Αφηρημένο

Ιστορικό

Μόνο ένα υποσύνολο των ριζικά εκτομή παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκίνωμα (PDAC ) ασθενείς ωφελούνται από τη χημειοθεραπεία, και την ταυτοποίηση των προγνωστικών παραγόντων είναι δικαιολογημένη. Πρόσφατα miRNAs αναδειχθεί ως διαγνωστικοί βιοδείκτες και καινοτόμων θεραπευτικών στόχων, ενώ οι συστοιχίες υψηλής απόδοσης ανοίγουν νέες ευκαιρίες για να αξιολογηθεί κατά πόσο μπορεί να προβλέψει την κλινική έκβαση. Η παρούσα μελέτη αξιολόγησε κατά πόσο ολοκληρωμένη έκφραση των miRNAs διαμόρφωση της γενικής εικόνας συσχετίζεται με τη συνολική επιβίωση (OS) σε PDAC ασθενείς εκτομή.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Υψηλής ανάλυσης προφίλ miRNA ελήφθησαν με το Toray του

3D-Gene

™ -miRNA-chip, την ανίχνευση περισσότερων από 1200 τα ανθρώπινα miRNAs. RNA πραγματοποιήθηκε με επιτυχία απομονώθηκε από παραφίνη-ενσωματωμένες πρωτογενείς όγκους των 19 από τους 26 ασθενείς ομοιογενώς αντιμετωπίζονται στάδιο-pT3N1 (ανοσοενισχυτικό γεμσιταβίνη 1000 mg /m

2 /ημέρα, ημέρες-1/8/15, κάθε 28 ημέρες), προσεκτικά επιλεγμένα σύμφωνα με το αποτέλεσμά τους (OS & lt? 12 (Ν = 13) έναντι OS & gt? 30 μηνών (Ν = 6), δηλαδή μικρής /μεγάλης OS). Ιδιαίτερα αυστηρές στατιστικά στοιχεία που περιλαμβάνονται t-test, απόσταση μήτρα με Spearman-κατετάγη συσχέτισης, και επαναληπτική προσεγγίσεις. Χωρίς επίβλεψη ιεραρχική ανάλυση αποκάλυψε ότι PDACs συγκεντρωμένα σύμφωνα με σύντομο /μακρύ-OS ταξινόμησή τους, ενώ ο αλγόριθμος επιλογής χαρακτηριστικών ΜΝΗΜΕΣ προσδιορίζονται στην κορυφή 4 διακρίσεις miRNAs μεταξύ των δύο ομάδων. Αυτά τα miRNAs στοχεύουν περισσότερο από 1500 μεταγραφές, συμπεριλαμβανομένων 169 στοχεύονται από δύο ή περισσότερα. MiR-211 αναδείχθηκε ως η καλύτερη διάκριση miRNA, με σημαντικά υψηλότερη έκφραση σε μακροπρόθεσμη εναντίον ασθενείς μικρής OS. Η έκφραση αυτού του miRNA στη συνέχεια εκτιμήθηκε με ποσοτική-PCR σε μια ανεξάρτητη ομάδα με λέιζερ-μικροτομή PDACs από 60 ασθενείς που έλαβαν θεραπεία με εκτομή ίδια αγωγή γεμσιταβίνη. Οι ασθενείς με χαμηλή έκφραση του miR-211, σύμφωνα με διάμεση τιμή είχαν σημαντικά μικρότερη διάμεση OS (14,8, 95% CI = 13,1 – 16,5, έναντι 25,7 μήνες, 95% CI = 16,2 – 35,1, log-rank-P = 0,004). Η πολυπαραγοντική ανάλυση έδειξε ότι τα χαμηλά miR-211 έκφρασης ήταν ανεξάρτητος παράγοντας κακής πρόγνωσης (αναλογία κινδύνου 2.3, P = 0,03) μετά την προσαρμογή για όλους τους παράγοντες που επηρεάζουν το αποτέλεσμα.

Συμπεράσματα /Σημασία

Μέσω ολοκληρωμένη ανάλυση μικροσυστοιχιών και επικύρωση PCR εντοπίσαμε miR-211 ως προγνωστικός παράγοντας για την εκτομή PDAC. Αυτά τα αποτελέσματα προτροπή περαιτέρω προοπτικές μελέτες και έρευνα σχετικά με το βιολογικό ρόλο του miR-211 στο PDAC

Παράθεση:. Giovannetti E, van der Velde Α, Funel Ν, Vasile Ε, Perrone V, Leon LG, et al. (2012) High-Throughput microRNA (miRNAs) Πίνακες ξετυλίξουν το Προγνωστική ρόλος της MiR-211 σε καρκίνο του παγκρέατος. PLoS ONE 7 (11): e49145. doi: 10.1371 /journal.pone.0049145

Επιμέλεια: Nathan A. Ellis, του Πανεπιστημίου του Ιλινόις στο Σικάγο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 3 Ιουλ 2012? Αποδεκτές: 4η Οκτωβρίου 2012? Δημοσιεύθηκε: 14, Νοεμβρίου 2012

Copyright: © 2012 Giovannetti et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα. Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από τις επιχορηγήσεις από την Ολλανδία Οργανισμού για την Επιστημονική Έρευνα, επιχορήγηση VENI (αριθμός έργου 91.611.046 (Elisa Giovannetti)) και Stimuleringfonds Ανοικτή Πρόσβαση (Elisa Giovannetti), επιχορήγηση CCA-VICI Ίδρυμα (Elisa Giovannetti, Amir Avan, Godefridus J Peters) , AIRC Marie Curie Διεθνούς Κοινότητας (Elisa Giovannetti), και ο Ιταλός Υπουργός Έρευνας, ΠΡΙΝ-2009 (Elisa Giovannetti, Niccola Funel, Ugo Boggi). Toray Industries, Inc είναι ένα χρηματοδότη οφείλεται στην απασχόληση των Hiroko Sudo, ο οποίος παρείχε τεχνική υποστήριξη για τη διεξαγωγή αυτού του έργου, αλλά δεν έχουν ένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα. Σε αυτή τη μελέτη, οι συγγραφείς χρησιμοποιούν προϊόντα της Toray Industries, Inc., 3D-GeneTM «για την μικροσυστοιχιών miRNA, αλλά αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις πολιτικές PLoS ONE σχετικά με την κοινοχρησία δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Με ένα ποσοστό επιβίωσης 5 ετών μικρότερη από 5%, παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκίνωμα (PDAC), συμπεριλαμβανομένων των περισσότερο από το 90% των καρκίνων του παγκρέατος, είναι η πιο θανατηφόρος μεταξύ των μεγάλων στερεών όγκων [1]. Τα τελευταία χρόνια, έχουν υπάρξει σημαντικές πρόοδοι στην κατανόηση της μοριακής βιολογίας του καρκίνου του παγκρέατος, καθώς και στη διάγνωση και σταδιοποίηση. Ωστόσο, ελάχιστη πρόοδος έχει επιτευχθεί όσον αφορά την πρόληψη, την έγκαιρη διάγνωση, τη θεραπεία και τα αποτελέσματα [2].

Η χειρουργική εκτομή είναι η μόνη θεραπευτική τροπικότητα για PDAC, αλλά μόνο το 15-20% των ασθενών έχουν χειρουργικά εξαιρέσιμων νόσου κατά τη στιγμή της διάγνωσης. Παρ ‘όλα αυτά, η πρόγνωση των ασθενών μετά από πλήρη εκτομή είναι κακή, με ελεύθερη νόσου επιβίωση (DFS) ποσοστό 3 ετών στο 27% (95% διάστημα εμπιστοσύνης (CI): 23-32%) και η διάμεση συνολική επιβίωση (OS) 15 -19 μήνες [3].

Μόνο ένα υποσύνολο των ριζικά εκτομή ασθενείς PDAC ωφεληθούν από τη χημειοθεραπεία, και ανοσοενισχυτικό θεραπείες μπορεί να έχουν σημαντικές τοξικότητες [4]. Ως εκ τούτου, τα νέα βιοδείκτες της ευαισθησίας στην επικουρική θεραπεία επειγόντως δικαιολογημένη προκειμένου να εξατομικεύσει την κλινική διαχείριση και βελτίωση του θεραπευτικού αποτελέσματος [5].

Εκτεταμένες μελέτες έχουν χαρακτηρίσει τις πολύπλοκες γενετικές δίκτυα και transcriptomics μεταβολές που διέπουν την ανάπτυξη και την εξέλιξη της PDAC [6]. Η πρόσφατη ανακάλυψη των microRNAs (miRNAs) έχει παράσχει πρόσθετες πληροφορίες ενδεχομένως να εξηγούν το χάσμα που υπάρχει μεταξύ του γονότυπου του όγκου και του φαινοτύπου

miRNA είναι μια κατηγορία των μικρών μη-κωδικοποίησης εξελικτικά συντηρημένη RNAs [19] -. [23 νουκλεοτίδια] που έχουν βρεθεί σε ζωικά και φυτικά κύτταρα. Από σήμερα, οι 1921 μοναδικές ώριμα ανθρώπινα miRNAs που αναφέρονται στη βάση δεδομένων miRBase (Release 18, Νοέμβριος 2011) [7]. Τα γονίδια μεταγράφονται ως microRNA μη κωδικοποίησης μεταγραφές, και υποβάλλονται σε επεξεργασία μέσω μιας σειράς διαδοχικών σταδίων που περιλαμβάνουν τα ένζυμα RNase III, Drosha και Dicer. Τα επεξεργασμένα microRNAs τελικά ενσωματώνονται σε το RNA επαγόμενη φίμωση συμπλόκου (RISC) για να κατευθύνει αυτό το περίπλοκο να ρυθμίζουν προς τα κάτω την έκφραση του γονιδίου μέσω δέσμευσης στην 3’UTR των mRNAs στόχου. Φυτών και μερικές miRNAs των ζώων αποτελούν τέλεια ζεύγη βάσεων με το mRNA που στόχο τους, με αποτέλεσμα την υποβάθμιση τους. Ωστόσο, τα περισσότερα από τα ανθρώπινα miRNAs προσδένονται σε 3’UTRs στόχο τους με ατελή συμπληρωματικότητα και ως εκ τούτου να προκαλέσει μεταφραστικής καταστολής [8].

Το κεντρικό ρυθμιστικό ρόλο του κάθε miRNA στον έλεγχο της έκφρασης πολλαπλών μεταγραφές γονιδίου προσφέρει μια μοναδική ευκαιρία εντοπισμού κρίσιμων miRNAs ως πληροφοριακό βιοδείκτες για την ανίχνευση, διάγνωση και πρόγνωση όγκων που προκύπτουν από την απορρύθμιση των πολλαπλών γονιδίων [9]. Αυτό το υποκείμενο βιολογικός μηχανισμός ήταν πιθανότατα ο λόγος για τον οποίο τα πρότυπα έκφρασης των miRNAs 217 βρέθηκαν να ταξινομήσει τους τύπους καρκίνου με μεγαλύτερη ακρίβεια από ό, τι οι πληροφορίες με βάση το προφίλ έκφρασης των ~16000 mRNAs [10].

Ο ρόλος των miRNAs στην έλεγχος του πολλαπλασιασμού /διαφοροποίησης και της απόπτωσης, και παρεκκλίνουσα έκφραση τους σε πολλούς όγκους, δήλωσαν ότι θα μπορούσε να λειτουργήσει ως καταστολείς όγκων και ογκογονίδια, γεγονός που υποδηλώνει τη χρήση τους για διαγνωστικούς και θεραπευτικούς σκοπούς. Επιπλέον, επιλεγμένα miRNAs μπορούν να επηρεάσουν όγκου κακοήθη συμπεριφορά και ανταπόκριση στη χημειοθεραπεία [11].

προηγούμενες μελέτες μας με επίκεντρο miR-21 έδειξε ότι τόσο Καυκάσου και της Ασίας ασθενείς οι οποίοι φέρουν υψηλή έκφραση αυτού του miRNA στην PDAC δείγματα τους είχαν σημαντικά μικρότερη επιβίωση [12], [13]. Αυτό miRNA έχει αναφερθεί ως μια «oncomir» (δηλαδή ένα miRNA με ογκογόνο ιδιότητες), διότι είναι σχεδόν πανταχού παρούσα και υπερεκφράζεται σε ανθρώπινους όγκους. Πρόσφατες

in vivo

μελέτες σε miR-21 που υπερεκφράζουν το μοντέλο ποντικών θεσπίστηκε με τεχνολογίες Cre /Tet-off, αποδεικνύεται ογκογόνο ρόλο της, δείχνει σημαντικές επιπτώσεις της στην έναρξη του όγκου, τη συντήρηση, την επιβίωση και την εισβολή [14].

Ωστόσο, υψηλής απόδοσης τεχνολογικές καινοτομίες στον εντοπισμό εκατοντάδων microRNAs παρέχουν νέους αποτελεσματικούς τρόπους για να διαλευκάνουν το ρόλο των άλλων βασικών miRNAs ρυθμίζουν πολλαπλά γονίδια που μπορεί να εξηγήσει γιατί οι ασθενείς με παρόμοια χαρακτηριστικά κλινικοπαθολογοανατομικές μπορεί να έχει σημαντικές διαφορές στις κλινικές εκβάσεις. Ως εκ τούτου, στην παρούσα μελέτη αξιολογήθηκε κατά πόσον προφίλ ολοκληρωμένη έκφραση των miRNAs, χρησιμοποιώντας ένα τσιπ miRNA ανιχνεύει περισσότερα από 1200 είδη της ανθρώπινης miRNA, μπορεί να γίνει διάκριση μεταξύ PDAC ασθενείς με πολύ μικρή OS σε σύγκριση με μακροχρόνια επιζώντες.

ειδικότερα, προσεκτικά επιλεγμένα 26 PDAC ασθενείς με ομοιογενή κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά που υποβλήθηκαν σε εκτομή με θεραπευτική πρόθεση και υποβλήθηκαν σε θεραπεία με τρεις κύκλους καθιερωμένο σχήμα γεμσιταβίνης ανοσοενισχυτικό. Οι μισοί από αυτούς τους ασθενείς είχαν μια θλιβερή πρόγνωση, πεθαίνουν μέσα σε 1 χρόνο από τη διάγνωση, ενώ οι άλλοι 13 ασθενείς επέζησαν περισσότερο από 30 μήνες. Η ανάλυση μικροσυστοιχιών miRNA πραγματοποιήθηκε σε 19 δείγματα που πέρασαν το κριτήριο της ποιότητας του RNA, συμπεριλαμβανομένων 13 ασθενών με μικρή επιβίωση και 6 ασθενείς με μακρά επιβίωση. Δεδομένου ότι το καθεστώς έκφραση miR-211 προέκυψε ως το πιο προβλεπτική βιοδείκτη για την έκβαση της θεραπείας σε αυτούς τους ασθενείς, η περαιτέρω ανάλυση του miR-211 έκφρασης εκτελέστηκε σε ένα δεύτερο κοόρτη 60 ασθενείς, οι οποίοι λάμβαναν την ίδια επικουρική θεραπεία. Αυτό το ανεξάρτητο σύνολο επιβεβαίωσε τη σημαντική συσχέτιση του miR-211 το καθεστώς έκφραση τόσο με το λειτουργικό σύστημα και DFS.

Μέθοδοι

Ασθενείς

Οι ασθενείς που υποβλήθηκαν σε ριζική χειρουργική εκτομή με θεραπευτική πρόθεση (pancreatico -duodenectomy, συνολικής παγκρεατεκτομή και άπω παγκρεατεκτομή) στο Τμήμα Γενικής Χειρουργικής και Μεταμοσχεύσεων, Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο της Πίζας (Πίζα, Ιταλία), μεταξύ 2000 και 2010 αναδρομικά χρησιμοποιώντας ηλεκτρονικά ιατρικά αρχεία. Μεταξύ αυτών, για την υψηλής ανάλυσης miRNA προφίλ έκφρασης επιλέξαμε 26 ασθενείς με παρόμοια παθολογικά ευρήματα, κλινικά χαρακτηριστικά και θεραπεία, αλλά σημαντικές διαφορές στις κλινικές εκβάσεις. Ειδικότερα, οι μισοί από αυτούς τους ασθενείς είχαν μια εξαιρετικά κακή πρόγνωση, πεθαίνουν μέσα σε 1 χρόνο από τη διάγνωση και ταξινομήθηκαν ως «μικρή-OS», ενώ οι άλλοι 13 ασθενείς επιβίωσαν άνω των 30 μηνών, και είχαν χαρακτηριστεί ως «μακρύ-OS». Τα χαρακτηριστικά αυτών των 2 ομάδων που αναφέρονται στον Πίνακα 1.

Η

Η ομάδα επικύρωσης αποτελείτο από άλλα 60 ριζικά εκτομή ασθενείς PDAC διαγνωστεί και αντιμετωπιστεί κατά την ίδια περίοδο, με τα χαρακτηριστικά τους περιγράφονται επίσης στον Πίνακα 1 . Όλες αυτές οι ασθενείς υποβλήθηκαν σε γεμσιταβίνη με βάση επικουρική θεραπεία, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15].

Ηθική

Όλοι οι ασθενείς έδωσαν γραπτή συγκατάθεση τους για τη συλλογή και την ανάλυση δειγμάτων, και η μελέτη έχει έλαβε την έγκριση από την επιτροπή δεοντολογίας του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου της Πίζας ως συνέχεια της μελέτης του πρωτοκόλλου της έρευνας με τίτλο «η φαρμακογενετική γονιδίων γεμσιταβίνης που σχετίζονται με τον καρκίνο του παγκρέατος: συσχέτιση με την κλινική έκβαση και την ανεκτικότητα» [15]. Οι υπεύθυνοι ερευνητές διασφαλίσει ότι αυτή η μελέτη διεξήχθη σύμφωνα με την Διακήρυξη του Ελσίνκι, οι ευρωπαϊκές κατευθυντήριες γραμμές για την ορθή κλινική πρακτική, καθώς και τις σχετικές απαιτήσεις των εθνικών και περιφερειακών αρχών.

Οι ιστοί

Φορμόλης Σταθερή τομές παραφίνης ( FFPE) τμήματα εξετάστηκαν προσεκτικά για τη διάγνωση και το περιεχόμενο των όγκων. Λόγω της μακράς εμπειρίας της παθολογικό εργαστήριο μας για μεγάλες ομάδες ριζικά εκτομή ασθενείς PDAC, δεν υπήρχε καμία δυσκολία στην επιλογή των περιοχών με μορφολογικά ορίζεται καρκινικά κύτταρα [16]. Οι όγκοι ταξινομούνται και αξιολογούνται για την σταδιοποίηση του όγκου και ταξινόμησης, όπως προτείνεται από τον ΠΟΥ, όπως αναφέρονται στον Πίνακα 1.

εκχύλιση RNA από FFPE διαφάνειες

Οι ιστολογικές τομές (10 μm) παρασκευάστηκαν από κάθε δείγμα FFPE. Παραφίνη απομακρύνθηκε με κατεργασία ξυλόλιο και ιστοί πλύθηκαν με αιθανόλη δύο φορές για να απομακρυνθεί το ξυλόλιο. Οι ιστοί στη συνέχεια κατεργάζεται με πρωτεϊνάση Κ στους 37 ° C όλη τη νύκτα. Μετά από φυγοκέντρηση, το υπερκείμενο υποβλήθηκε σε επεξεργασία με μία στήλη σπιν με βάση σίλικα (New Frontiers Research Laboratories, Toray Industries Inc., Kanagawa, Ιαπωνία) για να ληφθεί καθαρισμένο συνολικό RNA. Οι βαθμοί του RNA εγκάρσιας σύνδεσης και RNA αποικοδόμησης αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση χρησιμοποιώντας μια Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Τα δείγματα που έδειξαν την πλειοψηφία των RNAs σε & gt? 4000 νουκλεοτίδια λόγω εγκάρσιας σύνδεσης, ή η πλειονότητα των RNAs σε & lt? 1000 νουκλεοτίδια, λόγω της υποβάθμισης των προτύπων ηλεκτροφόρησης ήταν ακατάλληλα για την ανάλυση miRNA και έτσι δεν χρησιμοποιούνται. Από τα 26 δείγματα που μελετήθηκαν, 19 δείγματα πέρασε το κριτήριο αυτό και χρησιμοποιήθηκαν στο προφίλ miRNA.

Για τα 60 δείγματα που χρησιμοποιούνται ως ανεξάρτητο σύνολο επικύρωσης, ένα μέσο όρο 5000 νεοπλασματικών κυττάρων στη συνέχεια τεμαχίζεται με τη χρήση του οργάνου Leica LMD6500 (Leica, Wetzlar, Germany), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17]. Η ακρίβεια της στενή εστίαση της δέσμης λέιζερ ως αποτέλεσμα την κατάληψη των μεμονωμένων κυττάρων με υψηλό βαθμό ακρίβειας (Σχήμα S1). Το RNA απομονώθηκε με επιτυχία χρησιμοποιώντας το κιτ απομόνωσης RecoverAll Σύνολο Nucleic Acid (Ambion, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. RNA αποδόσεις και η καθαρότητα ελέγχθηκαν στα 260 και 280 nm με NanoDrop®-1000 Ανιχνευτής (NanoDrop-Technologies, Wilmington, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής).

Mirna προφίλ

Αξιοποιήσαμε Toray του 3D-Gene ™ (Toray Industries, Ιαπωνία) ανθρώπινα microRNA τσιπ για miRNA προφίλ έκφρασης. Η επαναληψιμότητα και η συγκρισιμότητα με Taqman RT-PCR και οι πειραματικές διαδικασίες των μικροσυστοιχιών Toray, η περιγράφηκαν προηγουμένως [18], [19]. Εν συντομία, 500 ng ολικού RNA που εξάγεται από το τμήμα FFPE αναλύθηκε για miRNA προφίλ χρησιμοποιώντας μικροσυστοιχιών, 3D-Gene® miRNA ολιγο τσιπ V.16 (Toray Industries) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή vE1.10. Ο αριθμός των τοποθετηθεί miRNAs σε αυτή τη μικροσυστοιχία είναι 1.212 συνολικά. Μικροσυστοιχιών σαρώθηκε και τα ληφθέντα εικόνες αριθμούνται με τη χρήση 3D-Gene® scanner 3000 (Toray Industries). Το επίπεδο έκφρασης του κάθε miRNA έγινε παγκοσμίως ομαλοποιήθηκε με τη χρήση του αφαιρεθεί το υπόβαθρο ένταση του σήματος του συνόλου των miRNAs σε κάθε μικροσυστοιχιών (Περιγραφή S1).

Όλα τα δεδομένα μικροσυστοιχιών από αυτή τη μελέτη είναι σε συμφωνία με τις ελάχιστες πληροφορίες Περίπου ένα πείραμα μικροσυστοιχιών (MIAME) και είναι διαθέσιμο στο κοινό μέσω της έκφρασης γονιδίων του NCBI του Omnibus (GEO) βάση δεδομένων (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/geo/) κάτω από το ρεκόρ σειρά GSE38781.

Συνολικά ομαδοποίηση

Για να διερευνήσει τις διαφορές στα πρότυπα έκφρασης μεταξύ των δύο ομάδων δειγμάτων, επιλέξαμε miRNAs που έδειξαν σημαντική διαφορά στην έκφραση. Το t-test διεξήχθη επί μακρύ-OS και ομάδες βραχείας-OS για όλα τα miRNAs και αυτά που δεν φαίνεται να είναι σημαντικά διαφορετική (ρ & gt? 0,05) έχουν φιλτραριστεί. Ιεραρχική χωρίς επίβλεψη ανάλυση συστάδων έγινε για τα υπόλοιπα 170 miRNAs. Δύο-ουρά Spearman κατετάγη συσχέτιση χρησιμοποιήθηκε για την παραγωγή ενός πίνακα αποστάσεων. Στη συνέχεια, η μήτρα απόσταση χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία συνεργατικών σχηματισμών και για τις δύο miRNAs και τα δείγματα χρησιμοποιώντας μια ιεραρχική αλγόριθμο, με βάση τη μέση σύνδεση [20] – [21].

Ανάλυση με ανακούφιση και επαναληπτική ΜΝΗΜΕΣ

Ένας αλγόριθμος επιλογής χαρακτηριστικών, ΜΝΗΜΕΣ [22] – [24], είχε προσληφθεί για τα πλήρη στοιχεία που έχουν τεθεί για να ανακαλύψετε τις πιο απαιτητικό miRNAs. ΜΝΗΜΕΣ είναι ένας επαναληπτικός αλγόριθμος που αντιστοιχίζει τα βάρη με τα χαρακτηριστικά (δηλαδή, miRNA τιμές έκφραση), σύμφωνα με τις αποστάσεις μεταξύ των χαρακτηριστικών εντός και μεταξύ των ομάδων. Από τους 1212 Mirs, επιλέχθηκαν 703 Mirs που έχουν μέγιστη ενός λείπει αξίας πάνω από όλα τα δείγματα. Ο αλγόριθμος ΜΝΗΜΕΣ εφαρμόστηκε προκειμένου να επιλέξει τις κορυφαίες 10 miRNAs υψηλότερο ζύγισης. Σε μια ανάλυση που ακολουθεί δημιουργήσαμε 100 τυχαία σύνολα 6 από τα 13 δείγματα που έχουν ταξινομηθεί ως σύντομη. Σε κάθε τυχαία σειρά δειγμάτων, σε συνδυασμό με τα 6 δείγματα χαρακτηρίστηκε ως μεγάλης αλγορίθμου ΜΝΗΜΕΣ εφαρμόστηκε για την επιλογή των κορυφαίων 10 Mirs υψηλότερο ζύγισης. Για όλα τα miRNAs που εμφανίζονται στο top 10 ένα σκορ κρατήθηκε και επιλέχθηκαν οι 10 πιο εμφανίζονται miRNAs.

γονιδίων στόχων Top miRNAs

Μια έρευνα διεξήχθη σε προβλεπόμενων στόχων για τον πιο απαιτητικό miRNAs που προσδιορίζονται στη μελέτη μας, χρησιμοποιώντας το

TargetScan

web interface v.6.1 (https://www.targetscan.org/) και miRDB έκδοση 4.0 (https://mirdb.org/miRDB/index.html) . Μετά τη σύγκριση όλων των συνόλων δεδομένων, ένα υποσύνολο των γονιδίων που απευθύνονται σε περισσότερα του ενός miRNA δημιουργήθηκε.

Η αντίστροφη μεταγραφή (RT) και ποσοτική-PCR ανάλυση του miR-211 και miR-4321

για την επικύρωση των πορισμάτων της ανάλυσης μικροσυστοιχιών, αξιολογήσαμε την έκφραση της πιο απαιτητικούς miRNA, miR-211, καθώς και η σπάνια διερευνώνται miR-4321, σε μια ανεξάρτητη ομάδα των PDAC ασθενών. RNA (10-100 ng) μεταγράφηκε αντίστροφα και το προκύπτον cDNA ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας τα ειδικά προσαρμοσμένο TaqMan®-microRNA-δοκιμασίες (Applied Biosystems) για miR-211 και miR-4321. Πραγματοποιήσαμε μια προκαταρκτική ανάλυση των 3 ενδογενούς ελέγχου (RNU1, RNU6 και RNU43) σε μια σειρά από 10 κύτταρα PDAC. Δεδομένου ότι οι τιμές των RNU6 ήταν το πιο κοντινό προς τις γεωμετρικές μέσες τιμές αυτών των γονιδίων, χρησιμοποιήσαμε αυτό οικοκυρικής για την εξομάλυνση όλων των παρακάτω ανάλυση. Οι αντιδράσεις PCR πραγματοποιήθηκαν στο σύστημα ανίχνευσης αλληλουχίας 7500HT (Applied Biosystems), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Δείγματα ενισχύθηκαν εις διπλούν, με κατάλληλους ελέγχους μη-πρότυπο. στοιχεία ενίσχυσης ομαλοποιήθηκαν να RNU6 έκφρασης. Ο ποσοτικός προσδιορισμός της σχετικής έκφρασης (αναφερόμενη ως αυθαίρετες μονάδες [a.u.]) πραγματοποιήθηκε με τη χρήση της μεθόδου ΔCt. Ποσοτική-PCR δεδομένα έδειξαν συντελεστή μεταβλητότητας της Ct πάντα κάτω από το 2% των μέσων τιμών.

Συσχέτιση του miR-211 και miR-4321 με αποτέλεσμα

Η σύγκριση των κλινικών πληροφοριών και των επιπέδων έκφρασης των miRNAs έγιναν με χ

2 τεστ Pearson και τεστ Wilcoxon. Η σχέση μεταξύ της έκφρασης miRNA και έκβαση αξιολογήθηκε με διαστρωμάτωσης των ασθενών σε σχέση με τη μέση τιμή της έκφρασης (υψηλή έναντι χαμηλή έκφραση). Οι αναλύσεις των δειγμάτων έγιναν με τυφλό τρόπο σε σχέση με την κλινική έκβαση.

OS υπολογίστηκε από την ημερομηνία της χειρουργικής επέμβασης για την ημερομηνία του θανάτου, DFS ορίστηκε ως ο χρόνος από την ημερομηνία της χειρουργικής επέμβασης για την ημερομηνία της πρώτης υποτροπής ή θανάτου. Οι καμπύλες επιβίωσης κατασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Kaplan-Meier, και οι διαφορές αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας δοκιμασία log-rank. Οι σημαντικές προγνωστικές μεταβλητές του OS και DFS σε μονοπαραγοντική ανάλυση συμπεριλήφθηκαν στην πολυπαραγοντική ανάλυση, χρησιμοποιώντας μοντέλο αναλογικών κινδύνων του Cox.

Η σχέση μεταξύ του miR-211 έκφρασης και το αποτέλεσμα αξιολογήθηκε επίσης με τη βοήθεια του χωρίς επίβλεψη αλγορίθμου ομαδοποίησης K- μέσα. τα σημεία αυτά τα δεδομένα χωρίσματα αλγόριθμο σε k ομάδες σε επαναληπτικό τρόπο, δίνεται ένας προκαθορισμένος αριθμός των clusters k (k = 2, κατ ‘ανώτατο όριο επαναλήψεων = 1000).

Για την χ

2 τεστ Pearson, Wilcoxon τεστ , καμπύλες Kaplan-Meier, δοκιμασία log-rank και πολυπαραγοντική ανάλυση, τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το

SPSS V.17

στατιστικού λογισμικού (SPSS, Inc, Chicago, IL), ενώ όλες οι άλλες υπολογιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν σε

R

(

R v.2.10.1

, πακέτα: στατιστικά, dprep). Περαιτέρω λεπτομέρειες σχετικά με τις μεθόδους και τα στατιστικά στοιχεία που παρέχονται στα συμπληρωματικά στοιχεία.

In vitro μελέτες

Οι ανθρώπινες κυτταρικές σειρές PDAC ASPC-1, Capan-1, CFPAC-1 , HPAC, ΗΡΑΡ-ΙΙ, ΜΙΑ PaCa-2, PANC-1, PL45, και Su86.86 αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA), ενώ πέντε πρωτογενείς καλλιέργειες κυττάρων (LPc006, LPc028, LPc033, LPc067, και LPc111) απομονώθηκαν από ασθενείς στο Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο της Πίζας (Πίζα, Ιταλία), όπως περιγράφηκε προηγουμένως (17). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640, συμπληρωμένο με 10% FBS, και 1% πενικιλίνη (50 IU /ml) και στρεπτομυκίνη (50 μg /mL) (Gibco, Gaithersburg, MD). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 37 ° C υπό ατμόσφαιρα 5% CO

2 σε 75 cm

2 φιάλες καλλιέργειας ιστού (Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany) και συλλέχθηκαν με τρυψίνη-ΕϋΤΑ σε εκθετικά αυξανόμενη φάση τους . RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας ένα πρωτόκολλο ΤπζοΙ-χλωροφόρμιο (Sigma, St. Louis, ΜΟ). RNA αποδόσεις και καθαρότητα ελέγχθηκαν με μέτρηση της οπτικής πυκνότητας στα 260/280 nm με φασματοφωτόμετρο Nanodrop®. Η βασική έκφραση του miR-211 αξιολογήθηκε με qRT-PCR, όπως περιγράφεται ανωτέρω για τους ιστούς PDAC. δεδομένα Amplification κανονικοποιήθηκαν σε RNU6 έκφραση, και τον ποσοτικό προσδιορισμό της σχετικής έκφρασης διεξήχθη χρησιμοποιώντας την μέθοδο ΔCt.

Η επίδραση του miR-211 επί χημειοευαισθησία αξιολογήθηκε με τον ΜΙΑ PaCa-2 και τα κύτταρα LPc028, με επιμόλυνση αυτών των κυττάρων με τον πρόδρομο και αντιπληροφοριακά ολιγονουκλεοτίδια (προ-miR-211 και αντι-miR-211) αγοράστηκε από την Ambion-Applied Biosystems (Δοκιμασία ID, MC10168 και MH10168, αντίστοιχα) στους 30 ηΜ τελική συγκέντρωση. Τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε 5000 κύτταρα /φρεάτιο σε 200 μΙ RPMI με 10% FBS και 1% αντιβιοτικά. Μετά από 24 ώρες τα κύτταρα εκτέθηκαν σε 0,9 μΙ Oligofectamine (Invitrogen, Paisley, UK) σε μέσο ελεύθερο ορού, αναμίχθηκαν για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, που ακολουθείται από την προσθήκη 0,3 μΙ 6,25 μΜ miR-211 πρόδρομος ή αναστολέα. Τα κύτταρα επωάστηκαν επίσης με miRNA αρνητικούς μάρτυρες (Ambion). Μετά από ολονύκτια έκθεση το μέσο απομακρύνθηκε από τα φρεάτια και αντικαταστάθηκε με RPMI με 10% FBS, χωρίς αντιβιοτικά. Στη συνέχεια, τα κύτταρα αφέθηκαν να αναπτυχθούν επί άλλες 48 ώρες σε μέσο χωρίς φάρμακο ή αγωγή με 1 μΜ γεμσιταβίνη, όπως περιγράφεται παραπάνω. Πρόσθετες φρεάτια ελέγχου χρησιμοποιήθηκαν για την εξαγωγή RNA, για να αξιολογήσει την αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης.

Τέλος, στο πλαίσιο της προκαταρκτικής λειτουργικές αναλύσεις σχετικά με πιθανούς στόχους του miR-211 που προβλέπεται από

TargetScan

, επιλέξαμε υπομονάδα ριβονουκλεοτιδικής αναγωγάσης 2 (RRM2), η οποία αποτελεί σημαντικό κυτταρικό στόχο της γεμσιταβίνης [25]. Ως εκ τούτου, πραγματοποιήσαμε μια ανάλυση RT-PCR της έκφρασης RRM2 στα κύτταρα επιμολυσμένα με προ-miR-211 και αντι-miR-211, όπως περιγράφεται παραπάνω. Αυτές οι αντιδράσεις PCR πραγματοποιήθηκαν με εκκινητές και ανιχνευτή από την Applied Biosystems Δοκιμασία-on-Demand προϊόν έκφρασης γονιδίων Hs0035724, χρησιμοποιώντας μια προηγουμένως πιστοποιημένη μέθοδο [15]. Ενισχύσεις κανονικοποιήθηκαν προς GAPDH, και ποσοτικοποίηση της γονιδιακής έκφρασης πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του υπολογισμού ΔΔCT, όπου CT είναι ο κύκλος ορίου? η ποσότητα του γονιδίου στόχου, κανονικοποιημένη προς GAPDH και σε σχέση με τα βαθμονομητή (κύτταρα ελέγχου μη επεξεργασμένα), δίνεται ως 2

-ΔΔCT. Δείγματα ενισχύθηκαν εις τριπλούν με κατάλληλους ελέγχους μη-πρότυπο, και ο συντελεστής διακύμανσης ήταν & lt? 1% για όλες τις επαναλήψεις

Αποτελέσματα

χαρακτηριστικά των ασθενών

Πίνακας. 1 συνοψίζει τα κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά όλων των PDAC ασθενείς που αξιολογήθηκαν στην παρούσα μελέτη. Οι περισσότεροι ασθενείς είχαν σταδίου-Τ3 ποιότητας-2 όγκων, με θετικούς λεμφαδένες, και περινευρικό εισβολή.

Η ανάλυση μικροσυστοιχιών miRNA πραγματοποιήθηκε σε 19 δείγματα που πέρασαν το κριτήριο της ποιότητας του RNA. Οι ασθενείς αυτοί περιλαμβάνονται 13 ασθενείς με OS μικρότερη από 1 έτος (διάμεση OS, 8,0, 95% CI, 05.04 – 10.06) και 6 ασθενείς που επέζησαν περισσότερο από 30 μήνες (διάμεση OS, 31.0, 95% CI, 30,6 έως 31,4). Τα οικόπεδα Kaplan-Meier των ομάδων αυτών που αναφέρονται στο σχήμα S2.

Μια άλλη ομάδα 60 ασθενών που χρησιμοποιήθηκε ως ομάδα επικύρωσης, με διάμεση OS και DFS των 20,9 και 11,9 μήνες, αντιστοίχως (βλέπε Σχήμα S3 για τα οικόπεδα Kaplan-Meier). Η εκδήλωση-ποσοστό ήταν 66,7%, και η μέση παρακολούθηση για την επιβίωση των ασθενών ήταν 21,4 μήνες. Σε αυτή την ομάδα OS ήταν σημαντικά μεγαλύτερη (p = 0,009) για τους ασθενείς που φέρουν βαθμού 1/2 όγκους (διάμεση OS, 25.2, 95% CI, 14,7 έως 35,7) από ό, τι οι ασθενείς με βαθμού 3 PDACs (διάμεση OS, 14.8, 95% CI, 11,3 – 18,3) στοιχεία σχετικά με τα αποτελέσματα σύμφωνα με τα χαρακτηριστικά των ασθενών αναφέρονται στον πίνακα S1

mirna ανάλυση μικροσυστοιχιών:. συνολική ομαδοποίηση

Μετά τις αναλυτικές διαδικασίες για την εξομάλυνση των πρώτων δεδομένων από το μικροσυστοιχιών ανάλυση (περιγράφεται στην Περιγραφή S1) πραγματοποιήσαμε μια ανάλυση t-test, η οποία οδήγησε σε μια λίστα 170 miRNAs που δείχνουν σημαντικές διαφορές στην έκφραση μεταξύ των δύο ομάδων (ρ & lt? 0,05) (Πίνακας S2). Για την εκτέλεση ιεραρχική ανάλυση συστάδων μπορούμε στη συνέχεια κατασκευάστηκε μια μήτρα απόσταση χρησιμοποιώντας το διπλής ουράς τεστ συσχέτισης Spearman, λόγω της μη-κανονική κατανομή της έκφρασης εντός δειγμάτων. Αυτή η ανάλυση διασποράς έδειξε καλό διαχωρισμό μεταξύ των δύο ομάδων δειγμάτων (short-OS εναντίον μακράς OS), με βάση τα σημαντικά διαφορετικές miRNAs (Σχήμα 1).

Για να εκτελέσετε ιεραρχική ανάλυση συστάδων κατασκευάσαμε μια μήτρα απόσταση χρησιμοποιώντας το διπλής ουράς τεστ συσχέτισης Spearman, λόγω της μη-κανονική κατανομή της έκφρασης εντός δειγμάτων. Η ανάλυση συστάδων δείχνει έναν καλό διαχωρισμό μεταξύ των δύο ομάδων των δειγμάτων, με βάση τις σημαντικά διαφορετικές miRNAs. Τα δεδομένα έκφρασης microRNA επικεντρώθηκαν κατά 2 κατευθύνσεις (δηλαδή, με miRNA και ασθενείς). Κόκκινο και κίτρινο αντιπροσωπεύουν χαμηλή και υψηλή έκφραση των miRNAs, αντίστοιχα

Η

Mirna ανάλυση μικροσυστοιχιών:. Αρωγής και επαναληπτική ΜΝΗΜΕΣ

Ο αλγόριθμος ΜΝΗΜΕΣ εργαζόταν στο πλήρες σύνολο δεδομένων, όπως περιγράφεται στο μεθόδους. Ο αλγόριθμος αυτός αποδίδεται βαθμολογία σε κάθε miRNA ανάλογα με το πόσο καλά διακρίσεις τις δύο ομάδες δειγμάτων (π.χ. δείγματα από μικρό-OS

έναντι

δείγματα από ασθενείς με μακράς OS). Αυτό οδήγησε σε ένα top 10 των πιο απαιτητικό miRNAs. Εικόνα S3 δείχνει την ανάλυση διασποράς με βάση αυτές τις 10 miRNAs, ενώ ο πίνακας 2 δείχνει αυτή την ομάδα των κορυφαίων 10 miRNAs και αποδίδεται βαθμολογίες τους.

Η

Μετά την παρατήρηση πως οι βαθμολογίες διανεμήθηκαν (Σχήμα S4), επιλέξαμε τα πρώτα τέσσερα (miR-211, miR-4321, miR-1207-3p και miR-326) μεταξύ αυτό το top 10 και πραγματοποιήθηκε ανάλυση διασποράς.

Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2, η κορυφή 4 miRNAs με σαφήνεια διαχώρισε τις δύο ομάδες των ασθενών. Με εξαίρεση μία περίπτωση (S2), η οποία έδειξε πολύ υψηλές τιμές έκφρασης για όλους τους μελετήθηκαν miRNAs, οι δύο κύριες ομάδες στις x-άξονα αντιστοιχούν στις δύο ομάδες (μικρή /μεγάλη OS). Ειδικότερα, δεδομένου ότι τα χρώματα στην heatmap έδειξε την σχετική έκφραση του miRNA σε όλα τα δείγματα, παρατηρήσαμε δυο τύπους προφίλ έκφρασης, ένα στο οποίο η έκφραση ήταν χαμηλότερη στους ασθενείς με μια σύντομη-OS (για miR-211, miR -1207-3p, miR-326) και μία στην οποία το μοτίβο ήταν αντίθετο (για miR-4321). Αντίθετα, οι ασθενείς με μακράς OS είχαν υψηλότερες τιμές έκφρασης για miR-211, miR-1207-3p, miR-326, και χαμηλότερες τιμές έκφρασης για miR-4321.

Τα χρώματα είναι κανονικοποιημένες και μπορεί να συγκριθεί μόνο αριστερά προς τα δεξιά.

η

για να επιβεβαιώσετε τις πιο διακριτική miRNAs πραγματοποιήσαμε μια πρόσθετη ανάλυση με τη χρήση επαναληπτικής ανακούφιση. Όπως παρατηρείται από τον Πίνακα S3, το top 10 Mirs ήταν τα ίδια, εκτός από το miR-1200 και miR-766 που αντικατέστησε miR-197 και miR-1296. Ωστόσο, η κατάταξη των επαναληπτικών βαθμολογίες ανακούφισης έδειξε μια σαφής διαχωρισμός μεταξύ της κορυφής 4 και του πυθμένα 6 πιο διακριτική miRNAs (Σχήμα S6). Με τον τρόπο αυτό απέδειξε ότι η κορυφή 4 miRNAs δεν μεροληπτεί υπέρ οποιουδήποτε συγκεκριμένου δείγματος. Όπως αναφέρεται στον Πίνακα 2, οι miRNAs που εμφανίστηκαν στην κορυφή 4 με χρήση της προσέγγισης ΑΠΑΛΛΑΓΗ εμφανίστηκε επίσης στην κορυφή 4 στην ανάλυση επαναληπτικής RELIEF, γεγονός που υποδηλώνει ότι το προφίλ έκφραση αυτών των 4 miRNAs μπορούν να χρησιμοποιηθούν για βεβαιότητα διάκριση μεταξύ των ασθενών με σύντομη-OS και οι ασθενείς με χρόνια OS.

πρόβλεψη στόχος για τους υποψηφίους κορυφή miRNA

Η ταυτότητα, χρωμοσωμική θέση και ο αριθμός των γονιδίων-στόχων των υποψηφίων miRNA εντοπίζονται στη μελέτη μας συνοψίζονται στον πίνακα 3. για να αποκτήσουν περαιτέρω γνώσεις σχετικά με τις βιολογικές πορείες δυνητικά ρυθμίζεται από miRNAs, είμαστε δίπλα πραγματοποιηθεί μια συνολική σύγκριση μεταξύ των προβλεπόμενων γονίδια-στόχους για 4 κορυφαία υποψηφίους miRNA μας σύμφωνα με τις

TargetScan

και

miRDB

. Είναι σημαντικό ότι, στο

TargetScan

πρόβλεψη για το 10% αυτών των γονιδίων είχαν προβλεφθεί να απευθύνονται κατά 2 miRNAs, με 13 γονίδια στοχεύονται από τρία miRNA και ένα γονίδιο στόχο όλες τις τέσσερις διαφορετικές miRNAs (Πίνακας S4).

χρησιμοποιήθηκε ανάλυση του προγνωστικού ρόλου του miR-211 και miR-4321 σε μια ανεξάρτητη ομάδα ασθενών PDAC

RT-PCR ανάλυση του miR-211 έκφρασης σε 60 ανεξάρτητα δείγματα PDAC να επικυρώσει την προγνωστική σημασία αυτού του miRNA. Αυτή η ομάδα επικύρωση δεν διέφεραν σημαντικά από την άποψη της κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά σε σύγκριση με την αρχική ομάδα ασθενών (Πίνακας 1).

Η έκφραση του miR-211 ήταν ανιχνεύσιμο σε όλα αυτά τα δείγματα, και οι ασθενείς αρχικά κατηγοριοποιούνται ανάλογα με η διάμεση τιμή έκφρασης του miR-211 (12,8 AU), σύμφωνα με την Gaussian κατανομή των τιμών έκφρασης, όπως περιγράφεται στο σχήμα S7.

Είναι αξιοσημείωτο ότι, miR-211 έκφρασης διέφερε σημαντικά μεταξύ βαθμού 1/2 ( Ν = 30) και βαθμού 3 (Ν = 30) όγκους (Ρ = 0.006 στην Wilcoxon-rank-sum-test). Σε αντίθεση, καμία διαφορά ανιχνεύθηκε σε miR-21 επίπεδα έκφρασης σύμφωνα με άλλες κλινικοπαθολογικών παραμέτρων (Πίνακας S5).

Μια ισχυρή συσχέτιση του miR-211 το καθεστώς της έκφρασης και του κλινικού αποτελέσματος αποδείχθηκε. Η ομάδα υψηλού έκφραση του miR-211 είχε μια καλύτερη πρόγνωση από την ομάδα χαμηλής έκφρασης. Οι ασθενείς με την έκφραση του miR-211 κάτω από μέση (χαμηλά miR-211) είχαν σημαντικά μικρότερη διάμεση OS (14,8 μήνες, 95% CI, 13,1 έως 16,5 μήνες) σε σύγκριση με τους ασθενείς με miR-211 έκφρασης υψηλότερα από την διάμεση (διάμεση OS, 25,7 μήνες , 95% CI, 16,2 έως 35,6 μήνες, HR = 3,0, 95% CI, 02.01 – 08.09, Ρ & lt? 0.001). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν με τις καμπύλες DFS των ασθενών με miR-211 έκφραση παραπάνω διάμεσος, με διάμεση DFS από 16,7, σε σύγκριση με 9,3 μήνες σε ασθενείς με τη χαμηλότερη έκφραση miR-211 (Ρ = 0,004). Οι καμπύλες OS και DFS Kaplan-Meier φαίνεται στα σχήματα 3Α-Β.

Η

Αντίθετα, η έκφραση του miR-4231 δεν συσχετιζόταν με αποτέλεσμα στην ίδια ομάδα ασθενών (Σχήμα S8). Ασθενείς με miR-4231 έκφρασης κάτω μεσαίο είχε μόνο μια τάση προς μια σημαντική πλέον διάμεση OS σε σύγκριση με τους ασθενείς με miR-4231 έκφρασης πάνω μεσαίο (25,8 μήνες, 95% CI, 18,2 έως 32,3 μήνες, έναντι 16,7 μηνών, 95% CI, 13,7 έως 19,7 μηνών, p = 0,194). Παρομοίως, δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές για το διάμεσο DFS (13,0 μήνες, 95% CI, 8,4 έως 17,6 μήνες, έναντι 10,0 μηνών, 95% CI, 2,0 έως 17,9 μηνών, p = 0,581).

Ωστόσο, δεδομένου ότι υπήρχε μια καλή συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης του miR-211 και OS, όπως φαίνεται στο Σχήμα S8 (r = 0,724) αναλύσαμε περαιτέρω τα δεδομένα έκφρασης miR-211 χρησιμοποιώντας ομαδοποίηση κ-μέσων (k = 2). Κάθε ένα από τα 60 δείγματα που ανατέθηκε σε μία από τις δύο ομάδες (Σχήμα S9), τα οποία συγκρίθηκαν με τις καμπύλες Kaplan-Meier για το OS και DFS.