Αφηρημένο

Ο καρκίνος του παγκρέατος είναι μια από τις πλέον θανατηφόρες ανθρώπινες κακοήθειες, και η πρόγνωση της δεν έχει βελτιωθεί κατά τα τελευταία 40 χρόνια. Τα μοντέλα ποντικιού που αυθόρμητα αναπτύσσουν παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα και μιμούνται την πρόοδο της ανθρώπινης ασθένειας αναδύεται ως ένα νέο εργαλείο για τη διερεύνηση της βασική βιολογία της νόσου και τον εντοπισμό δυνητικών θεραπευτικών στόχων. Εδώ, περιγράφουμε ένα νέο μοντέλο μεταστατικού αδενοκαρκινώματος του παγκρέατος με βάση παγκρέατος-ειδικό, επαγώγιμοι και αναστρέψιμη έκφραση ενός ογκογόνου μορφής Kras, μαζί με το πάγκρεας-ειδική έκφραση μιας μεταλλαγμένης μορφής του καταστολέα όγκου ρ53. Χρησιμοποιώντας μαγνητική τομογραφία υψηλής ευκρίνειας να ακολουθήσει μεμονωμένων ζώων σε μακροχρόνιες μελέτες, δείχνουμε ότι οι δύο πρωτογενών και μεταστατικών βλαβών εξαρτάται από τη συνεχή δραστηριότητα Kras για τη συντήρηση τους. Ωστόσο, η εκ νέου ενεργοποίηση του Kras * μετά από παρατεταμένη αδρανοποίηση οδηγεί σε ταχεία υποτροπή του όγκου, αυξάνοντας την ανησυχία ότι Kras * ανθεκτικότητας στο μπορεί τελικά να αποκτηθεί. Έτσι, τα δεδομένα μας εντοπίζει Kras * ως βασικό ογκογονιδίου σε παγκρεατικά συντήρησης του καρκίνου, αλλά αυξάνει την πιθανότητα της επίκτητης αντοχής θα πρέπει να καταστούν διαθέσιμα αναστολείς Kras για χρήση σε καρκίνο του παγκρέατος

Παράθεση:. Collins MA, Brisset JC, Zhang Υ , Bednar F, Pierre J, Heist ΚΑ, et al. (2012) Μεταστατικό καρκίνο του παγκρέατος εξαρτάται από Ογκογόνες Kras σε ποντίκια. PLoS ONE 7 (12): e49707. doi: 10.1371 /journal.pone.0049707

Επιμέλεια: Hana Algul, Τεχνικό Πανεπιστήμιο του Μονάχου, Γερμανία

Ελήφθη: 30 Μαρτίου, 2012? Αποδεκτές: 12η Οκτωβρίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 3 Δεκεμβρίου 2012

Copyright: © 2012 Collins et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Πανεπιστήμιο του Michigan Βιολογικών Μελετητής Πρόγραμμα και από GI Spore, P50CA13810 (Pilot Grant να MPdM) και από τις ΗΠΑ Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας έρευνας P50CA93990 επιχορήγησης. MRI πραγματοποιήθηκε από το Κέντρο Μοριακής Απεικόνισης υποστηρίζεται από ΝΙΗ P50 CA093990. MAC υποστηρίζεται από το Πανεπιστήμιο του Michigan Πρόγραμμα Κυτταρικής και Μοριακής Βιολογίας επιχορήγηση της κατάρτισης (ΝΙΗ Τ32 GM07315) και από το Πανεπιστήμιο του Michigan Κέντρου για Οργανογένεσης Εκπαίδευσης Grant (5-Τ32-HD007515). FB υποστηρίζεται από το Αμερικανικό Κολλέγιο Χειρουργών Resident ερευνητική υποτροφία και από ΝΙΗ Τ32 HD007505. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα του πόρου (PDA), η πιο κοινή μορφή καρκίνου του παγκρέατος, συνδέεται συχνά με μεταλλάξεις του ογκογονιδίου Kras, συνηθέστερα KRAS

G12D [1], [2]. Μεταλλάξεις του -τις περισσότερες ογκοκατασταλτικό ρ53 συνήθως R175H [3] – παρατηρούνται συχνά σε ανθρώπινα δείγματα [1]. Έκφραση μεταλλαγμένων Kras

G12D (Kras *) και μεταλλαγμένο p53

R172H -το ορθόλογο ποντικού του R175H- στο πάγκρεας ποντικού χρησιμοποιήθηκε για να δημιουργηθεί το μοντέλο KPC. KPC ποντίκια μιμούνται στενά την εξέλιξη της ανθρώπινης ασθένειας [4], [5] και ανταποκρίνονται σε θεραπευτικά με έναν παρόμοιο τρόπο όπως ανθρώπους ασθενείς. Αντίθετα, οι όγκοι μεταμοσχεύθηκαν σε ποντικούς ανοσοκατασταλμένους προβλέψουμε ανεπαρκώς θεραπευτική ανταπόκριση [6], [7]. Το μοντέλο KPC είναι έτσι ιδανικά για τη μελέτη του σχηματισμού καρκίνου του παγκρέατος. Ωστόσο, σε αυτό το μοντέλο μεταλλαγμένου έκφραση Kras είναι μη αναστρέψιμη. Έτσι, KPC ποντίκια δεν είναι κατάλληλα για τη μελέτη του ρόλου της Kras * στη διατήρηση του όγκου. Από τα φάρμακα που στοχεύουν Kras * είναι διαθέσιμο προς το παρόν, η γενετική μοντελοποίηση της αναστολής Kras είναι η μόνη επιλογή για να προσδιορίσετε αν αυτό το ογκογονίδιο απαιτείται για τη συντήρηση του όγκου.

Εμείς και άλλοι, έχουν περιγραφεί πρόσφατα την επαγώγιμη-Kras * p53

+/- (iKras * ρ53

+/-) μοντέλο ποντικού του καρκίνου του παγκρέατος, που επιτρέπει ιστού-ειδικούς, επαγώγιμοι και αναστρέψιμη έκφραση μεταλλαγμένων Kras σε συνδυασμό με την απώλεια της αλληλόμορφου συνάρτηση του όγκου καταστολέα ρ53 [8 ], [9]. iKras * p53

+/- ποντίκια αναπτύσσουν επεμβατική, αλλά μη μεταστατικό καρκίνο του παγκρέατος, που εξαρτάται από την παρατεταμένη Kras * δραστηριότητα για την ανάπτυξη και τη συντήρηση του. Σε άλλα μοντέλα ποντικών του καρκίνου του παγκρέατος, καθώς και σε άλλα μοντέλα όγκων, απώλεια της λειτουργίας του ρ53 επιταχύνθηκε σχηματισμού όγκου, αλλά μόνο σπάνια προκάλεσε μεταστατική νόσο. Σε αντίθεση, η έκφραση του μεταλλαγμένου ρ53 έχει δειχθεί ότι είναι ιδιαίτερα προ-μεταστατικό [10], [11], [12]. Υπάρχει μια ορισμένη μεταβλητότητα σε αυτές τις διαπιστώσεις: για παράδειγμα, το μεταστατικό δυναμικό έχει περιγραφεί από άλλες ομάδες χρησιμοποιώντας KC ή iKras * ποντικών σε συνδυασμό με την απώλεια του αλληλόμορφου λειτουργίας της ρ53 [9], [13], έτσι θα μπορούσε να υπάρχει πρόσθετη επιδράσεις να εξετάσει , όπως γενετικό υπόβαθρο των ποντικών. Δεδομένου ότι το p53 αποικία του ποντικιού μας απώλειας της λειτουργίας δεν παρέχουν μεταστατικό δυναμικό να iKras * ποντίκια, δημιουργήσαμε iKras * ποντίκια που έφεραν επίσης ένα μεταλλαγμένο αλληλόμορφο p53 (p53

R172H αποφασίζει p53 *). Ο στόχος μας ήταν να δημιουργήσει ένα μεταστατικό μοντέλο όπου θα μπορούσαμε να εξεταστεί ο ρόλος των Kras * στη διατήρηση του μεταστατικού καρκίνου του παγκρέατος, ακολουθώντας τα ποντίκια σε διαχρονικές μελέτες, χρησιμοποιώντας το

in vivo

απεικόνισης.

(Α ) γενετική σύσταση των iKras * p53 * ποντίκια. (Β) Πειραματικός σχεδιασμός: doxy χορηγήθηκε συνεχώς, ξεκινώντας από τον απογαλακτισμό. Η οξεία παγκρεατίτιδα προκλήθηκε εντός 72 ωρών, τότε τα ζώα ήταν ηλικίας μέχρι ανέπτυξαν όγκους. Kaplan-Meier καμπύλη επιβίωσης. iKras * p53 *, η = 25? iKras * p53

+/-, n = 9. Log-rank στατιστική ανάλυση έδωσε τιμή Ρ 0.001. (C) Το ακαθάριστο εικόνες μορφολογία ενός πρωτογενούς όγκου και μεταστάσεων ήπατος. T: όγκος, S: στομάχι, Sp: σπλήνα, Int: έντερο, L: ήπαρ (D). Η ιστολογική εξέταση ενός μετρίως διαφοροποιημένων (πάνω σειρά) και μια un-διαφοροποιημένα (κάτω σειρά) παγκρεατικά καρκινικά? ήπαρ και πνεύμονα μεταστάσεις. Τ: όγκου. μπαρ κλίμακα 100 um.

Η

Αποτελέσματα

Σε iKras * p53 * ποντίκια, το πάγκρεας ειδικά P48-Cre (Ptf1a-CRE) [14] ανασυνδυάζεται ένα floxed κασέτα στάση εισαχθεί σε η Rosa 26 locus, ενεργοποιώντας έτσι έκφραση του μεταγραφικού ενεργοποιητή rtTa [15]. Cre ανασυνδυασμός επάγει επίσης την έκφραση του p53

R172H (p53 *) [16] από την ενδογενή τόπο του μετά από ανασυνδυασμό ενός floxed κασέτας στάση. Η rtTa είναι μεταγραφικά ενεργή παρουσία δοξυκυκλίνη (doxy), και ανενεργά κατά την απουσία του. Έτσι, η TetO-Kras

G12D (Kras *) [17] αλληλόμορφο μπορεί να μεταγραφεί σε ένα επαγώγιμο, ιστο-ειδική και αναστρέψιμο τρόπο με χορήγηση δοξυκυκλίνη σε νερό των ζώων (Εικ. 1Α). Για να προκαλέσει καρκινογένεση, iKras * p53 * ποντίκια τοποθετήθηκαν σε doxy σε απογαλακτισμό, που ακολουθείται από μια σύντομη έκρηξη της οξείας παγκρεατίτιδας για την προώθηση PanIN σχηματισμό όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18], [19]. Τα ζώα στη συνέχεια διατηρήθηκαν επί doxy έως ότου αναπτυχθεί PDA και έπρεπε να ευθανασία ή υπέκυψαν, μεταξύ 2 και 45 εβδομάδες μετά doxy χορήγηση (Σχ. 1 Β και Πίνακας 1). Είναι ενδιαφέρον ότι, η επιβίωση του iKras * p53 * ζώα ήταν μεγαλύτερη από εκείνη του iKras * ρ53

+/- ποντίκια (βλέπε καμπύλη Kaplan Meier στην Εικόνα 1Β.)? Ωστόσο, ο λόγος για αυτή τη διαφορά παραμένει ασαφής. Κατά την νεκροψία, iKras * p53 * ζώα παρουσιάζονται με μάζα όγκου συχνά στην κεφαλή του παγκρέατος, μαζί με ορατό μεταστατικές βλάβες (Εικ. 1Γ). Ένα υποσύνολο των ζώων που παρουσιάζονται επίσης με ασκίτη αιμορραγικό (n = 5). Η ιστολογία του πρωτογενούς όγκου αποκάλυψε μέτρια έως παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα un διαχωριζόμενες με άφθονη δεσμοπλαστικό στρώμα (Εικ. 1 D, Εικ. 2Α και Πίνακας 1) παρόμοιο με αυτό που έχει βρεθεί σε iKras * ρ53

+/- ζώων [8] . Μεταστατικές αλλοιώσεις ήταν πολύ διαδεδομένη στο ήπαρ (Εικ 1C ένθετο, 1D, Σχήμα 2Α και Πίνακα 1..), Και λιγότερο συχνή στους πνεύμονες? δωδεκαδακτύλου εισβολή επίσης περιστασιακά παρατηρήθηκε (Εικ. 1 D, Εικ. 2Α, Πίνακας 1 και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Τόσο πρωτογενείς όγκους και μεταστάσεις εκφράζονται φωσφο-ERK1 /2, μια καθοδικός τελεστής του Kras (Εικ. 2Β). Περαιτέρω χαρακτηρισμός των όγκων και των μεταστάσεων έδειξε έκφραση δεικτών PDA, όπως CK19 (Σχ. 2C), η υψηλή πολλαπλασιαστική δείκτης όπως μετράται με Ki67 χρώσης (Σχ. 2D), συσσώρευση μεταλλαγμένης πρωτεΐνης ρ53 (Εικ. 2Ε), γονιδιωματική αστάθεια ως ανιχνεύεται με έκφραση γ-Η2ΑΧ (Σχ. 2F), και τη συσσώρευση των δεσμοπλαστικό στρώμα συμπεριλαμβανομένων των ινοβλαστών ακτίνη λείου μυός που εκφράζουν (Σχ. 2G). Έτσι, οι iKras * μοντέλο p53 * ποντικιού ανακεφαλαιώνει την ιστολογία και βιολογική συμπεριφορά του ανθρώπινου καρκίνου του παγκρέατος και τα προηγούμενα μοντέλα ποντικών με την πρόσθετη ικανότητα να ελέγχει Kras * έκφρασης σε ένα χρόνο και τον τρόπο οργάνου-εκλεκτική.

Η

(Α) Ιστολογία ενός πρωτογενούς παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα και μεταστάσεις στο ήπαρ και πνεύμονα. (Β-G) Ανοσοϊστοχημεία του πρωτογενούς όγκου και των μεταστάσεων για: (Β) φωσφο-ERK1 /2? (C) CK19? (D) Κί67? (Ε) ρ53? (F) γH2AX? (G) αSMA. M: μετάσταση. Κλίμακα ράβδου 20 um.

Η

Για να προσδιοριστεί η επίδραση της Kras * αδρανοποίησης επί του πρωτογενούς όγκου και των μεταστάσεων, αξιολογήσαμε διάφορες δυνατότητες για

in vivo

απεικόνισης, η οποία θα μας επιτρέψει να ακολουθήσει μεμονωμένων ζώων πάροδο του χρόνου σε διαχρονικές μελέτες. Φλουοροδεοξυγλυκόζη τομογραφία εκπομπής ποζιτρονίων (FDG-PET) και απεικόνιση μαγνητικού συντονισμού (MRI) έχουν χρησιμοποιηθεί εκτεταμένα για την εικόνα ορθοτοπική μοντέλα PDA [20], [21], και, σε ορισμένες περιπτώσεις, για αυθόρμητη όγκους [22], [23] . Άλλοι έχουν χρησιμοποιηθεί υψηλής ανάλυσης υπερήχων σε πρωτογενείς γενετικά μοντέλα ποντικών του PDA [6]. Ερευνήσαμε τη χρήση της μαγνητικής τομογραφίας, μια κλινικά σχετική τεχνική απεικόνισης που θα μας επιτρέψει να αποκτήσουν εικόνες υψηλής ανάλυσης των όγκων και μεταστάσεων και τη μέτρηση των μεταβολών του όγκου πάροδο του χρόνου. Εμείς απεικόνιση KPC ποντίκια (p48Cre? LSL-Kras? P53

R172H) [4], παράλληλα με iKras * p53 * ποντίκια για να συγκρίνετε σχηματισμό όγκων στα δύο μοντέλα. Αρχικά, οι ποντικοί που πρόκειται να απεικονιστεί επιλέχθηκαν με βάση την κλινική εκδήλωση της νόσου (κατάσταση φτωχό παλτό, διογκωμένη κοιλιά), ή, σε ορισμένες περιπτώσεις, μετά την ψηλάφηση μιας κοιλιακή μάζα (Σχ. 3Α). Οι ποντικοί ελέγχου απεικονίστηκαν για να απεικονίσει την κανονική πάγκρεας, ένθετα μεταξύ του στομάχου, του δωδεκαδάκτυλου, σπλήνα, και δίπλα στο δεξί νεφρό (Σχ. 3Β). Τόσο σε ατομικό KPC και iKras * p53 * ποντίκια (Εικ. 3C και 3D), MRI απεικόνισης προσδιορίζονται σαφώς την παγκρεατική μάζα του όγκου. Επιπλέον, σε iKras * p53 * ποντικούς, MRI οπτικοποιούνται επίσης πολλαπλές μεταστατικές αλλοιώσεις στο ήπαρ, που κυμαίνονται από πολύ μικρές μεγάλη για να αλλοιώσεις (0,11 mm

3) (Σχ. 3D, κάτω πάνελ). Σε επόμενα πειράματα απεικόνισης, τα ζώα απεικονίστηκαν μηνιαία, αρχίζοντας 1 μήνα μετά την ενεργοποίηση του Kras * έκφραση και επαγωγή παγκρεατίτιδας, και ανεξάρτητα από οποιοδήποτε σημάδι της νόσου. Σε αυτή τη δεύτερη ομάδα των ζώων, μικρότερους όγκους ενίοτε εντοπίστηκαν έτσι ώστε η ανάπτυξη του όγκου θα μπορούσε να ακολουθήσει την πάροδο του χρόνου (Εικ. 3Ε και Σχ. 4Β). Tumor και συνολική μεταστάσεις όγκων μετρήθηκαν για μεμονωμένα ζώα (Εικ. 3F, οι όγκοι του όγκου, κορυφή, και συνδυασμένο όγκο μεταστάσεις, κάτω, για KPC και iKras * p53 * # 1, # 2, # 3) στα δεικνυόμενα χρονικά σημεία. Έτσι, αυτή η τεχνική είναι μια αποτελεσματική, μη επεμβατική μέθοδο για τον προσδιορισμό της παρουσίας όγκων και μεταστάσεων σε μεμονωμένα ζώα.

(Α) Πειραματική σχεδίαση. (Β) μαγνητική τομογραφία του παγκρέατος και του ήπατος ποντίκι ελέγχου. P: πάγκρεας, S: το στομάχι, Σπ: σπλήνα, K: νεφρά, L: το συκώτι, G: χοληδόχου κύστης. (C) Μεγάλη παγκρεατική μάζα (Τ), αλλά δεν υπάρχουν μεταστατικές βλάβες σε ένα ποντίκι KPC. (D) Δύο iKras * p53 * ποντικών την doxy 15 εβδομάδες (αριστερά) και 42 εβδομάδες (δεξιά) δείχνουν ένα μεγάλο παγκρεατική μεταστάσεις μάζα και το συκώτι. (Ε) Προσδιορισμός των μικρότερων όγκων (iKras * p53 * # 3, αριστερό πάνελ, 38 εβδομάδες) μπορεί να ελεγχθεί, καθώς θα αναπτύσσουν σε μεγαλύτερους όγκους (iKras * p53 * # 3, δεξί πάνελ, 40 εβδομάδες). (F) μετρήσεις όγκου και των δύο πρωτοπαθείς όγκους και σε συνδυασμό μεταστάσεις για μεμονωμένες KPC και iKras * p53 * ζώα στα υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία.

Η

Για να καθοριστεί αν ο κύριος του όγκου και των μεταστάσεων εξαρτώνται από Kras * εμείς αποσύρθηκε doxy σε iKras * p53 * ποντικούς, αδρανοποιώντας έτσι την Kras * διαγονίδιο, και πραγματοποιείται σειριακή απεικόνιση του ίδιου ζώου συναρτήσει του χρόνου (σχήμα στο Σχ. 4Α και το Σχ. 5Α). Μετά Kras * αδρανοποίηση, η κύρια μάζα του όγκου (Εικ. 4Β και του Σχ. 5Β) υποχώρησαν σε μόλις ανιχνεύσιμα ή μη ανιχνεύσιμα εντός 3 εβδομάδων (Εικ. 4C και Σχ. 5C). Μέχρι τις 6 εβδομάδες μετά Kras * αδρανοποίηση, μόνο σπάνια μεταστατικών βλαβών συνεχίστηκε, αν και με μειωμένο μέγεθος (Εικ. 5C). Για κάθε χρονικό σημείο, ήμασταν σε θέση να λάβουν ογκομετρική μέτρα τόσο του πρωτογενούς όγκου και των μεταστάσεων (σχ. 4D και το Σχ. 5F). Όταν τα ποντίκια αποκόπηκαν μετά από παρατεταμένη Kras * αδρανοποίηση, το πάγκρεας τους εμφανίστηκαν μικρές και ημιδιαφανή, και στερείται κάθε φαινομενική ορατή μάζα του όγκου (Εικ. 4Ε). Ιστολογική ανάλυση (Εικ. 4Ε, μεσαίο πάνελ) αποκάλυψε ινωτικές παρέγχυμα (

πράσινο βέλος

), με acini (

κόκκινο βέλος

) διάσπαρτες μέσα σε διατατική αγωγούς (

κίτρινο βέλος

) και περιβάλλεται από το λιπώδη ιστό (

μπλε βέλος

). Μερικές από τις διεσταλμένες αγωγών διατηρούνται ενδοκυτταρική συσσώρευση βλεννίνη προσδιορίζονται από θετική χρώση PAS (Εικ. 4Ε, δεξί πάνελ). Παρατηρήσαμε επίσης κύστεις επενδεδυμένες με CK19-θετικά κύτταρα, που μπορεί να υποδεικνύουν την προηγούμενη θέση του όγκου (Σχ. 4F αριστερό πάνελ). Οι ινωτικές περιοχές διατηρούνται ίνες κολλαγόνου, όπως επισημαίνεται με βαφή Trichrome, αλλά τα κύτταρα στο εσωτερικό τους έλειπε Smooth Muscle έκφραση ακτίνης και δεν ήταν πολλαπλασιαστικές, υποδεικνύοντας ουλώδη ιστό και όχι ενεργό στρώμα. Τόσο σε όλες τις υπόλοιπες πάγκρεας και εντός των κύστεων, η έκφραση φωσφο-ERK1 /2 ήταν σπάνια, περιορίζεται σε μεμονωμένα κύτταρα? χρώση Κί67 ήταν παρούσα σε ένα υποσύνολο των επιθηλιακών κυττάρων, αλλά μιτωτικά σχήματα ήταν σπάνιες (Σχ. 4F). Έτσι, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι σε αυτό το αυθόρμητο μοντέλο του καρκίνου του παγκρέατος Kras * απαιτήθηκε για τη συντήρηση τόσο του πρωτογενούς όγκου και των μεταστάσεων, ακόμη και με την παρουσία ενός επιπλέον ογκογονιδίου, μεταλλαγμένο ρ53. Η εξάρτηση από ένα μόνο ογκογονίδιο για προχωρημένους όγκους έχει παρατηρηθεί πριν [24], [25], [26], [27], [28], [29]? Ωστόσο, απ ‘όσο γνωρίζουμε, η επίδραση του ογκογονιδίου αδρανοποίησης σε μεταστάσεις από συμπαγείς όγκους ήταν σπάνια αντιμετωπιστεί.

(Α) Πειραματική σχεδίαση. (Β) μαγνητική τομογραφία που λαμβάνονται σε 38 εβδομάδες μετά Kras * ενεργοποίηση δείχνει φυσιολογικό πάγκρεας μορφολογία. P: πάγκρεας, S: το στομάχι, Σπ: σπλήνα. Ωστόσο, στο ίδιο ζώο, υπάρχουν ενδείξεις ενός μικρού παγκρεατικού όγκου (Τ) με 40 εβδομάδες, 2 ημέρες, η οποία συνεχίζει να αυξάνεται σε μέγεθος κατά τη διάρκεια των επόμενων τεσσάρων εβδομάδων. (Γ) Η υποχώρηση του όγκου παρουσιάζεται παρακάτω Kras * αδρανοποίηση. Από τρεις εβδομάδες, δεν υπάρχει πλέον ένα αναγνωρίσιμο μάζα του όγκου. (Δ) Ο όγκος του όγκου στα δεικνυόμενα χρονικά σημεία. (Ε) Ακαθάριστο μορφολογία του παγκρέατος παρακάτω Kras * αδρανοποίηση – σημειώστε το μικρό πάγκρεας χωρίς εμφανή μάζα του όγκου (αριστερό πάνελ). Ιστολογία της υποχώρησαν ιστού (HE, μεσαίο πάνελ, μπαρ Κλίμακα 100 um) αποκαλύπτει acini (κόκκινο βέλος) που περιβάλλεται από ίνωση (πράσινο βέλος) και στο λιπώδη ιστό (μπλε βέλος) με διατατική αγωγούς (κίτρινο βέλος) που περιέχει μερικά κύτταρα που εμφανίζουν βλεννίνης συσσώρευσης που προσδιορίζονται από τα βέλη (χρώση PAS, δεξιά πάνελ, μπαρ Κλίμακα 20 um). (F) Ιστολογία ινωτικών κύστεις, υποδεικνύοντας μια πιθανή προηγούμενη θέση του όγκου (HE, αριστερό πάνελ), είναι επενδεδυμένα με κύτταρα που είναι CK19 θετικά (ένθετο). μπαρ κλίμακα 100 um. Gomori Trichrome (Κλίμακα ράβδου 100 um), SMA χρώση (ένθετο), ρ-ERK1 /2, και χρώση Ki67 δείχνουν ότι το υπόλοιπο ίνωση δεν είναι πλέον αντιδραστική. μπαρ κλίμακα 20 um.

Η

Είμαστε δίπλα προχώρησε να καθορίσει αν τα καρκινικά κύτταρα είχαν εξαλειφθεί εντελώς, ή αν ένα υποσύνολο από αυτούς είχαν επιβιώσει απενεργοποίηση της Kras *. Για το σκοπό αυτό, έχουμε εκ νέου επαγόμενη Kras * έκφρασης μετά την υποχώρηση του όγκου. Κατά doxy χορήγηση, παρατηρήσαμε ταχεία επανεμφάνιση του πρωτογενούς μάζας του όγκου (Σχ. 5D και 5F), υποδηλώνοντας ότι μερικά καρκινικά κύτταρα είχαν επιβιώσει την αδρανοποίηση διαγονίδιο και ήταν σε θέση να επαναλάβουν την ταχεία ανάπτυξη. Επιπλέον, περαιτέρω ανάλυση αποκάλυψε φωσφο-ERK1 /2 επίπεδα αυξήθηκαν σε ολόκληρη την πρωτογενή όγκο, καθώς και στο ήπαρ και στους πνεύμονες μεταστάσεις (Σχ. 5Ε). Η παρατήρηση αυτή μας οδήγησε να διερευνήσει κατά πόσον τα καρκινικά κύτταρα μπορεί να αποκτήσει τελικά αντίσταση στην Kras * αδρανοποίηση.

(Α) Πειραματική σχεδίαση. (Β) Προσδιορισμός μιας μεγάλης παγκρέατος μάζα όγκου 22 εβδομάδες μετά την ενεργοποίηση Kras *. Τ: όγκος, S: το στομάχι, Σπ: σπλήνα, L: το συκώτι, G: χοληδόχου κύστης. (C) Εικόνες που λαμβάνονται 1, 3 και 6 εβδομάδες μετά Kras * αδρανοποίηση. Σημειώστε την πολύ μειωμένη πρωτογενούς μάζας του όγκου και των μεταστατικών φορτίο. (Δ) Επανενεργοποίηση των Kras * Αποτελέσματα στην ταχεία υποτροπή του όγκου. (Ε) Ιστολογία του πρωτογενούς όγκου καθώς και μεταστάσεις που βρίσκονται στο ήπαρ και πνεύμονα εξής όγκου υποτροπή δείχνουν άφθονη φωσφο-ERK1 /2 έκφραση (ένθετα). μπαρ κλίμακα 100 um (F) του όγκου και του συνολικού όγκου μεταστάσεις στα υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία.

Η

Για να αντιμετωπιστεί αυτό το ενδεχόμενο, και να είναι σε θέση να αποκτήσουν ιστολογική πληροφορίες του ίδιου όγκου πάροδο του χρόνου, θα δημιουργείται πρωτογενές κυτταρικές σειρές από iKras * p53 * όγκους. Πρωτογενής γραμμές όγκου σε καλλιέργεια χαρακτηρίστηκαν είτε από επιθηλιακά ή μεσεγχυματικά-όπως μορφολογία (σχ. 6Α και 6C). Η έκφραση του μεταλλαγμένου Kras * Το RNA ρυθμίζεται από doxy στον πολιτισμό, όπως αναμενόταν (Εικ. 6Α και 6C). Επιπλέον, προσδιορίσαμε δραστικότητα Ras στα iKras * p53 * πρωτογενείς κυτταρικές σειρές ήταν συγκρίσιμο με τα επίπεδα του δραστικού Ras σε κύτταρα που προέρχονται από το KPC όγκους (Σχ. 6G). Φωσφο-ERK1 επίπεδα /2 αρχικά ρυθμίζεται από doxy στο μέσο? Ωστόσο, ο κανονισμός αυτός είχε αποδυναμωθεί την πάροδο του χρόνου σε καλλιέργεια, με φωσφο-ERK1 /2 επίπεδα όλο και συστατικά αυξημένα, παρόλο που Kras * έκφραση ήταν ακόμα doxy-εξαρτώμενη (Εικ. 6Β και 6D). Είναι ενδιαφέρον, πολλαπλασιασμός, όπως μετράται με πυρηνικό αντιγόνο πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων (PCNA), δεν φαίνεται να είναι εξαρτώμενη από doxy σε καλλιέργεια. Ωστόσο, ένα από τις κυτταρικές σειρές (iKras * p53 * -2) εμφάνισαν αυξημένη έκφραση του δείκτη απόπτωσης διασπασμένη κασπάση 3, ανάλογα με την απομάκρυνση των doxy από τα μέσα μαζικής ενημέρωσης (Σχ. 6Ε και 6F). Τα δεδομένα είναι σύμφωνα με προηγούμενες παρατηρήσεις ότι ένα υποσύνολο των ανθρώπινων παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων εξαρτάται από ογκογόνο Kras για επιβίωση [35], [36].

(Α) iKras Primary κυτταρική γραμμή * p53 * -1 εκθέματα επιθηλιακών μορφολογία και αποδεικνύει δοξυκυκλίνη εξαρτάται Kras * έκφρασης (* p & lt? 0.05), και /2 επίπεδα pERK1 στο πέρασμα 5. (β) τα ίδια κυτταρική γραμμή στο πέρασμα 12? Kras * έκφρασης εξακολουθεί να εξαρτάται από doxy (*** p & lt? 0.001), αλλά τα επίπεδα pERK1 /2 δεν εξαρτώνται από Kras * έκφρασης. (Γ) Ένα δεύτερο πρωτεύον κυτταρική γραμμή, iKras * ρ53 * -2, έχει μεσεγχυματικά μορφολογία. Στο χωρίο 6, Kras * η έκφραση εξαρτάται από doxy (** p & lt? 0.01), και pERK1 /2 επίπεδα εξαρτάται από Kras * έκφρασης. (Δ) Ανάλυση σε χωρίο 11: Kras * εξακολουθεί να ρυθμίζεται από doxy (* p & lt? 0,05, ** p & lt? 0.01), αλλά pERK1 /2 επίπεδα παραμένουν αυξημένα. (Ε) Ανάλυση Western blot της απόπτωσης, που υποδεικνύεται από διασπασμένης κασπάσης-3 (CC3), και ο πολλαπλασιασμός, μετράται με πυρηνικό αντιγόνο πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων (PCNA), και στις δύο iKras * p53 * -1 και iKras * p53 * -2 κυτταρικές γραμμές. (F) Ανοσοφθορισμός απόπτωσης, που υποδεικνύεται από διασπασμένης κασπάσης-3 (CC3), σε iKras * ρ53 * -2 κυττάρων είτε παρουσία (48 h) ή απουσία (-48 η) του doxy στα μέσα ενημέρωσης. χρώση DAPI χαρακτηρίζει τους πυρήνες. μπαρ κλίμακα 100 um. (G) Ras δοκιμασία pull-down αποδεικνύει ότι τα επίπεδα Ras δραστηριότητα είναι συγκρίσιμα μεταξύ iKras * κυτταρικές σειρές p53 * και τα κύτταρα από όγκους KPC.

Η

Για να προσδιοριστεί η επίδραση του Kras * αδρανοποίηση

in vivo

, εμείς ενέχυσαν τα κύτταρα υποδορίως σε NOD ποντίκια /SCID. Ενώ υποδόρια ένεση δεν είναι κατάλληλη για την προ-κλινικές μελέτες του καρκίνου του παγκρέατος, δεδομένου ότι δεν αντικατοπτρίζουν την πολυπλοκότητα του μικροπεριβάλλον του όγκου, ωστόσο παρέχει μια ένδειξη της ικανότητας των κυττάρων του όγκου να αυξηθεί

in vivo

. Όλες οι γραμμές που εξετάστηκαν (n = 3) ταχέως σχημάτισαν όγκους όταν μεταμοσχεύονται σε NOD /SCID ποντικοί κρατούνται σε doxy-νερό. Κατά doxy απόσυρση, οι όγκοι σταμάτησαν πρώτα αυξάνεται και στη συνέχεια υποχώρησαν γρήγορα? Είναι ενδιαφέρον, πλήρης υποχώρηση παρατηρήθηκε μόνο στην κυτταρική γραμμή που εξαρτιόταν από ογκογόνους Kras για την επιβίωση σε καλλιέργεια κυττάρων (iKras * p53 * -2). Μετά από μία λανθάνουσα περίοδο, όμως, οι όγκοι αναπτύχθηκαν ξανά απουσία doxy (Εικ. 7Α και η Εικ. 7C). Η ιστολογική ανάλυση έδειξε ότι οι μεταμοσχευμένων όγκων, καθώς και τα υποτροπιάζοντα όγκοι έμοιαζε πρωτογενούς όγκου που προήλθαν από (Σχ. 7Β και Το Σχ. 7D, συγκρίνετε με το Σχ. 1 D, άνω και κάτω πάνελ αντιστοίχως). Τόσο φωσφο-ERK1 επίπεδα έκφρασης Κί67 /2 και αρχικά κάτω-ρυθμίζονται κατά Kras * αδρανοποίηση (Σχ. 7D, ένθετο), αλλά εκφράζεται στα υποτροπή των όγκων (Σχ. 7Β και το Σχ. 7D). Παρατηρήσαμε επίσης ρύθμιση προς τα κάτω της SMA στους ινοβλάστες που περιβάλλουν τα καρκινικά κύτταρα, παρόλο που, όπως αναμενόταν, η έκφραση SMA διατηρήθηκε στο αγγειακό σύστημα που σχετίζεται με ινοβλάστες (Σχ. 7D), υποδεικνύοντας μία αλλαγή στις αλληλεπιδράσεις επιθηλιακά-μεσεγχυματικά κατόπιν Kras * αδρανοποίηση στο επιθήλιο. Όταν αναλύσαμε την έκφραση των ογκογόνων Kras * στους όγκους, βρήκαμε ότι οι όγκοι είχαν υποτροπιάσει ιδιοσυστατικά αυξημένη έκφραση του Kras *, υποδεικνύοντας απώλεια-εξάρτησης δοξυκυκλίνης στο διαγονίδιο (Εικ. 7Ε). Έτσι, φαίνεται πιθανό ότι η επανεμφάνιση του όγκου οφείλεται στην επιλεκτική πίεση για Kras * έκφρασης, και όχι για να αποκτήσει την ανεξαρτησία από Kras *. Εμείς διερευνηθεί επίσης κατά πόσον επιπλέον ογκογόνο πορείες θα μπορούσε να συμβάλει στην υποτροπή. Δεν ανιχνεύει τυχόν μεταβολές στην οδό σηματοδότησης EGF, αλλά κάναμε παρατηρούμε μια αύξηση στην myc έκφραση στα υποτροπή όγκων (Σχ. 7Ε, τα δεδομένα δεν φαίνονται).

(Α) Το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε συναρτήσει του χρόνου για iKras * p53 * -1 κύτταρα μεταμοσχεύονται υποδορίως σε NOD /SCID ποντίκια. Η κίτρινη γραμμή δείχνει την παρουσία doxy, μαύρες γραμμές δείχνουν την απουσία doxy, βέλη δείχνουν τη συγκομιδή χρονικά σημεία. Ν = 5. (Β) Ιστολογία και φωσφο-ERK1 /2 έκφραση (ένθετο) της iKras * p53 * -1 όγκους που συλλέγονται κατά τη διάρκεια της αρχικής φάσης ανάπτυξης και των υποτροπή των όγκων. μπαρ κλίμακα 100 um. (C) σχηματισμός όγκου, υποχώρηση, και υποτροπή σε NOD /SCID ποντίκια που ενέθηκαν υποδόρια με iKras πρωτογενή κυτταρική σειρά * p53 * -2. N = 5. Μια δεύτερη ομάδα των NOD /SCID ποντικοί ενέθηκαν με iKras * p53 * -2 κύτταρα, αλλά διατηρείται εν απουσία doxy που δεν αναπτύσσουν όγκους. Ν = 10. Η κίτρινη γραμμή δείχνει την παρουσία doxy, μαύρες γραμμές δείχνουν την απουσία doxy, βέλη δείχνουν τη συγκομιδή χρονικά σημεία. (D) Ιστολογίας και pERK1 /2 (ένθετο), Ki67 και SMA έκφραση iKras * p53 * -2 όγκους κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης, παλινδρόμηση, και υποτροπή φάσεις. μπαρ κλίμακα 100 um. (Ε) Ποσοτική PCR για ογκογόνους Kras * και έκφραση myc σε iKras * p53 * -2 όγκους.

Η

Σε μία διαφορετική ομάδα πειραμάτων, ενέθηκε καρκινικών κυττάρων σε NOD /SCID ποντίκια στην απουσία doxy, να καθοριστεί αν doxy-ανεξάρτητο κύτταρα ήταν ήδη παρούσα στις γραμμές όγκου. Στην περίπτωση αυτή, τα κύτταρα του όγκου απέτυχαν να προκαλέσουν όγκους σε χρονικό διάστημα 13 εβδομάδων (Σχήμα 7C).? Έτσι, απορύθμιση της Kras * διαγονίδιο δεν ήταν πιθανό να είναι παρόν στο αρχικό πληθυσμό κυττάρων, αλλά εμφανίστηκαν ενώ τα κύτταρα που αναπτύσσονται σε NOD /SCID ποντίκια. Περιληπτικά, οι παρατηρήσεις μας δείχνουν ότι,

in vivo

, τα κύτταρα του όγκου εξαρτώνται από ογκογόνο Kras * για να σχηματίσουν και να διατηρήσουν όγκους. Αξίζει να σημειωθεί ότι, εμείς δεν παρατηρούμε υποτροπή σε iKras * p53 * ποντίκια, αλλά μόνο μία φορά τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν και αποκαθίσταται σε NOD ποντίκια /SCID? είναι επομένως πιθανό ότι η διαφορετικό περιβάλλον, πιθανώς εξαιτίας της απουσίας ενός λειτουργικού ανοσοποιητικού συστήματος, ή λόγω του χειρισμού των κυττάρων, μπορεί να είναι ανεκτική για την ανάπτυξη του όγκου.

Η

Συζήτηση

Χάρη σε μελέτες σε μοντέλα ποντικών που μιμούνται στενά την εξέλιξη της ανθρώπινης ασθένειας, καθώς και γονιδιακά δεδομένα και μελέτες σε πρωτογενείς ανθρώπινους όγκους, έχουμε αναπτύξει μια εξελιγμένη κατανόηση της βιολογίας του καρκίνου του παγκρέατος [1], [30], [31]. Λαμβάνοντας υπόψη το συγκρότημα μετάλλαξης προφίλ του καρκίνου του παγκρέατος και της αδυναμίας να στοχεύσουν κάθε αλλοίωση, είναι καίριας σημασίας για την κατανόηση των γονιδίων /μονοπάτια που απαιτούνται για τη συντήρηση του όγκου. Οι μεταλλάξεις στο γονίδιο KRAS συμβαίνουν νωρίς κατά τη διάρκεια της εξέλιξης της νόσου [32]. μοντέλο ποντικού μελέτες έχουν δείξει καθοριστικό ρόλο των μεταλλαγμένων Kras στην έναρξη της νόσου [33], [34]. Επιπλέον, ένα υποσύνολο των ανθρώπινων παγκρεατικών καρκινικών κυτταρικών γραμμών απαιτούν Kras * για την ανάπτυξη και την επιβίωση τόσο

in vitro

και σε ανοσοκατασταλμένους ποντικούς ξενιστή [35], [36]. Επιπλέον, άλλες ανθρώπινων όγκων όπως αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα και ο καρκίνος του μαστού δείχνουν παρόμοια εξάρτηση από το ογκογόνο Kras [17], [24]. Δείξαμε πρόσφατα ότι ο καρκίνος του παγκρέατος σε ποντικό είναι εθισμένος να Kras * [8]. Ωστόσο, η πρώτη μας μελέτη δεν επεκτείνεται σε ανάλυση του ρόλου της Kras * με την παρουσία του άλλου ογκογόνο περίπτωση, ούτε τη διερεύνηση μεταστατικής νόσου. Δεδομένου ότι ο καρκίνος του παγκρέατος είναι ιδιαίτερα μεταστατικό στον άνθρωπο, θεωρήσαμε ότι ήταν απαραίτητο να επεκταθεί η προσέγγιση μας για να συμπεριλάβει αυτό το χαρακτηριστικό με το συνδυασμό Kras * έκφρασης με μεταλλαγμένο p53 *. Ακόμη και με την παρουσία του ρ53 *, δείχνουμε ότι Kras * απαιτείται για τη διατήρηση της πρωτογενούς όγκου και των μεταστάσεων. Ωστόσο, τα καρκινικά κύτταρα επέζησαν Kras * αδρανοποίησης και, κατόπιν Kras * επανενεργοποίηση, έδωσε αφορμή για την ανανέωση της ανάπτυξης του όγκου. Επιπλέον, όταν τα καρκινικά κύτταρα απομονώθηκαν και εμφυτεύονται σε ανοσοκατεσταλμένα ξενιστές, ανέπτυξαν ταχέως αντίσταση. Σε άλλα μοντέλα αντιμετώπιση ογκογονίδιο εξάρτησης, ενδεχόμενη εξαγορά της αντίστασης έχει παρατηρηθεί συχνά [24], [37]. Στο σύστημά μας, απομένει να καθοριστεί αν η παρουσία του μεταλλαγμένου p53 προωθεί την αντίσταση στην Kras * αναστολής, ή αν η ανοσοκατασταλμένοι κατάσταση του ξενιστή είναι ανεκτική για υποτροπή του όγκου, όπως προτάθηκε στο παρελθόν [38]. Στο σύνολό τους, τα ευρήματά μας επικυρώνει την έννοια της αναστολής της Kras σε ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος? Ωστόσο, παρέχουν επίσης μια προειδοποίηση σχετικά με τη δυνατότητα για τα καρκινικά κύτταρα να παρακάμψει τελικά ογκογονίδιο εξάρτησή τους. Μελλοντικές μελέτες θα πρέπει να αποσκοπεί στην κατανόηση των μηχανισμών που επιτρέπουν ένα υποσύνολο των καρκινικών κυττάρων να επιβιώσουν Kras * αδρανοποίηση για να παρέχει στρατηγικές για την πλήρη εξάλειψη του όγκου.

Υλικά και Μέθοδοι

Ποντίκια

τα ποντίκια στεγάστηκαν σε απαλλαγμένα από ειδικά παθογόνα εγκαταστάσεις του Πανεπιστημίου του Michigan Comprehensive Κέντρο Καρκίνου. Η μελέτη αυτή εγκρίθηκε από το Πανεπιστήμιο της επιτροπής του Πανεπιστημίου Μίσιγκαν για Χρήση και φροντίδα των ζώων (UCUCA) κατευθυντήριες γραμμές. p48Cre (Ptf1a-CRE) ποντίκια [14] είχαν διασταυρωθεί όσο με TetO-Kras

G12D [17], Rosa 26

rtTa /rtTa [15] και p53

R172H /+ [16] ποντίκια για να παράγουν p48Cre? TetO-Kras

G12D? Rosa 26

rtTa /+? p53

R172H /+ (iKras * p53 *). Νεογνά που στερούνται Cre ή το μεταλλαγμένο Kras και αλληλόμορφα ρ53 χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες. ποντίκια KPC [4] και iKras * ρ53

+/- ποντίκια [8] περιγράφηκαν προηγουμένως.

Doxy χορηγήθηκε μέσω του πόσιμου νερού, σε συγκέντρωση 0,2 g /L σε ένα διάλυμα 5 % σακχαρόζη, και να αντικατασταθεί κάθε 3-4 ημέρες.

η παγκρεατίτιδα προκλήθηκε μέσω δύο σειρές οκτώ ωριαίες ενδοπεριτοναϊκές ενέσεις κερουλεΐνη (Sigma), σε συγκέντρωση 75 μg /kg, σε μία περίοδο 48 ωρών, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18].

Απεικόνιση μαγνητικού Συντονισμού

οι ποντικοί αναισθητοποιήθηκαν με 1-2% ισοφλουράνιο /αέρα, και η θερμοκρασία του σώματος διατηρήθηκε με εμφύσηση θερμού αέρα μέσω της οπής του μαγνήτη χρησιμοποιώντας air-Therm (World Precision Instruments, Sarasota, FL). Μαγνητικές τομογραφίες διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας ένα 7 Τ Agilent (Palo Alto, CA)

Direct Drive

σύστημα με ένα κεφάλι τετραγωνισμού του αρουραίου ογκομετρικού πηνίο (M2M Imaging, Cleveland, ΟΗ). Οι ποντικοί τοποθετήθηκαν σε ύπτια θέση στο πηνίο, μαγνητοσκοπημένο κάτω από την θωρακική κοιλότητα στο κρεβάτι για τη μείωση της αναπνευστικής κίνησης. Τ2 εικόνες αποκτήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα γρήγορο γύρισμα echo ακολουθία πολλαπλών φέτα με TR /TE: 4000/30 ms, 8 τρένα ηχώ, 4 μέσους όρους, 2 σαρώσεις ομοίωμα, οπτικό πεδίο (FOV) = 25 × 25 mm

2, το μέγεθος matrix = 128 × 128, πάχος τομής = 1 mm, που αριθμό των φετών = 25 συνεχόμενες. Χρησιμοποιώντας in-house λογισμικό που αναπτύχθηκε σε MATLAB (The MathWorks, Inc., Natick, ΜΑ) το όριο όγκου ήταν το χέρι που καθορίζονται για κάθε φέτα και στη συνέχεια να ενσωματωθούν σε φέτες για να παρέχει μια εκτίμηση του όγκου.

Ανοσοϊστοχημεία

Ιστολογία και Ανοσοϊστοχημεία διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [8]. Μια λίστα των αντισωμάτων παρέχονται στον Πίνακα 2. Οι εικόνες ελήφθησαν με την Olympus ΒΧ-51 μικροσκόπιο, και την ψηφιακή φωτογραφική μηχανή της Olympus DP71, και το λογισμικό DP ελεγκτή.

Ίδρυση πρωτογενείς καλλιέργειες κυττάρων

Ιστός συλλέχθηκε από τον πρωτογενή όγκο, κιμά, και υπέστη πέψη με 1 mg /ml κολλαγενάση V (Sigma) στους 37 ° C για 15 λεπτά. Η πέψη διεκόπη με την προσθήκη πλήρους μέσου: RPMI-1640 (Gibco) + 10% ορό εμβρύου μόσχου + 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη. Τα κύτταρα απομονώθηκαν με διήθηση μέσα από ένα um κύτταρο σουρωτήρι 100 και καλλιεργήθηκαν σε πλήρες μέσο που περιείχε δοξυκυκλίνη (Sigma) σε 1 μg /ml.

υποδόριου όγκου Transplantation

1 × 10

6 iKras * p53 * κύτταρα εγχύθηκαν υποδορίως στο πλευρό του NOD /SCID ποντίκια σε αναλογία 1:01 του Matrigel (BD Biosciences) και πλήρες μέσο. Doxy χορηγήθηκε μέσω του πόσιμου νερού σε μια συγκέντρωση 0,2 g /L σε ένα διάλυμα 5% σακχαρόζη για 3 ημέρες, και σε τροφή (Bioserv). Το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε με παχύμετρο.

Ποσοτική RT-PCR

εκχύλιση RNA, cDNA παρασκευή και ποσοτική PCR για Kras * και κανονικοποίηση για GAPDH διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [8]. Η στατιστική ανάλυση διεξήχθη με μη ζευγαρωμένο t-test.

Ανάλυση Western Blot

Τα κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό RIPA (Sigma-Aldrich, R0278) και αναστολέα πρωτεάσης (Sigma-Aldrich, P8340). Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης ηλεκτροφορήθηκαν σε 12% ή 4-15% κλίση γέλες SDS-PAGE, μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη PVDF (Bio-Rad). Οι μεμβράνες δεσμεύτηκαν με 5% γάλα, και πρωτογενείς επωάσεις αντισώματος διεξήχθησαν όλη τη νύχτα στους 4 ° C. Οι πρωτογενείς αντισώματα και οι αραιώσεις που παρέχονται στον Πίνακα 2. Δευτερογενής αντίσωμα συζευγμένο με HRP αντι-κουνελιού (1:5,000) χρησιμοποιήθηκε και ανιχνεύθηκε με Western Lightning Plus-ECL (Perkin Elmer). πρωτεϊνικές ζώνες έγιναν ορατές σε φιλμ Kodak XAR Biomax.

Ενεργά Ras Pull-down Δοκιμασία

Τραβήξτε προς τα κάτω και ανοσοαποτύπωση της ενεργού Ras πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα Active Ras pull-down κιτ (Pierce) μετά τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Esha Mathew για την κριτική ανάγνωση του χειρογράφου και Marsha Thomas για εργαστηριακή υποστήριξη. Το CK19 αντίσωμα (Troma III) λήφθηκε από την Αϊόβα Αναπτυξιακή Hybridoma Bank.