Αφηρημένο

Ιστορικό

Ο μοριακός μηχανισμός μεταξύ του ελικοβακτηριδίου του πυλωρού (H. pylori) λοίμωξης και καρκίνου του στομάχου παρέμεινε σε μεγάλο βαθμό άγνωστη. Σε αυτή τη μελέτη, θα προσδιορίζεται ο ρόλος των miRNA σε H. pylori που προκαλείται από καρκίνο του στομάχου.

Μέθοδοι και Αποτελέσματα

Βρήκαμε ότι το miR-204 μειώθηκε σε H. pylori θετικά ιστούς από qRT- PCR. Knockdown του miR-204 βελτίωσε την ικανότητα εισβολής και του πολλαπλασιασμού των κυττάρων καρκίνου του στομάχου in vitro. δοκιμασία λουσιφεράσης αποκάλυψε ότι SOX4 ήταν γονιδίου στόχου του miR-204, το οποίο βρέθηκε πάνω ρυθμισμένα σε H. pylori θετικούς ιστούς. Κάτω ρύθμιση του miR-204 και υπερ-έκφραση της SOX4 προωθείται διαδικασία μετάβασης επιθηλιακά-μεσεγχυματικά.

Συμπέρασμα

Στο σύνολό τους, τα ευρήματά μας έδειξαν ότι το miR-204 μπορεί να δρα ως καταστολέας των όγκων σε H. pylori που προκαλείται από καρκίνο του στομάχου με τη στόχευση SOX4

Παράθεση:. Zhou Χ, Li L, Su J, Zhang G (2014) Μειωμένη miR-204 στο H. pylori καρκίνος που σχετίζεται με γαστρική Προωθεί τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και εισβολή από Στόχευση SOX4. PLoS ONE 9 (7): e101457. doi: 10.1371 /journal.pone.0101457

Επιμέλεια: Jin Ερ Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center & amp? Research Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 18 Μάρτη 2014? Αποδεκτές: 5 Ιούν 2014? Δημοσιεύθηκε: 1 Ιουλίου 2014

Copyright: © 2014 Zhou et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Guoxin Zhang χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Νο 81270476) (https://www.nsfc.gov.cn/). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνο του στομάχου είναι η τέταρτη πιο κοινή μορφή καρκίνου και η δεύτερη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο σχετίζονται με όλο τον κόσμο [1]. Μέχρι σήμερα, έχουν μοριακούς μηχανισμούς σχετικά με γαστρικό καρκίνο έχουν διερευνηθεί, ωστόσο, δεν έχουν πλήρως κατανοηθεί [2]. Τα γαστρικά καρκινώματα υποτίθεται να αναπτυχθεί σύμφωνα με μια διαδικασία πολλαπλών βημάτων της καρκινογένεσης, η οποία συνδέεται στενά με την μόλυνση από τον παθογόνο βακτήριο,

Helicobacter pylori

(

H. pylori

) [3].

Η. pylori

, το οποίο αποικίζει το στομάχι του 50% του παγκόσμιου πληθυσμού, έχει ταξινομηθεί ως καρκινογόνο κατηγορίας Ι λόγω των αιτιολογικός ρόλος του στην ανάπτυξη του καρκίνου του στομάχου [4].

Έχει αναφερθεί ότι η ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου του γαστρικού μπορεί να αποδοθεί σε microRNAs (miRNAs) [5] – [8]. MiRNAs είναι μικρά, μη κωδικοποιητικού RNA που ρυθμίζουν την έκφραση των γονιδίων στόχων μέσω μεταφραστικής καταστολής ή αγγελιοφόρο RNA (mRNA) αποδόμηση [9]. MiR-204 παρεκκλίνουσα έκφραση αναφέρθηκε να συνδέσει με διάφορους καρκίνους [10], [11]. Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά για τη λειτουργία miRNA-204 σε γαστρικό καρκίνο. Matsushima εκτελούνται miRNA μελέτη ποικιλία σε H. pylori θετικά ιστούς και contols και διαπίστωσε ότι η έκφραση του miR-204 ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε H. pylori θετικά ιστούς [12].

Στους ανθρώπους, το φύλο-προσδιορισμού περιοχή Υ (SRY ) οικογένεια κουτί, που αναφέρεται επίσης στην οικογένεια SOX, περιλαμβάνει 20 άκρως συντηρημένη παράγοντες μεταγραφής που παίζουν σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του καρκίνου του προστάτη [13]. Αυτοί οι παράγοντες μεταγραφής που ορίζεται από μία διατηρημένη αλληλουχία υπογραφή στο πεδίο ομάδας υψηλού κινητικότητας (HMG) δέσμευσης DNA (DBD) [14], [15]. SOX4 είναι μια πρωτεΐνη 47-kDa είναι άκρως συντηρημένη σε σπονδυλωτά και κλινική σημασία του έχει αποκτήσει ιδιαίτερη προσοχή τα τελευταία χρόνια, με πολυάριθμες αναφορές που υποδηλώνει ότι η SOX4 μπορεί να συμβάλλει στην εξέλιξη του όγκου [16], [17]. Η αυξημένη έκφραση SOX4 βρίσκεται σε όγκους της ουροδόχου κύστης, του προστάτη, και του κόλου, και με όγκους του πνεύμονα μη-μικρού κυττάρου [18] – [21]. Η απορρύθμιση της έκφρασης του SOX4 έχει συσχετισθεί με τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων αυξήθηκε, κυτταρική επιβίωση, η αναστολή της απόπτωσης και την εξέλιξη του όγκου σε γαστρικό καρκίνο [22]. υπερ-έκφραση της έχει επίσης σχετίζονται με την κακή πρόγνωση σε κλινικές και είναι ένας δείκτης για την πρόβλεψη της έκβασης ασθενών με καρκίνο του στομάχου [23].

Ωστόσο, μέχρι πρόσφατα, δεν είναι σαφές ότι αν H. pylori λοίμωξη μπορεί να προκαλέσει την έκφραση SOX4 μέσω προς τα κάτω ρύθμιση miR-204. Έτσι, πραγματοποιήθηκε η μελέτη μας για την περαιτέρω διερεύνηση του ρόλου του miR-204 και SOX4 στο ελικοβακτηρίδιο του πυλωρού που προκαλείται από την καρκινογένεση.

Υλικά και Μέθοδοι

Κλινικά δείγματα

Οι ασθενείς με ή χωρίς H.

πυλωρού

μόλυνση είχε υποστεί γαστροσκόπιο στο πρώτο Affiliated Νοσοκομείο Ιατρικό Πανεπιστήμιο Nanjing, Jiangsu Province, Κίνα από το Μάρτιο του 2012 και Δεκεμβρίου 2013. τα δείγματα που λαμβάνονται από τους 250 ασθενείς (150 noncancerous ασθενείς και 100 ασθενείς με όγκο) συλλέχθηκαν, και ταυτοποιήθηκαν θετικοί όταν ταχεία δοκιμή ουρεάσης ήταν θετική. Αυτά επιλεγμένους ασθενείς επιβεβαιώθηκαν και από

τεστ 13C αναπνοής. Noncancerous ασθενείς ταξινομήθηκαν σε επιφανειακή γαστρίτιδα, ατροφική γαστρίτιδα και δυσπλασία, σύμφωνα με την παθολογική ταξινόμηση. Αυτό το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας της πρώτης συνδεδεμένες νοσοκομείο της Nanjing Ιατρικό Πανεπιστήμιο, και κάθε ασθενής είχε έγγραφη συγκατάθεση.

Κυτταρική καλλιέργεια

SGC-7901 /ΜΚΝ45 κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου ( αγοράστηκαν από την ATCC) καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) (Gibico) και πενικιλλίνη (100 U /ml). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα με

2.

βακτηριακή καλλιέργεια και η μόλυνση μοντέλο

H 5% CO. pylori εμβολιάστηκε μέσα στην πλάκα και καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C σε μια ατμόσφαιρα μικροαεροφιλική με 5% O

2, 10% CO

2 και 85% Ν

2. Μετά από 3 ημέρες, η βακτηριακή επαναιωρήθηκε σε μέσο RPMI-1640 χωρίς FBS και μολυσμένα κύτταρα σε ένα ΜΟΙ 100. Τα κύτταρα μετά συλλέχθηκαν μετά από 48 ώρες από τη μόλυνση.

Απομόνωση ολικού RNA και ποσοτική RT-PCR

Ολικά RNAs που εξάγονται από συλλέχθηκαν ιστούς και κυτταρικές σειρές χρησιμοποιώντας ΤπζοΙ (Tarkara, Japan) και στη συνέχεια οι δύο miRNA και mRNA μεταγράφηκαν ανάστροφα σε cDNA. Η αντίστροφη μεταγραφή πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του κιτ της αντίστροφης μεταγραφής (Takara, Ιαπωνία). Η έκφραση των ώριμων miRNAs και δυνητικών γονίδια στόχους μετρήθηκαν με qRT-PCR με κιτ SYBR Green PCR (Takara) επί Applied Biosystems StepOne-Plus Real-Time PCR System και την ανθρώπινη U6 RNA ενισχύθηκε ως εσωτερικό έλεγχο. Η σχετική αναλογία έκφραση του miR-204 υπολογίστηκε με την μέθοδο -ΔΔCT 2

. Οι αντιδράσεις PCR εκτελέστηκαν με τους ακόλουθους εκκινητές: για HSA-miR-204, προς τα εμπρός, 5′-CAUCUUCCAGUACAGUGUUGGA-3 ‘και για U6, προς τα εμπρός, 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’. Σχετικά επίπεδα έκφρασης του mRNA SOX4 εξετάστηκαν με SYBR Green PCR πραγματικού χρόνου (RT-PCR) και ομαλοποιήθηκε ως προς GAPDH. Οι εκκινητές για SOX4 ήταν μπροστά, 5 ‘AGCCATCTCGGAGGAATA 3’ και να αντιστραφεί, 5 ‘CAGACAACCGGCCTTTAT 3′? και για GAPDH, προς τα εμπρός, 5’-CGTGGGCCGCCCTAGGCACCA-3 ‘και αντίστροφος, 5′-TTGGCTTAGGGTTCAGGGGGG-3’. RT-PCR πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του Fast Real-Time PCR σύστημα ΑΒΙ 7500 (ΑΒΙ, CA, USA).

Η ανοσοϊστοχημεία

Οι ιστοί μονιμοποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη και κόβονται από μπλοκ παραφίνης 5 μm πάχος. Μετά την αποκήρωση με ξυλόλιο και επανυδάτωση με μια διαβαθμισμένη σειρά αιθανόλης, οι πλάκες θερμαίνονται σε αυτόκλειστο για τρία λεπτά με τη χρήση κιτρικού ρυθμιστικού διαλύματος νατρίου (ρΗ 6.0) και επωάζονται με το αντίσωμα SOX4 (Technology κυτταρική σηματοδότηση) στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Ρυθμιστικό διάλυμα αποκλεισμού ορού ή αραίωσης αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικοί έλεγχοι. Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν πριν ήταν οι ίδιες όπως και για ανάλυση Western blot. Οι φωτογραφίες ελήφθησαν από microsope (Nikon, ECLIPSE 50i). Ο αριθμός των θετικών κυττάρων χρώσης που δείχνει ανοσοαντιδραστικότητα του SOX4 σε δέκα μικροσκοπικά πεδία αντιπροσωπευτικά μετρήθηκε, και το ποσοστό των θετικών κυττάρων υπολογίστηκε επίσης. Το ποσοστό βαθμολόγησης των ανοσοδραστικών κυττάρων όγκου περιγράφεται ως εξής: 0 (0%), 1 (1-10%), 2 (11-50%), και 3 (& gt? 50%). Η ένταση βαθμολογήθηκε ως εξής: 0 (αρνητικός), 1 (ασθενής), 2 (μέτρια) και 3 (ισχυρή). Το επίπεδο έκφρασης των SOX4 μετρήθηκε πολλαπλασιάζοντας το ποσοστό και το σκορ ένταση. δείγματα υψηλή έκφραση σημαίνει όγκους με πολλαπλασιασμένη βαθμολογία άνω των 4 ενώ οι άλλοι θεωρείται ότι είναι χαμηλή έκφραση.

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων assasy

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εξετάστηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία τετραζολίου υδατοδιαλυτό χρησιμοποιώντας το κινητό μετρώντας Kit-8 (Dojindo, Κουμαμότο, Ιαπωνία). Εν ολίγοις, τα κύτταρα (1,5 χ 10

3 /φρεάτιο) σπάρθηκαν σε πλάκες καλλιέργειας 96 φρεατίων εις τριπλούν και επωάστηκαν για 4 ημέρες στους 37 ° C /5% CO2 σε υγροποιημένο επωαστή. Τα βιώσιμα κύτταρα προσδιορίστηκαν ποσοτικά σε κάθε χρονικό 24 ώρες με μέτρηση OD450 χρησιμοποιώντας αναγνώστη μικροπλακός. (Epoch? BioTek, Winooski, VT)

Τα κύτταρα (2 χ 10

6) στερεώθηκαν με 75% αιθανόλη στους 4 ° C όλη τη νύκτα και στη συνέχεια πλύθηκε με ψυχρό PBS και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με RNaseI, που ακολουθείται από χρώση με ιωδιούχο προπίδιο για 30 λεπτά σε σκοτάδι. Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου εκτελέσθηκε έπειτα με κυτταρομετρία ροής (FACSCalibur? Becton Dickinson, Sparks, MD).

Τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και επιστρώθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων (500 κύτταρα /φρεάτιο) και καλλιεργήθηκαν για 2 εβδομάδες. Οι αποικίες βάφτηκαν με 1% κρυσταλλικού ιώδους για 30 λεπτά μετά τη σταθεροποίηση με παραφορμαλδεΰδη 4% για 30 λεπτά. Ο αριθμός των αποικιών, που ορίζεται ως & gt? 50 κύτταρα /αποικία καταμετρήθηκαν. Τρία ανεξάρτητα πειράματα. Τα δεδομένα υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας ζεύγη δοκιμή t.

δοκιμασία μετανάστευσης κυττάρων (επούλωση πληγών)

Μια δοκιμασία επούλωση της πληγής χρησιμοποιήθηκε για να εκτιμηθεί η ικανότητα των κυττάρων του όγκου κινητικότητα. Εν συντομία, τα κύτταρα (1 * 10

6 /φρεάτιο) σπάρθηκαν σε πλάκες έξι φρεατίων, καλλιεργήθηκαν όλη τη νύκτα, και επιμολύνθηκαν με miR-204 μιμείται ή αναστολέα, pcDNA-SOX4 ή ροϋΝΑ-NC. Την επίτευξη συρροή, το κυτταρικό στρώμα αποξέσθηκε με μία αποστειρωμένη πλαστική μύτη και στη συνέχεια πλένονται με μέσο καλλιέργειας δύο φορές και καλλιεργήθηκαν πάλι για έως και 48 με μέσο χωρίς ορό μειώνεται περιέχει 1% FBS. Το κλείσιμο της ψαλίδας μετρήθηκε και τα δεδομένα συνοψίζονται βασίζονται σε δοκιμασίες εξαπλάσιος για κάθε πείραμα.

Κυττάρων εισβολή δοκιμασία

δραστικότητα κυττάρων εισβολή αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ένθετα κυτταρικής καλλιέργειας επικαλυμμένα με μήτρα βασικής μεμβράνης (BD Biosciences , Bedford, ΜΑ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, ένα σύνολο 1 χ 105 κύτταρα σε 0,2 ml ελεύθερο ορού RPMI-1640 σπάρθηκαν σε συσκευή Transwell. RPMI-1640 που περιείχε 10% FBS (600 μΐ) προστέθηκε στον κάτω θάλαμο. Μετά την επώαση των κυττάρων για 24 ώρες στους 37 ° C σε επωαστή 5% CO2, τα κύτταρα επί της άνω επιφανείας του ενθέτου απομακρύνθηκαν με σκούπισμα με ένα βαμβάκι. Τα κύτταρα που εισέβαλαν στην κάτω επιφάνεια του ενθέτου μονιμοποιήθηκαν σε μεθανόλη πρόψυξης 100% για 30 λεπτά, χρωματισμένο σε 0,5% κρυσταλλικό ιώδες επί 30 λεπτά, στη συνέχεια ξεπλύθηκαν σε PBS και υποβλήθηκαν σε μικροσκοπική επιθεώρηση. Τα κύτταρα μετρήθηκαν υπό μικροσκόπιο σε πέντε τυχαία πεδία και η σχετική εισβολή και τη μετανάστευση ερμηνεύτηκαν ως ο μέσος αριθμός κυττάρων ± τυπική απόκλιση ανά πεδίο.

κηλίδωση Western

Σύνολο πρωτεΐνες παρασκευάστηκαν και ποσοτικά χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία πρωτεΐνης (BCA μέθοδο, Θέρμο, USA). Οι πρωτεΐνες κλασματώθηκαν με ηλεκτροφόρηση νάτριο δωδεκυλ θειικού πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) μεταφέρονται σε φθοριούχο πολυβινυλιδένιο (PVDF), μπλοκαριστεί σε 5% ξηρό γάλα σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα και ανοσοχρώση με αντισώματα στους 4 ° C όλη τη νύκτα χρησιμοποιώντας αντι-SOX4 ( 1:1000, CST, USA), αντι-Ν-cadherin (1:1000, CST, USA) και αντι-Ε-καδερίνης (1:1000, CST, USA). Anti-GAPDH (1:5000, Sigma, USA) χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας φόρτωσης. Τα αποτελέσματα έγιναν ορατά μέσα από ένα σύστημα ανίχνευσης χημειοφωταύγειας (σύστημα ανίχνευσης κηλίδα Pierce ECL υποστρώματος Western, Θέρμο, Pittsburgh, PA) και, στη συνέχεια, εκτίθεται στη Μοριακή Imager ChemiDoc XRS Σύστημα (Bio-Rad, Hercules, CA).

κατασκευή πλασμίδιο

Πρόβλεψη θέσεις πρόσδεσης miR-204 πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του λογισμικού TargetScan (https://www.targetscan.org). 3′-UTR αλληλουχία του SOX4 που είχε προβλεφθεί να αλληλεπιδρά με miR-204 ή μια μεταλλαγμένη αλληλουχία με τις προβλεπόμενες θέσεις στόχου εισήχθησαν εντός των θέσεων ΚρηΙ και Sacl του φορέα pGL3 προαγωγό (Invitrogen). Πήραν το όνομά τους pGL3-SOX4 και pGL3-SOX4-mut. Τα κύτταρα επιστρώθηκαν επί πλακών 6-φρεατίων και επιμολύνθηκαν με 100 ng του pGL3-SOX4 ή pGL3-SOX4-mut, και miR-204 μιμείται (50 ηΜ) με χρήση Lipofectamine 2000 (Invitrogen Corp, CA, USA). Εμείς ομαλοποιήθηκαν τις διαφορές στην αποτελεσματικότητα επιμόλυνσης με συν-επιμόλυνση ενός φορέα λουσιφεράσης Renilla pRL-SV40 (5 ng).

γονίδιο SOX4 συντέθηκε (αγοράστηκε από Genscript, Piscataway, NJ) με περιοριστική πέψη χρησιμοποιώντας ΜΙυ Ι και υποκλωνοποιήθηκαν PLV-GFP πλασμίδιο, και το όνομά του PLV-GFP-SOX4. Η ανασυνδυασμένη φακοϊό παρήχθη από κύτταρα 293Τ χρησιμοποιώντας καθίζηση φωσφορικού ασβεστίου. κυτταρικές σειρές SGC-7901 διαμολύνθηκαν με φακοϊό χρησιμοποιώντας πολυβρένιο (8 μg /ml).

δραστηριότητες λουσιφεράσης ανάλυση

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία 24 φρεατίων και επιμολύνθηκαν με 0.2 μα είτε ευρείας τύπου ή μεταλλαγμένο πλασμίδιο pGL-SOX4 περιέχουν λουσιφεράση πυγολαμπίδας, μαζί με 0.01 μ§ του φορέα pGL-SOX4 (Invitrogen) που περιέχει λουσιφεράση της Renilla και 1 μg ολιγονουκλεοτίδια. Η επιμόλυνση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Σχετική δραστικότητα λουσιφεράσης υπολογίστηκε 48 ώρες μετά την επιμόλυνση με τη δοκιμασία Reporter διπλής λουσιφεράσης (Promega). Όλα τα πειράματα επιμόλυνσης πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και επαναλήφθηκαν τρεις φορές ανεξάρτητα. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SD.

Στατιστική ανάλυση

έλεγχος τ ή μονόδρομη ανάλυση της διακύμανσης χρησιμοποιήθηκε για στατιστική ανάλυση, όταν απαιτείται. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του SPSS 17.0 (SPSS, Chicago, IL). Ένα δίπλευρη τιμή της P & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

MiR-204 με αποκλίνοντα προς τα κάτω-ρυθμίζονται σε

Η.. pylori

θετικών ιστών και κυττάρων

Η έκφραση των επιλεγμένων miRNAs σύμφωνα με τα προηγούμενα δεδομένα μικροσυστοιχιών [10] ανιχνεύθηκαν σε 75 ζεύγη H. pylori θετικά και αρνητικά φυσιολογικούς ιστούς, και 50 ζεύγη H. pylori θετικά και τα αρνητικά τους ιστούς όγκων με πραγματικού χρόνου PCR. Βρήκαμε ότι miR-204 ήταν ένα από τα πιο σημαντικά miRNAs ρυθμίζεται προς τα κάτω κατά τη μόλυνση από ελικοβακτηρίδιο του πυλωρού (Σχήμα S1A, Σχήμα 1Α, Β). Επιπλέον, miR-204 εκφράστηκε σε χαμηλότερα επίπεδα σε πιο σοβαρές γαστρίτιδα (Σχήμα 1 C). Εμείς περαιτέρω σε σύγκριση με την έκφραση της σε ιστούς όγκων με φυσιολογικούς ιστούς, ανεξάρτητα από το καθεστώς του ελικοβακτηριδίου του πυλωρού και διαπίστωσε ότι το miR-204 εκφράστηκε σημαντικά χαμηλότερη σε όγκους (Σχήμα S1B). Χωρίσαμε τους ασθενείς με όγκους σύμφωνα με τις διαφορετικές φάσεις TNM και Τ2-Τ4 και Μ1 ασθενείς εξέφρασαν σημαντικά χαμηλότερο miR-204 από Τ1 και M0 ασθενείς (Σχήμα S1c, S1D). Εξετάσαμε, επίσης, miR-204 έκφρασης σε κύτταρα που έχουν μολυνθεί με H. pylori και βρήκαμε ότι η έκφραση του miR-204 ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε πολλαπλές H. pylori μολυσμένα κύτταρα από τον έλεγχο (Εικόνα 1Δ, Σχήμα S1E).

(Α) Τα επίπεδα έκφρασης του miR-204 σε ανθρώπινα H. Pylori θετικούς ιστούς και φυσιολογικούς ιστούς σε σχέση προς U6 προσδιορίστηκαν με qRT-PCR. (Β) Τα επίπεδα έκφρασης του miR-204 σε H. pylori θετικά και αρνητικά ιστούς όγκων. (C) Τα επίπεδα έκφρασης του miR-204 στο CG, CAG και δυσπλασία σε H. pylori θετικά ιστούς και H. pylori αρνητική ιστού. (D) Τα επίπεδα έκφρασης του miR-204 σε Η.ργΙοπ μολυσμένα κύτταρα. (* P & lt? 0,05).

Η

MiR-204 καταστέλλει τη μετανάστευση /την εισβολή και τον πολλαπλασιασμό των γαστρικών καρκινικών κυττάρων στην SGC-7901 και ΜΚΝ-45 κύτταρα

Εμείς επιμολυσμένα SGC7901 και ΜΚΝ45 κύτταρα με HSA-miR-204 μιμούνται /αναστολέα ολιγονουκλεοτίδια και εξέτασαν τις επιδράσεις στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση /την εισβολή. Πρώτον, πραγματοποιήσαμε qRT-PCR για την επαλήθευση της αποτελεσματικότητας επιμόλυνσης, όπως υποδεικνύεται στο Σχ. 2Α, η επιμόλυνση των κυττάρων με miR-204 μιμείται /αναστολέα έδειξε αυξήσει σημαντικά /μείωση του miR-204 έκφρασης σε σύγκριση με αρνητικό έλεγχο τους (NC /inc). Τραύματος δοκιμασία επούλωσης έδειξαν ότι η υπερ-έκφραση του miR-204 θα μπορούσε να καταστείλει την κυτταρική μετανάστευση, ενώ knockdown του επαγόμενη μετανάστευση των κυττάρων, με σημαντική στενότερη θέση από τον έλεγχο (Σχήμα 2Β). Σταθερά, δοκιμασία εισβολή Matrigel έδειξε επίσης ότι η υπερ-έκφραση του miR-204 εξασθενημένο κύτταρο εισβολή, ενώ νοκ ντάουν της θα μπορούσε να αντιστρέψει την αγάπη (Σχήμα 2C). Πραγματοποιήσαμε επίσης ανάλυση ΜΤΤ και διαπίστωσε ότι ο ρυθμός ανάπτυξης των κυττάρων επιμολυσμένων με αναστολέα miR-204 ήταν σημαντικά αυξημένη σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, ενώ κυττάρων με miR-204 μιμείται αυτή έδειξε το διαφορετικό (Σχήμα 3Α, Β). Εξετάσαμε επίσης κατά πόσο ο κυτταρικός κύκλος θα επηρεαστεί από την knockdown /υπερ-έκφραση του miR-204 χρησιμοποιώντας ενεργοποιούμενη με φθορισμό διαλογή κυττάρων (FACS) ανάλυση του προπιδίου-ιωδίδιο-χρωματισμένα κύτταρα. Knockdown του miR-204 οδήγησε σε σημαντική αύξηση των ποσοστών των κυττάρων στις φάσεις G2, ενώ η υπερ-έκφραση έδειξε το αντίθετο αποτέλεσμα (Εικόνα 3C). δοκιμασίες σχηματισμού αποικίας έδειξε ότι η αναστολή της miR-204 αύξησε σημαντικά τον ρυθμό ανάπτυξης των κυτταρικών γραμμών (Σχήμα 3D). Έχουμε, επίσης, σε σύγκριση κυττάρων λειτουργίες της επιμόλυνσης με miR-204 μιμείται με μιμείται και λοίμωξη H. pylori. Βρήκαμε ότι το miR-204 μιμείται θα μπορούσε να καταστείλει την κυτταρική μετανάστευση, την εισβολή και τον πολλαπλασιασμό κατά την H. pylori λοίμωξη (Εικόνα S2). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η από κοινού ρύθμιση προς τα κάτω του miR-204 που επάγεται από λοίμωξη από ελικοβακτηρίδιο του πυλωρού προώθηση της μετανάστευσης /εισβολής και του πολλαπλασιασμού του γαστρικού καρκίνου κυτταρική γραμμή in vitro.

(Α) επίπεδο MiR-204 σε κύτταρα επιμολυσμένα με miR-204 μιμείται, miR-204 αναστολέα, αρνητικό μάρτυρα (NC) και αναστολέα αρνητικού ελέγχου (INC). Το αποτέλεσμα ήταν επικυρωθεί από PCR πραγματικού χρόνου. (Β) Οι εικόνες φωτογραφήθηκαν σε 0 h (άνω) και 24 ώρες (κάτω) μετά τον τραυματισμό αποδείχθηκε σε μεγέθυνση x200. C. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με miR-204 μιμείται, αναστολέας miR-204, NC και INC για 24 ώρες. Οι αντιπροσωπευτικές εικόνες των μεταστατικών κυττάρων στον πυθμένα της μεμβράνης χρωματίζονται με κρυσταλλικό ιώδες απεικονίστηκαν όπως φαίνεται. Οι ποσοτικοί προσδιορισμοί της κυτταρικής μετανάστευσης παρουσιάστηκαν ως ποσοστό μετανάστευσαν αριθμούς κυττάρων. Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν και παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD. * Υποδηλώνει σημαντική διαφορά σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (P & lt? 0,05). Κάθε ανεξάρτητο πείραμα διεξήχθη 3 φορές.

Η

(Α) Τα κύτταρα επιμολυσμένα με miR-204 αναστολέα και βιωσιμότητες προσδιορίστηκαν με CCK-8 δοκιμασία. (Β) Κύτταρα επιμολυσμένα με miR-204 μιμείται και βιωσιμότητες προσδιορίστηκαν με CCK-8 δοκιμασίας. (Γ) Αποτελέσματα της miR-204 μιμείται ή αναστολέα επί του κυτταρικού κύκλου των γαστρικών καρκινικών κυττάρων με κυτταρομετρία ροής. (D) Δοκιμασία αποικίας μετά κύτταρα επιμολυσμένα με miR-204 μιμείται και αναστολέα. (* P & lt? 0,05).

Η

MiR-204 επάνω ρυθμισμένη έκφραση SOX4 στο γαστρικό καρκίνο

Έχουμε εντοπίσει τα κατάντη στόχοι του miR-204 από την υπολογιστική πρόβλεψη για τη διαλεύκανση των μηχανισμών με η οποία miR-204 κατέστειλε γαστρικού εισβολή των καρκινικών κυττάρων. Μεταξύ των εκατοντάδων γονιδίων που προβλέπεται από σε απευθείας σύνδεση miRNA ιστοσελίδα πρόβλεψη-στόχο (starbase, https://starbase.sysu.edu.cn/), έχουμε forcused την προσοχή μας σε SOX4. SOX4 είχαν αναφερθεί για τη ρύθμιση της γαστρικής εξέλιξης του καρκίνου και EMT ή να ενεργεί ως ένα υποκείμενο λειτουργικό στόχο της miR-204. Για τον προσδιορισμό της πρόβλεψης, μέσω qRT-PCR και ανοσοϊστοχημεία, διαπιστώσαμε ότι SOX4 ήταν ρυθμισμένη σε H. pylori θετικά ιστούς. Η έκφρασή του ήταν επίσης υψηλότερη σε CAG από CG σε H. pylori θετικά ιστούς. (N = 75, ρ & lt? 0,05? Σχήμα 4Α-C), το οποίο αντιστρόφως ανάλογη με miR-204. Χρησιμοποιώντας την ανάλυση συσχέτισης του Pearson της έκφρασης mRNA SOX4-miR-204, πήραμε μια στατιστικά σημαντική αντίστροφη συσχέτιση (Σχήμα S3A, R = -0,849, P = 0,002). Χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημεία, ανακαλύψαμε επίσης ότι η έκφραση SOX4 συσχετίστηκε σημαντικά με γαστρικό ιστολογία (ρ & lt? 0,05? Πίνακας 1). In vitro, βρήκαμε επίσης ότι SOX4 mRNA και το επίπεδο πρωτεΐνης επάνω ρυθμισμένη σε γαστρικό καρκίνο κύτταρα μολυσμένα με H. pylori (Σχήμα S3b, S3C). Στη συνέχεια προσδιορίζεται η έκφραση του SOX4 σε απόκριση προς τις αλλαγές στην έκφραση miR-204. κηλίδα Western και δοκιμασίες qRT-PCR έδειξε ότι η υπερ-έκφραση του miR-204 θα μπορούσε σημαντικά μειορυθμίζουν το mRNA και πρωτεΐνη έκφρασης SOX4, ενώ η επίδραση του knockdown του miR-204 ήταν το αντίθετο (Σχήμα 3D). Βρήκαμε επίσης ότι η έκφραση των δεικτών EMT, Ν-cadherin και E-cadherin, άλλαξε επίσης σχετίζεται με miR-204 έκφρασης (Σχήμα 4Ε), η οποία πρότεινε ότι το miR-204 θα μπορούσε να επηρεάσει τη διαδικασία της EMT.

Τα επίπεδα mRNA του SOX4 σχέση με GAPDH σε ανθρώπινο H. pylori θετικό ιστούς (Α) συμπεριλαμβανομένων CG και CAG και φυσιολογικούς ιστούς (Β) αξιολογήθηκαν με qRT-PCR. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως διάγραμμα διασποράς του διάμεσου. * Σημαντικά διαφορετική σε σχέση με εκείνη του ελέγχου (Ρ & lt? 0,05). (C) έκφραση πρωτεΐνης SOX4 του H. pylori θετικά και αρνητικά ιστούς ανιχνεύθηκε με χρώση ανοσοϊστοχημική. (D) Τα επίπεδα πρωτεΐνης SOX4 και mRNA σε κύτταρα επιμολυσμένα με αρνητικό έλεγχο (NC), miR-204 μιμείται? miR-204 αναστολέα και Inc αναλύθηκαν μέσω κηλίδωση Western και qRT-PCR. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Μέσες τιμές των ολοκληρωμένων οπτική πυκνότητα (IOD) εκτιμήθηκαν με την ανάλυση πέντε πεδία για κάθε πλάκα και καταγράφονται στο ιστόγραμμα. (Ε) Ε-καδερίνης και Ν-καδερίνης επίπεδα πρωτεΐνης σε κύτταρα επιμολυσμένα με αρνητικό έλεγχο (NC), miR-204 μιμείται? miR-204 αναστολέα και Inc αναλύθηκαν μέσω κηλίδωση Western. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD. * Υποδηλώνει P & lt?. 0.05

Η

SOX4 είναι μια άμεση γονίδιο στόχο του miR-204 στο γαστρικό καρκίνο κύτταρα

Αν και SOX4 έχει θεωρηθεί ως άμεσο στόχο ΜΙΚ 204, δεν είναι σαφές αν miR-204 μπορεί να αναγνωρίσει άμεσα την 3′-UTR του SOX4 mRNA. Σύμφωνα με την προβλεπόμενη θέση του στόχου από Targetscan, κλωνοποιήσαμε το θραύσμα 3′-UTR που περιέχει την προβλεπόμενη θέση εντός του λουσιφεράσης pGL3 φορέα αναφοράς (pGL3-SOX4). Το θραύσμα 3′-UTR με μεταλλαγμένη αλληλουχία μέσα στην προβλεπόμενη θέση στόχο κλωνοποιήθηκε επίσης ως έλεγχος (pGL3-SOX4-mut). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι συν-επιμόλυνση με miR-204 μιμείται και του φορέα pGL3-SOX4 μειωμένη δραστηριότητα λουσιφεράσης σε SGC-7901 κύτταρα. Ωστόσο, miR-204 μιμείται δεν είχε την επίδραση στην δραστικότητα λουσιφεράσης όταν τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με pGL3-SOX4-mut φορέα (Σχήμα 5). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι το γονίδιο SOX4 ήταν ένας από τους άμεσους στόχους του miR-204.

Η πιθανή θέση δέσμευσης miR-204 στο 3′-UTR της SOX4 mRNA ήταν υπολογιστικά προβλεφθεί από Targetscan. Τα κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν με miR-204 μιμείται (ή αρνητικός έλεγχος) με pGL3-SOX4 (ή pGL3-SOX4-mut) φορέα. Η δραστικότητα λουσιφεράσης ομαλοποιήθηκε με την αναλογία της πυγολαμπίδας και Renilla λουσιφεράσης σημάτων. * Υποδηλώνει P & lt?. 0.05

Η

Η υπερέκφραση της SOX4 έχει ως αποτέλεσμα την miR-204 στο γαστρικό καρκίνο κύτταρα εισβολή

Για να προσδιορίσετε SOX4 ως λειτουργική τελεστή miR-204 στην γαστρικό εισβολή καρκίνου, εμείς υπερεκφράζεται SOX4 με επιμόλυνση με φακοϊό και εξέτασε τις επιδράσεις της στην γαστρική καρκινικά κύτταρα. Υπερ-έκφραση του SOX4 στην κυτταρική γραμμή επιβεβαιώθηκε με κηλίδωση Western (Σχήμα 6Α). Βρήκαμε επίσης ότι η Ε-καντερίνη ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω, ενώ N-cadherin ήταν ρυθμισμένη μετά PLV-SOX4 επιμόλυνση. Μέσω επούλωση των πληγών και την δοκιμασία εισβολής Matrigel, μπορούμε τότε ανακαλύψει ότι η υπερ-έκφραση του SOX4 προωθείται σημαντικά κύτταρα μετανάστευση και εισβολή (Σχήμα 6Β και 6C). Για την περαιτέρω αποδείξει ότι miR-204 που προκαλείται από την απώλεια της SOX4 κατέστειλε τον πολλαπλασιασμό και την εισβολή του καρκίνου του στομάχου, κύτταρα επιμολύνθηκαν με miR-204 μιμείται και SOX4 υπερέκφραση φορέα μαζί και τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η καταστολή της μετανάστευσης, εισβολή και πολλαπλασιασμός με miR-204 εξασθένησε (σχήμα S4).

(Α) SOX4, Ν-καδερίνη και η έκφραση πρωτεΐνης Ε-καδερίνης αναλύθηκαν με κηλίδωση Western σε κύτταρα μέσω επιμόλυνσης με φακοϊό, πλασμίδιο ελέγχου, και Mock. GADPH φάνηκε σαν εσωτερικού ελέγχου. (Β) τυλιγμένο δοκιμασία αυτών των εικόνων επούλωσης σε 0 h (άνω) και 24 ώρες (κάτω) μετά τον τραυματισμό αποδείχθηκε σε μεγέθυνση x200. (Γ) SOX4 υπερεκφράζεται και ομάδες NC αντιστοίχως χρωματισμένο. Οι αντιπροσωπευτικές εικόνες των μεταστατικών κυττάρων στον πυθμένα της μεμβράνης χρωματίζονται με κρυσταλλικό ιώδες απεικονίστηκαν όπως φαίνεται. Οι ποσοτικοί προσδιορισμοί της κυτταρικής μετανάστευσης παρουσιάστηκαν ως ποσοστό μετανάστευσαν αριθμούς κυττάρων. Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν και παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD. * Υποδηλώνει σημαντική διαφορά σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (P & lt? 0,05). Κάθε ανεξάρτητο πείραμα διεξήχθη 3 φορές.

Η

Συζήτηση

καρκίνο του στομάχου είναι μια παγκόσμια νόσος με υψηλή συχνότητα, ειδικά στη Νοτιοανατολική Ασία [21]. Το ποσοστό επιβίωσης 5 ετών για καρκίνο του στομάχου είναι αρκετά χαμηλή. Μερικοί από τους ασθενείς με γαστρικό καρκίνο ήταν H. pylori συναφή. Ως εκ τούτου, είναι αναγκαίο να διερευνηθεί σε βάθος την παθογένεια και την ανάπτυξη νέων στοχευμένων θεραπειών για H. pylori που σχετίζονται με τον καρκίνο του στομάχου.

miRNAs αποτελούν μια μεγάλη οικογένεια των ρυθμιστικών γονιδίων που ρυθμίζουν αρνητικά τα mRNA στόχο τους σε μια ακολουθία-ειδικό τρόπο. miRNAs μπορεί επίσης να λειτουργήσει ως καταστολείς όγκων ή ογκογονίδια [22]. Πρόσφατα στοιχεία έδειξαν ότι miRNAs παίζουν βασικούς ρόλους σε πολλαπλές βιολογικές διαδικασίες που σχετίζονται με τον καρκίνο, συμπεριλαμβανομένων των κυτταρική διαφοροποίηση, τον πολλαπλασιασμό, tumorignesis, αγγειογένεση, εισβολή και μετάσταση [23]. MiR-204 έχει αναφερθεί να λειτουργεί ως ένας καταστολέας όγκων και την έκφραση χαμηλού επιπέδου του miR-204 συνδέεται με κακή προγνωστική φαινότυπο σε ασθενείς με καρκίνο [24], [25]. Ωστόσο, υπήρχαν λίγες μελέτες που διερευνούν miR-204 λειτουργία του H. pylori σχετίζεται γαστρικού καρκίνου. Εδώ, ήμασταν η πρώτη να παρουσιάσει αποδείξεις ότι miR-204 ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα κάτω σε H. pylori θετικό ιστούς (φυσιολογικών και καρκινικών ιστών) και ότι η υπερ-έκφραση του miR-204 κατέστειλε την έκφραση της πρωτεΐνης SOX4 και την ανάπτυξη των κυττάρων που προέρχονται από όγκου του στομάχου.

εμείς ποσοτικά για πρώτη φορά την έκφραση του miR-204 στο H. Pylori ιστούς μόλυνσης και τους ελέγχους και βρήκαμε ότι η έκφραση του miR-204 είναι σημαντικά χαμηλότερη σε H. Pylori λοίμωξη. Βρήκαμε επίσης ότι η έκφραση σχετίζεται με την ιστολογία των ασθενών, δηλαδή η έκφραση του miR-204 είναι σημαντικά χαμηλότερη σε H. Pylori θετικούς ασθενείς με χρόνια ατροφική γαστρίτιδα από τη χρόνια μη-ατροφική γαστρίτιδα. Αυτό το πρότυπο έκφρασης έδειξε ότι πιθανότητα ότι miR-204 σχετίζεται με διαφορετικά είδη γαστρίτιδα και η πιο σοβαρή ασθενών ήταν, τόσο χαμηλότερη είναι η έκφραση του miR-204 ήταν. Με βάση το επίπεδο έκφρασης miR-204, επιλέξαμε SGC-7901 και τα κύτταρα ΜΚΝ45 για την επακόλουθη αύξηση του κύκλου λειτουργίας και μελέτες απώλειας λειτουργίας, αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι τα κάτω ρύθμιση του miR-204 σε γαστρικό καρκίνο κύτταρο σχετίζεται με την εξέλιξη της. Αν και έχει αναφερθεί ένας μεγάλος αριθμός ανθρώπινων miRNAs, πολλοί από τους στόχους mRNA τους παραμένουν άγνωστοι [9]. Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε ένα συνδυασμένο βιοπληροφορική και πειραματική προσέγγιση για τον εντοπισμό ότι SOX4 είναι η λειτουργική κατάντη στόχος του miR-204.

SOX4 υπερεκφράζεται σε διάφορους καρκίνους και συσχετίζεται στενά με εισβολή και μετάσταση όγκου [ ,,,0],16] – [19]. Είναι επίσης ένα από τα μέλη της EMT-μεταγραφικό επαγωγείς [26]. EMT είναι ένα βασικό αναπτυξιακό πρόγραμμα που συχνά ενεργοποιείται κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου και μπορεί να προωθήσει την αντίσταση στη θεραπεία [27]. Zhang et al [20] έδειξε ότι η υπερέκφραση του SOX4 σε ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα μαστού οδήγησε στην απόκτηση μεσεγχυματικών γνωρίσματα, και ενισχυμένη κυτταρική μετανάστευση και εισβολή. Επιπλέον, SOX4 θετικά ρυθμίζεται η έκφραση των γνωστών επαγωγέων ΕΜΤ και ενεργοποιείται το μονοπάτι ΤΟΡ-β να συμβάλει στην ΕΜΤ [28]. Μέχρι σήμερα, ΕΜΤ είναι ένας ελκυστικός στόχος για θεραπευτικές παρεμβάσεις, παρέχει μια νέα βάση της εξέλιξης του καρκινώματος προς αποδιαφοροποιημένων και περισσότερο κακοήθεις καταστάσεις [29]. Η μελέτη μας έδειξε κατ ‘αρχάς ότι η μόλυνση ελικοβακτηριδίου του πυλωρού που προκαλείται miR-204 προς τα κάτω ρύθμιση μπορεί να οδηγήσει σε καρκίνο του στομάχου από τη διαδικασία EMT.

Για να ολοκληρώσω, τα στοιχεία μας έδειξαν ότι το miR-204 ήταν κάτω-ρυθμίζονται, ενώ SOX4 ήταν απότομη ανωφέρεια ρυθμίζεται με λοίμωξη από H. Pylori και τον καρκίνο του στομάχου. Η έκτοπη έκφραση miR-204 μειωμένη έκφραση SOX4 στα επίπεδα mRNA και πρωτεΐνης στο γαστρικό καρκίνο κυτταρική γραμμή. Δείξαμε επίσης ότι miR-204 ήταν άμεσα συνδεδεμένο με το 3′-UTR του SOX4. έκφραση MiR-204 ανέστειλε EMT μέσω καταστολής της SOX4. Επιπλέον, η οδός miR-204-EMT που εντοπίσαμε μπορεί να αξιοποιηθεί σε μια θεραπευτική προσέγγιση για τη θεραπεία του H. Pylori καρκίνων που σχετίζονται.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

(Α) Η έκφραση των 5 miRNAs στην H pylori θετικά και τα αρνητικά τους ιστούς ανιχνεύθηκε από qRT-PCR. (Β) Τα επίπεδα έκφρασης του miR-204 στον όγκο και τον έλεγχο των ιστών. (C) Τα επίπεδα έκφρασης του miR-204, σύμφωνα με τα στάδια ΤΝΜ. (Δ) Το επίπεδο έκφρασης του miR-204 σε τρία είδος H. pylori μολυσμένα κύτταρα. (* P & lt? 0,05)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0101457.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2.

Κύτταρα μετεμβολιασμένα με miR-204 μιμείται και μιμείται με λοίμωξη από H. pylori και (Α) βιωσιμότητες προσδιορίστηκαν με CCK-8 δοκιμασίας (Β) Οι εικόνες φωτογραφήθηκαν σε 0 h (άνω) και 24 ώρες (κάτω) μετά τον τραυματισμό παρουσιάστηκαν σε μεγέθυνση χ200 (Γ) Οι αντιπροσωπευτικές εικόνες των μεταστατικών κυττάρων στον πυθμένα της μεμβράνης χρωματίζονται με κρυσταλλικό ιώδες απεικονίστηκαν όπως φαίνεται. (* P & lt? 0,05)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0101457.s002

(ΔΕΘ)

Εικόνα S3.

(Α) Η σχετική έκφραση του mRNA του miR-204 και SOX4, κανονικοποιημένη με U6 και GAPDH, εκτιμήθηκε σε 15 δείγματα του H. pylori θετικά και τα αρνητικά τους ιστούς από qRT-PCR. (Β) Ένας αντίστροφος συσχετισμός του SOX4 και τα επίπεδα έκφρασης miR-204 εξετάστηκε (R = -0,920, ρ = 0.001). (Γ) Η έκφραση του mRNA SOX4 προσδιορίστηκε με qRT-PCR σε Η.ργΙοπ μολυσμένα κύτταρα. (Δ) Η έκφραση της πρωτεΐνης επίπεδο SOX4 προσδιορίστηκε με κηλίδα western σε H. pylori μολυσμένα κύτταρα. (* P & lt? 0,05)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0101457.s003

(ΔΕΘ)

Εικόνα S4.

Κύτταρα μετεμβολιασμένα με miR-204 μιμείται και μιμείται με PLV-SOX4 και (Α) βιωσιμότητες προσδιορίστηκαν με CCK-8 δοκιμασίας (Β) Οι αντιπροσωπευτικές εικόνες των μεταστατικών κυττάρων στον πυθμένα της μεμβράνης χρωματίζονται με κρυσταλλικό ιώδες απεικονίστηκαν ως απεικονίζεται. (Γ) Οι εικόνες που φωτογραφίζονται σε 0 h (επάνω) και 24 ώρες (κάτω) μετά τον τραυματισμό είχαν δείξει σε μεγέθυνση x200 (* p & lt? 0,05)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0101457.s004

(ΔΕΘ)