Αφηρημένο

Ιστορικό

Anti-μιτωτική ενώσεις (μικροσωληνίσκων de -stabilizers) όπως βινκριστίνη και βινβλαστίνη έχει αποδειχθεί κλινικά επιτυχής στη θεραπεία διαφόρων καρκίνων. Ωστόσο, η ανάπτυξη των κυττάρων φαρμακευτικής αντίστασης περιορίζει αποτελεσματικότητες τους σε κλινικές καταστάσεις. Ως εκ τούτου, διεξήχθησαν πειράματα για τον προσδιορισμό πιθανών μηχανισμών ανθεκτικότητας στα φάρμακα που σχετίζονται με την εφαρμογή του αντι-μιτωτικής θεραπείας του καρκίνου.

Κύρια Ευρήματα

Μια KB προέρχονται από μικροσωληνίσκων de-σταθεροποιητή ανθεκτικά KB-

L30

καρκινική κυτταρική σειρά δημιουργήθηκε για τη μελέτη αυτή. KB-

L30

κύτταρα έδειξαν διασταυρούμενη αντίσταση σε διάφορες μικροσωληνίσκων de-σταθεροποιητές, συμπεριλαμβανομένων BPR0L075, βινκριστίνη και κολχικίνη μέσω ανθεκτικών σε πολλαπλά φάρμακα (MDR) ανεξάρτητη από μηχανισμούς. Παραδόξως, KB-

L30

κύτταρα έδειξαν υπερ-ευαισθησία προς τον μικροσωληνίσκων σταθεροποιητή, πακλιταξέλη. Τα αποτελέσματα της ανάλυσης RT-PCR αποκάλυψε ότι η έκφραση και των δύο κλάσεων II και III β-τουμπουλίνης ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω σε KB-

L30

κύτταρα σε σύγκριση με τη γονική καρκινικά κύτταρα του ΚΒ. Επιπλέον, η ανάλυση της αλληλουχίας του DNA αποκάλυψε έξι νέες θέσεις μετάλλαξης παρόν σε εξώνιο τέσσερα του βΙ-τουμπουλίνης γονίδιο. Υπολογιστική μοντελοποίηση έδειξε ότι υπάρχει άμεση σχέση μεταξύ βΙ-τουμπουλίνης μεταλλάξεις και τις μεταβολές στο συγκρότημα μικροσωληνίσκων και δυναμική αστάθεια στην KB-

L30

κύτταρα και αυτή προέβλεψε μοντέλο υποστηρίχθηκε από μια αυξημένη συγκρότηση μικροσωληνίσκων και μειωμένη μικροσωληνίσκων δυναμική αστάθεια σε KB-

L30

κύτταρα, όπως φαίνεται με ανάλυση κηλίδος Western.

Συμπεράσματα και Σημασία

η μελέτη μας έδειξε ότι αυτά τα νέα μεταλλάξεις στο εξόνιο τέσσερα του βΙ-τουμπουλίνης που προκαλείται αντίσταση να μικροσωληνίσκων de-σταθεροποιητές και υπερ-ευαισθησία προς σταθεροποιητής μικροσωληνίσκων μέσω μιας αλλαγής στην συγκρότηση μικροσωληνίσκων και τη δυναμική σε καρκινικά κύτταρα. Είναι σημαντικό ότι, η τρέχουσα μελέτη αποκαλύπτει ότι τα καρκινικά κύτταρα μπορούν να αποκτήσουν την ικανότητα αντίστασης φαρμάκου σε αντι-μιτωτική ενώσεις μέσω πολλαπλών αλλαγών στα δίκτυα μικροσωληνίσκων. Η μελέτη παρέχει περαιτέρω μοριακές πληροφορίες σε επιλογή φαρμάκου για ασθενείς με συγκεκριμένες μεταλλάξεις τουμπουλίνης

Παράθεση:. Cheung CHA, Wu S-Y, Lee, Τ-R, Chang, C-Y, Wu J-S, Hsieh Η-Ρ, et al. (2010) Τα καρκινικά κύτταρα αποκτήσουν Μιτωτικά Drug Resistance Properties Μέσω Beta I-τουμπουλίνης Μεταλλάξεις και Μεταβολές στην έκφραση της β-τουμπουλίνης ισότυποι. PLoS ONE 5 (9): e12564. doi: 10.1371 /journal.pone.0012564

Επιμέλεια: Wen-Liang Zhou, η Sun Yat-Sen University, η Κίνα

Ελήφθη: 21 Ιουνίου 2010? Αποδεκτές: 12 Αυγ του 2010? Δημοσιεύθηκε: 3 Σεπτεμβρίου 2010

Copyright: © 2010 Cheung et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από τειχών επιχορηγήσεις NSC98-3114-M-006-002 και NSC98-2323-Β-400-004 από το Εθνικό Επιστημονικό Συμβούλιο, την Ταϊβάν, Δημοκρατία της Κίνας, DOH99-TD-C-111-004 από το Υπουργείο Υγείας , Ταϊβάν, Δημοκρατία της Κίνας και CA-097-PP-02 από τις Εθνικό Σύστημα Υγείας Ερευνητικά Ινστιτούτα, την Ταϊβάν, Δημοκρατία της Κίνας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

οι μικροσωληνίσκοι είναι πρωτεΐνη νήματα του κυτταροσκελετού που αποτελείται από α-τουμπουλίνης και β-τουμπουλίνης μόρια. Σε κύτταρα, ίνες μικροσωληνίσκων γρήγορα εναλλάσσονται μεταξύ των φάσεων της ανάπτυξης και συρρίκνωσης (δυναμική αστάθεια) κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου [1]. Δεδομένου ότι οι μικροσωληνίσκοι παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της μιτωτικής συσκευής, διάσπαση των μικροσωληνίσκων μπορεί να διεγείρει διακοπή κύκλου κυττάρου σε φάση Μ, ο σχηματισμός των μη φυσιολογικών μιτωτικών ατράκτων, και, τέλος, ενεργοποίηση των σημάτων για την απόπτωση. Η ανακάλυψη ότι η κυτταροτοξική δραστικότητα των διαφόρων ενώσεων είναι μέσω της παρεμβολής με τη συσκευή μιτωτικής ατράκτου έχει προσελκύσει μεγάλη προσοχή εντός των τελευταίων δύο δεκαετιών, και μικροσωληνίσκους έχουν καταστεί ένας ελκυστικός στόχος για φαρμακολογικές ανακάλυψη αντικαρκινικών φαρμάκων. Αντι-μιτωτικά ενώσεις όπως βινκριστίνη, βινβλαστίνη (μικροσωληνίσκους αποσταθεροποιούν

Vinca

αλκαλοειδές) και paclitaxel (σταθεροποίησης μικροσωληνίσκων ταξανίου) έχουν αναπτυχθεί για να στοχεύουν καρκίνους κλινικώς [2], [3]. Αν και οι ταξάνες και

Vinca αλκαλοειδή

είναι αποτελεσματικές για τη διαχείριση των διαφόρων κακοηθειών, το δυναμικό τους είναι περιορισμένη από την ανάπτυξη αντοχής πολυφαρμάκου (MDR) [4], [5]. MDR είναι πολυ-παραγοντική, με ένα μονοπάτι που οδηγεί στην αντίσταση που προκαλείται από την υπερ-έκφραση των αντλιών διαμεμβράνης εκροής, δηλαδή, η

M

r 170.000 Ρ-γλυκοπρωτεΐνη (P-gp170 /MDR) και η πρωτεΐνη αντοχής πολυφαρμάκου (MRP) [5], [6]. Εκτός από την έκφραση του MDR, επιπλέον μηχανισμούς αντοχής σε αντι-μιτωτική φαρμάκων έχουν επίσης περιγραφεί προηγουμένως. Αυτές περιλαμβάνουν αλλαγές στην έκφραση ισότυπο τουμπουλίνης και μεταλλάξεις στο γονίδιο τουμπουλίνης [7], [8]. Τα κύτταρα που περιέχουν μεταλλάξεις όπως D45Y, S172A, D197N, D224N, S234N, L240I και K350N στην κατηγορία Ι βήτα-τουμπουλίνης έχουν βρεθεί ανθεκτικά σε κολχικίνη και

Vinca

αλκαλοειδές [7]. Από την άλλη πλευρά, τα κύτταρα που περιέχουν μεταλλάξεις όπως P173A, Q292E και Y422C στην κατηγορία Ι βήτα-τουμπουλίνης βρέθηκε ανθεκτική στην εποθιλόνη (μέσο σταθεροποίησης μικροσωληνίσκων) [9]. Είναι ενδιαφέρον ότι, η υπερέκφραση του βIII-τουμπουλίνης έχει αποδειχθεί σε πακλιταξέλη ανθεκτικά κύτταρα [10], [11], [12]. Ωστόσο, σε συνδυασμό αλλαγές (εναλλαγές στο έκφρασης τουμπουλίνης ισότυπο και μεταλλάξεις στο γονίδιο β-τουβουλίνης) στα δίκτυα μικροσωληνίσκων σπάνια αποδεικνύεται στα αντι-μιτωτικά κύτταρα καρκίνου αντοχής φαρμάκου.

Σε αυτή τη μελέτη, ένας μικροσωληνίσκων de -stabilizer ανθεκτική κυτταρική σειρά καρκίνου χρησιμοποιήθηκε για να ερευνήσει νέες αλλαγές στα κύτταρα που ήταν σε θέση να επάγουν αντίσταση σε αντι-μιτωτική ενώσεις. KB-

L30

είναι μια KB προερχόμενο BPR0L075 (μικροσωληνίσκων de-σταθεροποιητής) ανθεκτικών καρκινικών κυττάρων γραμμή. δημοσιευμένη μελέτη μας έδειξε ότι KB-

L30

κύτταρα υπερ-εκφράζεται survivin, οδηγώντας στη σταθεροποίηση των μικροσωληνίσκων δικτύων και καταλήγοντας σε αντίσταση σε μικροσωληνίσκους ενώσεις de σταθεροποίησης [13]. Ωστόσο, κάτω ρύθμιση survivin μόνο εν μέρει αποκατασταθεί το φάρμακο-ευαισθησία σε μικροσωληνίσκων de-σταθεροποιητές κολχικίνη και BPR0L075, υποδηλώνοντας ότι πρόσθετα ανθεκτικά στα φάρμακα μηχανισμός είναι παρόν σε αυτή την κυτταρική σειρά [13]. Εδώ, ερευνήσαμε πρόσθετους μηχανισμούς που μπορεί να είναι υπεύθυνη για τα ναρκωτικά αντίσταση στην μικροσωληνίσκων de-σταθεροποιητών σε KB-

L30

κύτταρα.

Αποτελέσματα

KB-

L30

κύτταρα δείχνουν τα ναρκωτικά αντίσταση στην μικροσωληνίσκων de-σταθεροποιητές και υπερ-ευαισθησία στο σταθεροποιητή μικροσωληνίσκων

Μια KB προέρχονται από BPR0L075 ανθεκτική κυτταρική σειρά καρκίνου, KB-

L30

, δημιουργήθηκε στο εργαστήριο μας. Εν συντομία, KB-

L30

ήταν ένα μονοκλωνικό κυτταρική γραμμή που επιλέγεται για την αντοχή με την συνεχή έκθεση του γονικού κυτταρική σειρά καρκίνου, KB, σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις του μικροσωληνίσκων de-σταθεροποιητική ένωση, BPR0L075. KB-

L30

κύτταρα καλλιεργούνται σε μέσο με 30 nM της BPR0L075 να διατηρήσει ανθεκτικά στα φάρμακα χαρακτηριστικό της. Αυτή η ειδική ανθεκτική στα φάρμακα κυτταρική σειρά καρκίνου είναι 6 φορές πιο ανθεκτικό σε BPR0L075 σε σύγκριση με γονικά κύτταρα του (Πίνακας 1) (Σχήμα 1Α). Επιπλέον, KB-

L30

κύτταρα εμφανίζουν διασταυρούμενη αντοχή με άλλα μικροσωληνίσκων παράγοντες de-σταθεροποίησης, κολχικίνη (7-πλάσια ανθεκτικά) και βινκριστίνη (7-πλάσια ανθεκτικά) (Πίνακας 1) (Σχήμα 1 Β και C) . Παραδόξως, αυτή η ανθεκτική στα φάρμακα κυτταρική σειρά καρκίνου είναι 5 φορές πιο ευαίσθητο στην πακλιταξέλη σταθεροποίησης μικροσωληνίσκων παράγοντα όπως σύγκριση με κύτταρα ΚΒ (Πίνακας 1) (Σχήμα 1 D).

ΚΒ και KB-

L30

κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις BPR0L075 (Α), κολχικίνη (Β), βινκριστίνη (C) και paclitaxel (D) για 3 ημέρες και η κυτταρική βιωσιμότητα μετρήθηκε με τη δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας ΜΤΤ.

η

Πολλαπλών ανθεκτικών στα φάρμακα πρωτεΐνης (MDR) δεν υπάρχει στο KB-

L30

κύτταρα

Προηγούμενη μελέτη έδειξε ότι η μικροσωληνίσκων de-σταθεροποιητική ένωση BPR0L075 ήταν εξίσου αποτελεσματική τόσο MDR /MRP αρνητικά και θετικά καρκινικά κύτταρα [14], εμμέσως υποδηλώνοντας ότι η BPR0L075-αντίσταση KB-

L30

κύτταρα εμφανίζουν ιδιότητες αντοχής φαρμάκου μέσω MDR /MRP-ανεξάρτητο μηχανισμό. Για να υποστηρίξει περαιτέρω τα παραπάνω ευρήματα, RT-PCR διεξήχθη για να διαπιστωθεί αν KB-

L30

κύτταρα υπερ-εκφράζεται MDR-1. RT-PCR ανάλυση έδειξε ότι ούτε KB ούτε KB-

L30

κύτταρα εκφράζουν MDR-1 (Σχήμα 2Α). Σε αντίθεση, MDR-1 εκφράστηκε στο βινκριστίνη ανθεκτική κυτταρική σειρά καρκίνου, ΚΒ-VIN10 (θετικός έλεγχος) (Εικόνα 2Α). Επιπλέον, τα αποτελέσματα από τον ποσοτικό πραγματικό χρόνο PCR αποκάλυψε ότι μια άλλη σημαντική αντλία εκροής φαρμάκου, MPR-1, δεν ήταν υπερ-εκφράζεται σε KB-

L30

κύτταρα σε σύγκριση με τη γονική ΚΒ κύτταρα (Εικόνα 2Β). Σε αντίθεση, MRP-1 υπερεκφράζεται στη θετική κυτταρική σειρά ελέγχου, ΚΒ-20α (Σχήμα 2Β). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι KB-

L30

κύτταρα επάγεται αντίσταση σε μικροσωληνίσκους de-σταθεροποιητές μέσω MDR-ανεξάρτητων μηχανισμών.

Η έκφραση του MDR-1 σε KB, KB-

L30

και τα κύτταρα ΚΒ-VIN10 αναλύθηκε με RT-PCR (Α). Η έκφραση του MRP-1 σε KB, KB-

L30

και κύτταρα ΚΒ-20α αναλύθηκε με πραγματικού χρόνου PCR (Β). GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος τόσο RT-PCR και σε πραγματικό χρόνο αναλύσεις PCR.

Η

KB-

L30

κύτταρα παρουσιάζουν μεταβολές στην έκφραση ισοτόπου β τουμπουλίνης

Από KB-

L30

κυττάρων που προκαλείται από BPR0L075 και κολχικίνη-αντίστασης μέσω MDR /MRP-ανεξάρτητο μηχανισμό, άλλοι μηχανισμοί ανθεκτικότητας στα φάρμακα έχει διερευνηθεί. Έχει ευρέως καταδειχθεί ότι οι αλλοιώσεις της έκφρασης β-τουμπουλίνης ισοτύπων στο επίπεδο του mRNA που σχετίζονται με την επαγωγή μιτωτικό φαρμακευτικής αντίστασης σε καρκινικά κύτταρα [15], [16]. Εδώ, η έκφραση της β-τουμπουλίνης ισοτύπων σε ΚΒ και KB-

L30

κύτταρα αναλύθηκε με RT-PCR. Στο επίπεδο mRNA, η έκφραση της τάξης II και III β-τουμπουλίνης ισοτύπων μειώθηκε σε KB-

L30

κύτταρα σε σύγκριση με τα μικροσωληνίσκων de-σταθεροποιητές ευαίσθητα κύτταρα ΚΒ (Σχήμα 3Α). Η ποσότητα της τάξης II και III β-τουμπουλίνης ισοτύπων εκφράζονται σε KB-

L30

κυττάρων μειώθηκε κατά 35% και 40% σε σύγκριση με γονικά κύτταρα του. Σε αντίθεση, δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στην έκφραση των τάξης Ι, IV

α και IV

b β-τουμπουλίνης ισοτύπων μεταξύ των δύο κυτταρικές γραμμές (Σχήμα 3Α).

την έκφραση διαφορετικών β-τουμπουλίνης ισοτύπων σε ΚΒ και KB-

L30

κύτταρα αναλύθηκε με RT-PCR. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος (A). RT-PCR και ένθετη-PCR αναλύσεις των εξονίων 1, 2, 3 και 4 στην κατηγορία III γονίδιο β-τουβουλίνης του ΚΒ και KB-

L30

κύτταρα. Πρώτη λωρίδα, ΚΒ κύτταρα και δεύτερη λωρίδα, KB-

L30

κύτταρα (Β). PCR-SSCP αναλύσεις των εξονίων 1, 2, 3 και 4 στην κατηγορία III γονίδιο β-τουβουλίνης του ΚΒ και KB-

L30

κύτταρα. Πρώτη λωρίδα, ΚΒ κύτταρα και δεύτερη λωρίδα, KB-

L30

κύτταρα (C).

Η

KB-

L30

κύτταρα παρουσιάζουν πολλαπλές μεταλλάξεις στο εξόνιο τέσσερα από τα βΙ-τουμπουλίνης γονίδιο

Η συμβολή των σημειακών μεταλλάξεων β-τουμπουλίνης στην επαγωγή αντίστασης φαρμάκου σε διάφορες αντι-μιτωτική ενώσεων περιγράφεται επίσης προηγουμένως [7], [8], [17]. Δεδομένου ότι κατηγορίας Ι β-τουβουλίνης αντιπροσωπεύει -90% του συνολικού ενδοκυτταρικού πισίνα σε κύτταρα, η γονιδιακή αλληλουχία του βΙ-τουμπουλίνης του KB-

L30

κύτταρα αναλύθηκε. Πρώτον, RT-PCR διεξήχθη για να προσδιοριστεί εάν υπάρχει μεγάλη κλίμακα ένθεση αλληλουχίας ή διαγραφή ήταν παρόντα στο εξόνιο 1, 2, 3 και 4 του βΙ-τουμπουλίνης γονίδιο του KB-

L30

κύτταρα. Αποτελέσματα της RT-PCR και ηλεκτροφόρηση γέλης δεν αποκάλυψε σημαντικές διαφορές στο μοριακό μέγεθος (μήκος) οποιασδήποτε από τις εξώνια του βΙ-τουμπουλίνης γονίδιο μεταξύ KB-

L30

και ΚΒ κύτταρα (Σχήμα 3Β). Αυτό το αποτέλεσμα έδειξε ότι μεγάλη κλίμακα ένθεση αλληλουχίας ή διαγραφή δεν ήταν παρούσα στο βΙ-τουμπουλίνης γονίδιο του KB-

L30

κύτταρα. Έχουμε καθορίζεται περαιτέρω την παρουσία της σημειακής μετάλλαξης μόνο σε KB-

L30

κύτταρα εκτελώντας ανάλυση μονόκλωνης διαμόρφωσης πολυμορφισμού (SSCP). SSCP είναι ο ηλεκτροφορητικός διαχωρισμός των μονόκλωνων νουκλεϊκών οξέων με βάση λεπτές διαφορές στην αλληλουχία (συχνά ένα μόνο ζεύγος βάσεων), με αποτέλεσμα ένα διαφορετικό δευτερεύουσα δομή και μια μετρήσιμη διαφορά στην κινητικότητα μέσω πήγματος. Εδώ, τα αποτελέσματα του SSCP ανάλυση του βΙ-τουμπουλίνης γενωμικού DNA έδειξε καμία μετατόπιση ζώνης κινητικότητα του εξονίου 1, 2 και 3 του KB-

L30

, σε σύγκριση με εκείνη του ΚΒ κύτταρα (Σχήμα 3C). Παραδόξως, η ανάλυση SSCP αποκάλυψε μια μετατόπιση μοτίβο στο εξόνιο 4 του βΙ-τουμπουλίνης σε KB-

L30

κύτταρα.

αλληλούχιση του DNA πραγματοποιήθηκε για την εκ νέου επιβεβαίωση των παραπάνω αποτελεσμάτων. Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα των δύο RT-PCR και ανάλυση SSCP, της αλληλουχίας του DNA του βΙ-τουμπουλίνης του KB-

L30

κύτταρα δεν αποκάλυψε καμία μετάλλαξη που υπάρχει στο εξόνιο του 1, 2 και 3 περιοχές (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Είναι ενδιαφέρον, αλληλουχίας του DNA αποκάλυψε πολλαπλές μεταλλάξεις που υπάρχουν στο εξόνιο 4 του βΙ-τουμπουλίνης του

L30

κύτταρα KB-. Τα δεδομένα προσδιορισμού σειράς είναι τα αποτελέσματα από τουλάχιστον δύο πειράματα. Έξι σημειακές μεταλλάξεις βρέθηκαν στο νουκλεοτίδιο 947 από Τ σε Α (με νόημα), 1114 από Α σε Τ, 1145 από Ο σε Τ, 1213 από Ο σε Α, 1294 από Ο σε Α και 1310 από Ο σε Τ (Σχήμα 4Α). Αυτές οι μεταλλάξεις αντιστοιχούν σε αμινο-οξύ μεταλλάξεις V316D, T372S, S382L, E405K, E432K και G437K (Σχήμα 4Β).

αλληλουχίας του DNA του βΙ-τουμπουλίνης γενωμικού DNA αποκαλύπτει έξι μεταλλάξεις σημείου που υπάρχει στο εξόνιο 4 (Α) . Μεταφρασμένη αλληλουχία αμινοξέων της μεταλλαγμένης εξονίου 4 του γονιδίου βΙ-τουμπουλίνης (Β). Η έκφραση του μεταλλαγμένου βΙ-τουμπουλίνης πρωτεΐνη και την ενσωμάτωσή της στα δίκτυα μικροσωληνίσκων αποκαλύφθηκαν με ανοσο-φθορισμού μικροσκοπία. Τα κύτταρα ανιχνεύθηκαν με αντι-βΙ-τουμπουλίνης αντίσωμα (C). Η επιμόλυνση του μεταλλαγμένου γονιδίου βΙ-τουμπουλίνης σε κύτταρα ΚΒ μείωσε την ευαισθησία φαρμάκου σε BPR0L075 in vitro (D).

Η

χρώση ανοσοφθορισμού διεξήχθη για να προσδιοριστεί εάν η μεταλλαγμένη βΙ-τουμπουλίνης γονίδιο οδήγησαν σε πρωτεΐνες που ενσωματώθηκαν στη συνέχεια στα δίκτυα μικροσωληνίσκων σε L30

κύτταρα KB-

. KB-

L30

κύτταρα βάφτηκαν με αντι-βΙ-τουμπουλίνης αντίσωμα και το συζευγμένο με FITC δεύτερο αντίσωμα. Αποτελέσματα της μικροσκοπία ανοσοφθορισμού έδειξε ότι η μεταλλαγμένη βΙ-τουμπουλίνης πρωτεΐνη ήταν παρούσα ως μέρος των μικροσωληνίσκων δίκτυα (Σχήμα 4C). Για να καταδειχθεί ότι μεταλλάξεις τουμπουλίνης ήταν πράγματι υπεύθυνο για την πρόκληση του φαινοτύπου BPR0L075 ανθεκτική, γονίδιο επιμόλυνση και υπερ-έκφραση του βΙ-τουμπουλίνης μεταλλαγμένο που περιέχει τις ανωτέρω μεταλλάξεις πραγματοποιήθηκε σε κύτταρα ΚΒ. ΜΤΤ δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας αποκάλυψε ότι ΚΒ κύτταρα επιμολυσμένα με το μεταλλαγμένο βΙ-τουμπουλίνης έδειξαν αυξημένη αντίσταση σε BPR0L075 (IC

50 11 ηΜ) σε σύγκριση με τα κύτταρα που επιμολύνθηκαν με τον έλεγχο κενό πλασμίδιο (IC

50 7 ηΜ) και άγριου τύπου βΙ-τουμπουλίνης (IC

50 7 nM) (Εικόνα 4D). Έτσι, η έκφραση του μεταλλαγμένου βΙ-τουμπουλίνης έκανε παίζουν ρόλο στην ευαισθησία των ναρκωτικών σε BPR0L075 σε KB κύτταρα.

μελέτες μοντέλων υπολογιστών για βΙ-τουμπουλίνης μεταλλάξεις στην αντίσταση BPR0L075

τουμπουλίνης μεταλλάξεις μπορεί να είναι που συνδέεται είτε με αλλαγμένη θέση σύνδεσης φαρμάκου ή αλλαγές στη σταθερότητα μικροσωληνίσκων. Εδώ, υπολογιστική μοντελοποίηση χρησιμοποιήθηκε για να δώσει διαρθρωτικές ιδέες. Η τρισδιάστατη δομή της τουμπουλίνης (κωδικός ΠΣΠ: 1SA0) χρησιμοποιήθηκε [18] και το πρόγραμμα Discovery Studio 2.1 (Accelrys, Inc) εφαρμόστηκε για την κατασκευή μοντέλου μεταλλάσσοντας υπολείμματα και εκτελώντας ελαχιστοποίησης ενέργειας. Σε αυτό το μοντέλο, το υπόλειμμα V318D (που αντιστοιχεί σε V316D σε KB-

L30

) βρίσκεται στην θέση κολχικίνη-σύνδεσης επί βΙ-τουμπουλίνης (Σχήμα 5Α). Val318 (είδος άγριου) που σχηματίζεται υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις με κολχικίνη. Ωστόσο, το μεταλλαγμένο υπόλειμμα (V μεταλλαχθεί προς D) μετατοπίζεται μακριά από κολχικίνη για να σχηματίσει ένα δεσμό υδρογόνου με το κατάλοιπο R320, με αποτέλεσμα την απώλεια της υδρόφοβης αλληλεπίδρασης με κολχικίνη (Σχήμα 5Α) στη μελέτη μοντελοποίησης. Αυτό το αποτέλεσμα δείχνει ότι V318D μπορεί να αποδυναμώσει τη συγγένεια δέσμευσης κολχικίνης σε β-τουμπουλίνης. Από την άλλη πλευρά, οι μεταλλάξεις του καταλοίπου 392 (που βρίσκεται στο Helix 11) και το υπόλειμμα 382 (που βρίσκεται στο βρόχο κοντά Helix 11) αλλάζουν την διαμόρφωση της Helix 11, το οποίο θα μπορούσε να αυξήσει τις διαμήκεις αλληλεπιδράσεις και κατά συνέπεια μεταβάλλει την σταθερότητα των μικροσωληνίσκων (Σχήμα 5Β ) [19]. E415K (που αντιστοιχεί σε E405K σε KB-

L30

) βρίσκεται στην περιοχή H11-H12 κοντά στη διασύνδεση διμερούς που εμπλέκεται στη διαμήκη επαφές. Υπόλειμμα 415, μεταλλάσσεται από Glu σε Lys, σπάει τις αλληλεπιδράσεις δεσμού υδρογόνου με το κατάλοιπο K402 και, κατά συνέπεια, οδηγεί στην κίνηση των K402 πιο κοντά στην α-τουμπουλίνης. Η μετατόπιση του υπολείμματος K402 (Σχήμα 5C) οδηγεί σε στενές επαφές με τα κατάλοιπα; V260, Y262 και W346 στην α-τουμπουλίνης, αυξάνοντας τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ των β-τουμπουλίνης και α-τουμπουλίνης. Helix 11 βρίσκεται στη διεπαφή του α-τουμπουλίνης και β-τουμπουλίνης διμερές. Συμπερασματικά, η μελέτη υπολογιστική μοντελοποίηση δείχνει ότι οι μεταλλάξεις τουμπουλίνης σε KB-

L30

κύτταρα μπορεί να αυξήσει τη συγκρότηση μικροσωληνίσκων και τη σταθερότητα.

Η

KB-

L30

κύτταρα εμφανίζουν αυξημένη δυναμικής των μικροσωληνίσκων συναρμολόγηση των μικροσωληνίσκων και μείωσε

Για να καθοριστεί αν, η ανάλυση της σταθερότητας και της δυναμικής των μικροσωληνίσκων σε KB-

L30

κύτταρα που επηρεάζονται από μεταλλάξεις στο βΙ-τουμπουλίνης, όπως διακηρύχθηκε από υπολογιστική ανάλυση Western blot διεξήχθη. Εδώ, ανάλυση κηλίδος Western αποκάλυψε ότι η ποσότητα τόσο α- και β-τουμπουλίνης σφαιρίδια υπάρχουν σε KB-

L30

κύτταρα αυξήθηκαν σε σύγκριση με τη γονική ΚΒ κύτταρα (Εικόνα 6Α). Αντίθετα, η διαλυτή μορφή του β-τουμπουλίνης παρούσα σε KB-

L30

κύτταρα μειώθηκε σε σύγκριση με εκείνη των κυττάρων ΚΒ (Σχήμα 6Α). χρώση ανοσοφθορισμού χρησιμοποιήθηκε επίσης για να στηρίξει περαιτέρω την παραπάνω αποτέλεσμα. Οι μικροσωληνίσκοι σημάνθηκαν με την rodamine-συζευγμένο αντίσωμα αντι-β-τουμπουλίνης και κύτταρα παρατηρήθηκαν κάτω από το μικροσκόπιο. KB-

L30

κύτταρα φαίνεται να έχουν μεγαλύτερη περιεκτικότητα μικροσωληνίσκων σε σύγκριση με ΚΒ κύτταρα (Σχήμα 6Β). Επιπλέον, η χρήση των μικροσωληνίσκων de-σταθεροποιητής, BPR0L075, ήταν σε θέση να μειώσει την περιεκτικότητα των μικροσωληνίσκων σε KB-

L30

κύτταρα (Σχήμα 6Β). Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματά μας πρότεινε ότι KB-

L30

κύτταρα παρουσίασαν αυξημένη συγκρότηση μικροσωληνίσκων.

Το ποσό της διαλυτές και αδιάλυτες α- και β-τουμπουλίνης σε KB και KB-

L30

κύτταρα αναλύθηκε με κηλίδωση Western. Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης (Α). Η ακεραιότητα των δικτύων μικροσωληνίσκων σε KB και KB-

L30

κυττάρων έδειξε με ανοσο-φθορισμού μικροσκόπιο. Τα κύτταρα ανιχνεύθηκαν με αντίσωμα αντι-β-τουμπουλίνης (Β). δυναμικής των μικροσωληνίσκων σε κύτταρα αναλύθηκαν με ανάλυση κηλίδος Western. Ακετυλιωμένης α-τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως έμμεσος δείκτης της δυναμικής των μικροσωληνίσκων και της ποσότητας ακετυλιωμένης-α-τουμπουλίνης αναλύθηκε σε BPR0L075 και paciltaxel επεξεργασμένα κύτταρα ΚΒ με κηλίδωση Western. Αλφα-τουμπουλίνης (συνολικός μορφή) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης (C). Η ποσότητα του ενδογενώς ακετυλιωμένης α-τουμπουλίνης σε ΚΒ και KB-

L30

κύτταρα αναλύθηκε με κηλίδωση Western. Άλφα-τουμπουλίνης (συνολική μορφή) χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας φόρτωσης (D).

Η

μικροσωληνίσκων δυναμική αστάθεια χαρακτηρίζεται από απότομες μεταβάσεις στοχαστική μεταξύ των φάσεων της επέκτασης και συντόμευση. Στο μοριακό επίπεδο, η αυξημένη α-τουμπουλίνης ακετυλίωση θεωρείται ότι είναι ένας δείκτης της μειωμένης δυναμικής μικροσωληνίσκων. Εδώ, ανάλυση κηλίδος Western αποκάλυψε ότι η ποσότητα της ακετυλιωμένης α-τουμπουλίνης μειώθηκε σε BPR0L075-επωάστηκαν ΚΒ κυττάρων σε μια συγκέντρωση-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 6C). Σε αντίθεση, η ποσότητα της ακετυλιωμένης α-τουμπουλίνης ήταν αυξημένη σε κύτταρα paclitaxel-επωάζονται (Σχήμα 6C). Μικροσωληνίσκων de-σταθεροποιητή βρέθηκε λειτουργούν στην επαγωγή των μικροσωληνίσκων δυναμική σταθεροποιητή αστάθεια και μικροσωληνίσκων βρέθηκε λειτουργεί στη μείωση των μικροσωληνίσκων δυναμική αστάθεια [20], [21]. Έτσι, η ποσότητα του ακετυλιωμένου α-τουμπουλίνης που υπάρχει στα κύτταρα θα μπορούσε να σχετίζεται με την ευαισθησία των κυττάρων σε διάφορα αντι-μιτωτικές ενώσεις. Για να καθοριστεί εάν KB-

L30

κύτταρα παρουσίασαν μειωμένη δυναμική των μικροσωληνίσκων, ανάλυση κηλίδος Western χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί το επίπεδο της α-τουμπουλίνης ακετυλίωση υπάρχει στα κύτταρα ανθεκτικά σε φάρμακο. Εδώ, ανάλυση κηλίδος Western αποκάλυψε ότι η ποσότητα του ακετυλιωμένου α-τουμπουλίνης ήταν αυξημένη σε KB-

L30

κύτταρα, σε σύγκριση με ΚΒ κύτταρα (Σχήμα 6D). Σύμφωνα με την πρόβλεψη από το υπολογιστικό μοντέλο, τα αποτελέσματα μας αποκάλυψαν ότι KB-

L30

κύτταρα παρουσίασαν τόσο βελτιωμένη σταθεροποίηση των μικροσωληνίσκων και μείωσε τη δυναμική των μικροσωληνίσκων. Επιπλέον, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η αλλοίωση της σταθερότητας των μικροσωληνίσκων και δυναμική KB-

L30

κύτταρα μπορεί να προκαλείται από την παρουσία του μεταλλαγμένου βΙ-τουμπουλίνης, με αποτέλεσμα την αντίσταση σε μικροσωληνίσκων de-σταθεροποιητές και υπερ-ευαισθησία σε μικροσωληνίσκων σταθεροποιητές.

Συζήτηση

έχουν αντιμιτωτική ενώσεις έχουν αποδειχθεί επιτυχείς στη θεραπεία διαφόρων καρκίνων. Ωστόσο, η ανάπτυξη των κυττάρων φαρμακευτικής αντίστασης περιορίζει αποτελεσματικότητες τους σε κλινικές καταστάσεις. Ως εκ τούτου, είναι σημαντικό να καθοριστεί πιθανός μηχανισμός ανθεκτικότητας στα φάρμακα που σχετίζονται με την εφαρμογή της θεραπείας του καρκίνου αντι-μιτωτικές. Θετική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης των πρωτεϊνών αντοχής σε πολλαπλά φάρμακα MDR-1, MRP-1 και την επαγωγή της ανθεκτικότητας στα φάρμακα για αντι-μιτωτική ενώσεων σε καρκίνους έχει αναφερθεί ευρέως προηγουμένως [4], [5]. Ωστόσο, αντοχή φαρμάκου σε αντι-μιτωτική ενώσεων σε καρκινικά κύτταρα πιστεύεται ότι είναι πολυπαραγοντική. Εδώ, έχουμε αποδείξει ότι η BPR0L075 ανθεκτικά KB-

L30

κύτταρα δεν εκφράζουν MDR-1 και MRP-1. Είναι σημαντικό ότι, η τρέχουσα μελέτη indentifies νέες θέσεις μετάλλαξης στο εξόνιο 4 του βΙ-τουμπουλίνης που είναι σε θέση να επάγουν τόσο φαρμακευτικής αντοχής σε μικροσωληνίσκους de-σταθεροποιητές και υπερ-ευαισθησία σε μικροσωληνίσκους σταθεροποιητές διαμέσου και των δύο μεταβολών στην θέση σύνδεσης φαρμάκου και μικροσωληνίσκων σταθερότητα.

Οι BPR0L075 ανθεκτικά KB-

L30

κύτταρα που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη φαίνεται να αποκτήσουν ανθεκτικά σε φάρμακο ιδιότητες της μέσω MDR /MRP-ανεξάρτητων μηχανισμών. Πρώτον, KB-

L30

κύτταρα δεν εκφράζουν δύο από τις πιο κοινές αντλίες αποβολής του φαρμάκου, MDR-1 και MRP-1. Επιπλέον, σε αντίθεση με τα παραδοσιακά αναστολείς μικροσωληνίσκων όπως η βινκριστίνη και η πακλιταξέλη, BPR0L075 είναι αποτελεσματική στην καταστολή της ανάπτυξης των κυττάρων και των δύο MDR /MRP-θετικών και -αρνητικοί κυτταρικών γραμμών όγκου [14].

In vivo

, BPR0L075 έδειξε ισχυρή δραστικότητα έναντι της ανάπτυξης των όγκων ξενομοσχεύματος του γαστρικού καρκινώματος ΜΚΝ-45, ανθρώπινο καρκίνωμα του τραχήλου της μήτρας ΚΒ, και ΚΒ-προερχόμενο P-gp170 /MDR κύτταρα που υπερεκφράζουν ΚΒ-VIN10 σε γυμνά ποντίκια [14]. Ωστόσο, BPR0L075 ήταν αναποτελεσματική στην επαγωγή του θανάτου του KB-

L30

κύτταρα σε αυτή τη μελέτη. Ως εκ τούτου, η μελέτη μας έδειξε ότι η MDR /MRP δεν παίζουν σημαντικό ρόλο στην αντίσταση στην μικροσωληνίσκων de-σταθεροποιητές, όπως BPR0L075, κολχικίνη και η βινκριστίνη σε KB-

L30

κύτταρα.

Από MDR και MRP δεν παίζουν σημαντικό ρόλο στην επαγωγή της ανθεκτικότητας στα φάρμακα σε KB-

L30

κύτταρα, άλλους μηχανισμούς αντοχής φαρμάκου πρέπει να είναι παρόν στα κύτταρα. ενώσεις σύνδεσης τουμπουλίνης όπως η βινκριστίνη, κολχικίνη και πακλιταξέλη, αναστέλλει την πρόοδο της κυτταρικής μίτωσης μέσω της αναστολής της δυναμικής σχηματισμό μιτωτικής ατράκτου κατά την διάρκεια G

2 /M φάση. Ως εκ τούτου, οι μεταλλάξεις στο στόχο του φαρμάκου, τουμπουλίνης, μπορεί να επηρεάσει την αποτελεσματικότητα των αντι-μιτωτικών ενώσεις. Στην πραγματικότητα, έχουν μεταλλάξεις σε αμφότερα α- και β-τουμπουλίνης σε κύτταρα ωοθήκης κινεζικού χάμστερ έχει αποδειχθεί ότι οδηγεί σε αντίσταση στην κολχικίνη και βινβλαστίνη [8]. Επιπλέον, μεταλλάξεις στο β-τουμπουλίνης στα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών έχει αποδειχθεί ότι έχει ως αποτέλεσμα ανθεκτικότητα σε εποθιλόνη και ταξάνες [22]. Σε αυτή τη μελέτη, έξι νέες θέσεις μετάλλαξης βρέθηκαν παρόντα στο βΙ-τουμπουλίνης γονίδιο του KB-

L30

κύτταρα. Αυτές οι μεταλλάξεις αντιστοιχούν σε αμινο-οξύ μεταλλάξεις V316D, T372S, S382L, E405K, E432K και G437K. Αυτές οι θέσεις μετάλλαξης που παρουσιάζονται στο εξόνιο τέσσερις περιοχές αντί του εξονίου ένα, δύο και τρία που έχουν προηγουμένως ταυτοποιηθεί [7]. Αυτό είναι ιδιαίτερα σημαντικό, καθώς οι μεταλλάξεις στο εξόνιο τέσσερα στην πρόκληση αντι-μιτωτική αντοχή φαρμάκου λιγότερα αποδειχθεί σε σύγκριση με το εξώνιο 1, 2 και 3. Σε αυτή τη μελέτη, η υπερ-έκφραση των μεταλλαγμένων τουμπουλίνες (περιείχε πολλαπλά μεταλλαγμένο-sites) σε κύτταρα ΚΒ μείωσε την ευαισθησία φαρμάκου στο μικροσωληνίσκων de-σταθεροποιητική ένωση BPR0L075 σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με άδειο φορέα ή άγριου τύπου τουμπουλίνης. Οι μικρές διαφορές μεταξύ των κυττάρων που επιμολύνθηκαν με μεταλλαγμένη-τουμπουλίνης και άγριου τύπου τουμπουλίνης ήταν πιθανώς λόγω του μεγάλου ύψους του ενδογενώς εκφράζονται άγριου τύπου τουμπουλίνης παρόν στα επιμολυσμένα κύτταρα ΚΒ. Επιμόλυνση κατασκευασμάτων που περιέχουν β-τουμπουλίνης με διαφορετική μετάλλαξη μοναδική θέση σε κύτταρα ΚΒ πραγματοποιήθηκε επίσης για να προσδιοριστεί αν μια συγκεκριμένη μετάλλαξη μόνο θέση στο γονίδιο ήταν αρκετά πράγματι να προκαλέσουν αντοχή φαρμάκου για BPR0L075 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ωστόσο, τα αποτελέσματα της μελέτης μας δεν αποκάλυψε καμία σημαντική διαφορά στην ευαισθησία φαρμάκου μεταξύ των κυττάρων που επιμολύνθηκαν με το μεταλλαγμένο (απλή μετάλλαξη θέση) και άγριου τύπου βΙ-τουμπουλίνης (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτό το αποτέλεσμα μπορεί πιθανώς να εξηγηθεί από τα ακόλουθα: 1) Οι θέσεις μετάλλαξης δεν είχαν άμεση βρίσκεται στον ειδικές θέσεις σύνδεσης φαρμάκου και 2), η τρισδιάστατη δομή του βΙ-τουμπουλίνης δεν επηρεάσθηκε σημαντικά από οποιαδήποτε μεμονωμένη μετάλλαξη περιοχή που αποκαλύφθηκε σε αυτή την μελέτη. Αντ ‘αυτού, οι έξι μεταλλάξεις που υπάρχουν στο εξόνιο 4 θα μπορούσαν να συμβάλουν από κοινού στην τροποποίηση των τρισδιάστατων δομών του βΙ-τουμπουλίνης, με αποτέλεσμα τις αλλαγές της ευαισθησίας των ναρκωτικών στην KB-

L30

κύτταρα.

Με η χρήση της υπολογιστικής μοντελοποίησης, οι μεταλλαγμένες περιοχές στον υπολογιστικό μοντέλο που προβλέψαμε αναλύθηκαν για να συγκρίνουν με την αύξηση ή μείωση των αλληλεπιδράσεων πριν και μετά μεταλλάξεις. Στο μοντέλο μας, προσδιορίστηκαν οι θέσεις του βΙ-τουμπουλίνης μεταλλάξεις και οι αλλαγές που συνεπάγεται διάπλασης στην βΙ-τουμπουλίνης πρωτεΐνης στηρίζεται με πιθανές επιπτώσεις στην συγκρότηση μικροσωληνίσκων και τη σταθερότητα. Σε συμφωνία με το υπολογιστικό μοντέλο, αυξημένα επίπεδα πολυμερούς τουμπουλίνης παρατηρήθηκαν στην BPR0L075 ανθεκτικό KB-

L30

κύτταρα σε σύγκριση με τα γονικά κύτταρα ευαίσθητα σε φάρμακο (Εικόνα 6Α και 6Β). Επιπλέον, το επίπεδο της ακετυλιωμένο α-τουμπουλίνης ήταν επίσης αυξημένη σε KB-

L30

κύτταρα (Σχήμα 6D), υποδεικνύοντας ότι μειώνεται μικροσωληνίσκων δυναμική αστάθεια ήταν παρούσα σε αυτή τη συγκεκριμένη κυτταρική γραμμή. Ένας ρόλος για μεταβάλλονται τα επίπεδα πολυμερές μικροσωληνίσκων σε αντίσταση βινκριστίνη της οξείας λεμφοβλαστικής λευχαιμίας έχει καταδειχθεί

in vivo

προηγουμένως [23]. Επιπλέον, ένα βινκριστίνη ανθεκτικό ξενομοσχεύματος με υψηλά επίπεδα πολυμερίζονται τουμπουλίνης αποδείχθηκε σχετικά ευαίσθητο στην μικροσωληνίσκων πολυμερισμού paclitaxel φάρμακο [23]. Επιπλέον, μια μελέτη ανέφερε επίσης ότι η δυναμική αστάθεια των μικροσωληναρίων του paclitaxel ανθεκτικών Α549-T12 καρκινικά κύτταρα αυξήθηκε σημαντικά σε σύγκριση με τα γονικά κύτταρα του [24]. Έτσι, η ενισχυμένη μικροσωληνίσκων πολυμερισμού και μειωμένη δυναμική αστάθεια που προκαλείται από μεταλλάξεις τουμπουλίνη μπορεί να αντιπροσωπεύει ένα μηχανισμό επιβίωσης έναντι των μικροσωληνίσκων ενώσεις de-σταθεροποίησης. Από την άλλη πλευρά, η αυξημένη πολυμερισμού μικροσωληνίσκων και μειωμένη δυναμική αστάθεια μπορεί να βελτιώσει την αποτελεσματικότητα της σταθεροποίησης μικροσωληνίσκων ενώσεων όπως η πακλιταξέλη. Στην πραγματικότητα, η δημοσιευμένη μελέτη μας έδειξε ότι τα κάτω ρύθμιση survivin (ΙΑΡ) που επάγεται μικροσωληνίσκων de-πολυμερισμού, με αποτέλεσμα την αυξημένη ευαισθησία φαρμάκου ΚΒ κυττάρων σε κολχικίνη και BPR0L075 [13]. Επιπλέον, η ίδια μεταχείριση εν μέρει αποκατασταθεί η ευαισθησία του KB-

L30

κύτταρα να BPR0L075 μέσω της διαδικασίας των μικροσωληνίσκων de-πολυμερισμού [13]. Ωστόσο, κάτω ρύθμιση survivin δεν επηρέασε την δραστηριότητα των κασπασών [13]. Στο σύνολό τους, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ισορροπία μεταξύ πολυμερισμένου και μη πολυμερισμένου τουμπουλίνης μπορεί να είναι ένας σημαντικός καθοριστικός παράγοντας της απόκρισης σε αντι-μιτωτική χημειοθεραπεία με βάση.

Αξίζει επίσης να σημειωθεί ότι η ρύθμιση προς τα κάτω των βII- και βIII-τουμπουλίνης ισότυποι παρατηρήθηκε σε KB-

L30

κύτταρα. Βιβλιογραφία αποκάλυψε ότι η υπερ-έκφραση του βIII-τουμπουλίνης που προκαλείται paclitaxel- και docetaxel αντοχής σε καρκινικά κύτταρα [7], [10], [16]. Υψηλό επίπεδο βIII-τουμπουλίνης έκφραση επίσης αποδειχθεί ότι σχετίζονται με την αντίσταση στην πακλιταξέλη και μειωμένη επιβίωση σε ασθενείς με καρκίνωμα [25]. Είναι ενδιαφέρον, μια πρόσφατη μελέτη από Τσενγκ

et al.

Προσέφερε μια πιθανή εξήγηση για αυτό το φαινόμενο. Μαθηματική και υπολογιστικά μοντέλα της μελέτης τους δείχνουν ότι μικροσωληνίσκων de-σταθεροποιητικούς παράγοντες, colchincine και τα παράγωγά της, δεσμεύονται ισχυρότερα στην βIII-τουμπουλίνης όπως σύγκριση με άλλους ισότυπους β-τουμπουλίνης [26]. Έτσι, οι αλλαγές στην έκφραση των βIII-τουμπουλίνης μπορεί να αλλάξει την ευαισθησία σε παράγωγα κολχικίνης που αναστέλλουν τον πολυμερισμό των μικροσωληνίσκων. Ως εκ τούτου, προς τα κάτω ρύθμιση της βIII-τουμπουλίνης μπορεί επίσης να συμβάλει στην αυξημένη ευαισθησία στην πακλιταξέλη και η μειωμένη ευαισθησία στην κολχικίνη /BPR0L075 στο KB-

L30

κύτταρα.

Εν κατακλείδι, δείξαμε ότι τα νέα μεταλλάξεις στο εξόνιο 4 της βΙ-τουμπουλίνης που προκαλείται αντίσταση σε μικροσωληνίσκους de-σταθεροποιητές και υπερ-ευαισθησία προς σταθεροποιητής μικροσωληνίσκων μέσω μεταβολή στο συγκρότημα μικροσωληνίσκων και τη δυναμική σε καρκινικά κύτταρα. Αυτή η έκθεση αναφέρει περαιτέρω ότι τα καρκινικά κύτταρα μπορεί να μεταβάλει τη σταθερότητα και τη δυναμική των δικτύων των μικροσωληνίσκων μέσω πολλαπλών μηχανισμών, όπως μεταλλάξεις τουμπουλίνης και εκφράσεις απόκλιση ισότυπο ταυτοχρόνως, με αποτέλεσμα την ανθεκτική στην θεραπεία του καρκίνου αντι-μιτωτικές. Τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης παρέχουν μοριακές πληροφορίες σε επιλογή φαρμάκου για ασθενείς με συγκεκριμένες μεταλλάξεις τουμπουλίνης και επίσης έχουν σημαντικές συνέπειες για την ανάπτυξη της μελλοντικής αντι-μιτωτικές ενώσεις που είναι σε θέση να στοχεύσουν ανθεκτικά στα φάρμακα καρκινικά κύτταρα. Παρ ‘όλα αυτά, απαιτούνται περαιτέρω έρευνες απαιτούνται για να καθορίσουν εάν αυτά τα ειδικά βΙ-τουμπουλίνης μεταλλάξεις μπορεί να βρεθεί σε κλινικά δείγματα (μετά τη θεραπεία) και ο συσχετισμός της με ανθεκτικότητα στα φάρμακα.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές , αντισώματα και αντιδραστήρια

Ανθρώπινα κύτταρα του στόματος καρκινώματος (KB) αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Αυτή η ειδική καρκινική κυτταρική γραμμή επίσης περιγραφεί ως μια πρόσμειξη HeLa από την ATCC. ΚΒ και ΚΒ-προερχόμενα KB-

L30

κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI 1640 (Gibco, Grand Island, ΝΥ), συμπληρωμένο με 5% ορό εμβρύου μόσχου, πενικιλλίνη (100 U /ml), στρεπτομυκίνη (100 μg /mL) και Ε-γλουταμίνη (0.29 mg /mL), στους 37 ° C. Τα αντισώματα που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη περιλαμβάνονται: ένα αντι-αtubulin αντισώματος ποντικού (Upstate κυτταρική σηματοδότηση, Lake Placid, ΝΥ), ένα αντι-βtubulin αντισώματος ποντικού (BD PharMingen, Franklin Lakes, NJ) και ένα αντίσωμα αντι-ακτίνης ποντικού (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA).

Δημιουργία του ΚΒ-προερχόμενο BPR0L075 ανθεκτική κυτταρική γραμμή

Ανθρώπινα κύτταρα του στόματος καρκινώματος (KB) καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 όπως περιγράφηκε προηγουμένως.