχλωροφθορεσκεϊνης (DCF), μετρήθηκαν μέσω ενός φίλτρου φραγμού 530/22-nm χρησιμοποιώντας ένα Becton-Dickinson FACScan κυτταρόμετρο ροής.

Nrf2 siRNA διαμόλυνση

Για να φιμώσουν τη γονιδιακή έκφραση των Nrf2, τρεις σειρές siRNA ολιγονουκλεοτίδια σχεδιάστηκαν: (1) 5′-GCAUGCUACGUGAUGAAGAtt-3 ‘(με νόημα) και 5′-UCUUCAUCACGUAGCAUGCtt-3′ (αντιπληροφοριακό)? και (2) 5’-CUCCUACUGUGAUGUGAAAtt-3 ‘(νοηματικό) και 5′-UUUCACAUCACAGUAGGAGtt-3′ (antisense)? και (3) 5’-GUGUCAGUAUGUUGAAUCAtt-3 ‘(νοηματικό) και 5′-UGAUUCAACAUACUGACACtt-3’ (antisense). Τα κύτταρα (4 χ 10

5) καλλιεργήθηκαν σε πιάτα 60-mm σε 5 ml RPMI-1640 συμπληρώνεται με 10% FBS και επιμολύνθηκαν σε 40% συρροή με προσθήκη Σύλληψη-In παράγοντα μορφομετατροπής (Huntsville, AL) και Nrf2 siRNA. Κύτταρα ελέγχου υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Σύλληψης-In παράγοντα μορφομετατροπής και το περιπλεγμένο siRNA [5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ‘(νοηματικό) και 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’ (antisense)], η οποία δεν οδηγεί σε συγκεκριμένη αποικοδόμηση οποιουδήποτε κυτταρικών μηνυμάτων . Τα κύτταρα ξεπλύθηκαν με μέσο μετά από 25 λεπτά επώασης και κατόπιν διατηρήθηκε σε καλλιέργεια για επιπλέον 24 ώρες. Το πυρηνικό Nrf2 έκφραση αξιολογήθηκε με κηλίδωση Western.

Akt δραστικότητα κινάσης δοκιμασία

Akt δραστικότητα κινάσης ανιχνεύθηκε με τη χρήση της μη ραδιενεργού Akt κιτ δοκιμασίας κινάσης. Εν συντομία, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πιάτα των 60 mm υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 500 ng /ml epirubicin ή όχημα ως έλεγχος. Μετά epirubicin κατεργασία, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με παγωμένο PBS και συλλέχθηκαν με ρυθμιστικό κυτταρικής λύσης [20 mM Tris (ρΗ 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton, 2.5 mM πυροφωσφορικό νάτριο , 1 mM β-γλυκεροφωσφορικό, 1 mM Να

3νο

4, και 1 μg /ml λευπεπτίνη]. Η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα αντιδραστήριο δοκιμασίας πρωτεΐνης Bio-Rad. Akt κινάση ανοσοκατακρημνίσθηκε από το κυτταρικό εκχύλισμα (300 μg πρωτεΐνης) χρησιμοποιώντας μία φωσφο-Akt (Ser473) μονοκλωνικό αντίσωμα κουνελιού συζευγμένο με σφαιρίδια και επωάστηκαν με ήπια ανακίνηση όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Τα σφαιρίδια πλύθηκαν δύο φορές με ένα ρυθμιστικό λύσης κυττάρου και στη συνέχεια πλένεται δύο φορές με 500 μ1 ρυθμιστικού κινάσης. Τα ιζήματα αιωρήθηκαν σε 50 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος κινάσης συμπληρωμένο με 1 μΐ 10 mM ΑΤΡ και μία κατάλληλη ποσότητα του υποστρώματος κινάσης (GSK-3 πρωτείνη σύντηξης) για 30 λεπτά στους 30 ° C. Η αντίδραση τερματίστηκε με 25 μλ 3 χ ρυθμιστικού διαλύματος δείγματος SDS. Η φωσφορυλίωση της GSK-3 πρωτεΐνη σύντηξης ανιχνεύθηκε με κηλίδωση Western με antiphospho-GSK-3α /β (Ser21 /9) μονοκλωνικό αντίσωμα κουνελιού.

πρωτεϊνικής φωσφατάσης 2Α (ΡΡ2Α) δραστηριότητα δοκιμασία

ΡΡ2Α δραστικότητα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το κιτ δοκιμασίας φωσφατάσης Ser /Thr. Εν συντομία, τα κύτταρα λύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα λύσεως, όπως προτείνεται από το πρωτόκολλο που περιλαμβάνεται στο κιτ. Ένα κλάσμα που αντιστοιχεί σε 50 μg πρωτεΐνης χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογηθεί η δραστικότητα ΡΡ2Α χρησιμοποιώντας το πρωτόκολλο από τον κατασκευαστή. Η απορρόφηση του διαλύματος της αντίδρασης μετρήθηκε σε πλάκες 96 φρεατίων στα 405 nm σε μία συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας (Bio-Rad, Richmond, CA).

κηλίδωση Western ανάλυση

Μετά την επεξεργασία, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS, επαναιωρήθηκαν σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα εκχύλισης πρωτεΐνης για 10 λεπτά, και φυγοκεντρήθηκε στα 12.000 χ g για 10 λεπτά στους 4 ° C για να ληφθούν οι εκχυλισμένες πρωτεΐνες (υπερκείμενο). Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης μετρήθηκαν με ένα αντιδραστήριο δοκιμασίας πρωτεΐνης Bio-Rad. Οι κυτταρικές πρωτεΐνες εκχυλίζονται έβρασαν σε ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης, και ένα κλάσμα που αντιστοιχεί σε 50-100 μg πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν σε μια 12% πηκτή SDS-πολυακρυλαμιδίου. Μετά την ηλεκτροφόρηση, οι πρωτεΐνες ηλεκτρομεταφέρθηκαν σε μεμβράνη πολυβινυλιδενο μεταφορά φθορίου. Μετά την κηλίδωση, οι μεμβράνες επωάστηκαν με διάφορες πρωτογενή αντισώματα για όλη τη νύχτα και κατόπιν πλύθηκε με διάλυμα PBST (0,05% Tween 20 σε PBS). Μετά την πλύση, το δευτερεύον αντίσωμα, το οποίο σημάνθηκε με υπεροξειδάση αρμορακίας, προστέθηκαν στη μεμβράνη για 1 ώρα και στη συνέχεια πλύθηκε με διάλυμα PBST (0,05% Tween 20 σε PBS). Τα σύμπλοκα αντιγόνου-αντισώματος ανιχνεύθηκαν με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) με έναν αναλυτή χημειοφωταύγειας.

Στατιστική ανάλυση

Δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το

t

τεστ του Student. Ένα

P

αξία μικρότερη από 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική [20].

Αποτελέσματα

GRP78 νοκ ντάουν ενίσχυσε το κυτταρικό θάνατο και την απόπτωση που επάγεται από epirubicin θεραπεία

Σχήμα 1Α δείχνει την έκφραση GRP78 στις DLD-1 κύτταρα περιπλεγμένο έλεγχο και GRP78 knockdown κυττάρων DLD-1. GRP78 knockdown κυττάρων DLD-1 έδειξαν χαμηλότερη έκφραση του GRP78 από τα κωδικοποιημένα ελέγχου κυττάρων DLD-1. Αξιολογήσαμε περαιτέρω τη βιωσιμότητα των κυττάρων και την απόπτωση μετά την epirubicin επεξεργασία στο νοκ ντάουν GRP78 και ομελέτα έλεγχο των κυττάρων DLD-1. Η Εικόνα 1Β δείχνει ότι η βιωσιμότητα των κυττάρων ήταν σημαντικά μειωμένη στα GRP78 knockdown κυττάρων σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου περιπλεγμένο μετά από 48 ώρες από 500 ng /ml epirubicin θεραπεία. Επιπλέον, το ποσοστό απόπτωσης των GRP78 knockdown κυττάρων (83,17%) ήταν πολύ υψηλότερο από το ποσοστό που παρατηρήθηκε στα κύτταρα ελέγχου κωδικοποιημένο (35,12%) 48 ώρες μετά την θεραπεία epirubicin (Σχήμα 1 C). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι GRP78 είναι μια πρωτεΐνη-στόχο για επιρουβικίνη-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο και απόπτωση σε DLD-1 καρκίνος παχέος εντέρου.

(Α) Ανάλυση της έκφρασης GRP78 στα κωδικοποιημένα και GRP78 knockdown κυττάρων DLD-1 με κηλίδωση Western . Ανάλυση του (Β) κυτταρική βιωσιμότητα και (C) απόπτωση μετά από αγωγή με φορέα (έλεγχος) και epirubicin (EPI). Κωδικοποιημένα ελέγχου και GRP78 knockdown κυττάρων DLD-1 υποβλήθηκαν σε αγωγή με επιρουβικίνη (500 ng /ml) για 48 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων αξιολογήθηκε με την δοκιμασία εξαίρεσης κυανούν τρυπανίου. Τα ποσοστά των κυττάρων που ήταν στην

1 φάση subG (υποδεικνύεται από βλάβες στο DNA) προσδιορίστηκαν όπως περιγράφεται στο

Υλικά και Μέθοδοι

. Οι τιμές παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση (η = 5-8) από τα επιμέρους πειράματα. Σημαντικές διαφορές για την ομάδα ελέγχου και την ομελέτα ομάδα ελέγχου είναι

P

& lt? 0,05 (*) και

P

& lt? 0,05 (#), αντίστοιχα. Αυτά τα πειράματα διεξήχθησαν τουλάχιστον 3 φορές, και ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα παρουσιάζεται.

Η

GRP78 νοκ ντάουν μειωμένη epirubicin που προκαλείται από ενδοκυτταρική ROS

Για να αξιολογηθεί η ενδοκυτταρική οξειδωτικό στρες, ενδοκυτταρική ROS αξιολογήθηκαν με χρώση DCFH-DA στα κωδικοποιημένα κύτταρα ελέγχου και τα GRP78 νοκ ντάουν κύτταρα. Σχήμα 2Α δείχνει ότι τα GRP78 νοκ ντάουν κύτταρα εκτίθενται 7 έως 10 φορές σε μεγαλύτερο DCF φθορισμού από τα κωδικοποιημένα κύτταρα ελέγχου μετά από 24-48 ώρες καλλιέργειας, η οποία έδειξε ότι υπήρχε σημαντική οξειδωτικό στρες στα GRP78 νοκ ντάουν κύτταρα. Κατεργασία των κυττάρων ελέγχου κωδικοποιημένα με epirubicin οδήγησε σε ROS αυξήσεις 1,3- και 1,5-φορές σε 24 και 48 ώρες σε σύγκριση με τα ανακατωμένα κύτταρα ελέγχου χωρίς epirubicin (Σχήμα 2Β). Σε αντίθεση, η ενδοκυτταρική ROS μειώθηκαν κατά 0.65- 0.81 και φορές στα GRP78 knockdown κυττάρων επιρουβικίνη κατεργασία στους 24 και 48 ώρες σε σύγκριση με GRP78 knockdown κυττάρων χωρίς epirubicin (Σχήμα 2Β). Η δόση της epirubicin πάνω από 500 ng /ml δεν αύξησε το ROS στο GRP78 knockdown κυττάρων DLD-1. Epirubicin ανέστειλε την ROS με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο στα knockdown κυττάρων GRP78 DLD-1 (Σχήμα 2C). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η ενδοκυτταρική αναγωγή ROS μπορεί να ενισχύσει απόπτωση σε κύτταρα ελέγχου περιπλεγμένο επιρουβικίνη επεξεργασία. Όταν το PG αντιοξειδωτικά και DTT, τα οποία χρησιμοποιούνται για να μειώσουν ενδοκυτταρική ROS, προστέθηκαν στα κωδικοποιημένα κύτταρα ελέγχου epirubicin αγωγή, η απόπτωση αυξήθηκε από 35,12% σε 53,18% και 83,06%, αντίστοιχα (Σχήμα 2D). Είναι ενδιαφέρον, ούτε PG ούτε DTT και μόνο θα μπορούσε να επάγει απόπτωση στα κωδικοποιημένα κύτταρα ελέγχου.

Κωδικοποιημένα ελέγχου και GRP78 knockdown κυττάρων DLD-1 ήταν (Α) καλλιεργήθηκαν για 24 και 48 ώρες ή (Β) που έλαβαν θεραπεία με epirubicin (500 ng /ml) για 24 ή 48 ώρες. (Γ) GRP78 knockdown κυττάρων DLD-1 υποβλήθηκαν σε αγωγή με επιρουβικίνη (500, 750, 1000 ng /ml) για 48 ώρες. Ενδοκυτταρικά ROS αξιολογήθηκαν με χρώση DCFH-DA και κυτταρομετρία ροής όπως περιγράφεται στο

Υλικά και Μέθοδοι

. (D) Κωδικοποιημένα ελέγχου DLD-1 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 500 ng /ml epirubicin (EPI) μόνο, 25 μΜ γαλλικό προπύλιο (PG) μόνο, 1 mM διθειοθρεϊτόλη (DTT) μόνη ή σε συνδυασμό με επιρουβικίνη PG ή DTT για 48 ώρες. Τα ποσοστά των κυττάρων που ήταν στην

1 φάση subG (υποδεικνύεται από βλάβες στο DNA) προσδιορίστηκαν όπως περιγράφεται στο

Υλικά και Μέθοδοι

. Οι τιμές παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση (η = 5-8) από τα επιμέρους πειράματα. Μια σημαντική διαφορά από την ομάδα ελέγχου ορίστηκε σε

P

& lt?. 0,05 (*)

Η

Nrf2 εμπλέκεται στο μηχανισμό άμυνας στα GRP78 νοκ ντάουν κύτταρα

Nrf2 είναι ένας παράγοντας μεταγραφής που αποκρίνεται σε ενδοκυτταρική ROS διέγερση και μετατοπίζεται στον πυρήνα μέσω δέσμευσης του αντιοξειδωτικού στοιχείου απόκρισης και μεταγραφή φάση ένζυμα II. Μελετήσαμε Nrf2 πυρηνική μετατόπιση στα κωδικοποιημένα κύτταρα ελέγχου και τα GRP78 νοκ ντάουν κύτταρα. Το Σχήμα 3Α δείχνει ότι Nrf2 πυρηνική μετατόπιση αυξήθηκε περίπου 1,6 φορές στα GRP78 knockdown κυττάρων σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου περιπλεγμένο. Αξιολογήσαμε επίσης αν Nrf2 πυρηνική μετατόπιση έπαιξε αμυντικό ρόλο έναντι επιρουβικίνη επαγόμενη απόπτωση στα GRP78 knockdown κυττάρων. Τα GRP78 knockdown κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με siRNA Nrf2 για 24 ώρες για να αναστείλουν την έκφραση Nrf2 πριν από την επώαση με epirubicin για 48 ώρες. Μετά την επώαση επιρουβικίνη, η απόπτωση αξιολογήθηκε με κυτταρομετρία ροής. Το Σχήμα 3Β δείχνει ότι, η έκφραση Nrf2 ανεστάλη έντονα από Nrf2 siRNA στα GRP78 knockdown κυττάρων, και το Σχήμα 3C δείχνει ότι η απόπτωση αυξήθηκε σημαντικά με θεραπεία Nrf2 siRNA στα επιρουβικίνη κατεργασμένα κύτταρα GRP78 knockdown, γεγονός που δείχνει ότι Nrf2 παρέχεται ένα σημαντικό μηχανισμό άμυνας όταν GRP78 χτυπήθηκε κάτω στα κύτταρα DLD-1.

(Α) Κωδικοποιημένα ελέγχου και GRP78 νοκ ντάουν κυττάρων DLD-1 καλλιεργήθηκαν για 48 ώρες, και η πυρηνική Nrf2 έκφραση αξιολογήθηκε με κηλίδωση western. (Β) Το GRP78 knockdown κυττάρων DLD-1 προκατεργάστηκαν με μπερδεμένο siRNA (sc) ή Nrf2 siRNA για 24 ώρες, και η πυρηνική Nrf2 έκφραση αξιολογήθηκε με κηλίδωση Western. (Γ) Το GRP78 knockdown κυττάρων DLD-1 προκατεργάστηκαν με μπερδεμένο siRNA (σκαρφάλωμα) ή Nrf2 siRNA για 24 ώρες και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 500 ng /ml epirubicin (EPI) για ένα άλλο 48 ώρες. Μετά τη θεραπεία, το ποσοστό των κυττάρων που ήταν στην

1 φάση subG υποδεικνύεται από βλάβη στο DNA προσδιορίστηκε όπως περιγράφεται στο

Υλικά και Μέθοδοι

. Αυτά τα πειράματα διεξήχθησαν τουλάχιστον 3 φορές, και ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα παρουσιάζεται.

Η

GRP78 νοκ ντάουν ενίσχυσε την epirubicin μεσολάβηση αναστολή του μονοπατιού Akt

Υπάρχουν αυξανόμενες ενδείξεις ότι η Akt μονοπάτι παρέχει σύνδεση μεταξύ των σημάτων εξωκυτταρικό επιβίωση και τους παράγοντες που επάγουν αποπτωτικά γεγονότα εντός κυττάρων [21]. Για να διερευνηθεί κατά πόσο η οδός Akt συμμετέχει σε επιρουβικίνη-απόπτωση, εξετάσαμε την κατάσταση φωσφορυλίωσης της Akt στα κωδικοποιημένα κύτταρα ελέγχου και η GRP78 νοκ ντάουν κύτταρα μετά την epirubicin θεραπεία. Κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν, και το επίπεδο φωσφορυλίωσης της Akt αναλύθηκε με στύπωση western με το αντίσωμα αντι-φωσφο-Ακί (Thr308). Akt φωσφορυλίωση μειώθηκε σε μεγαλύτερο βαθμό στα GRP78 knockdown κυττάρων σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου περιπλεγμένο μετά από 24 και 48 ώρες της epirubicin θεραπείας (Σχήμα 4Α). Ερευνήσαμε επίσης τα αποτελέσματα της epirubicin στην δραστικότητα της κινάσης Akt χρησιμοποιώντας ανοσοκαθίζηση και κηλίδωση Western τεχνικές. Epirubicin ανέστειλε το επίπεδο φωσφορυλίωσης GSK-3α /3β, (όπως φάνηκε με την δραστικότητα της κινάσης Akt) και στις δύο κωδικοποιημένα κύτταρα ελέγχου και τα GRP78 knockdown κυττάρων, και η ελάττωση της δραστικότητας της κινάσης Akt φάνηκε να ενισχύεται στο knockdown GRP78 κύτταρα σε 48 h (Σχήμα 4Β). Επειδή πρόσφατα ευρήματα έχουν προτείνει ότι η πρωτεΐνη GSK-3β, η οποία είναι βασικός παράγοντας σε στρες αποκρίνονται απόπτωση, είναι μία από τις κατάντη πρωτεϊνικών υποστρωμάτων για Akt κινάση [22], η επιρουβικίνη επαγόμενη καταστολή της φωσφορυλίωσης Akt μπορεί να αναστέλλει Akt-εξαρτώμενη φωσφορυλίωση της GSK-3β. Για να ελεγχθεί αυτή η πιθανότητα, ολική πρωτεΐνη προϊόντα λύσης που παρασκευάζονται από κωδικοποιημένα κύτταρα ελέγχου epirubicin επεξεργασμένο και GRP78 knockdown κύτταρα υποβλήθηκαν σε ανοσοκηλίδωση με ένα αντίσωμα φωσφο-GSK-3β που ειδικά αναγνωρίζει GSK-3β φωσφορυλιωμένη επί Ser-9. Κωδικοποιημένα κύτταρα ελέγχου και GRP78 knockdown κυττάρων εμφάνισαν σημαντικές μειώσεις στην φωσφορυλίωση GSK-3β, και το υψηλότερο επίπεδο αναστολής εμφανίστηκε στα GRP78 knockdown κύτταρα επωάζονται με epirubicin για 48 ώρες (Εικόνα 4C). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η αναστολή της καταρράκτη σηματοδότησης Akt ενισχύθηκε από την knockdown GRP78 σε κύτταρα επιρουβικίνη φάρμακο.

Κωδικοποιημένα ελέγχου και GRP78 knockdown κυττάρων DLD-1 υποβλήθηκαν σε αγωγή με επιρουβικίνη (500 ng /ml) για την υποδεικνυόμενους χρόνους. Η φωσφορυλίωση των (Α) Akt και (C) GSK 3β αξιολογήθηκε με κηλίδωση Western. (Β) Akt ενεργότητα προσδιορίστηκε όπως περιγράφεται στο

Υλικά και Μέθοδοι

. Η πρωτεΐνη στη μεμβράνη PVDF κηλιδώθηκαν με Coomassie brilliant blue δείχνεται ως εσωτερικός έλεγχος. Αυτά τα πειράματα διεξήχθησαν τουλάχιστον 3 φορές, και ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα παρουσιάζεται.

Η

GRP78 νοκ ντάουν ενίσχυσε την epirubicin μεσολάβηση προς τα κάτω ρύθμιση των κατάντη στόχους του μονοπατιού Akt

Εμείς διερευνηθεί κατά πόσον αναστολή του μονοπατιού σηματοδότησης Akt είχε επιπτώσεις στην κατάντη στόχους στην ομελέτα κύτταρα ελέγχου και GRP78 νοκ ντάουν κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με epirubicin. β-κατενίνη είναι ένας στόχος GSK-3β που εμπλέκεται στην αποπτωτική αντίσταση και σηματοδότησης επιβίωσης [23], και αυξημένη έκφραση του β-κατενίνης έχει συσχετιστεί με αυξημένη επιβίωση στον καρκίνο [23]. Μια εξέταση της έκφρασης β-κατενίνης απεκάλυψε ότι δεν είχε αλλάξει σημαντικά στα κωδικοποιημένα κύτταρα ελέγχου μετά από 24 ή 48 ώρες της θεραπείας epirubicin. Μια μείωση στην έκφραση β-κατενίνης, ωστόσο, παρατηρήθηκε μετά από 48 ώρες της epirubicin θεραπείας στις GRP78 knockdown κυττάρων (Σχήμα 5).

Κωδικοποιημένα ελέγχου και GRP78 knockdown κυττάρων DLD-1 υποβλήθηκαν σε αγωγή με επιρουβικίνη (500 ng /ml) για τους υποδεικνυόμενους χρόνους, και η έκφραση της β-κατενίνης αξιολογήθηκε με κηλίδωση Western. Αυτά τα πειράματα διεξήχθησαν τουλάχιστον 3 φορές, και ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα παρουσιάζεται.

Η

GRP78 νοκ ντάουν αυξημένη πρωτεΐνη δραστηριότητα 2Α φωσφατάσης με epirubicin θεραπεία

Διάφορες μελέτες έχουν δείξει σύνδεση μεταξύ της οδού Akt και φωσφατάσες. Για παράδειγμα, ΡΡ2Α έχει δειχθεί ότι είναι ένας βασικός Akt φωσφατάση που μπορούν να αποφωσφορυλιώνει Akt τόσο σε Thr 308 και Ser 493 κατάλοιπα και μπλοκάρουν την Akt μονοπάτι [21]. Εξετάσαμε στη συνέχεια εάν η έκφραση και η δραστικότητα της ΡΡ2Α συμμετείχε σε επιρουβικίνη επαγόμενη απόπτωση στα κωδικοποιημένα κύτταρα ελέγχου και η GRP78 knockdown κυττάρων. Το Σχήμα 6Α δείχνει ότι η έκφραση του ΡΡ2Α μειώθηκε στα κωδικοποιημένα κύτταρα ελέγχου επιρουβικίνη επεξεργασία μετά από 48 ώρες θεραπείας. Αντιστρόφως, η έκφραση της ΡΡ2Α αυξήθηκε στις 24 ώρες και δεν μειώνεται στις 48 ώρες στα GRP78 knockdown κυττάρων επιρουβικίνη επεξεργασία. Η δραστικότητα των ΡΡ2Α μειώθηκε ελαφρά σε 24 ώρες και μειώθηκε σημαντικά στις 48 ώρες στα κύτταρα ελέγχου επιρουβικίνη επεξεργασμένα κωδικοποιημένο. Αντίθετα, η δραστηριότητα αυξήθηκε σημαντικά ΡΡ2Α περίπου 2-φορές στις 24 ώρες στα επιρουβικίνη-κατεργασμένων κυττάρων GRP78 knockdown (Σχήμα 6Β). δραστηριότητα ΡΡ2Α δεν μειωθεί σημαντικά σε 48 ώρες στις επιρουβικίνη επεξεργασμένα κύτταρα GRP78 νοκ ντάουν. Αυτά τα πειράματα έδειξαν μια σαφή σχέση μεταξύ αυξημένης δραστηριότητας ΡΡ2Α και επαγωγή απόπτωσης μέσω της αναστολής της οδού Akt στα GRP78 knockdown κυττάρων κατά τη διάρκεια της θεραπείας epirubicin. Αυτό υπογράμμισε τη σημασία της GRP78 νοκ ντάουν για την αναστολή της DLD-1 κύτταρα πολλαπλασιασμού.

Ομελέτα ελέγχου και GRP78 νοκ ντάουν κυττάρων DLD-1 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με epirubicin (500 ng /ml) για τους υποδεικνυόμενους χρόνους. (Α) Η έκφραση της ΡΡ2Α εκτιμήθηκε με κηλίδωση Western, και (Β) της δραστηριότητας της ΡΡ2Α προσδιορίστηκε όπως περιγράφεται στο

Υλικά και Μέθοδοι

. Αυτά τα πειράματα διεξήχθησαν τουλάχιστον 3 φορές, και ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα παρουσιάζεται.

Η

Συζήτηση

Ένα κοινό χαρακτηριστικό πολλών καρκίνων είναι επαυξημένης επίπεδα των ROS. Η κύρια πηγή αυτών των ROS είναι αυξημένη μεταβολική δραστηριότητα [21]. Τα υψηλά επίπεδα ROS και Nrf2 πυρηνική μετατόπιση στα GRP78 knockdown κυττάρων έδειξαν ότι GRP78 παίζει ένα οξειδοαναγωγικό ομοιοστατική ρόλο στα κύτταρα DLD-1. Με την παρουσία του GRP78, epirubicin προκάλεσε μόνο ένα χαμηλό επίπεδο ROS (& lt? 2-φορές) σε DLD-1 κύτταρα, και ένα χαμηλό επίπεδο ROS μπορεί να οδηγήσει στην ενεργοποίηση ειδικών αντιοξειδωτικών συστημάτων σε καρκινικά κύτταρα που μπορεί να επάγει αντίσταση σε χημειοθεραπεία. Είναι ενδιαφέρον ότι, τα αντιοξειδωτικά DTT και PG τόσο ενίσχυσε την αποπτωτική δράση της epirubicin στα κωδικοποιημένα κύτταρα ελέγχου. Η μείωση των ROS από epirubicin στα GRP78 νοκ ντάουν κύτταρα υπογράμμισε την πιθανότητα ότι τα αυξημένα επίπεδα ROS στα κύτταρα DLD-1 μπορεί να έχει άμεση επίδραση στις οδούς κυτταρικής επιβίωσης.

GRP78 είναι μια συνοδός που υπάρχει στο ER. Σε άτονα κύτταρα, οι ER διαμεμβρανικές πρωτεΐνες (PERK και IRE1) διατηρούνται σε μία ανενεργή κατάσταση μέσω της προσάρτησης της GRP78 για ER-αυλική περιοχές τους [24]. Σε γενικές γραμμές, οι αυλού περιοχές των ανενεργών μορφών PERK και IRE1 αποτελείται από 1:01 συμπλοκών με GRP78 [25]. Μόλις ER στρες παρουσιάζεται, GRP78 διαχωρίζει και συνδέεται με ξεδιπλωμένη ή misfolded πρωτεΐνες, η οποία επιτρέπει στον ομο-ολιγομερισμό PERK, IRE1 ή και τα δύο και οδηγεί στην αυτοφωσφορυλίωση των ενζύμων αυτών και την ενεργοποίηση των υποστρωμάτων τους [24]. Nrf2 είναι ένα άμεσο υπόστρωμα του PERK και ένας τελεστής της επιβίωσης PERK-εξαρτώμενη κυτταρική [26], το οποίο εξηγεί γιατί η GRP78 knockdown DLD-1 κύτταρα εξέφρασαν ένα μεγάλο ποσό των πυρηνικών Nrf2.

Nrf2 δρα ως αισθητήρας για οξειδωτικό στρες και ρυθμίζει την ενεργοποίηση των αμυντικών γονιδίων, η οποία οδηγεί στην προστασία των κυττάρων από τις δυσμενείς επιπτώσεις του οξειδωτικού στρες και προάγει κυτταρική επιβίωση [27]. Σε πολλές καρκινικά κύτταρα, Nrf2 δείχνει προ-καρκινικές χαρακτηριστικά τα οποία είναι παρόμοια με εκείνα των πανομοιότυπων κυτταροπροστατευτικών γονίδια που μπορούν να αυξήσουν την αντίσταση των καρκινικών κυττάρων σε χημειοθεραπευτικά φάρμακα [8]. Για παράδειγμα, φθοροουρακίλη διεγείρει την οδό Nrf2, η οποία διαμορφώνει χημειοευαισθησία και επάγει κυτταροπροστατευτική γονιδίων σε ΗΤ-29 κύτταρα καρκίνου κόλου [9]. Nrf2 είναι ένας κρίσιμος παράγοντας μεταγραφής που ελέγχει μια προστατευτική ανταπόκριση έναντι τοξικών προσβολών από ένα εκτεταμένο φάσμα των χημικών ουσιών [25]. Τα τελευταία χρόνια, μελέτες έχουν αποδείξει το ρόλο της Nrf2 στην προστασία έναντι τόσο νέα όσο και ρεύμα χημειοθεραπευτικά φάρμακα σε καρκίνους του αίματος [8]. Nrf2 υπερέκφραση έχει επίσης παρατηρηθεί σε καρκίνο του παγκρέατος [7]. Επιπλέον, μια μελέτη έχει δείξει ότι η σταθερή υπερέκφραση του Nrf2 σε καρκινικά κύτταρα επάγει ένα αυξημένο επίπεδο αντίστασης σε χημειοθεραπευτικούς παράγοντες, συμπεριλαμβανομένων των δοξορουβικίνη, ετοποσίδη και σισπλατίνη [25]. Άλλες αναφορές έχουν προτείνει ότι η στρατηγική της χρήσης αναστολέων Nrf2 για να αυξήσει την αποτελεσματικότητα των χημειοθεραπευτικών παραγόντων δεν περιορίζεται σε αντικαρκινικά φάρμακα ή ορισμένων τύπων καρκίνου. Πράγματι, οι αναστολείς Nrf2 μπορεί να χρησιμοποιηθεί κατά τη διάρκεια της χημειοθεραπείας για τη θεραπεία πολλών τύπων καρκίνου [25]. Η παρούσα μελέτη αποκάλυψε ότι η απόπτωση ενισχύθηκε από epirubicin θεραπεία στα Nrf2 siRNA που έλαβαν GRP78 νοκ ντάουν κύτταρα, γεγονός που υποδηλώνει ότι η Nrf2 παίζει κρίσιμο αμυντικό ρόλο στις GRP78 νοκ ντάουν κύτταρα.

Μια πρόσφατη μελέτη αποκάλυψε ότι η αποσιώπηση της Lin et al.